Summary
हम, माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के खिलाफ उपन्यास यौगिकों की खोज intracellular लक्षित करने के लिए और इन-शोरबा बैक्टीरिया के साथ-साथ cytotoxicity बढ़ रही स्तनधारी मेजबान सेल के खिलाफ एक मॉड्यूलर उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रणाली विकसित की है।
Introduction
माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग, तपेदिक (टीबी) की प्रेरणा का एजेंट, रुग्णता और मृत्यु दर दुनिया भर के एक प्रमुख कारण है। नशीली दवाओं के प्रति संवेदनशील टीबी एक इलाज बीमारी है जो 6 महीने की अवधि के लिए एक से अधिक एंटीबायोटिक दवाओं की आवश्यकता है। एक इलाज बीमारी होने के बावजूद, टीबी मृत्यु दर 2015 1 में 15 लाख होने का अनुमान था। पिछले 10 वर्षों में, वहाँ दवा प्रतिरोधी तपेदिक एम के प्रसार पर चिंता बढ़ रही है। बहुत दबा प्रतिरोधी टीबी (एमडीआर-टीबी) टीबी कि कम से कम आइसोनियाज़िड (INH) और रिफैम्पिसिन (आरएमपी), और सबसे एमडीआर-टीबी उपभेदों भी दूसरी पंक्ति टीबी दवाओं का चयन करने के प्रतिरोधी रहे हैं, इस प्रकार उपचार के विकल्प सीमित के लिए प्रतिरोधी है के रूप में परिभाषित किया गया है । दवा प्रतिरोध के प्रभाव ह्यूमन इम्यूनो वायरस (एचआईवी) के साथ मिलकर संक्रमित रोगियों के इलाज के लिए एक अधिक से अधिक चुनौती बनाएँ; 400,000 रोगियों दुनिया भर में 2015 1 में एचआईवी जुड़े टीबी की मृत्यु हो गई। निराश, संयुक्त राज्य अमेरिका के खाद्य एवं औषधि Administराशन पिछले 40 वर्षों 2 में एमडीआर-टीबी, bedaquiline के खिलाफ केवल एक नए टीबी दवा को मंजूरी दी है,। बेहतर और कम टीबी उपचारों की खोज के क्षेत्र में अग्रिम तत्काल आदेश टीबी और एमडीआर-टीबी के खिलाफ लड़ाई में आगे रहने के लिए में की जरूरत है।
परंपरागत रूप से, टीबी दवा स्क्रीन विकास माध्यम में इन विट्रो विकास की स्थिति, जिससे यौगिकों बढ़ती संस्कृति से जुड़ जाते हैं और सूक्ष्मजीवों उन्मूलन में उनकी प्रभावशीलता ठोस माध्यम पर कॉलोनी के गठन इकाइयों (CFU) की गणना के द्वारा निर्धारित कर रहे हैं के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं। CFU मायने रखता है श्रम गहन काफ़ी समय है, और महंगी हैं के रूप में, विभिन्न अप्रत्यक्ष तरीकों से इस समस्या को कम करने के लिए विकसित किया गया है। इस तरह के तरीके Alamar ब्लू व्यवहार्यता परख 3, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) या luciferase व्यक्त बैक्टीरिया से चमक 5 से प्रतिदीप्ति 4 के निर्धारण, और कुल एडेनोसाइन ट्रायफ़ोस्फेट के आकलन (ए में शामिलटीपी) 6, 7।
ठेठ टीबी फेफड़े, जहां बैक्टीरिया रहते हैं और वायुकोशीय मैक्रोफेज 8 की phagosomes अंदर दोहराने के एम तपेदिक संक्रमण की विशेषता है। सरल में शोरबा प्ररूपी स्क्रीन बाह्य रोगाणुओं के अनुरूप कर सकते हैं; हालांकि, ऐतिहासिक परिप्रेक्ष्य में, मारा एम तपेदिक के खिलाफ यौगिकों इस पद्धति का उपयोग पहचान अक्सर संक्रमण मॉडल में नीचे की ओर सत्यापन चरणों के दौरान अपेक्षाओं पर खरा उतरने में विफल रहते हैं। हमारा प्रस्ताव है कि टीबी दवा सबसे अच्छा एक intracellular मेजबान सेल संक्रमण मॉडल में किया जाता है। फिर भी, intracellular मॉडल उच्च throughput स्क्रीनिंग (HTS) विकास के लिए कई तकनीकी और जैविक बाधाओं पास है। एक बड़ा बाधा संक्रमण प्रक्रिया की जटिलता, कई कदम और द्वारा बाह्य बैक्टीरिया की विस्तृत हटाने धोने के बीच द्वारा उदाहरण है। एक दूसरा बड़ी बाधा लंबा समय फिर से हैquirements, विकास का पता लगाने, सामान्य रूप से CFU संस्कृति प्लेटों पर भरोसा कर के द्वारा किया के रूप में, इस प्रक्रिया को पूर्ण करने के लिए 3 सप्ताह लेता है। CFU मायने रखता है को बदलने के लिए एक समाधान फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के साथ संयोजन में स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान की गई है। हालांकि, इस समाधान के लिए एक प्रारंभिक उपकरण निवेश कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए पहुंच से बाहर है कि आवश्यकता है। एक सरल, कम लागत, और रोग-प्रासंगिक एचटीएस विधि बहुत दवाओं की खोज की प्रक्रिया में वृद्धि होगी।
इस अध्ययन में, हम एक नए, मॉड्यूलर एचटीएस प्रणाली है कि एक तेजी से, और उच्च स्केलेबल, अभी तक किफायती, intracellular एम तपेदिक के खिलाफ यौगिकों की गतिविधि का पता लगाते उपयुक्त परख प्रदान करने के उद्देश्य से है रिपोर्ट। (I) intracellular, (ii) cytotoxicity, और (iii) में शोरबा assays: यह प्रणाली तीन मॉड्यूल से बना है। संयुक्त अंतिम परिणाम कार्रवाई के संभावित मोड के रूप में अतिरिक्त जानकारी के साथ, यौगिक संपत्तियों की एक व्यापक विवरण प्रदान करता है। यह अनुसूचित जातिreening प्रणाली दवा तालमेल 9 के विश्लेषण सहित विभिन्न यौगिक पुस्तकालयों कि कार्रवाई की विधा लक्षित करते हैं, के साथ कई परियोजनाओं में इस्तेमाल किया गया है, भोजी 10 की उत्तेजना, और एम तपेदिक के निषेध -secreted डाह कारक (अप्रकाशित)। कार्रवाई की अज्ञात मोड के यौगिकों भी 11 अध्ययन किया गया है। इस विधि का एक संशोधित संस्करण भी intracellular एम तपेदिक 11 के खिलाफ नए यौगिकों की पहचान करने के लिए प्राथमिक जांच पद्धति के रूप में हमारे औद्योगिक साथी द्वारा अपनाया गया था।
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Protocol
1. बैक्टीरियल तनाव और विकास का माध्यम
- गोजातीय सीरम albumin 25 ग्राम, डेक्सट्रोज की 10.0 ग्राम, और विआयनीकृत जल की 460 एमएल में सोडियम क्लोराइड की 4.05 ग्राम solubilizing द्वारा एल्बुमिन डेक्सट्रोज और नमक शेयर समाधान (एडीएस) बनाओ। 4 डिग्री सेल्सियस पर विज्ञापनों और दुकान फ़िल्टर-नसबंदी।
- 7H9 पाउडर के 4.7 ग्राम और शुद्ध पानी की 900 एमएल के लिए ग्लिसरॉल के 2 एमएल जोड़कर 7H9 शोरबा करें। 10 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर 7H9 शोरबा आटोक्लेव और यह आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान को ठंडा होने दें। एडीएस की 100 एमएल और 7H9 शोरबा के 900 एमएल के लिए Tween80 के 0.5 एमएल जोड़कर 7H9ADST करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- केनामाइसिन सल्फेट की 50 मिलीग्राम वजन और विआयनीकृत जल के 1 एमएल में भंग; अंतिम एकाग्रता 50 मिलीग्राम / एमएल है। फ़िल्टर बाँझ और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। प्रति 7H9ADST का 1 एल शेयर समाधान केनामाइसिन के 0.5 एमएल जोड़ें।
ध्यान दें: इस माध्यम ताजा किया जाना चाहिए, ताकि उचित रूप से मात्रा पैमाने संस्कृति आकार के अनुसार। - 7H में एम तपेदिक के लिए आगे बढ़ें9ADST संस्कृति खड़े में केनामाइसिन के साथ पूरक। संस्कृति दैनिक हिला और यह पतला से पहले OD600 1.0 तक पहुँच जाता है का एकत्रीकरण से बचने के लिए।
नोट: एम तपेदिक इस पद्धति के विकास के लिए इस्तेमाल किया तनाव H37Rv pJAK2.A प्लाज्मिड 12 के साथ बदल गया था। pJAK2.A एक एकीकृत pMV361 वेक्टर, जो hsp60 प्रमोटर से जुगनू luciferase जीन की उच्च स्तरीय अभिव्यक्ति की अनुमति देता है और केनामाइसिन का उपयोग कर चुना जा सकता है के आधार पर प्लाज्मिड है।
2. THP-1 मध्यम और रखरखाव
- गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1640 RPMI के 500 एमएल के लिए 200 मिमी एल glutamine 5 एमएल के 50 एमएल जोड़ें RPMI अधूरा मध्यम (लगभग 10% एफबीएस और 2 मिमी glutamine) बनाने के लिए।
- मानक प्रोटोकॉल 13 के अनुसार एक THP-1 सेल संस्कृति को बनाए रखें। संक्षेप में, RPMI अधूरा माध्यम में THP-1 कोशिकाओं को बढ़ने जबकि 0.2 की एक सेल घनत्व क़दम के बीच माध्यम की प्रति मिली 1 लाख को बनाए रखनेसंतों।
3. उच्च throughput इंट्रासेलुलर स्क्रीनिंग luciferase व्यक्त एम तपेदिक H37Rv का उपयोग करना
- 600 एनएम के तरंग दैर्ध्य में एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में एक सक्रिय रूप से बढ़ रहा है बैक्टीरियल निलंबन के ऑप्टिकल घनत्व को मापने। एमएल प्रति 0.1 आयुध डिपो 600 = 3 x 10 7 बैक्टीरिया के रूपांतरण कारक का उपयोग कर बैक्टीरियल घनत्व की गणना।
- 1 एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब में: संक्रमण 10 के (MOI) की बहुलता के लिए पर्याप्त बैक्टीरिया बाहर पिपेट। 10 मिनट के लिए 3000 XG पर गोली और तरल aspirate। मानव सीरम के 50 μL RPMI1640 के 450 μL में जोड़े। मात्रा के प्रयोग के लिए मूल्यों को उचित स्केल।
- बैक्टीरिया opsonize करने के लिए, RPMI1640 के प्रति 500 μL 1 x 10 8 बैक्टीरिया 10% मानव सीरम होने के घनत्व में गोली resuspend। मिश्रण 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते की अनुमति दें। एक hemocytometer और उलटे microsco साथ की गणना के द्वारा THP-1 सेल संस्कृति घनत्व का निर्धारणपीई।
- 100 XG पर बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में गोली कोशिकाओं और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और अधूरा एमएल प्रति 1 लाख कोशिकाओं की एक घनत्व पर RPMI में कोशिकाओं resuspend। phorbol-12-myristate-13-एसीटेट (PMA) एक 40 एनजी / एमएल अंतिम एकाग्रता में जोड़े।
नोट: यह भेदभाव मिश्रण के रूप में करने के लिए भेजा जाएगा। - 10 एक MOI में कम्बाइन THP-1 भेदभाव मिश्रण के साथ opsonized एम तपेदिक: 1 और एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे सफेद प्लेट में अच्छी तरह से प्रति 100 μL में अंतिम मिश्रण विभाज्य। नियमित रूप से मिश्रण हलचल एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए। भेदभाव और संक्रमण युक्त 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में आगे बढ़ने दें।
- कुओं RPMI प्रत्येक के 100 μL के साथ दो बार धोएं। RPMI अधूरा में वांछित सांद्रता के पतला यौगिकों जोड़ें और 3 दिनों के लिए सेते हैं।
- कुओं से मध्यम aspirate। luciferase परख अभिकर्मक के 50 μL प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें। टी के साथ प्लेटें सीलransparent चिपकने वाला थाली sealers। 22 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 5 मिनट के लिए अनुमति दें और उसके बाद प्रति अच्छी तरह से 1 s पर एक luminometer में एक रीडआउट प्राप्त करते हैं।
4. cytotoxicity विश्लेषण एक 3 (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT) का उपयोग करते हुए परख 14
- RPMI में THP-1 कोशिकाओं को अलग करें अधूरा स्पष्ट 96-अच्छी तरह प्लेटों में पीएमए के 40 एनजी / एमएल के साथ पूरक। एमएल प्रति 1 लाख की सेल घनत्व और विभाज्य अच्छी तरह से प्रति 100 μL बनाए रखें। भेदभाव से युक्त 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में आगे बढ़ने दें।
- कुओं से मध्यम Aspirate और RPMI में पतला यौगिकों कुओं अधूरा जोड़े उन्हें RPMI 1640 के साथ दो बार धोएं। 3 दिनों के लिए सेते हैं।
- 5 मिलीग्राम / एमएल के एक शेयर समाधान बनाने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 100 एमएल में MTT की 0.5 ग्राम भंग। -20 डिग्री सेल्सियस, प्रकाश से दूर पर बाँझ फिल्टर और दुकान; यह इस समाधान ताजा बनाने के लिए सबसे अच्छा है।
- 2.5 ज beforई 3 दिन ऊष्मायन अवधि के अंत में, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए MTT समाधान के 25 μL जोड़ें और ऊष्मायन अवधि को पूरा करें।
- 50% एन तैयार, एन -dimethyl formamide (DMF) विआयनीकृत जल के 250 एमएल के साथ DMF के 250 एमएल के मिश्रण से।
- इस प्रकार MTT निष्कर्षण बफर तैयार: 500 एमएल की बोतल में एसडीएस के 100 ग्राम वजन और 50% DMF के 300 एमएल जोड़ें। कम आंच एसडीएस भंग करने के लिए अनुमति देने के लिए लागू करें। शुद्ध एसिटिक एसिड के 10 एमएल और 1 एम एचसीएल का 12.5 एमएल जोड़ें। 50% DMF के साथ 500 एमएल निशान से ऊपर भरें, निष्कर्षण बफर के अंतिम रचना 50% DMF, 20% एसडीएस, 2.5% एसिटिक एसिड, और 2.5% 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड है।
- इलाज की अवधि के अंत में, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए (किसी भी क्रिस्टल भंग करने के लिए 45 डिग्री सेल्सियस को गरम) निष्कर्षण बफर के 100 μL जोड़ें। मिश्रण 37 पर रात में सेते करने की अनुमति दें युक्त 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में सी °। 570 एनएम पर अवशोषण पढ़ें।
नोट: cytotoxicity परख सबसे अच्छा एक intracell के साथ समानांतर में किया जाता हैTHP-1 कोशिकाओं के एक ही बैच और उम्र का उपयोग कर ular स्क्रीन।
5. इन-शोरबा गतिविधि विश्लेषण एक Resazurin परख 3 का उपयोग करना
- मध्य लॉग चरण (- 0.8 आयुध डिपो 600 ~ 0.5) को 7H9ADST में एम तपेदिक के लिए आगे बढ़ें। 0.01 आयुध डिपो 600 7H9ADST साथ संस्कृति पतला। 7H9ADST में यौगिकों पतला अच्छी तरह से प्रत्येक में परीक्षण सांद्रता और प्रत्येक पतला परिसर के विभाज्य 100 μL 2 गुना तक।
- प्रत्येक कुएं में पतला जीवाणु निलंबन के 100 μL स्थानांतरण। प्लेटों 5 दिनों के लिए एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते की अनुमति दें। विआयनीकृत जल और बाँझ फिल्टर की 100 एमएल में resazurin के 10 मिलीग्राम भंग।
- 30 resazurin समाधान के μL जोड़ें और 48 घंटे के बाद रंग बदलने की निगरानी; बैक्टीरियल वृद्धि नीले से एक रंग रूपांतरण गुलाबी से मिलता है।
नोट: एक मात्रात्मक विश्लेषण भी 530 में उत्तेजना के साथ 590 एनएम पर या तो प्रतिदीप्ति मापने के द्वारा किया जा सकता है - 560एनएम या 570 एनएम पर अवशोषण और 600 एनएम 15।
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Representative Results
उच्च throughput intracellular स्क्रीनिंग एम तपेदिक luciferase जीन व्यक्त का उपयोग कर
चित्रा 2A और तालिका 1 luminometer द्वारा एकत्र कच्चे डेटा,, रिश्तेदार luminescent इकाइयों (RLU) में व्यक्त THP-1 कोशिकाओं के अंदर एम तपेदिक पर टीबी दवा रिफैम्पिसिन की एक बढ़ती हुई एकाग्रता के प्रभाव दिखा होते हैं। चित्रा 2A कच्चे चमक रिफैम्पिसिन के विभिन्न सांद्रता के लिए RLU में मापा के बिखराव की साजिश है। त्रुटि सलाखों मतलब (SEM) की मानक त्रुटि संकेत मिलता है। चित्रा 2 बी प्रतिशत इलाज कुओं की तुलना में इलाज किया कुओं में चमक में कमी को दर्शाता है। आंकड़ों से पता चलता है कि रिफैम्पिसिन 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता पर intracellular एम तपेदिक से RLU की> 99.9% कम करने में सक्षम है। यह previousl के अनुसार हैy 0.1 और 0.4 माइक्रोग्राम / एमएल 16 के बीच प्रकाशित एमआईसी। प्रत्येक अच्छी तरह से में उत्पादित चमक की कुल luciferase एम तपेदिक द्वारा व्यक्त का एक संकेत है और इस प्रकार अच्छी तरह से अंदर एम तपेदिक के चयापचय स्थिति को दर्शाती है। कच्चे luminescent स्तरों प्रयोगों के बीच भिन्न करने के लिए यह सामान्य बात है। जैसे, कच्चे डेटा की तुलना अविश्वसनीय निष्कर्ष उत्पन्न होगा। इस प्रकार, डेटा एक परिभाषित नकारात्मक नियंत्रण है, जो नमूने केवल DMSO के साथ इलाज किया जाएगा के खिलाफ सामान्यीकृत किया जाना चाहिए। के रूप में एम में प्रतिशत की कटौती कुओं (चित्रा 2 बी) में तपेदिक जिसके परिणामस्वरूप मूल्यों व्यक्त किया जा सकता।
Cytotoxicity विश्लेषण MTT परख का उपयोग कर
MTT परख यूकेरियोटिक cytotoxicity के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित परख है। यह वर्णमिति परख करने के लिए MTT (पीला) के रूपांतरण के माध्यम से जीवित कोशिकाओं को इंगित करता हैबैंगनी रंग का formazan। यह परख क्योंकि जीवाणु MTT, जो यौगिकों के मनाया विषाक्तता को कम कर देता metabolizing में सक्षम हैं एक एम तपेदिक संक्रमण के बिना किया जाता है। MTT परख के लिए एक आम सुझाव 570 एनएम 17 पर अवशोषण के कारण पीएच सूचक फिनोल लाल के बिना मीडिया का उपयोग करने के लिए है। हालांकि, अम्लीय निष्कर्षण बफर इस विधि में वर्णित लाल 17 फिनोल की वजह से हस्तक्षेप को कम करने में सक्षम है।
3 चित्र एक परीक्षण यौगिक कोडित G1-1H की एक बढ़ती हुई एकाग्रता की वजह से cytotoxicity को दिखाता है। आम तौर पर, एक 50% निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी 50) cytotoxicity के स्तर को इंगित करने कार्यरत है। G1-1H के मामले में, 10 माइक्रोन और 3 सुक्ष्ममापी की सांद्रता आईसी 50 एकाग्रता नीचे स्पष्ट रूप से कर रहे हैं।
इन-शोरबा गतिविधि हमें विश्लेषणresazurin परख ing
Resazurin परख सामान्यतः कोशिकाओं में cytotoxicity के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह भी शोरबा 3 में जीवित बैक्टीरिया की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। resazurin परख एक रेडोक्स आधारित MTT परख के लिए इसी तरह परख है। यह resorufin, एक लाल फ्लोरोफोरे में resazurin के रूपांतरण के माध्यम से एनएडीपीएच स्तरों और एनएडीपीएच डिहाइड्रोजनेज गतिविधि को मापता है। दवा का प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए सबसे आसान और तेज तरीका सबसे कम उपचार एकाग्रता जहां कुओं रंग नीला रहने के लिए देखने के लिए है। चित्रा 4 एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रभाव एम तपेदिक से रूपांतरण resazurin पर एंटीबायोटिक apramycin के विभिन्न सांद्रता है दिखाने का हिस्सा पता चलता है। इन-शोरबा एमआईसी 2.5 और 5 माइक्रोग्राम / एमएल के बीच होने के लिए निर्धारित किया गया था। यह 1.5 माइक्रोग्राम / एमएल 18 के पहले प्रकाशित मूल्य से थोड़ा अधिक है, लेकिन यह acceptab भीतर अच्छी तरह से अब भी हैle रेंज। कई मामलों में, रंग बदलने के बजाय धीरे-धीरे होता है, तो यह एक विश्वास है दृढ़ संकल्प करना मुश्किल है। ऐसी स्थिति में, यह या तो अवशोषण या प्रतिदीप्ति का उपयोग कर रूपांतरण resazurin की वास्तविक राशि अंदाजा लगाना बेहतर है। Resazurin और resorufin, एमआईसी दृढ़ संकल्प अवशोषण का उपयोग करने का समान अवशोषण विशेषताओं के कारण दो अलग अलग तरंग दैर्ध्य और जटिल गणनाओं 15 का उपयोग कर माप की आवश्यकता है। इसलिए, सबसे अच्छा तरीका निर्माता के साहित्य 15 में वर्णित है, 530- 560 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्तेजना और एक 590 एनएम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर प्रतिदीप्ति मापने के लिए है।
चित्रा 4 बहुदिवसीय incubations कि काफी स्क्रीनिंग परिणाम बदल सकता है के साथ जुड़े विसंगति का एक संभावित स्रोत को दिखाता है। इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के अनुचित humidifying के कारण, पी के किनारों पर कुओं lates काफी अधिक वाष्पीकरण सामना करना पड़ा। सभी 15 DMSO के इलाज कुओं समान होना चाहिए रहे हैं, लेकिन छोड़ दिया और शीर्ष किनारों के साथ कुओं की मात्रा कम थी। इन कुओं भी थाली के बीच में अन्य DMSO के इलाज कुओं से अलग अलग रंग दिखाई देते हैं। एक ही विसंगति भी 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल apramycin इलाज कुओं में मनाया जा सकता है। इस मामले में, कम मात्रा भी एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और fluorometer द्वारा एक मात्रात्मक पढ़ने के लिए नेतृत्व करेंगे। वाष्पीकरण, लंबे समय तक ऊष्मायन समय के साथ सभी प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है तो देखभाल इन्क्यूबेटरों विसंगति के इस स्रोत से बचने के लिए अच्छी तरह से humidified रखने के लिए लिया जाना चाहिए।
चित्र 1: विधि Schematics। आरेख उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रणाली के 3 अलग मॉड्यूल के लिए परख schematics चित्रण। _upload / 55,273 / 55273fig1large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एक इंट्रासेलुलर से प्रतिनिधि डेटा THP-1 कोशिकाओं के अंदर एम तपेदिक खत्म में रिफैम्पिसिन की प्रभावशीलता की जांच करने के लिए। (ए) प्रत्येक उपचार (रिफैम्पिसिन) एकाग्रता के लिए मतलब चमक पढ़ने (सापेक्ष चमक इकाइयों में) का ग्राफ़। त्रुटि सलाखों प्रत्येक तीन प्रतियों के लिए मतलब की मानक त्रुटि को दर्शाते हैं। (बी) चमक में गणना प्रतिशत की कटौती रिफैम्पिसिन के उपचार, जहां उच्च मूल्यों अधिक से अधिक प्रभावशीलता का संकेत की वजह से का ग्राफ़। 90% निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी 90) इस मामले में 0.01 और 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल के बीच कहीं है।nk "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: cytotoxicity (MTT) परख से प्रतिनिधि डेटा विभेदित THP-1 कोशिकाओं पर यौगिक G1-1H के जहरीले प्रभाव की जांच करने के लिए। गणना की उपचार यौगिक G1-1H, जहां उच्च मूल्यों स्वस्थ THP-1 कोशिकाओं से संकेत मिलता है के प्रत्येक एकाग्रता के लिए "नियंत्रण का प्रतिशत" का ग्राफ़। इस मामले में आईसी 50 10 30 कहीं बीच माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: एक Resazurin परख से प्रतिनिधि डाटा ई की जांच करने के लिएएम तपेदिक में बाधा-शोरबा में Apramycin की ffectiveness। केवल गुणात्मक डेटा बायोसेफ्टी स्तर 3 (BSL3) प्रयोगशाला में उपकरण सीमाओं के कारण इस मामले में एकत्र किया जाता है। तस्वीर एक 96 अच्छी तरह से थाली एम तपेदिक या तो DMSO या apramycin की मात्रा के साथ इलाज किया युक्त का हिस्सा पता चलता है। DMSO के इलाज कुओं resorufin लिए, के रूप में नीले रंग से रंग रूपांतरण गुलाबी ने संकेत दिया resazurin का रूपांतरण का प्रदर्शन किया। apramycin इलाज नमूने स्पष्ट रूप से 5 माइक्रोग्राम / एमएल नीचे रंग रूपांतरण किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| [रिफैम्पिसिन] | Rep1 | Rep2 | Rep3 | % कमी | |
| 4 माइक्रोग्राम / एमएल | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1 माइक्रोग्राम / एमएल | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल | 1037 | 731 | 976 | 915 | 98 |
| 0.01 माइक्रोग्राम / एमएल | 19200 | 24400 | 23,919 | 22,506 | 54 |
| 0 माइक्रोग्राम / एमएल | 39,877 | 49655 | 57,728 | 49087 | 0 |
तालिका 1: intracellular आईसी 90 रिफैम्पिसिन की के निर्धारण के लिए luciferase परख का अपरिष्कृत डेटा।
| [G1-1H] | निरसित 1 A570 | निरसित 2 A570 | निरसित 3 A570 | औसत A570 | अनुपचारित का% |
| 30 सुक्ष्ममापी | 0.056 | 0.056 | 0.055 | 0.056 | 7 |
| 10 माइक्रोन | 0.518 | 0.488 | 0.492 | 0.499 | 62 |
| 3 सुक्ष्ममापी | 0.652 | 0.638 | 0.656 | 0.649 | 80 |
| 0 माइक्रोन | 0.822 | 0.782 | 0.815 | 0.806 | 100 |
तालिका 2: Differe पर टेस्ट के cytotoxicity यौगिक G1-1H का निर्धारण के लिए MTT परख से कच्चे डाटाNT सांद्रता।
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Discussion
इस अध्ययन का लक्ष्य एम तपेदिक के लिए एक मानव intracellular संक्रमण मॉडल का उपयोग कर एक सरल और लागत प्रभावी एचटीएस विधि बनाने के लिए किया गया था। क्षय रोग एक मानव रोग एम तपेदिक से वायुकोशीय मैक्रोफेज के संक्रमण की विशेषता है। बायोसेफ्टी मुद्दों के कारण, दोनों जीवाणु और मेजबान कोशिकाओं के जैविक मॉडल को शामिल अनुसंधान अतीत में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, यह दिखाया गया है कि सरोगेट बैक्टीरिया और गैर मानव मॉडल के उपयोग के नशीली दवाओं के विकास में हिट-टू-लीड सफलता के गरीब predictors हैं, यह दर्शाता है कि दवा स्क्रीनिंग सबसे अच्छा एम तपेदिक 19, 20 से संक्रमित मानव कोशिकाओं के साथ किया जाता है, 21, 22।
इस विधि में, हम उन्नत और मानव बृहतभक्षककोशिका की तरह THP-1 सेल लाइन के लिए वर्तमान राज्य के अत्याधुनिक स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल ढाल लिया है। आदेश उच्च प्राप्त करने के लिएप्रवाह क्षमता, हम संक्रमण प्रोटोकॉल के लिए कई तकनीकी सुधार की शुरुआत की। सबसे पहले, हम CFU दृढ़ संकल्प में शामिल सभी चरणों की जगह है और उन्हें एक luciferase आधारित रिपोर्टर प्रणाली के साथ प्रतिस्थापित किया। जुगनू luciferase सरल अंत बिंदु परख, मेजबान सेल लाइसोसोम एंजाइमों द्वारा तेजी से गिरावट, और कम उपकरण कि आवश्यकताओं की वजह से चुना गया था। इस बदलाव से प्रभावी रूप से एक 30 दिन की ऊष्मायन अवधि, साथ ही चढ़ाना और कॉलोनी की गिनती चरणों के साथ जुड़े श्रम और उपभोग्य लागत सफाया कर दिया।
एक दूसरा बड़ा सुधार हम शुरू की बैच प्रोसेसिंग और संक्रमण है, जो आगे एक सरल संक्रमण प्रोटोकॉल के साथ कुओं के बीच प्रवाह और एकरूपता में सुधार होता था। एक ही चरण में भेदभाव और संक्रमण चरणों के संयोजन से, हम एक दिन से प्रोटोकॉल को छोटा करने में सक्षम थे। एक ही समय में, हम कपड़े धोने के तीन चक्र कि सामान्य रूप से भेदभाव और infectio के बीच घटित होता कम करने में सक्षम थेn, जो सेना की टुकड़ी के कारण संभव THP-1 सेल नुकसान का एक स्रोत है।
यह प्रोटोकॉल THP-1 सेल लाइन है, जो कई फायदे प्रदान अंदर स्क्रीनिंग के लिए विकसित किया गया था। THP-1, एक अमर सेल लाइन के रूप में, मज़बूती से 20 से अधिक अंश 23 के लिए इन विट्रो में सुसंस्कृत हो सकता है। इस बड़े स्क्रीनिंग अभियानों, जहां यह एक उच्च throughput सेटअप की आपूर्ति करने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं बनाए रखने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। साथ ही, THP-1 में परीक्षण के एक समरूप आनुवंशिक पृष्ठभूमि है कि परिणाम में परिवर्तनशीलता को कम करता है प्रदान करता है। यह परीक्षण यौगिकों कि मेजबान कोशिका प्रतिक्रियाओं 10 को प्रभावित करने के लिए अत्यधिक लाभकारी है। एक अतिरिक्त बोनस के रूप में, THP-1 सेल लाइन में जीन अभिव्यक्ति छोटे दखल RNAs (siRNAs) 24 से नीचे विनियमित हो सकता है। यह हिट यौगिकों की कार्रवाई की मोड में नीचे की ओर जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है। हालांकि इस पद्धति THP-1 सेल लाइन का उपयोग कर डिजाइन किया गया था यह,आसानी से, इस तरह के परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) के रूप में मानव प्राथमिक कोशिकाओं, के लिए अनुकूलित किया जा सकता जैसा कि पहले 10 दिखाया गया था।
सबसे अच्छा वायुकोशीय मैक्रोफेज और एम तपेदिक के बीच वास्तविक बातचीत की नकल करने के लिए, intracellular परख प्रोटोकॉल बैक्टीरिया opsonize करने के लिए एक कदम भी शामिल है। मानव सीरम कोट एम तपेदिक के opsonization और पूरक रिसेप्टर 3 (CR3) 25 के माध्यम से सेल प्रविष्टि की सुविधा। नग्न बैक्टीरिया अधिक लेक्टिन रिसेप्टर 8 के माध्यम से मैक्रोफेज में प्रवेश करने की संभावना है। यह देखते हुए कि ब्रोन्कोएल्वियोलर तरल पदार्थ मानव सीरम 25, opsonization, या उसके अभाव के घटकों को शामिल करने के लिए जाना जाता है, स्क्रीनिंग परिणाम पर एक मौलिक प्रभाव हो सकता है। हालांकि, कुछ आगे संक्रमण प्रक्रिया 16 सरल बनाने के लिए इस कदम को छोड़ करने के लिए चुन सकते हैं, या यह ली के आकार के कारण पर्याप्त मानव सीरम प्राप्त करने के लिए संभव नहीं हो सकता हैbrary 11 की जांच की जा रही है।
intracellular परख पहले luciferase अभिकर्मक के अलावा करने के लिए सभी तरल कुओं से स्वाधीन सामग्री से युक्त दूर करने के लिए एक कदम भी शामिल है। यह कदम संकेत करने वाली शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए है, जबकि राशि अच्छी तरह से प्रति इस्तेमाल किया अभिकर्मक को कम करने के लिए बनाया गया है। हालांकि, इस कदम के शामिल किए जाने, यौगिक होते हैं जो THP-1 को मारने के लिए गलत सकारात्मक डेटा नहीं बल्कि एम तपेदिक उत्पन्न हो सकता है के बाद से अलग और lysed THP-1 और मुक्त रूप से प्रवाहित एम तपेदिक हटा दिया जाएगा। इसलिए, निर्माता की अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए luciferase अभिकर्मक (100 μL) के बराबर मात्रा जोड़ने का सुझाव दिया प्रोटोकॉल क्रम साइटोटोक्सिक यौगिकों से युक्त कुओं में एम तपेदिक अस्तित्व के लिए परख करने में पालन किया जाना चाहिए।
जुगनू luciferase प्रणाली के विपरीत, बैक्टीरियल लक्स प्रणाली संकेत पीढ़ी 26 के लिए बाहरी अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं है। तथापि,जुगनू प्रणाली निम्नलिखित कारणों के लिए लक्स प्रणाली पर पसंद किया जाता है: सबसे पहले, बैक्टीरियल प्रणाली माइक्रोबैक्टीरिया 26 में विषाक्त हो सकता है। दूसरा, एक अधिक जटिल संवाददाता प्रणाली (लक्स बनाम 1 जुगनू के लिए जीन के लिए 5 जीन) परीक्षण यौगिकों द्वारा निषेध संकेत करने के लिए अतिसंवेदनशील है। अन्त में, जुगनू luciferase परख के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों इष्टतम संकेत पीढ़ी के लिए आवश्यक शर्तों प्रदान करते हैं। दूसरी ओर, बैक्टीरियल luciferase प्रणाली एटीपी उत्पादन और सहकारकों संकेत पीढ़ी के लिए बैक्टीरिया के अंदर मौजूद पर निर्भर करता है। ये अलग-अलग उपचार के बीच भिन्न हो और नियंत्रित करने के लिए के रूप में आसान नहीं है सकते हैं। इसलिए, जुगनू व्यवस्था करने के लिए luciferase अभिकर्मक के अलावा प्रतिक्रिया की स्थिति मानकीकरण और सभी उपचार भर में luciferase गतिविधि की अधिक विश्वसनीय माप प्रदान करता है।
CFU दृढ़ संकल्प लंबे बैक्टीरियल घनत्व मात्र निर्धारण के लिए स्वर्ण मानक हो गया है। अनुबंध में, bioluminescence, सबसे संवाददाताओं की तरह, जीवाणुओं की एक सीधा उपाय नहीं है। इसके बजाय, RLU दोनों CFU और बैक्टीरिया के चयापचय राज्य के एक समारोह है। अन्य लोग ज्यादातर रैखिक विशिष्ट परिस्थितियों के तहत 5-जीव माइक्रोबैक्टीरिया के लिए RLU और CFU के बीच संबंध का प्रदर्शन किया है। किसी भी मामले में, luciferase परख संकेत में उल्लेखनीय कमी, कोई फर्क नहीं पड़ता luciferase एंजाइम मेजबान सेल के अंदर एम तपेदिक फिटनेस की कमी गतिविधि होगा संकेत मिलता है की वास्तविक निषेध से मूल कारण-अन्य। इसलिए, इन यौगिकों एक दवा स्क्रीनिंग के दृष्टिकोण से ब्याज की हो सकता है और विधि विकास में शामिल नहीं किया जाना चाहिए।
Luciferase आधारित intracellular स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के लिए एक वैकल्पिक है स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी आधारित दृष्टिकोण 11, 27, 28, 29। luciferaseपरख उत्पादन एक luminometer से मापा जाता है, और डेटा प्राप्त, मात्रात्मक है, जबकि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों कि गुणात्मक हैं उत्पन्न करता है। हालांकि, चालाक कंप्यूटर प्रोग्रामिंग के माध्यम से, छवियों मात्रात्मक डेटा उत्पन्न करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी जो इस तरह के सेल व्यवहार्यता, सेल की गिनती, और संक्रमण की वास्तविक दर के रूप में मूल्यवान मापदंडों एकत्रित करने के लिए बहुत उपयोगी है कई fluorophores समवर्ती इस्तेमाल की अनुमति देता,। एक भविष्यवाणी कर सकते हैं, इन लाभों को कुछ झटके के साथ आते हैं। स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी उपकरण पर प्रारंभिक निवेश कई बार एक luminometer या fluorometer की लागत से अधिक है और कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए पहुंच से बाहर इसलिए है। जो लोग उपकरण का उपयोग के लिए, नमूना प्रसंस्करण छवि अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण करने से पहले विचार किया जाना चाहिए। उन दो चरणों पुस्तकालय आकार में वृद्धि के साथ समग्र समय निवेश प्रभावित करते हैं। मेजबान कोशिकाओं requir में अतिरिक्त फ्लोरोसेंट लेबल के शामिल किए जानेतों फिक्सिंग, धुंधला, और कपड़े धोने के कदम, इस प्रकार अतिरिक्त उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप और समय निवेश की जरूरत महसूस। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी डेटा संग्रह और विश्लेषण, हालांकि स्वचालित, अभी भी काफी अधिक समय और सरल luciferase परख रीडआउट से संसाधनों की आवश्यकता है। इसलिए, luciferase संवाददाता आधारित intracellular स्क्रीनिंग पद्धति सरल और उच्च throughput में सक्षम है।
luciferase आधारित intracellular स्क्रीनिंग पद्धति फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप आधारित स्क्रीनिंग तरीकों की तुलना में एक महत्वपूर्ण सीमा है। यह तथ्य यह है कि luciferase परख मेजबान मैक्रोफेज के स्वास्थ्य की स्थिति के बारे में कोई जानकारी प्रदान नहीं की वजह से है। साइटोटोक्सिक यौगिकों मैक्रोफेज की मौत का कारण होता है, और इस तरह जीवित बैक्टीरिया माध्यम में जारी किया जा सकता है और अब अंतिम luciferase परख संकेत में योगदान होगा। नतीजतन, साइटोटोक्सिक यौगिकों intracellular एम तपेदिक और इस तरह generat के मौत का कारण बन करने के लिए प्रकट होताझूठे सकारात्मक की ईए बड़ी संख्या। इस मुद्दे के समाधान के लिए, हम मेजबान मैक्रोफेज पर यौगिकों के cytotoxicity आकलन करने के लिए एक MTT परख के साथ हमारे विधि पूरित है। स्क्रीनिंग पद्धति के इस मॉड्यूल हमें ब्याज की यौगिकों के drugability के बारे में अतिरिक्त जानकारी देता है और कम-से-आदर्श दवा उम्मीदवारों के प्रारंभिक उन्मूलन अनुमति देता है।
वैकल्पिक रूप से, एक भी स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन से पहले luciferase आधारित intracellular परख का उपयोग कर सकते हैं। बड़े यौगिक पुस्तकालयों की स्क्रीन में, इस बृहतभक्षककोशिका संक्रमण मॉडल में यौगिक प्रभाव का त्वरित और कुशल मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। नतीजतन, स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी विस्तृत अध्ययन के लिए बेहतर उम्मीदवारों पर, के रूप में एक पहले से प्रकाशित एक अध्ययन 11 से सचित्र आरक्षित किया जा सकता।
कम लागत और luciferase आधारित intracellular परख के सरल स्वभाव भी बहुत शोधकर्ताओं जो छोटे परीक्षण करना चाहते हैं लाभएर रासायनिक पुस्तकालयों। कुल मिलाकर, luciferase आधारित intracellular परख सभी calibers के अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए और विभिन्न आकारों की परियोजनाओं की जांच के लिए एक अत्यंत लचीला उपकरण साबित हो गया है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
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