Summary
我们已经开发了模块化高通量筛选系统，用于发现新化合物对结核分枝杆菌 ，靶向细胞内和细胞在肉汤中生长的细菌以及细胞毒性对哺乳动物宿主细胞。
Introduction
结核分枝杆菌 ，结核病（TB）的病原体，是全世界发病率和死亡率的主要原因。药物敏感的TB是可治疗的疾病，需要一段6个月多种抗生素。尽管是一种可治疗的疾病，结核病的死亡率，估计是在2015年1 150万。在过去的10年来，一直在增加了耐药结核分枝杆菌的发病率的担忧。多药耐药TB（MDR-TB）被定义为TB即至少对异烟肼（INH）和利福平（RMP），最MDR-TB菌株也耐选择二线结核病药物，从而限制了治疗选择耐。耐药性的作用创造了治疗患者共感染人类免疫缺陷病毒（HIV），一个更大的挑战;全球40万例，到2015年，死亡1例HIV相关结核。令人失望的是，美国食品和药物ADMINIST比已批准对MDR-TB，bedaquiline只有一个新的抗结核药物，在过去40年中2。在找到更好的和更短的结核病治疗方法的进步，迫切需要以对抗结核病和耐多药结核病的斗争中保持领先地位。
传统上，TB药物屏幕在生长培养基中体外生长条件，从而被添加到生长的培养物的化合物和它们在消灭微生物效力是由固体培养基上计数菌落形成单位（CFU）测定条件下进行。作为CFU计数是劳动密集，耗时且昂贵，各种间接的方法已经被开发来缓解这个问题。这样的方法包括阿尔玛蓝活力试验3，荧光4的从绿色荧光蛋白（GFP），或从荧光素酶表达菌发光5的测定，总三磷酸腺苷的估计（ATP）6,7。
典型TB的特征是肺，其中所述细菌驻留和复制肺泡巨噬细胞8的吞噬体内部的结核分枝杆菌感染。简单的在肉汤表型屏幕可能适合胞外病原体;然而，在历史的角度看，打使用这种方法鉴定的针对结核分枝杆菌的化合物往往不能期间感染模型下游验证步骤，以达到预期。我们建议，抗结核药物在细胞内宿主细胞感染模型表现最好。然而，细胞内的机型具备高通量筛选（HTS）开发的许多技术和生物屏障。一大障碍是感染过程的复杂性，由许多步骤和由精心制作的洗涤除去在中间外细菌的举例说明。第二个主要障碍是漫长的时间再quirements，生长检测，通常由CFU上培养板计数完成，是一个过程，需要超过3周才能完成。一种解决方案，以取代CFU计数已经提供通过自动化荧光显微镜结合荧光的细菌。然而，这种解决方案需要一个初始设备投资是遥不可及的许多研究实验室。一个简单的，低成本的，与疾病相关的HTS方法将大大提高药物发现过程。
在这项研究中，我们报告一个新的，模块化的HTS系统，其目的在于提供适合于确定针对细胞内结核分枝杆菌的化合物的酶活性的快速，高度可扩展的，而经济，测定。该系统由三个模块组成：（ⅰ）细胞内，（ⅱ）细胞毒性，和（iii）中的发酵液测定法。将合并的最终结果提供化合物性质的全面描述，以作为动作的电位模式的附加信息。这SCreening系统已经结合靶向的作用模式不同的化合物库，包括药物的协同作用9的分析多个项目被使用，自噬10的刺激，和结核分枝杆菌的抑制-secreted毒力因子（未发表）。的未知作用模式化合物也已研究了11。该方法的修改版本也通过了我们的工业伙伴作为初筛方法来标识对细胞内结核分枝杆菌 11的新化合物。
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Protocol
1.细菌菌株和生长培养基
- 通过溶解25克牛血清白蛋白的10.0克右旋糖，并在460毫升去离子水4.05克的氯化钠使白蛋白右旋糖和盐储备溶液（ADS）。在4℃下过滤灭菌的ADS和存储。
- 通过添加4.7克7H9粉末和2mL甘油至900毫升的精制水使7H9肉汤。高压釜中在121℃的7H9肉汤10分钟，并允许其继续之前冷却到室温。通过加入100mL的ADS和0.5mL吐温80至900毫升7H9肉汤使7H9ADST。储存于4℃。
- 称取50毫克卡那霉素硫酸盐的和在1mL去离子水中溶解;的最终浓度为50毫克/毫升。过滤灭菌，并在-20℃下存储。添加卡那霉素每1L 7H9ADST的储备溶液的0.5毫升。
注：本媒体应新鲜，所以要根据文化尺寸适当缩放卷。 - 生长在7H 结核分枝杆菌9ADST在稳定培养补充卡那霉素。每天摇动文化和OD600达到1.0之前，避免结块稀释。
注意：用于此方法的发展中的结核分枝杆菌菌株H37Rv的被转化有质粒pJAK2.A 12。 pJAK2.A是基于所述pMV361载体，其允许从HSP60启动子的萤火虫荧光素酶基因的高水平表达，并且可以使用卡那霉素进行选择的整合质粒。
2. THP-1培养基和维护
- 添加热灭活的胎牛血清（FBS）和5毫升200mM的L-谷氨酰胺至500毫升的RPMI 1640中的50毫升，使不完全的RPMI培养基（约10％FBS和2mM谷氨酰胺）。
- 根据标准协议13保持THP-1细胞培养物。简言之，将生长THP-1细胞在RPMI培养基不完全，同时维持0.2的细胞密度至100万每毫升介质的PAS之间先贤。
3.高通量筛选细胞内使用荧光素酶表达结核分枝杆菌H37Rv
- 测量在600nm的波长在分光光度计中活跃生长的细菌悬浮液的光密度。使用每毫升0.1 OD 600 = 3×10 7细菌的换算系数计算该细菌密度。
- 吸取出足够的细菌用于感染复数10（MOI）的：1到一个新的离心管中。沉淀在3000×g离心10分钟，吸出液体。添加人血清的50μL到RPMI1640 450μL。缩放到合适的值用于实验的音量。
- 到调理细菌，重悬沉淀以每500μL1×10 8个细菌RPMI1640含有10％人血清的密度。使混合物在37℃下温育30分钟。通过用血细胞计数器和反相microsco计数确定THP-1细胞培养物密度PE。
- 沉淀在无菌离心管将细胞在100×g下和37℃下10分钟。吸出上清液并重新悬浮在RPMI细胞不完全以每毫升1个百万细胞的密度。佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）添加至40毫微克/毫升的最终浓度。
注意：这将是分化组合被称为。 - 结合调理结核分枝杆菌与THP-1分化混合物以10的MOI：1和等分以每孔100μL的最终混合物在96孔平底白色板。定期搅拌混合物，以确保均匀性。允许分化和感染在37℃下在含有5％CO 2的加湿培养箱中进行过夜。
- 用100微升的各RPMI的洗涤各孔两次。添加在不完全RPMI稀释至所需浓度的化合物孵育3天。
- 吸从孔中的培养基。添加荧光素酶测定试剂50μL的各孔中。密封用叔板ransparent粘合剂板密封剂。允许5分钟的温育在22℃，然后在1秒获得光度计读出每孔。
4.细胞毒性分析使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定14
- 分化的THP-1细胞在RPMI在干净的96孔板中不完全补充有PMA的40毫微克/毫升。维持100万每毫升的细胞密度和每等份孔100μL。允许分化为在37℃下在含有5％CO 2的加湿培养箱中进行过夜。
- 从抽吸孔中的培养基并用RPMI 1640洗涤两次他们不完全添加到孔中在RPMI中稀释的化合物。孵育3天。
- 溶解0.5克MTT在100ml磷酸盐缓冲盐水（PBS），使5 mg / mL的储备溶液。无菌过滤器，并储存在-20℃下，避光;最好是使这种解决方案新鲜。
- 2.5小时beforE中的3天孵育期结束时，加入MTT溶液25μL至每个孔，并完成潜伏期。
- 制备50％的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）通过混合250毫升DMF用250mL去离子水。
- 制备MTT提取缓冲液如下：在500毫升瓶中称取将100g SDS，并添加50％DMF的300mL的。涂抹低热量，使SDS溶解。加入10 mL的纯乙酸和12.5毫升的1M HCl。填充到500毫升标记，用50％DMF;提取缓冲液的最终组成为50％DMF，20％SDS，2.5％乙酸，和2.5％1M盐酸。
- 在治疗期结束时，加入100μL提取缓冲液（加温到45℃以溶解任何晶体）到每个孔中。使混合物在37温育过夜 在含有5％CO 2的潮湿培养箱°℃。阅读吸光度在570纳米。
注：细胞毒性测定最好在平行于一个小区内进行的使用THP-1细胞的相同的分批和年龄ular屏幕。
5.在肉汤活性分析使用刃天青试验3
- 生长在7H9ADST 结核分枝杆菌对数中期（〜0.5 - 0.8 OD 600）。稀释文化与7H9ADST 0.01 OD 600。稀释在7H9ADST化合物到每个稀释的化合物的测试浓度和分装100μL的2倍到每个孔中。
- 传送稀释的细菌悬浮液的100μL到每个孔中。将平板在37℃下在湿润的培养箱孵育5天。溶解10mg的刃天青的在100毫升的去离子水和无菌过滤器。
- 加入30μL的刃天青溶液并监测48个小时后的颜色变化;细菌的生长是通过从蓝色的颜色转换到粉红色指示。
注意：也可以通过在含有530激发590nm处测量时，要么的荧光进行定量分析 - 560纳米或在570nm的吸光度和600nm处15。
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Representative Results
使用结核分枝杆菌表达荧光素酶基因的高通量筛选的细胞内
图2A和表1包含由光度计收集的原始数据，以相对发光单位（RLU）来表示，表现出对结核分枝杆菌的TB药利福平THP-1细胞内的浓度的增加的效果。 图2A是在RLU测定各种浓度的利福平的原始发光的散点图。误差棒表示平均值（SEM）的标准误差。 图2B示出了在发光的减少百分比在处理孔相比，未处理的孔。这些数据表明，利福平能够在0.1微克/ mL的浓度减少来自胞内结核分枝杆菌的RLU> 99.9％的。这是根据与previously在0.1和0.4微克/毫升16之间出版MIC。在每个孔中所产生的发光是由结核分枝杆菌表达的萤光素酶总的指示，因此是在阱内结核分枝杆菌的代谢状态的指示器。这是正常的原始发光水平的实验之间变化。因此，原始数据的对比会产生不可靠的结论。因此，该数据应针对所定义的阴性对照，这将是仅DMSO处理的样品进行归一化。所产生的值可以被表示为在M的减少百分比的孔中（ 图2B） 结核病 。
采用MTT法细胞毒性分析
MTT法是真核细胞毒性的行之有效的检测。这个比色测定通过MTT（黄色）的至转换表示活细胞紫色甲。是不具有结核分枝杆菌感染，因为细菌能够代谢MTT，从而降低了化合物的毒性观察的进行该测定法。对于MTT测定的一个常见的建议是在570nm处17使用媒体没有pH指示剂酚红由于吸收。然而，在该方法中描述的酸化的提取缓冲液能够最小化由酚红17干扰。
图3示出引起的试验化合物经译码G1-1H浓度的增加的细胞毒性。通常情况下，采用50％的抑制浓度（IC 50），以指示细胞毒性水平。在G1-1H的情况下，10点至3μm的浓度显然在IC 50浓度的下方。
在肉汤活动分析我们荷兰国际集团的刃天青测定法
刃天青试验通常用于在真核细胞中的细胞毒性的分析，但它也可以用于监测活细菌在发酵液3。该刃天青测定法类似，MTT法基于氧化还原法。它通过刃天青为试卤灵，红色荧光的转换办法NADPH水平和NADPH脱氢酶活性。以确定药物疗效的最简单快捷的方法就是寻找最低的治疗浓度，其中井颜色仍为蓝色。 图4示出了显示由结核分枝杆菌刃天青转换效果的抗生素阿泊拉霉素的各种浓度的有一个96孔板的一部分。测定在肉汤MIC为2.5和5μg/ mL的之间。这是一个比1.5微克/毫升18的先前公布的值略高，但它仍然是良好的acceptab内乐范围。在许多情况下，颜色的变化是相当渐进的，所以很难做出自信的决定。在这些条件下，最好是使用量化或者吸光度或荧光刃天青转换的实际量。由于刃天青和试卤灵，使用吸光度MIC测定的类似的吸收特性，需要使用两个不同的波长和复杂的计算15个测量。因此，最好的方法是利用530-至560纳米的激发波长和590纳米的发射波长测量荧光，如制造商的文献15中描述。
图4示出了具有多天的温育，可以极大地改变筛选结果相关联的不一致性的潜在来源。由于37℃培养箱的加湿不当用于该实验，在p的边缘孔鲈遭受显著更多的蒸发。所有15 DMSO处理的孔都应该是相同的，但沿左和顶部边缘的孔减少了体积。这些井似乎也具有不同的颜色比在板中间的其他DMSO处理的孔。相同的不一致性也可以在2.5微克/毫升阿泊拉霉素处理的孔中观察到。在这种情况下，缩小体积也会导致用分光光度计和荧光定量读数。蒸发变成用于延长培养时间所有实验显著，所以必须注意保持良好的孵化器，加湿，以避免出现不一致的这一来源。
图1： 方法示意图。示出了用于3个独立的高通量筛选系统的模块测定示意图。 _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg”目标=‘_空白’>点击此处查看该图的放大版本。
图2：来自细胞内的代表性数据，研究在消除THP-1细胞内结核分枝杆菌利福平的实效性。 （A）的平均发光读数（以相对发光单位）的曲线图对于每个处理（利福平）浓度。误差条表示平均值的标准误差为每个一式三份。在发光所计算出的百分比减少所引起的处理利福平，其中较高值指示更大的效力的（B）曲线图。在这种情况下的90％抑制浓度（IC 90）是某处0.01和0.1微克/毫升之间。NK“>点击此处查看该图的放大版本。
图3： 从细胞毒性（MTT）测定法的代表性数据检验化合物G1-1H对分化的THP-1细胞的毒性作用。用于治疗化合物G1-1H，其中较高值指示健康的THP-1细胞的各浓度值计算出的“的控制百分数”曲线图。该IC 50在这种情况下是介于10和30微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 从刃天青测定法代表数据，研究对E安普霉素ffectiveness在抑制结核分枝杆菌 在肉汤。由于生物安全3级（BSL3）实验室设备的限制仅仅是定性的数据收集在这种情况下。图为含结核分枝杆菌与DMSO或不同量的安普霉素处理过的96孔板的一部分。在DMSO处理的孔表现出刃天青为试卤灵，通过从蓝色颜色转换为粉红色指示的转化。安普霉素处理的样品清楚地经历低于5微克/毫升的颜色转换。 请点击此处查看该图的放大版本。
| [利福平] | REP1 | REP2 | REP3 | 还原％ | |
| 4微克/毫升 | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1微克/毫升 | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0.1微克/毫升 | 1037 | 731 | 976 | 915 | 98 |
| 0.01微克/毫升 | 19200 | 24400 | 23919 | 22506 | 54 |
| 0微克/毫升 | 39877 | 49655 | 57728 | 49087 | 0 |
表1：从荧光素酶分析对 利福平的 细胞内IC 90 的确定原始数据 。
| [G1-1H] | 众议员1架A570 | 众议员2 A570 | 众议员3 A570 | 平均A570 | 未处理％ |
| 30μM | 0.056 | 0.056 | 0.055 | 0.056 | 7 |
| 10μM | 0.518 | 0.488 | 0.492 | 0.499 | 62 |
| 3μM | 0.652 | 0.638 | 0.656 | 0.649 | 80 |
| 0μM | 0.822 | 0.782 | 0.815 | 0.806 | 100 |
表2：MTT法原始数据测试的细胞毒性复合G1-1H的各色处测定NT浓度。
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Discussion
这项研究的目标是创建使用结核分枝杆菌的人的细胞内感染模型的简单和具有成本效益的方法HTS。结核病是人类疾病，其特征感染肺泡巨噬细胞的由结核分枝杆菌 。由于生物安全问题，包括细菌和宿主细胞两者的生物模型研究已经在过去使用。然而，已经表明，替代细菌和非人体模型的使用是在药物开发的命中对铅的成功不能预测，表明药物筛选最好用结核分枝杆菌感染19，20人体细胞完成的， 21，22。
在该方法中，我们已经提出，并适于对人巨噬细胞样THP-1细胞系的当前状态的最先进的筛选方案。为了实现高吞吐量，我们推出的感染协议数次技术改良。首先，我们更换参与CFU确定的所有步骤，并与基于荧光素酶报告系统取代它们。萤火虫萤光素酶被选为由于简单终点测定，由宿主细胞溶酶体酶快速降解，并且最少的设备的要求。这种替代有效地消除了30天的孵育期，以及与电镀和集落计数步骤相关的劳动力和消耗品成本。
我们引入了第二个主要的改进是批量处理和感染，这进一步改进以更简单的感染协议的孔之间的吞吐量和一致性。通过结合分化和感染步入一个步骤，我们能够通过一天缩短了协议。与此同时，我们能够减少三轮洗涤，将分化和infectio之间正常进行N，这是可能的THP-1细胞损失的源极由于脱离。
该协议是为THP-1细胞系，其赋予若干优点内部筛选开发的。 THP-1中，作为永生化细胞系，可在体外超过20次传代23可靠地进行培养。这是一个大的筛查活动，它可以是具有挑战性的保持足够的细胞提供一个高吞吐量的设置尤为重要。另外，在THP-1试验提供了一个均匀的遗传背景，在最小化的结果可变性。这是影响宿主细胞反应10测试化合物非常有益的。作为额外的奖励，在THP-1细胞系的基因表达可以是由小干扰RNA（siRNA）24下调。这为下游调查命中化合物的作用模式的重要工具。虽然这种方法是使用THP-1细胞系设计的，它可以很容易地适合于人原代细胞，如外周血单核细胞（PBMC），如先前所示10。
为了最好地模拟肺泡巨噬细胞和结核分枝杆菌间的实际相互作用，细胞内的测定方案包括步骤，以调理细菌。调理作用与人血清外套结核分枝杆菌 ，并促进通过补体受体3（CR3）25进入细胞。裸细菌更容易通过凝集素受体8进入巨噬细胞。鉴于支气管肺泡液已知含有人血清25，调理作用，或其缺少的部件，可能对筛选结果的基本影响。然而，一些可以选择跳过此步骤，以便进一步简化感染过程16，或者它可以不是由于Li的大小是获得足够的人血清可行brary正在筛选11。
胞内测定中包括一个步骤，以除去含有从孔中独立的材料中的所有液体在加入萤光素酶试剂之前。该步骤被设计以增加信噪比，同时降低每孔所用的试剂量。但是，这一步骤的包含可产生用于杀死THP-1化合物的假阳性的数据，但不结核分枝杆菌 ，因为分离并裂解THP-1和自由浮动的结核分枝杆菌将被移除。因此，制造商的建议加入萤光素酶试剂（100μL）的等量至每个孔的协议应遵循以测定在含有细胞毒性化合物的孔的结核分枝杆菌存活。
与此相反的萤火虫萤光素酶系统，所述细菌勒克斯系统不需要用于产生信号26外部的试剂。然而，萤火虫系统优于勒克斯系统由于以下原因：首先，将细菌系统可以是分枝杆菌26有毒的。第二，更复杂的报道系统（5个基因勒克斯对 1个基因萤火虫）是更容易被试验化合物的信号抑制。最后，对于萤火虫萤光素酶测定市售试剂提供最佳的信号产生的必要条件。在另一方面中，细菌萤光素酶系统依赖于ATP的产生和存在的细菌用于产生信号内的辅因子。这些可以和不同处理之间变化并不像容易控制。因此，添加荧光素酶试剂与萤火虫系统的标准化的反应条件，并提供所有处理萤光素酶活性的更可靠的测量。
CFU决心一直是量化细菌密度的金标准。在合同，bioluminescence，最喜欢的记者，是不是细菌的直接测量。相反，RLU既是CFU和细菌的代谢状态的功能。他人已经证明RLU和CFU之间，用于生物发光分枝杆菌的特定条件下5的主要线性关系。在任何情况下，显著减少在荧光素酶分析信号，无论比荧光素酶的活性，将指示减少在宿主细胞内结核分枝杆菌健身的实际抑制的根本原因，其他。因此，这些化合物将是从药物筛选的角度来看感兴趣的，并且不应当被排除在方法开发。
到基于萤光素酶的细胞内筛选方案的替代方案是自动化荧光显微镜为基础的方法11，27，28，29。荧光素酶测定输出由光度计测量，并且所获得的数据是定量的，而荧光显微镜生成是定性的图像。然而，通过巧妙计算机编程，可以对图像进行分析，以生成量化数据。此外，荧光显微镜允许多个荧光基团被同时使用，这是收集有价值的参数，如细胞活力，细胞计数和感染的实际利率非常有帮助。正如人们所预料，这些好处有一些挫折。在自动荧光显微镜设备的初始投资比光度计或荧光计的成本高出许多倍，因此是遥不可及的许多研究实验室。对于那些谁有权访问设备，样品处理必须考虑之前的图像采集和数据分析。这两个步骤影响与库规模的增大的总时间的投资。额外的荧光标记在宿主细胞requir纳入ES固定，染色，和洗涤步骤，因此需要额外的用户的干预和时间投资。此外，荧光显微镜数据收集和分析，虽然自动化，仍需要比简单的荧光素酶试验读数显著更多的时间和资源。因此，基于荧光素酶记者细胞内筛选方法比较简单，能够提供更高的吞吐量。
相比荧光基于显微镜的筛选方法的基于萤光素酶的细胞内筛选方法具有一个显著限制。这是由于萤光素酶测定提供有关主机巨噬细胞的健康状况没有数据的事实。细胞毒性化合物会导致巨噬细胞的死亡，因此活细菌可被释放到培养基中，并将不再对最终萤光素酶测定信号。其结果是，细胞毒性化合物似乎引起细胞内结核分枝杆菌 ，因此发电机密封的死亡EA大量的误报。为了解决这个问题，我们已经补充我们的方法与MTT法评估主机巨噬细胞的化合物的细胞毒性。筛选方法的这种模块为我们提供了目标化合物的成药性的附加信息，并允许早日消除低于理想的候选药物。
可替代地，还可以使用基于萤光素酶的细胞内测定执行自动荧光显微镜之前。在大化合物库的屏幕，这允许化合物的效力在巨噬细胞感染模型的快速和高效的评估。其结果是，自动荧光显微镜可以保留详细的研究更好的人选，由先前公布的研究11所示。
成本和简单的性质基于萤光素酶的细胞内检测的低也大大有利于谁希望测试小研究者呃化学库。总体而言，基于萤光素酶的细胞内检测已被证明是对所有口径的研究实验室和筛选各种大小的项目一个非常灵活的工具。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
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