Summary
Nós desenvolvemos um sistema de rastreio de alto rendimento modular para descobrir novos compostos contra o Mycobacterium tuberculosis, direccionamento intracelular e em caldo de crescimento de bactérias, bem como a citotoxicidade contra a célula hospedeira de mamífero.
Introduction
Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose (TB), é uma das principais causas de morbilidade e mortalidade em todo o mundo. TB sensível a drogas é uma doença tratável que requer múltiplos antibióticos durante um período de 6 meses. Apesar de ser uma doença tratável da taxa de mortalidade foi estimada em 1,5 milhões em 2015 um. Nos últimos 10 anos, tem vindo a aumentar as preocupações com a prevalência de fármaco-resistentes de M. tuberculosis. Multirresistente tuberculose (TB-MR) é definida como a tuberculose que é resistente a pelo menos isoniazida (INH) e Rifampicina (RMP), e a maioria das estirpes de MDR-TB são também resistentes para seleccionar fármacos para a tuberculose de segunda linha, o que limita as opções de tratamento . Os efeitos da resistência à droga criar um maior desafio para o tratamento de pacientes co-infectados com o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV); 400.000 doentes em todo o mundo morreu de tuberculose associada ao HIV em 2015 um. Lamentavelmente, os Estados Unidos Food and Drug Administração aprovou apenas uma nova droga TB contra a MDR-TB, bedaquilina, nos últimos 40 anos 2. Avanços em encontrar melhores e mais curtas terapias de tuberculose são urgentemente necessários, a fim de permanecer à frente na luta contra a TB e MDR-TB.
Tradicionalmente, as telas de drogas de TB são realizadas sob condições de crescimento in vitro em meio de crescimento, através do qual os compostos são adicionados a uma cultura em crescimento e a sua eficácia na erradicação dos microrganismos são determinadas pela contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) em meio sólido. Como contagens de UFC é trabalho intensivo, demorado, e caro, vários métodos indiretos foram desenvolvidos para aliviar este problema. Tais métodos incluem o ensaio de viabilidade Alamar Blue 3, a determinação da fluorescência a partir de 4 proteína verde fluorescente (GFP) ou luminescência 5 a partir de bactérias que expressam luciferase, e a estimativa do trifosfato de adenosina total de (ATP) 6, 7.
TB típica é caracterizada por uma infecção de M. tuberculosis do pulmão, onde residem as bactérias e replicar no interior das fagossomas de macrófagos alveolares 8. A tela fenotípica simples no caldo pode atender patógenos extracelulares; no entanto, na perspectiva histórica, bateu compostos contra M. tuberculosis identificados usando este método muitas vezes não conseguem corresponder às expectativas durante as etapas de validação de transformação em modelos de infecção. Propomos que a droga TB é melhor executada em um modelo de infecção da célula hospedeira intracelular. No entanto, os modelos intracelulares possuem muitos obstáculos tecnológicos e biológicos para triagem (HTS) desenvolvimento de alto rendimento. Um grande obstáculo é a complexidade do processo de infecção, exemplificado por numerosos passos e a remoção de bactérias extracelulares elaborada por no meio de lavagem. Um segundo grande obstáculo é o longo tempo de requirements, como a detecção de crescimento, normalmente feito por contagem de CFU nas placas de cultura, é um processo que demora mais de 3 semanas para completar. Uma solução para substituir contagens de UFC foi fornecida por microscopia fluorescente automatizada em combinação com bactérias fluorescentes. No entanto, esta solução requer um investimento inicial equipamento que está fora do alcance de muitos laboratórios de pesquisa. Uma simples, de baixo custo, e método HTS doença relevante aumentaria grandemente o processo de descoberta de drogas.
Neste estudo, são descritos um novo sistema de HTS, modular que visa proporcionar uma rápida e altamente flexível, mas económica, ensaio adequado para a determinação da actividade de compostos contra intracelular de M. tuberculosis. Este sistema é composto por três módulos: (i) intracelular, (ii) da citotoxicidade, e (iii) Ensaios in-caldo. O resultado final combinada fornece uma descrição detalhada das propriedades do composto, com a informação adicional quanto ao modo de potencial de acção. este screening sistema tem sido utilizado em vários projectos com várias bibliotecas de compostos, o modo de acção que têm como alvo, incluindo a análise de sinergia droga 9, a estimulação de autofagia 10, e a inibição de M. tuberculosis -secreted factor de virulcia (não publicado). Os compostos de modo desconhecido de ação também foram estudados 11. Uma versão modificada deste método foi também adoptada pelo nosso parceiro industrial como o método de rastreio primário de identificar novos compostos contra intracelular de M. tuberculosis 11.
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Protocol
1. Estirpe bacteriana e Meio de Crescimento
- Adicione de dextrose e albumina de solução de estoque de sal (ADS) por solubilização de 25 g de albumina de soro bovino, 10,0 g de dextrose, e 4,05 g de cloreto de sódio em 460 mL de água desionizada. Filtro-esterilizar a ADS e armazenar a 4 ° C.
- Adicione 7H9 pela adição de 4,7 g de 7H9 em pó e 2 ml de glicerol a 900 mL de água purificada. Autoclave o 7H9 a 121 ° C durante 10 min e permita que arrefeça para a temperatura ambiente antes de continuar. Adicione 7H9ADST por adição de 100 mL de ADS e 0,5 ml de Tween 80 a 900 mL de caldo 7H9. Armazenar a 4 ° C.
- Pesar 50 mg de sulfato de canamicina e dissolver em 1 ml de água desionizada; a concentração final é de 50 mg / mL. Filtro-esterilizar e armazenar a -20 ° C. Adicionar 0,5 mL de canamicina solução estoque por 1 L de 7H9ADST.
NOTA: Este meio deve ser feita, de modo dimensionar os volumes apropriadamente de acordo com o tamanho da cultura. - Crescer M. tuberculosis em 7H9ADST suplementado com canamicina em pé cultura. Agite a cultura diariamente e dilui-lo antes da DO600 atinge 1,0 para evitar aglomeração.
NOTA: A estirpe de M. tuberculosis utilizado para o desenvolvimento deste método foi H37Rv transformada com o plasmídeo pJAK2.A 12. pJAK2.A é um plasmídeo integrativo baseado no vector pMV361, que permite a expressão de alto nível do gene luciferase de pirilampo do promotor hsp60 e pode ser seleccionado utilizando canamicina.
2. THP-1 e Meio de Manutenção
- Adicionar 50 mL de soro inactivado por calor de bovino fetal (FBS) e 5 mL de 200 mM de L-glutamina e 500 mL de meio RPMI 1640 para fazer meio RPMI incompleta (cerca de 10% de FBS e glutamina 2 mM).
- Manter uma cultura de células THP-1 de acordo com o protocolo padrão 13. Resumidamente, crescer as células THP-1 em meio RPMI incompleta mantendo ao mesmo tempo uma densidade celular de 0,2 a 1 milhão por ml de meio entre passábios.
3. Apresentação de intracelular de alto rendimento usando-expressar luciferase M. tuberculosis H37Rv
- Medir a densidade óptica de uma suspensão de bactérias em crescimento activo num espectrofotómetro a um comprimento de onda de 600 nm. Calcular a densidade bacteriana utilizando o factor de conversão de 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 de bactérias por ml.
- Pipetar as bactérias suficientes para uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10: 1 para um novo tubo de centrífuga. Sedimentar a 3000 xg durante 10 min e aspirar o líquido. Adicionar 50 ul de soro humano a 450 uL de RPMI 1640. Dimensionar o volume de se apropriar valores para a experiência.
- Para opsonizar as bactérias, ressuspender o sedimento a uma densidade de 1 x 10 8 de bactérias por 500 ul de RPMI1640 contendo 10% de soro humano. Deixar a mistura a incubar a 37 ° C durante 30 min. Determinar a densidade da cultura de células THP-1 por contagem com um hemocitómetro e um microsco invertidoPE.
- Sedimentar as células em tubos de centrífuga estéreis, a 100 x g e 37 ° C durante 10 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meio RPMI incompleta a uma densidade de 1 milh de culas por mL. Adicionar forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) para uma concentração final de 40 ng / mL.
NOTA: Este será referido como o mix diferenciação. - Combinar opsonizado de M. tuberculosis com THP-1 mistura de diferenciação, a uma MOI de 10: 1 e alíquotas da mistura final em 100 ul por cavidade em uma placa branca de 96 pos de fundo plano. Regularmente agita-se a mistura para assegurar a uniformidade. Permitir que a diferenciação e a infecção prosseguir durante a noite a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2.
- Lavam-se os poços duas vezes com 100 uL de meio RPMI cada. Adicionar compostos diluídos para as concentrações desejadas em RPMI incompleta e incubar durante 3 dias.
- Aspirar o meio das cavidades. Adicionar 50 uL de reagente de ensaio de luciferase para cada cavidade. Selar as placas com transparent selantes de placas adesivas. Permitir 5 min de incubação a 22 ° C e, em seguida, obter uma leitura num luminómetro em 1 s por poço.
4. Análise de Citotoxicidade Usando um grupo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) 14
- Diferenciar células THP-1 em meio RPMI incompleto suplementado com 40 ng / ml de PMA, em placas de 96 poços claras. Manter uma densidade celular de 1 milhão por ml e alíquota de 100 uL por poço. Permitir diferenciação prosseguir durante a noite a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2.
- Aspirar o meio dos poços e lava-se duas vezes com RPMI 1640. Adicionar compostos diluídos em RPMI incompletos para os poços. Incuba-se durante 3 dias.
- Dissolve-se 0,5 g de MTT em 100 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para produzir uma solução stock de 5 mg / mL. Filtrar em condições estéreis e armazenar a -20 ° C, ao abrigo da luz; é melhor fazer esta solução fresca.
- 2,5 horas antes da suae o fim do período de incubação de 3 dias, adicionar 25 ul de solução de MTT a cada poço e completar o período de incubação.
- Prepare a 50% de N, N-dimetil formamida (DMF) por mistura de 250 mL de DMF com 250 mL de água desionizada.
- Preparar tampão de extracção de MTT como se segue: Pesar 100 g de SDS em um frasco de 500 ml e adicionam-se 300 mL de 50% de DMF. Aplicar fogo baixo para permitir que o SDS para dissolver. Adicionam-se 10 mL de ácido acético puro e 12,5 mL de HCl 1M. Encha até à marca de 500 mL com 50% de DMF; a composição final do tampão de extracção é de 50% de DMF, 20% de SDS, ácido acético a 2,5%, e 2,5% de ácido clorídrico 1 M.
- No final do período de tratamento, adiciona-se 100 uL de tampão de extracção (aquecida a 45 ° C para dissolver todos os cristais) para cada poço. Deixar a mistura a incubar durante a noite a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2. Leia a absorvância a 570 nm.
NOTA: O ensaio de citotoxicidade é melhor realizado em paralelo com um intracelulartela ular usando mesmo lote e idade das células THP-1.
5. No caldo Análise Atividade Usando um resazurina Ensaio 3
- Crescer M. tuberculosis em 7H9ADST à fase mid-log (~ 0,5-0,8 OD 600). Dilui-se a cultura com a 7H9ADST a 0,01 OD600. Dilui-se os compostos em 7H9ADST 2x as concentrações de teste e alíquota de 100 ul de cada composto diluída para cada poço.
- Transferir 100 ul da suspensão bacteriana diluída para cada poço. Permitir que as placas a incubar a 37 ° C num incubador humidif içado, durante 5 dias. Dissolve-se 10 mg de resazurina em 100 ml de água desionizada e o filtro esterilizado.
- Adicionar 30 mL de solução de resazurina e controlar a mudança de cor após 48 h; o crescimento bacteriano é indicado por uma conversão de cor de azul para rosa.
NOTA: A análise quantitativa também pode ser realizada medindo quer a fluorescência a 590 nm com excitação a 530-560nm ou a absorvência a 570 nm e 600 nm de 15.
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Representative Results
Rastreio intracelular de alto rendimento usando M. tuberculosis expressando o gene da luciferase
A Figura 2A e na Tabela 1 contém os dados brutos recolhidos pelo luminómetro, expressa em unidades luminescentes relativas (RLU), mostrando o efeito de uma concentração crescente da droga rifampicina em M. tuberculosis TB no interior das células THP-1. A Figura 2A é um gráfico de dispersão da matéria-luminescência medida em RLU para várias concentrações de rifampicina. As barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM). A Figura 2B mostra a redução percentual na luminescência em pos tratados em comparação com os poços não tratados. Os dados mostram que a rifampicina é capaz de reduzir> 99,9% de RLU de intracelular de M. tuberculosis, a uma concentração de 0,1 ug / mL. Isto está de acordo com o previously publicada MIC entre 0,1 e 0,4 ug / mL de 16. Luminescência produzida em cada poço é uma indicação da luciferase total expresso por M. tuberculosis e, portanto, é um indicador do estado metabólico de M. tuberculosis, no interior do poço. É normal para níveis luminescentes matérias a variar entre experiências. Como tal, a comparação dos dados brutos geraria conclusões confiáveis. Assim, os dados devem ser normalizado contra um controlo negativo definido, que seriam as amostras tratadas apenas com DMSO. Os valores resultantes podem ser expressos como a percentagem de redução de M. tuberculosis nos poços (Figura 2B).
análise de citotoxicidade utilizando o ensaio de MTT
O ensaio com MTT é um ensaio bem estabelecido para a citotoxicidade eucariótica. Este ensaio colorimétrico indica células vivas através da conversão de MTT (amarelo) deformazano de cor roxa. Este ensaio é realizado sem uma infecção por M. tuberculosis porque as bactérias são capazes de metabolizar o MTT, o que reduz a toxicidade observada dos compostos. Uma sugestão comum para o ensaio com MTT é a utilização de meios de comunicação sem o indicador de pH vermelho de fenol, devido à absorção a 570 nm 17. No entanto, o tampão de extracção acidificada descrito no presente método é capaz de minimizar a interferência causada pelo vermelho de fenol 17.
A Figura 3 ilustra a citotoxicidade causada por uma concentração crescente de um composto de teste codificada G1-1H. Normalmente, uma concentração inibidora em 50% (IC50) é empregue para indicar o nível de citotoxicidade. No caso de G1-1H, concentrações de 10 uM e 3 | iM são claramente abaixo da concentração IC50.
Em caldo análise da atividade nosção do ensaio resazurina
O ensaio de resazurina é comumente utilizado para a análise de citotoxicidade em células eucarióticas, mas também pode ser utilizado para monitorizar a bactérias vivas em caldo de 3. O ensaio de resazurina é um ensaio à base de redox semelhante ao ensaio MTT. Ele mede os níveis de actividade de desidrogenase de NADPH e NADPH através da conversão de resazurina em resorufina, um fluoróforo vermelho. A maneira mais fácil e mais rápido para determinar a eficácia do fármaco é olhar para a concentração mais baixa de tratamento onde os poços permanecer azul em cor. A Figura 4 mostra parte de uma placa de 96 poços que mostra os efeitos de várias concentrações dos antibióticos têm apramicina em resazurina conversão por M. tuberculosis. A MIC no caldo foi determinado para ser entre 2,5 e 5 ug / mL. Este valor é ligeiramente superior ao valor previamente publicada de 1,5 ug / mL de 18, mas ainda está bem dentro da acceptabgama le. Em muitos casos, a mudança de cor é bastante gradual, por isso é difícil fazer uma determinação confiante. Sob estas condições, é melhor para quantificar a quantidade real de resazurina conversão usando absorvância ou de fluorescência. Devido às características de absorvância semelhantes de resazurina e resorufina, a determinação de MIC utilizando absorvância requer medições usando dois comprimentos de onda diferentes e complexos cálculos 15. Por conseguinte, o melhor método é a de medir a fluorescência utilizando a 530- 560 nm de comprimentos de onda de excitação e um comprimento de onda de emissão de 590 nm, como descrito na literatura do fabricante 15.
A Figura 4 ilustra uma potencial fonte de inconsistência associada com incubações multiday que podem alterar drasticamente resultados do rastreio. Devido a humidificação imprópria da incubadora a 37 ° C utilizada para esta experiência, os poços nas bordas do p lates sofreu significativamente mais evaporação. Todos os 15 poços tratados com DMSO são supostos ser idênticos, mas as cavidades ao longo das bordas esquerda e de topo tinha reduzido volume. Estas cavidades também parecem ter cores diferentes do que os outros poços tratados com DMSO no meio da placa. O mesmo inconsistência também pode ser observada em 2,5 ug / ml de poços tratados com apramicina. Neste caso, o volume reduzido levaria também a uma leitura quantitativa por um espectrofotômetro e fluorímetro. A evaporação torna-se significativo para todas as experiências com tempos de incubação prolongados, de modo que deve ser tomado cuidado para manter incubadoras bem humedecida para evitar esta fonte de inconsistência.
Figura 1: Esquema Método. Diagrama que descreve esquemas de ensaio durante 3 módulos separados do sistema de rastreio de alto rendimento. _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg" target = '_ blank'> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os dados representativos a partir de uma intracelular para examinar a eficácia de rifampicina em M. tuberculosis Eliminando dentro THP-1 As células. (A) Representação gráfica da luminescência médio lendo (em unidades de luminescência relativa) para cada tratamento (rifampicina) concentração. As barras de erro indicam o erro padrão da média para cada triplicado. (B) O gráfico da redução percentual calculado em luminescência provocada por um tratamento de rifampicina, em que valores mais elevados indicam uma maior eficácia. A concentração inibidora de 90% (IC 90), neste caso, situa-se entre 0,01 e 0,1 ug / mL.nk "> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os dados representativos a partir de um ensaio de citotoxicidade (MTT) para examinar os efeitos tóxicos do composto no G1-1H Diferenciadas As células THP-1. Gráfico da "percentagem de controlo" valores calculados para cada concentração do composto de tratamento G1-1H, onde os valores mais elevados indicam células saudáveis THP-1. O IC 50 neste caso se situa entre 10 e 30? M. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Os dados representativos a partir de uma Resazurina Ensaio para examinar o EFICÁCIA de AMP na inibição da M. tuberculosis em caldo. Somente os dados recolhidos qualitativa é nesse caso devido a limitações do equipamento do 3 (BSL3) laboratório nível de segurança biológica. A fotografia mostra parte de uma placa de 96 poços contendo M. tuberculosis tratados com DMSO ou de quantidades variáveis de apramicina. Os poços tratados com DMSO exibiu uma conversão de resazurina a resorufina, como indicado pela conversão de cor de azul para rosa. As amostras tratadas com apramicina foram submetidos claramente a conversão de cor abaixo de 5 ug / mL. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| [Rifampicina] | REP1 | rep2 | REP3 | % Redução | |
| 4 ug / mL | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1 ug / mL | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0,1? G / mL | 1037 | 731 | 976 | 915 | 98 |
| 0,01? G / mL | 19200 | 24400 | 23919 | 22506 | 54 |
| 0 ug / mL | 39877 | 49655 | 57.728 | 49087 | 0 |
Tabela 1: Os dados em bruto a partir do ensaio de luciferase para a determinação do IC90 intracelular de rifampicina.
| [G1-1H] | Rep 1 A570 | Rep 2 A570 | Rep 3 A570 | A570 média | % De não tratada |
| 30 uM | 0,056 | 0,056 | 0,055 | 0,056 | 7 |
| 10 uM | 0,518 | 0,488 | 0,492 | 0,499 | 62 |
| 3 uM | 0,652 | 0,638 | 0,656 | 0,649 | 80 |
| 0 uM | 0,822 | 0,782 | 0,815 | 0,806 | 100 |
Tabela 2: dados brutos do Ensaio MTT para a Determinação da Citotoxicidade do Composto de Teste em G1-1H DiffereConcentrações nt.
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Discussion
O objetivo deste estudo foi o de criar um método HTS simples e de baixo custo utilizando um modelo de infecção intracelular humano para o M. tuberculosis. A tuberculose é uma doença humana caracterizado pela infecção de macrófagos alveolares por M. tuberculosis. Devido a questões de biossegurança, pesquisa envolvendo modelos biológicos, tanto da bactéria e as células hospedeiras tem sido usado no passado. No entanto, foi demonstrado que o uso de bactérias substitutos e modelos não-humanos são pobres preditores de sucesso hit-to-lead no desenvolvimento de medicamentos, indicando que a seleção da droga é o melhor feito com células humanas infectadas com o M. tuberculosis 19, 20, 21, 22.
Neste método, temos avançado e adaptados actuais estado-da-arte protocolos de rastreio para a linha celular de macrófagos como THP-1 humana. Para atingir altarendimento, introduzimos várias melhorias técnicas ao protocolo de infecção. Em primeiro lugar e acima de tudo, que substituiu todos os passos envolvidos na determinação de CFU e substituído-los com um sistema repórter baseados em luciferase. Firefly luciferase foi escolhida devido ao simples ensaio de ponto final, a rápida degradação por enzimas de lisossoma da célula hospedeira, e os requisitos de equipamento mínimo. Esta substituição eficazmente eliminado um período de incubação de 30 dias, bem como os custos do trabalho e consumíveis associados com passos de plaqueamento e contagem de colónias.
Uma segunda grande melhoria introduzimos foi processamento em lote e a infecção, o que melhora ainda mais o rendimento e a coerência entre as cavidades com um protocolo de infecção mais simples. Através da combinação dos passos de diferenciação e de infecção em um único passo, nós fomos capazes de encurtar o protocolo por um dia. Ao mesmo tempo, que foram capazes de reduzir os três ciclos de lavagem que, normalmente, ocorrem entre a diferenciação e infection, que é uma fonte de possível perda de células THP-1, devido ao descolamento.
Este protocolo foi desenvolvido para o rastreio de dentro da linha de células THP-1, o que confere várias vantagens. THP-1, como uma linha celular imortalizada, pode ser fiavelmente cultivadas in vitro durante mais de 20 passagens 23. Isto é especialmente importante para grandes campanhas de triagem, onde ele pode ser um desafio para manter as células suficientes para fornecer uma configuração de alto rendimento. Adicionalmente, testes em células THP-1 proporciona um fundo genético homogénea que minimiza a variabilidade nos resultados. Isto é altamente benéfico para testar compostos que influenciam as respostas de 10 células hospedeiras. Como uma vantagem adicional, a expressão do gene na linha celular THP-1 pode ser sub-regulada por pequenos ARN interferentes (ARNsi) 24. Isso fornece uma ferramenta valiosa para as investigações a jusante para o modo de ação dos compostos de sucesso. Embora este método foi concebido utilizando a linha celular THP-1, lapode ser facilmente adaptado para células primárias humanas, tais como as células mononucleares do sangue periférico (PBMC), como foi anteriormente mostrado 10.
Para melhor imitar a interacção efectiva entre os macrófagos alveolares e M. tuberculosis, o protocolo de ensaio intracelular inclui um passo para opsonizar as bactérias. Opsonização com revestimentos de soro humano M. tuberculosis e facilita a entrada na célula através do receptor de complemento 3 (CR3) 25. Bactérias nus são mais susceptíveis de entrar macrófagos através do receptor de lectina 8. Dado que o fluido broncoalveolar é conhecido por conter componentes de soro humano 25, opsonização, ou a falta dela, podem ter um impacto fundamental sobre o resultado de rastreio. No entanto, alguns podem optar por ignorar esta etapa, a fim de simplificar ainda mais o processo de infecção de 16, ou pode não ser factível obter soro humano suficiente devido ao tamanho da library sendo selecionados 11.
O ensaio intracelular inclui um passo para remover todo o líquido que contém o material solto a partir dos poços antes da adição do reagente luciferase. Este passo destina-se a aumentar a relação sinal-para-ruído ao mesmo tempo reduzir a quantidade de reagente utilizado por poço. No entanto, a inclusão deste passo pode gerar dados falsos-positivos para compostos que matam as células THP-1, mas não M. tuberculosis, uma vez que independente e lisaram-se células THP-1 e livre flutuante-M. tuberculosis seria removido. Portanto, o protocolo sugerido pelo fabricante da adição de quantidades iguais de reagente de luciferase (100 ul) para cada poço deve ser seguida, a fim de ensaiar a sobrevivência M. tuberculosis em pos contendo compostos citotóxicos.
Em contraste com o sistema de luciferase do pirilampo, o sistema lux bacteriana não requer reagentes externos para a geração do sinal 26. Contudo,o sistema do vaga-lume é preferido sobre o sistema lux, pelas seguintes razões: Primeiro, o sistema bacteriano pode ser tóxico em micobactérias 26. Em segundo lugar, um sistema repórter mais complexo (5 genes para lux contra um gene para pirilampo) é mais susceptível de sinalizar a inibição pelos compostos de teste. Por último, os reagentes disponíveis comercialmente para o ensaio de luciferase de pirilampo fornecem as condições necessárias para a geração de sinal óptima. Por outro lado, o sistema de luciferase bacteriano baseia-se na produção de ATP e os co-factores presentes no interior das bactérias para a geração de sinal. Estes podem variar entre diferentes tratamentos e não são tão fáceis de controlar. Por conseguinte, a adição do reagente de luciferase de pirilampo para o sistema uniformiza as condições de reacção e fornece medições mais fiáveis de actividade de luciferase em todos os tratamentos.
determinação de CFU tem ser longo o padrão de ouro para a quantificação da densidade bacteriana. No contrato, Bioluminescence, como a maioria dos repórteres, não é uma medida direta da bactéria. Em vez disso, RLU é uma função de ambos CFU e o estado metabólico das bactérias. Outros demonstraram a relação linear entre principalmente RLU e CFU por micobactérias bioluminescentes sob condições específicas 5. Em qualquer caso, uma redução significativa do sinal de ensaio de luciferase, não importa a causa subjacente-excepto a inibição efectiva da enzima luciferase atividade-indicaria uma redução da aptidão de M. tuberculosis no interior da célula hospedeira. Portanto, estes compostos seriam de interesse a partir de um ponto de vista de rastreio de drogas e não deve ser excluída no desenvolvimento de métodos.
Uma alternativa ao protocolo de rastreio intracelular com base em luciferase é a abordagem automatizada fluorescente 11, 27, 28, 29, com base em microscopia. a luciferasesaída de ensaio é medido por um luminómetro, e os dados obtidos é quantitativa, ao passo que a microscopia fluorescente gera imagens que são qualitativa. No entanto, através de programação de computador inteligente, as imagens podem ser analisadas para gerar dados quantitativos. Além disso, microscopia fluorescente permite que vários fluoróforos para ser usado simultaneamente, o que é muito útil para a recolha de parâmetros valiosos, tais como a viabilidade celular, contagens de células, e taxa real de infecção. Como se poderia prever, esses benefícios vêm com alguns contratempos. O investimento inicial em equipamentos de microscopia de fluorescência automatizado é muitas vezes maior do que o custo de um luminómetro ou fluorímetro e, portanto, fora do alcance para muitos laboratórios de pesquisa. Para aqueles que têm acesso ao equipamento, o processamento da amostra devem ser considerados antes da aquisição de imagem e análise de dados. Esses dois passos afetar o investimento global tempo com aumentos no tamanho da biblioteca. A inclusão de marcas fluorescentes adicionais em células hospedeiras requires passos de fixação, coloração, lavagem e, necessitando, assim, investimentos intervenção do utilizador e tempo adicionais. Além disso, a coleta de dados de microscopia fluorescente e análise, apesar de automatizada, ainda requer significativamente mais tempo e recursos do que a simples leitura do ensaio luciferase. Portanto, o método de rastreio baseado intracelular repter da luciferase é mais simples e capaz de um maior rendimento.
O método de rastreio intracelular com base em luciferase tem uma limitação significativa em comparação com métodos de rastreio baseados em microscópio de fluorescência. Isto é devido ao fato de que o ensaio de luciferase não fornece dados sobre o estado de saúde dos macrófagos do hospedeiro. compostos citotóxicos causaria a morte de macrófagos, e bactérias, assim, ao vivo pode ser libertado para o meio e que não contribuem para o sinal final de ensaio de luciferase. Como resultado, os compostos citotóxicos parecem causar a morte intracelular de M. tuberculosis e, assim, generatea grande número de falsos positivos. Para abordar esta questão, temos complementado nosso método com um ensaio MTT para avaliar a citotoxicidade de compostos nos macrófagos do hospedeiro. Este módulo do método de triagem nos dá informações adicionais sobre o drugability de compostos de interesse e permite a eliminação precoce de candidatos menos-que-ideal de drogas.
Alternativamente, pode-se também utilizar o ensaio intracelular com base em luciferase antes de efectuar microscopia fluorescente automatizada. Nas telas de bibliotecas de compostos grandes, isto permite a avaliação rápida e eficiente de eficácia composto no modelo de infecção de macrófagos. Como resultado, a microscopia de fluorescência automatizado pode ser reservado para estudos detalhados sobre melhores candidatos, como ilustrado por um estudo publicado anteriormente 11.
O baixo custo e simples natureza do ensaio intracelular com base em luciferase também beneficia muito os pesquisadores que desejam testar pequenaer bibliotecas químicas. No geral, o ensaio intracelular com base em luciferase tem provado ser uma ferramenta extremamente flexível para laboratórios de todos os calibres de pesquisa e para o rastreio projetos de vários tamanhos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
- WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
- USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
- Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
- Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
- Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
- Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
- Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
- ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
- Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
- Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
- Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
- Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
- Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
- Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
- Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
- Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
- Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
- Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
- Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).
