Summary
Abbiamo sviluppato un sistema di screening ad alto rendimento modulare per scoprire nuovi composti contro Mycobacterium tuberculosis, il targeting intracellulare e in brodo coltura di batteri e citotossicità contro la cellula ospite di mammifero.
Introduction
Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi (TB), è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. TB Drug-sensibile è una malattia curabile che richiede più antibiotici per un periodo di 6 mesi. Pur essendo una malattia curabile, la mortalità TB è stato stimato a 1,5 milioni nel 2015 1. Negli ultimi 10 anni, ci sono stati crescenti preoccupazioni sulla prevalenza della farmaco-resistente M. tuberculosis. Multiresistente TB (MDR-TB) è definita come TBC che è resistente ad almeno isoniazide (INH) e rifampicina (RMP), e la maggior parte dei ceppi MDR-TB sono anche resistenti per selezionare farmaci di seconda linea TB, limitando così le opzioni di trattamento . Gli effetti della resistenza ai farmaci creano una sfida maggiore per il trattamento di pazienti co-infettati con il virus dell'immunodeficienza umana (HIV); 400.000 pazienti in tutto il mondo sono morte di tubercolosi associata ad HIV nel 2015 1. Purtroppo, gli Stati Uniti Food and Drug Administrazione ha approvato un solo nuovo farmaco contro la TB MDR-TB, bedaquiline, negli ultimi 40 anni 2. I progressi nella ricerca di una migliore e più brevi terapie TB sono urgentemente necessarie al fine di rimanere in testa nella lotta contro la tubercolosi e la MDR-TB.
Tradizionalmente, TB droga schermi vengono eseguite in vitro in condizioni di crescita in terreno di coltura, per cui i composti vengono aggiunti ad una coltura in crescita e la loro efficacia nel sradicare i microrganismi sono determinati dal conteggio delle unità formanti colonie (CFU) su terreno solido. Come conta CFU sono alta intensità di lavoro, che richiede tempo, e costoso, vari metodi indiretti sono stati sviluppati per alleviare questo problema. Tali metodi includono la vitalità dosaggio Alamar Blue 3, la determinazione della fluorescenza 4 dalla proteina verde fluorescente (GFP) o luminescenza 5 dai batteri luciferasi che esprimono, e la stima di adenosina trifosfato totale (ATP) 6, 7.
TB tipica è caratterizzata da un'infezione da M. tuberculosis del polmone, in cui i batteri risiedono e replicano all'interno dei fagosomi di macrofagi alveolari 8. Lo schermo semplice in brodo fenotipica può soddisfare patogeni extracellulari; tuttavia, in prospettiva storica, ha colpito composti contro M. tuberculosis individuati con questo metodo spesso non riescono a essere all'altezza delle aspettative durante le fasi di validazione a valle in modelli di infezione. Proponiamo che la tubercolosi farmaco è meglio eseguita in un modello di infezione cellula ospite intracellulare. Tuttavia, i modelli intracellulari possiedono molte barriere tecnologiche e biologiche di screening (HTS) sviluppo ad alta produttività. Un grande ostacolo è la complessità del processo di infezione, esemplificato da numerosi passaggi e la rimozione elaborato di batteri extracellulari da in-tra lavaggio. Un secondo ostacolo principale è il tempo lungo rigenze, il rilevamento crescita, normalmente svolto da CFU contando su piastre di coltura, è un processo che richiede più di 3 settimane per completare. Una soluzione per sostituire una conta è stata fornita mediante microscopia a fluorescenza automatizzata in combinazione con i batteri fluorescenti. Tuttavia, questa soluzione richiede un investimento iniziale che apparecchiatura è fuori portata per molti laboratori di ricerca. Un semplice, a basso costo, e il metodo HTS malattie rilevanti sarebbero migliorare notevolmente il processo di scoperta di nuovi farmaci.
In questo studio, riportiamo un nuovo sistema modulare HTS che mira a fornire un rapido e altamente scalabile, ma economica, saggio atto a determinare l'attività dei composti contro M. tuberculosis intracellulare. Questo sistema è composto da tre moduli: (i) intracellulari, (ii) citotossicità, e (iii) Prove in brodo. Il risultato finale combinato fornisce una descrizione completa delle proprietà dei componenti, con ulteriori informazioni riguardanti la modalità potenziale di azione. Questo scSistema reening è stato utilizzato in diversi progetti con varie librerie di composti modalità di azione che colpiscono, compresa l'analisi di sinergia farmaco 9, la stimolazione dell'autofagia 10, e l'inibizione di M. tuberculosis -secreted fattore di virulenza (non pubblicata). I composti di modalità sconosciuta di azione sono stati studiati 11. Una versione modificata di questo metodo è stato adottato anche dal nostro partner industriale come il metodo di screening primario di identificare nuovi composti contro intracellulare M. tuberculosis 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ceppo batterico e crescita medio
- Rendere albumina destrosio e soluzione salina magazzino (ADS) solubilizzando 25 g di albumina di siero bovino, 10,0 g di destrosio, e 4,05 g di cloruro di sodio in 460 ml di acqua deionizzata. Filtro-sterilizzare ADS e conservare a 4 ° C.
- Rendere 7H9 brodo aggiungendo 4,7 g di polvere 7H9 e 2 mL di glicerolo a 900 ml di acqua purificata. Autoclavare il brodo 7H9 a 121 ° C per 10 minuti e lasciare raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere. Fare 7H9ADST aggiungendo 100 ml di ADS e 0,5 ml di Tween80 a 900 ml di brodo 7H9. Conservare a 4 ° C.
- Pesare 50 mg di kanamicina solfato e sciogliere in 1 ml di acqua deionizzata; la concentrazione finale è di 50 mg / mL. Filtro-sterilizzare e conservare a -20 ° C. Aggiungere 0,5 ml di kanamicina soluzione madre per 1 L di 7H9ADST.
NOTA: Questo terreno deve essere fatta fresca, così scalare i volumi modo appropriato secondo la dimensione cultura. - Crescere M. tuberculosis in 7H9ADST integrato con kanamicina nella cultura in piedi. Agitare la cultura quotidiana e diluirlo prima che la raggiunga OD600 1,0 per evitare grumi.
NOTA: Il ceppo M. tuberculosis utilizzato per lo sviluppo di questo metodo è stato trasformato con H37Rv pJAK2.A plasmide 12. pJAK2.A è un plasmide integrativo basato sul vettore pMV361, che permette l'espressione ad alto livello del gene luciferasi di lucciola dal promotore HSP60 e può essere selezionata tramite kanamicina.
2. THP-1 Medium e manutenzione
- Aggiungere 50 ml di siero inattivato al calore fetale bovino (FBS) e 5 ml di 200 mM di L-glutammina a 500 ml di RPMI 1640 per fare mezzo RPMI incompleta (circa il 10% FBS e 2 mM glutammina).
- Mantenere una coltura cellulare THP-1 secondo protocollo standard 13. Brevemente, crescere cellule THP-1 in mezzo RPMI incompleta mantenendo una densità cellulare da 0,2 a 1 milione per mL di terreno tra passaggi.
3. Screening intracellulare high-throughput Utilizzando luciferasi che esprimono M. tuberculosis H37Rv
- Misurare la densità ottica di una sospensione batterica attiva crescita in uno spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 600 nm. Calcolare la densità batterica utilizzando il fattore di conversione di 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 batteri per mL.
- Pipettare i batteri sufficienti per una molteplicità di infezione (MOI) di 10: 1 in una nuova provetta da centrifuga. Pellet a 3.000 xg per 10 minuti e aspirare il liquido. Aggiungere 50 ml di siero umano a 450 ml di RPMI1640. Scala il volume di appropriarsi dei valori per l'esperimento.
- Per opsonize i batteri, risospendere il pellet ad una densità di 1 x 10 8 batteri per 500 ml di RPMI1640 contenente 10% di siero umano. Lasciare la miscela a incubare a 37 ° C per 30 min. Determinare la THP-1 cellule densità coltura contando con un emocitometro e un microsco invertitape.
- Agglomerare le cellule in provette da centrifuga sterili a 100 xg e 37 ° C per 10 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in RPMI incompleta ad una densità di 1 milione di cellule per ml. Aggiungere forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) per un 40 ng ml di concentrazione / finale.
NOTA: Questo sarà indicato come il mix di differenziazione. - Combinare opsonizzati M. tuberculosis con THP-1 mix differenziazione ad una MOI di 10: 1 e aliquota della miscela finale a 100 microlitri per pozzetto in una piastra bianca 96 pozzetti a fondo piatto. Regolarmente agitare la miscela per assicurare uniformità. Permettono la differenziazione e l'infezione di procedere notte a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2.
- Lavare i pozzetti due volte con 100 ml di RPMI ciascuno. Aggiungere composti diluiti alle concentrazioni desiderate in RPMI incompleta ed incubare per 3 giorni.
- Aspirare il terreno dai pozzi. Aggiungere 50 ml di reagente saggio luciferasi in ciascun pozzetto. Sigillare le piastre con transparent sigillanti piastra adesivi. Consentire 5 min di incubazione a 22 ° C e quindi ottenere una lettura in un luminometro a 1 s per pozzetto.
4. Analisi citotossicità usando un 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) 14
- Differenziare le cellule THP-1 in RPMI incompleta completato con 40 ng / ml di PMA in chiaro piastre da 96 pozzetti. Mantenere una densità cellulare di 1 milione per mL e un'aliquota di 100 microlitri per pozzetto. Lasciare differenziazione di procedere notte a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2.
- Aspirare il terreno dai pozzetti e lavarli due volte con RPMI 1640. Aggiungere composti diluite in RPMI incompleti ai pozzetti. Incubare per 3 giorni.
- Sciogliere 0.5 g di MTT in 100 mL di tampone fosfato salino (PBS) per ottenere una soluzione stock di 5 mg / mL. filtro sterile e conservare a -20 ° C, al riparo dalla luce; è meglio per rendere questa soluzione fresca.
- 2.5 h before la fine del periodo di incubazione di 3 giorni, aggiungere 25 ml di soluzione di MTT ad ogni pozzetto e completare il periodo di incubazione.
- Preparare 50% N, N-dimetil formammide (DMF) miscelando 250 ml di DMF con 250 mL di acqua deionizzata.
- Preparare tampone di estrazione MTT come segue: Pesare 100 g di SDS in una bottiglia da 500 ml e aggiungere 300 ml di DMF al 50%. Applicare a fuoco basso per permettere al SDS sciogliere. Aggiungere 10 ml di acido acetico puro e 12,5 ml di 1 M HCl. Riempire fino al segno da 500 ml con il 50% DMF; la composizione finale del tampone di estrazione è del 50% DMF, 20% SDS, 2,5% di acido acetico e 2,5% 1 M di acido cloridrico.
- Al termine del periodo di trattamento, aggiungere 100 ml di tampone di estrazione (riscaldato a 45 ° C per sciogliere i cristalli) a ciascun pozzetto. Lasciare la miscela a incubare durante la notte a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2. Leggere l'assorbanza a 570 nm.
NOTA: Il test di citotossicità migliore viene eseguita in parallelo con un'intracellularischermo lare con persone dello stesso lotto e l'età di cellule THP-1.
5. In brodo di attività di analisi Utilizzando un resazurina Assay 3
- Crescere M. tuberculosis in 7H9ADST alla fase di mid-log (~ 0,5-0,8 OD 600). Diluire la cultura con la 7H9ADST a 0,01 OD 600. Diluire i composti in 7H9ADST a 2x le concentrazioni di prova e un'aliquota di 100 microlitri di ciascun composto diluito in ciascun pozzetto.
- Trasferire 100 microlitri della sospensione batterica diluita in ciascun pozzetto. Lasciare le piastre di incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato per 5 giorni. Sciogliere 10 mg di resazurina in 100 mL di acqua deionizzata e filtro sterile.
- Aggiungere 30 ml di soluzione di resazurina e monitorare il cambiamento di colore dopo 48 ore; la crescita batterica è indicato da una conversione di colore dal blu al rosa.
NOTA: Un'analisi quantitativa può essere eseguita misurando sia la fluorescenza a 590 nm con eccitazione a 530 - 560nm o l'assorbanza a 570 nm e 600 nm 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
High-Throughput Screening intracellulare con M. tuberculosis che esprime il gene della luciferasi
Figura 2A e 1 contengono i dati grezzi raccolti dal luminometro, espressi in unità luminescenti relativa (RLU), che mostra l'effetto di un aumento di concentrazione di TB rifampicina farmaco su M. tuberculosis all'interno cellule THP-1. La figura 2A è un diagramma a dispersione della luminescenza grezzo misurata in RLU per varie concentrazioni di rifampicina. Le barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM). La Figura 2B mostra la riduzione percentuale di luminescenza in pozzetti trattati rispetto ai pozzetti non trattate. I dati dimostrano che la rifampicina è capace di ridurre> 99,9% di RLU da M. tuberculosis intracellulare ad una concentrazione di 0,1 mg / mL. Questo è in accordo con il precedente ay pubblicato MIC tra 0,1 e 0,4 ug / ml 16. Luminescenza prodotta in ciascun pozzetto è un'indicazione del totale luciferasi espressa da M. tuberculosis e quindi è un indicatore dello stato metabolico di M. tuberculosis all'interno del pozzo. È normale livelli luminescenti prime per variare tra esperimenti. In quanto tale, un confronto tra i dati grezzi genererebbe conclusioni inaffidabili. Pertanto, i dati devono essere normalizzati contro un controllo negativo definito, che sarebbero i campioni trattati con solo DMSO. I valori ottenuti possono essere espressi come riduzione percentuale in M. tuberculosis nei pozzetti (Figura 2B).
Analisi citotossicità usando il saggio MTT
Il saggio MTT è un saggio ben consolidata per la citotossicità eucarioti. Questo saggio colorimetrico indica cellule vive attraverso la conversione di MTT (giallo) performazano color porpora. Questo test viene eseguito senza infezione da M. tuberculosis perché i batteri sono in grado di metabolizzare MTT, che riduce la tossicità osservata dei composti. Un suggerimento comune per il saggio MTT è utilizzare supporti senza l'indicatore di pH rosso fenolo per assorbimento a 570 nm 17. Tuttavia, il tampone di estrazione acidificato descritto in questo metodo è in grado di minimizzare le interferenze causate da rosso fenolo 17.
La Figura 3 illustra la citotossicità causata da una crescente concentrazione di un composto di prova G1-1H codificata. Normalmente, una concentrazione di inibizione del 50% (IC 50) viene impiegato per indicare il livello di citotossicità. Nel caso di G1-1H, concentrazioni di 10 uM e 3 pM sono chiaramente sotto della IC50 concentrazione.
In brodo attività analisi ciing saggio resazurina
Il saggio resazurin è comunemente usato per l'analisi di citotossicità in cellule eucariotiche, ma può anche essere utilizzato per monitorare batteri vivi in brodo 3. Il saggio è un saggio resazurina redox-based simile al dosaggio MTT. Misura livelli NADPH e deidrogenasi NADPH attraverso la conversione di resazurina in resorufina, un fluoroforo rosso. Il modo più semplice e veloce per determinare l'efficacia della droga è quello di cercare la concentrazione trattamento più basso in cui i pozzi rimangono di colore blu. La figura 4 mostra parte di una piastra a 96 pozzetti che mostra gli effetti varie concentrazioni dei apramicina antibiotici hanno sulla resazurina conversione da M. tuberculosis. La MIC in brodo è stato determinato per essere tra 2,5 e 5 mg / mL. Questo è leggermente superiore al valore precedentemente pubblicata di 1,5 pg / ml 18, ma è ancora ben all'interno della acceptabLe gamma. In molti casi, il cambiamento di colore è piuttosto graduale, per cui è difficile fare una determinazione fiducioso. In queste condizioni, è meglio quantificare la quantità effettiva di resazurina conversione utilizzando assorbanza o fluorescenza. A causa delle caratteristiche di assorbanza simili di resazurin e resorufina, determinazione MIC utilizzando assorbanza richiede misurazioni utilizzando due diverse lunghezze d'onda e calcoli complessi 15. Pertanto, il metodo migliore è quello di misurare la fluorescenza usando da 530 a 560 nm lunghezza d'onda di eccitazione e di una lunghezza d'onda di emissione 590 nm, come descritto nella letteratura del produttore 15.
La figura 4 illustra una potenziale fonte di incoerenza associato incubazioni più giorni che potrebbero alterare drasticamente risultati dello screening. A causa di umidificazione improprio del incubatore a 37 ° utilizzato per questo esperimento, pozzi sui bordi del p tardive sofferto significativamente più evaporazione. Tutti 15 pozzetti DMSO-trattati dovrebbero essere identici, ma i pozzi lungo i bordi di sinistra e superiore avevano ridotto volumi. Questi pozzi sembrano avere colori diversi rispetto agli altri pozzetti DMSO-trattati al centro della piastra. La stessa incoerenza può anche essere osservata in 2,5 ug / mL pozzetti Apramicina trattati. In questo caso, il volume ridotto potrebbe anche portare ad una lettura quantitativa da uno spettrofotometro e fluorimetro. Evaporazione diventa significativa per tutti gli esperimenti con tempi di incubazione prolungati, quindi bisogna fare attenzione a mantenere ben incubatori umidificati-evitare questa fonte di incoerenza.
Figura 1: Metodo Schemi. Diagramma raffigurante schemi di dosaggio per 3 moduli particolari del sistema di screening ad alto rendimento. _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentante dati da un intracellulare di esaminare l'efficacia di rifampicina nell'eliminazione M. tuberculosis all'interno cellule THP-1. (A) Grafico della luminescenza medio lettura (in unità di luminescenza relativa) per ciascun trattamento (rifampicina) concentrazione. Le barre di errore indicano l'errore standard della media per ogni triplicato. (B) Grafico della riduzione percentuale calcolata in luminescenza causato da un trattamento del rifampicina, in cui i valori più elevati indicano una maggiore efficacia. La concentrazione inibitoria del 90% (IC 90) in questo caso è da qualche parte tra 0,01 e 0,1 mg / mL.nk "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dati rappresentativi da un saggio di citotossicità (MTT) per esaminare gli effetti tossici di Compound G1-1H su differenziate cellule THP-1. Grafico della "percentuale di controllo" valori calcolati per ciascuna concentrazione del composto G1-1H trattamento, dove valori maggiori indicano sani cellule THP-1. L'IC 50 in questo caso è da qualche parte tra 10 e 30 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: dati rappresentativi da un resazurina Assay per esaminare la Effectiveness di Apramicina nell'inibizione M. tuberculosis in brodo. Solo dati qualitativi raccolti in questo caso a causa di limitazioni di apparecchiature in 3 (BSL3) laboratorio livello di biosicurezza. La foto mostra parte di una piastra a 96 pozzetti contenenti M. tuberculosis trattati sia con DMSO o quantità variabili di apramicina. I pozzetti DMSO-trattati hanno mostrato una conversione del resazurina a resorufina, come indicato dalla conversione di colore dal blu al rosa. I campioni Apramicina trattata chiaramente sottoposti la conversione del colore sottostante 5 ug / mL. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| [Rifampicina] | Rep1 | rep2 | rep3 | Riduzione% | |
| 4 mg / ml | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1 mg / ml | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0,1 mg / ml | 1037 | 731 | 976 | 915 | 98 |
| 0,01 ug / mL | 19200 | 24400 | 23919 | 22506 | 54 |
| 0 mg / ml | 39877 | 49655 | 57728 | 49087 | 0 |
Tabella 1: dati grezzi dal saggio luciferasi per la determinazione del intracellulare IC 90 di rifampicina.
| [G1-1H] | Rep 1 A570 | Rep 2 A570 | Rep 3 A570 | A570 media | % Di greggia |
| 30 micron | 0,056 | 0,056 | 0,055 | 0,056 | 7 |
| 10 micron | 0,518 | 0,488 | 0,492 | 0,499 | 62 |
| 3 micron | 0,652 | 0,638 | 0,656 | 0,649 | 80 |
| 0 micron | 0,822 | 0.782 | 0,815 | 0,806 | 100 |
Tabella 2: dati grezzi dal MTT Assay per la determinazione della citotossicità della prova Compound G1-1H a different concentrazioni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'obiettivo di questo studio era quello di creare un metodo semplice e conveniente HTS utilizzando un modello di infezione intracellulare umana per M. tuberculosis. La tubercolosi è una malattia umana caratterizzata da infezione di macrofagi alveolari di M. tuberculosis. A causa di problemi di biosicurezza, ricerca che coinvolgono modelli biologici sia del batterio e le cellule ospiti è stata utilizzata in passato. Tuttavia, è stato dimostrato che l'uso di batteri surrogate e modelli non umani sono predittori poveri del successo hit-to-lead nello sviluppo di farmaci, indicando che lo screening di stupefacenti è fatto meglio con le cellule umane infettate con M. tuberculosis 19, 20, 21, 22.
In questo metodo, abbiamo avanzato e adattato protocolli di screening attuale stato dell'arte per la THP-1 linea cellulare macrofagica-like umano. Al fine di raggiungere alterendimento, abbiamo introdotto diversi miglioramenti tecnici al protocollo infezione. Innanzitutto, abbiamo sostituito tutte le fasi coinvolte nella determinazione CFU e sostituito con un sistema reporter luciferasi-based. Luciferasi di lucciola è stato scelto per il semplice dosaggio punto finale, la rapida degradazione da parte di enzimi lisosomiali cellula ospite, e dei requisiti minimi attrezzature. Questa sostituzione eliminato efficacemente un periodo di incubazione di 30 giorni, nonché i costi di manodopera e di consumo associati placcatura e la colonia di conteggio passi.
Un secondo importante miglioramento abbiamo introdotto era elaborazione batch e infezione, che migliora ulteriormente la velocità e la coerenza tra i pozzetti con un protocollo più semplice infezione. Combinando i punti di differenziazione e di infezione in un unico passaggio, siamo stati in grado di accorciare il protocollo di un giorno. Allo stesso tempo, siamo riusciti a ridurre i tre cicli di lavaggio che normalmente verificarsi tra differenziazione e infection, che è una fonte di possibile perdita di cellule THP-1 dovuta al distacco.
Questo protocollo è stato sviluppato per lo screening all'interno della linea di cellule THP-1, che conferisce diversi vantaggi. THP-1, come una linea cellulare immortalizzata, può essere attendibilmente coltivate in vitro per oltre 20 passaggi 23. Ciò è particolarmente importante per le grandi campagne di screening, in cui può essere difficile da mantenere abbastanza cellule per la fornitura di una configurazione high-throughput. Inoltre, test in THP-1 fornisce un background genetico omogenea che minimizza la variabilità nei risultati. Questo è estremamente utile per i composti di prova che influenzano le risposte della cellula ospite 10. Come ulteriore vantaggio, l'espressione genica nella linea cellulare THP-1 può essere down-regolato da piccoli RNA interferenti (siRNA) 24. Questo fornisce uno strumento prezioso per le indagini a valle nel modo di azione dei composti di successo. Anche se questo metodo creata usando THP-1 linea cellulare, essapuò essere facilmente adattato per le cellule primarie umane, come le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), come precedentemente illustrato 10.
Per simulare meglio l'interazione effettiva tra macrofagi alveolari e M. tuberculosis, il protocollo di dosaggio intracellulare comprende una fase di opsonize batteri. Opsonizzazione con cappotti siero umano M. tuberculosis e facilita l'ingresso delle cellule via recettore del complemento 3 (CR3) 25. Batteri nudo hanno maggiori probabilità di entrare macrofagi attraverso il recettore lectina 8. Dato che il fluido broncoalveolare è noto per contenere componenti di siero umano 25, opsonizzazione, o la sua mancanza, può avere un impatto fondamentale sul risultato di screening. Tuttavia, alcuni possono scegliere di saltare questo passaggio, al fine di semplificare ulteriormente il processo di infezione 16, oppure potrebbe non essere possibile ottenere abbastanza siero umano a causa delle dimensioni del library subendo il blocco 11.
Il saggio intracellulare comprende un passaggio per rimuovere tutto il liquido contenente il materiale staccato dai pozzi prima dell'aggiunta del reagente luciferasi. Questo passo è progettato per aumentare il rapporto segnale-rumore riducendo la quantità di reagente usato per pozzetto. Tuttavia, l'inclusione di questa fase può generare dati falsi-positivi per composti che uccidono THP-1 ma non M. tuberculosis, poiché staccati e lisate THP-1 e fluttuante M. tuberculosis verranno eliminate. Pertanto, il protocollo suggerito dal produttore di aggiungere la stessa quantità di luciferasi reagente (100 mL) a ciascun pozzetto deve essere seguita per saggiare per M. tuberculosis sopravvivenza in pozzetti contenenti composti citotossici.
In contrasto con il sistema di luciferasi di lucciola, il sistema lux batterica non richiede reagenti esterni per la generazione del segnale 26. Però,il sistema di lucciola è preferito rispetto al sistema lux per i seguenti motivi: In primo luogo, il sistema batterico può essere tossico nei micobatteri 26. In secondo luogo, un sistema reporter più complesso (5 geni lux contro 1 gene per lucciola) è più suscettibile di segnalare inibizione da composti in esame. Infine, reagenti disponibili in commercio per il saggio luciferasi di lucciola forniscono le condizioni necessarie per la generazione del segnale ottimale. D'altra parte, il sistema di luciferasi batterica si basa sulla produzione di ATP e cofattori presenti all'interno dei batteri alla generazione del segnale. Questi possono variare tra diversi trattamenti e non sono facili da controllare. Pertanto, l'aggiunta del reagente luciferasi di lucciola sistema standardizza le condizioni di reazione e fornisce misurazioni più affidabili di attività della luciferasi in tutti i trattamenti.
determinazione CFU ha lungo il gold standard per la quantificazione densità batterica. Nel contratto, bioluminescence, come la maggior parte dei giornalisti, non è una misura diretta di batteri. Invece, RLU è funzione sia CFU e lo stato metabolico dei batteri. Altri hanno dimostrato la relazione tra lo più lineare RLU e CFU per micobatteri bioluminescenti in condizioni specifiche 5. In ogni caso, una significativa riduzione nel segnale test luciferasi, indipendentemente sottostante causa-diverso l'inibizione effettiva di enzima luciferasi per attività indicherebbe una riduzione della tubercolosi idoneità M. all'interno della cellula ospite. Pertanto, questi composti sarebbero interessanti dal punto di vista screening di farmaci e non dovrebbe essere escluso sviluppo del metodo.
Un'alternativa al protocollo di screening intracellulare luciferasi-based è fluorescente automatizzato microscopia approccio basato 11, 27, 28, 29. la luciferasiuscita saggio viene misurata mediante un luminometro, ei dati ottenuti è quantitativa, mentre microscopia a fluorescenza genera immagini che sono qualitativa. Tuttavia, tramite programmazione di computer intelligente, le immagini possono essere esaminati per generare dati quantitativi. Inoltre, la microscopia a fluorescenza consente più fluorofori per essere utilizzati contemporaneamente, che è molto utile per la raccolta di parametri importanti quali la vitalità cellulare, conta delle cellule, e il tasso effettivo di infezione. Come ci si potrebbe prevedere, questi benefici sono dotati di alcune battute d'arresto. L'investimento iniziale in attrezzature microscopia a fluorescenza automatizzato è molte volte superiore al costo di un luminometro o fluorimetro ed è quindi fuori dalla portata di molti laboratori di ricerca. Per coloro che hanno accesso alle apparecchiature, il trattamento del campione deve essere considerato prima dell'acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati. Queste due fasi riguardano l'investimento di tempo nel complesso, con aumenti delle dimensioni della libreria. L'inclusione di etichette fluorescenti supplementari in cellule ospiti, necessitanties passi fissaggio, colorazione e lavaggio, che richiedono quindi investimenti intervento da parte dell'utente e tempi aggiuntivi. Inoltre, la raccolta di dati fluorescente microscopia ed analisi, anche se automatizzato, richiede ancora molto più tempo e risorse rispetto alla semplice lettura saggio di luciferasi. Pertanto, il metodo intracellulare di screening basato luciferasi è più semplice e in grado di maggiore produttività.
Il metodo di screening intracellulare luciferasi basata avere una limitazione significativa rispetto ai metodi di screening microscopio basati fluorescenti. Questo è dovuto al fatto che il saggio luciferasi non fornisce i dati per quanto riguarda lo stato di salute dei macrofagi ospitanti. composti citotossici causerebbe la morte dei macrofagi, e quindi batteri vivi possono essere rilasciati nel mezzo e sarebbe più contribuire al segnale finale dosaggio luciferasi. Come risultato, i composti citotossici sembrerebbero causare la morte di M. tuberculosis intracellulare e quindi generazioea gran numero di falsi positivi. Per risolvere questo problema, abbiamo completato il nostro metodo con un metodo MTT per valutare la citotossicità dei composti sui macrofagi ospitanti. Questo modulo del metodo di screening ci fornisce ulteriori informazioni sulla drugability di composti di interesse e consente l'eliminazione precoce di meno-che-ideale farmaci candidati.
In alternativa, si può utilizzare anche il saggio luciferasi intracellulare basata prima di effettuare microscopia a fluorescenza automatizzato. In schermi di grandi librerie di composti, questo permette per la valutazione rapida ed efficace di efficacia composto nel modello di infezione dei macrofagi. Di conseguenza, microscopia a fluorescenza automatizzato può essere riservato per studi dettagliati sui candidati migliori, come illustrato da uno studio pubblicato in precedenza 11.
Il basso costo e la natura semplice del saggio intracellulare luciferasi a base beneficia anche notevolmente i ricercatori che desiderano testare piccolier librerie chimiche. Nel complesso, il saggio di luciferasi intracellulare a base ha dimostrato di essere uno strumento estremamente flessibile per i laboratori di ricerca di tutti i calibri e per lo screening di progetti di varie dimensioni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
- WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
- USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
- Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
- Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
- Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
- Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
- Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
- ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
- Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
- Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
- Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
- Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
- Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
- Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
- Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
- Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
- Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
- Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
- Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).
