Summary
We hebben een modulair high-throughput screening ontwikkeld voor het ontdekken van nieuwe verbindingen tegen Mycobacterium tuberculosis, intracellulaire targeting en-bouillon kweken bacteriën en cytotoxiciteit tegen de zoogdiergastheercel.
Introduction
Mycobacterium tuberculosis, de verwekker van tuberculose (TB), is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Geneesmiddel- gevoelige TB is een behandelbare ziekte die meerdere antibiotica gedurende 6 maanden vereist. Ondanks dat het een behandelbare ziekte, werd TB sterfte geschat op 1,5 miljoen in 2015 1. In de afgelopen 10 jaar zijn er zijn toenemende bezorgdheid over de prevalentie van resistente M. tuberculosis. Multiresistente tuberculose (MDR-TB) wordt gedefinieerd als tuberculose die resistent is tegen ten minste isoniazide (INH) en rifampicine (RMP), en de meeste MDR-TB-stammen zijn ook bestand tegen tweedelijns tbc selecteren, dus beperkt behandelingsmogelijkheden . De effecten van geneesmiddelresistentie maken een grotere uitdaging voor de behandeling van patiënten die geïnfecteerd zijn met humaan immunodeficiëntievirus (HIV); 400.000 patiënten wereldwijd overleden aan HIV-geassocieerde TB in 2015 1. Teleurstellend, de Amerikaanse Food and Drug Administrantsoen heeft goedgekeurd slechts één nieuwe TB-geneesmiddelen tegen MDR-TB, Bedaquiline, in de afgelopen 40 jaar 2. Vooruitgang in het vinden van betere en kortere TB therapieën zijn dringend nodig om voorop te blijven in de strijd tegen tbc en MDR-TB.
Traditioneel worden TB drug screens uitgevoerd onder in vitro kweekomstandigheden in groeimedium, waarbij verbindingen worden toegevoegd aan een groeiende kweek en hun doeltreffendheid bij het uitroeien van de micro-organismen wordt bepaald door het tellen van kolonievormende eenheden (CFU) op vast medium. Zoals CFU tellingen zijn arbeidsintensief, tijdrovend en kostbaar zijn verschillende indirecte methoden ontwikkeld om dit probleem te verlichten. Dergelijke werkwijzen omvatten de Alamar Blue assay levensvatbaarheid 3, de bepaling van fluorescentie 4 van groen fluorescent eiwit (GFP) of luminescentie 5 van luciferase-expressie bacteriën, en de schatting van de totale adenosine trifosfaat (ATP) 6, 7.
Typische TB wordt gekenmerkt door een M. tuberculosis-infectie van de longen, waar de bacteriën bevinden en repliceren in de phagosomes van alveolaire macrofagen 8. De eenvoudige bouillon fenotypische scherm kan extracellulaire pathogenen te passen; Echter, in het historisch perspectief, sloeg verbindingen tegen M. tuberculosis geïdentificeerd met behulp van deze methode vaak niet om te voldoen aan de verwachtingen tijdens downstream validatie stappen in modellen van infectie. Wij stellen voor dat TB drug wordt het best uitgevoerd in een intracellulaire gastheercel infectie model. Toch intracellulaire modellen beschikken over een groot aantal technologische en biologische barrières voor high-throughput screening (HTS) ontwikkeling. Een grote hindernis is de complexiteit van het infectieproces, geïllustreerd door tal van stappen en de uitgebreide verwijdering van extracellulaire bacteriën door middel van in-tussen wassen. Een tweede belangrijke horde is de lange tijd aan het opnieuwquirements, de groei detectie Gewoonlijk wordt hierbij CFU rekenen op kweekplaten, is een proces dat meer dan 3 weken in beslag neemt. Een oplossing voor CFU tellingen vervangen is door geautomatiseerde fluorescentie microscopie in combinatie met fluorescerende bacteriën. Echter, deze oplossing vereist een initiële investering in apparatuur die buiten het bereik van vele onderzoekslaboratoria. Een eenvoudige, goedkope en ziekte-relevante HTS methode zou sterk verbeteren het geneesmiddel ontdekkingsproces.
In deze studie rapporteren we een nieuwe, modulaire HTS systeem dat is gericht op een snelle en zeer schaalbaar, zuinige, assay voor de bepaling van de activiteit van verbindingen tegen intracellulaire M. tuberculosis. Dit systeem bestaat uit drie modules: (i) intracellulair, (ii) cytotoxiciteit en (iii) in bouillon assays. De gecombineerde eindresultaat geeft een uitgebreide beschrijving van de verbinding eigenschappen, aanvullende informatie over de mogelijke werkingsmechanismen. dit screening systeem is gebruikt in verscheidene projecten verschillende samengestelde bibliotheken die werkingsmechanisme targeten, waaronder de analyse van geneesmiddel synergie 9, de stimulering van autofagie 10, en de remming van M. tuberculosis -secreted virulentiefactor (ongepubliceerd). Verbindingen van onbekende werkingsmechanisme hebben ook onderzocht 11. Een aangepaste versie van deze methode werd ook door onze industriële partner aangenomen als de primaire screening methode om nieuwe verbindingen te identificeren tegen intracellulaire M. tuberculosis 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bacteriestam en groeimedium
- Voeg albumine dextrose en zout voorraadoplossing (ADS) door het oplossen van 25 g runderserumalbumine, 10,0 g dextrose en 4,05 g natriumchloride in 460 ml gedeioniseerd water. Filter-steriliseer de ADS en bewaar bij 4 ° C.
- Voeg 7H9 bouillon door toevoeging van 4,7 g 7H9 poeder en 2 ml glycerol en 900 ml gezuiverd water. Autoclaaf de 7H9 bouillon bij 121 ° C gedurende 10 minuten en laat het afkoelen tot kamertemperatuur alvorens. Maak 7H9ADST door toevoeging van 100 ml van ADS en 0,5 ml Tween80 tot 900 ml van 7H9 bouillon. Bewaren bij 4 ° C.
- Weeg 50 mg kanamycine sulfaat en los op in 1 ml gedeïoniseerd water; de uiteindelijke concentratie 50 mg / ml. Filter-steriliseer en bewaar bij -20 ° C. Voeg 0,5 ml kanamycine voorraadoplossing per 1 liter 7H9ADST.
Let op: dit medium moet vers worden gemaakt, zodat de schaal van de volumes op de juiste wijze in overeenstemming met de cultuur grootte. - Groeien M. tuberculosis in 7H9ADST aangevuld met kanamycine in staande cultuur. Schud de cultuur dagelijks en verdunnen voordat de OD600 bereikt 1,0 tot klonteren te voorkomen.
LET OP: Het M. tuberculosis stam die is gebruikt voor de ontwikkeling van deze methode werd H37Rv getransformeerd met pJAK2.A plasmide 12. pJAK2.A is een integratief plasmide gebaseerd op de pMV361 vector, die een hoog-niveau expressie van de vuurvlieg luciferasegen van de hsp60 promotor mogelijk maakt en kan worden geselecteerd met kanamycine.
2. THP-1 Medium en onderhoud
- Voeg 50 ml met warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 5 ml 200 mM L-glutamine en 500 ml RPMI 1640 met RPMI maken onvolledig medium (circa 10% FBS en 2 mM glutamine).
- Onderhouden van een THP-1 celkweken volgens standaardprotocol 13. In het kort, groei THP-1-cellen in RPMI medium onvolledige terwijl een celdichtheid van 0,2-1.000.000 per ml medium tussen paswijzen.
3. High-throughput Intracellulaire Screening Met behulp van Luciferase uiten M. tuberculosis H37Rv
- Meet de extinctie van een actief groeiende bacteriesuspensie in een spectrofotometer bij een golflengte van 600 nm. Bereken de bacteriedichtheid met de conversiefactor van 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 bacteriën per ml.
- Pipet niet voldoende bacteriën een multipliciteit van infectie (MOI) van 10: 1 in een nieuwe centrifugebuis. Pellet bij 3000 xg gedurende 10 min en zuig de vloeistof. Voeg 50 ul humaan serum tot 450 gl RPMI1640. Schaal het volume op waarden die geschikt zijn voor het experiment.
- De bacteriën opsoniseren, resuspendeer de pellet in een dichtheid van 1 x 10 8 bacteriën per 500 pl RPMI 1640 dat 10% humaan serum. Laat het mengsel incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Bepaal de THP-1 celkweken dichtheid door tellen met een hemocytometer en een omgekeerde Micrpe.
- Pellet de cellen in steriele centrifugebuizen bij 100 xg en 37 ° C gedurende 10 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in RPMI incomplete bij een dichtheid van 1 miljoen cellen per ml. Add forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA) tot 40 ng / ml eindconcentratie.
OPMERKING: Dit zal de differentiatie mix worden aangeduid. - Combineer geopsoniseerd M. tuberculosis met THP-1 differentiatie mengsel bij een MOI van 10: 1 en het laatste aliquot mix in 100 ul per putje in een 96 putjes vlakke bodem witte plaat. Regelmatig roer het mengsel tot uniformiteit. Laat de differentiatie en infectie overnacht bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Was de putjes tweemaal met 100 pl RPMI elk. verbindingen verdund tot de gewenste concentraties in RPMI onvolledige toe en incubeer gedurende 3 dagen.
- Zuig het medium van de putten. Voeg 50 pl luciferase testreagens aan elk putje. Dicht de platen met transparent kleefplaat sealers. Toestaan 5 min incubatie bij 22 ° C en vervolgens een uitlezing in een luminometer verkrijgen 1 s per putje.
4. Cytotoxiciteit analyse met behulp van een 3- (4,5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay 14
- Differentiëren THP-1-cellen in RPMI onvolledige aangevuld met 40 ng / ml PMA in heldere platen met 96 putjes. Handhaaf een celdichtheid van 1.000.000 per ml monster en 100 ul per putje. Toestaan differentiatie overnacht bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Zuig het medium van de putten en was ze tweemaal met RPMI 1640. verbindingen verdund in RPMI onvolledig aan de putjes toe. Incubeer gedurende 3 dagen.
- Ontbinding 0,5 g MTT in 100 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) een voorraadoplossing van 5 mg / ml te maken. Steriel filter en bewaar bij -20 ° C, beschermd tegen licht; is het het beste om deze oplossing vers te maken.
- 2,5 h before het einde van de 3-dagen incubatieperiode, voeg 25 ul MTT-oplossing aan elk putje en voltooi de incubatieperiode.
- Bereid 50% N, N-dimethylformamide (DMF) door het mengen van 250 ml DMF met 250 ml gedeïoniseerd water.
- Bereid MTT extractiebuffer als volgt: Weeg 100 g SDS in een 500 ml fles en voeg 300 ml 50% DMF. Breng een laag vuur, zodat de SDS op te lossen. Voeg 10 ml zuiver azijnzuur en 12,5 ml 1 M HCl. Vullen tot 500 mL markering met 50% DMF; de uiteindelijke samenstelling van de extractiebuffer is 50% DMF, 20% SDS, 2,5% azijnzuur en 2,5% 1 M zoutzuur.
- Na afloop van de behandelingsperiode, voeg 100 pl extractiebuffer aan elk putje (verwarmd tot 45 ° C om alle kristallen op te lossen). Laat het mengsel gedurende een nacht incuberen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Lees de absorptie bij 570 nm.
OPMERKING: De cytotoxiciteit assay wordt het best uitgevoerd in parallel met een intracelular scherm met behulp van dezelfde batch en leeftijd van THP-1 cellen.
5. bouillon behulp Activity Analysis een Resazurin Assay 3
- Groeien M. tuberculosis in 7H9ADST de mid-logfase (~ 0,5-0,8 OD 600). Verdun de cultuur met de 7H9ADST tot 0,01 OD 600. Verdun de verbindingen 7H9ADST het testen concentratie en hoeveelheid 100 pl van elk verdund 2x verbinding in elk putje.
- Breng 100 pi van de verdunde bacteriële suspensie in elk putje. Laat de platen geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde incubator gedurende 5 dagen. Los 10 mg resazurine in 100 ml gedeïoniseerd water en steriel filter.
- Voeg 30 ul van resazurin oplossing en het toezicht op de kleurverandering na 48 uur; bacteriegroei wordt aangegeven door een kleur conversie van blauw naar roze.
Opmerking: Een kwantitatieve analyse kan worden uitgevoerd door het meten van ofwel de fluorescentie bij 590 nm met excitatie bij 530-560nm en de absorptie bij 570 nm en 600 nm 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
High-throughput screening met intracellulaire M. tuberculosis die het luciferasegen
Figuur 2A en Tabel 1 bevat de ruwe gegevens verzameld door de luminometer, uitgedrukt in relatieve luminescentie-eenheden (RLU), die het effect van een toenemende concentratie van tuberculose geneesmiddel rifampicine op M. tuberculosis in THP-1 cellen. Figuur 2A is een spreidingsdiagram van het ruwe luminescentie gemeten in RLU voor verschillende concentraties rifampicine. De fout balken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Figuur 2B toont het percentage vermindering van de luminescentie bij behandelde wells in vergelijking met de onbehandelde wells. De gegevens tonen dat rifampicine kan verminderen> 99,9% RLU van intracellulaire M. tuberculosis in een concentratie van 0,1 ug / ml. Dit is in overeenstemming met de previously MIC verschenen tussen 0,1 en 0,4 ug / ml 16. Luminescentie in elk putje is een indicatie van de totale luciferase door M. tuberculosis uitgedrukt en dus is een indicator van de metabolische status van M. tuberculosis in de put. Het is normaal voor ruwe luminescente niveau varieert tussen experimenten. Als zodanig zou een vergelijking van de ruwe data onbetrouwbare conclusies te genereren. Aldus dient de gegevens worden genormaliseerd tegen een bepaalde negatieve controle, waarbij de monsters behandeld met alleen DMSO was. De resulterende waarden worden uitgedrukt als het percentage vermindering van M. tuberculosis in de putjes (figuur 2B).
Cytotoxiciteit analyse met behulp van MTT-assay
De MTT test is een gevestigde assay voor eukaryote cytotoxiciteit. Deze colorimetrische assay duidt levende cellen door omzetting van MTT (geel) tepaars gekleurd formazan. Deze test wordt uitgevoerd zonder een M. tuberculosis-infectie omdat de bacteriën die in staat metaboliseren MTT, waarbij de waargenomen toxiciteit van de verbindingen verminderd worden. Een algemene suggestie voor de MTT assay media gebruiken zonder pH-indicator fenolrood als gevolg van de absorptie bij 570 nm 17. De aangezuurde extractiebuffer beschreven in deze methode kan veroorzaakt door fenolrood 17 minimaliseren.
Figuur 3 toont de cytotoxiciteit veroorzaakt door een toenemende concentratie van een proefverbinding gecodeerd G1-1H. Gewoonlijk wordt een 50% remmende concentratie (IC50) toegepast om het niveau van cytotoxiciteit geven. Bij G1-1H concentraties van 10 pM en 3 pM duidelijk beneden de IC50 concentratie.
In-bouillon activiteit analyse onsing de Resazurin assay
De resazurin test wordt vaak gebruikt voor de analyse van de cytotoxiciteit in eukaryotische cellen, maar het kan ook worden gebruikt om levende bacteriën te controleren in bouillon 3. De resazurin assay is een redox-gebaseerde test vergelijkbaar met de MTT assay. Het meet NADPH niveaus en NADPH-dehydrogenase activiteit door middel van de omzetting van Resazurin in resorufine een rode fluorofoor. De makkelijkste en snelste manier om de werkzaamheid van drugs te bepalen is om te zoeken naar de laagste behandeling concentratie wanneer de putten blijven blauw van kleur. Figuur 4 toont een deel van een 96-putjesplaat die de effecten van verschillende concentraties van het antibioticum apramycin aanbieden op resazurin conversie door M. tuberculosis. De in-bouillon MIC werd bepaald tussen 2,5 en 5 ug / ml. Dit is iets hoger dan de eerder gepubliceerde waarde van 1,5 ug / mL 18, maar het is nog ruim binnen de acceptable bereik. In veel gevallen is de kleurverandering is vrij geleidelijke, dus het is moeilijk om een zelfverzekerde beslissing te nemen. Onder deze omstandigheden, is het beter om de werkelijke hoeveelheid Resazurin omzetting met behulp van absorptie of fluorescentie te kwantificeren. Vanwege de vergelijkbare absorptiekarakteristieken van Resazurin en resorufine, MIC bepaling met absorptie vereist metingen met twee verschillende golflengten en complexe berekeningen 15. Daarom is de beste methode om fluorescentie te meten met behulp van 530- tot 560-nm excitatie golflengten en een golflengte van 590 nm emissie, zoals beschreven in de literatuur van de fabrikant 15.
Figuur 4 toont een mogelijke bron van inconsistentie geassocieerd met meerdere dagen incubaties die screeningresultaten drastisch kunnen veranderen. Als gevolg van verkeerde bevochtigen van de 37 ° C incubator voor dit experiment, putten op de randen van de p lates leed aanzienlijk meer verdamping. Alle 15-DMSO behandelde putjes worden verondersteld identiek te zijn, maar de putjes langs de linker- en bovenranden had volumes verminderd. Deze bronnen blijken ook andere kleuren dan de andere-DMSO behandelde putten in het midden van de plaat te hebben. Dezelfde inconsistentie kan ook worden waargenomen bij 2,5 ug / ml apramycine-behandelde putjes. In dit geval zou het gereduceerde volume ook leiden tot een kwantitatieve lezing van een spectrofotometer en fluorometer. Verdamping wordt aanzienlijk voor alle experimenten met een langduriger incubatietijd, dus zorg moet worden genomen om incubators goed bevochtigd om deze bron van inconsistentie te voorkomen houden.
Figuur 1: Schema Method. Diagram assay schema 3 afzonderlijke modules van de high-throughput screening-systeem. _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Representatieve gegevens van een Intracellulaire de effectiviteit van rifampicine onderzoeken wegwerken M. tuberculosis in THP-1 cellen. (A) Diagram van de gemiddelde luminescentie teller (in relatieve luminescentie-eenheden) per behandeling (rifampicine) concentratie. De foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde voor elke triplo. (B) Diagram van het berekende percentage vermindering in luminescentie als gevolg van een behandeling van rifampicine, waarbij hogere waarden geven een grotere effectiviteit. De 90% remmende concentratie (IC90) in dit geval ergens tussen 0,01 en 0,1 ug / ml.nk "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: representatieve gegevens van een cytotoxiciteit (MTT) Assay voor de toxische effecten van Verbinding G1-1H op gedifferentieerde THP-1 cellen onderzoeken. Grafiek van de berekende "percentage controle" voor elke concentratie van de behandelingsverbinding is G1-1H, waarbij hogere waarden duiden gezonder THP-1 cellen. De IC 50 is in dit geval ergens tussen 10 en 30 uM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Vertegenwoordiger Gegevens uit een Resazurin Assay aan de E Onderzoekffectiveness van AMP op remmende M. tuberculosis in bouillon. Alleen kwalitatieve gegevens verzameld in dit geval als gevolg van beperkingen in het materiaal bioveiligheidsniveau 3 (BSL3) lab. De foto toont een deel van een plaat met 96 putjes bevattende M. tuberculosis behandeld met DMSO of variërende hoeveelheden apramycin. De DMSO-behandelde putjes vertoonden een omzetting van Resazurin met resorufine, zoals aangegeven door de kleurconversie van blauw naar roze. De apramycin-behandelde monsters duidelijk onderging de kleurconversie dan 5 ug / ml. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| [Rifampicine] | Rep1 | Rep2 | REP3 | % Vermindering | |
| 4 gg / mL | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1 ug / ml | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0,1 ug / ml | 1037 | 731 | 976 | 915 | 98 |
| 0,01 ug / ml | 19200 | 24400 | 23919 | 22506 | 54 |
| 0 ug / ml | 39877 | 49655 | 57728 | 49087 | 0 |
Tabel 1: Ruwe gegevens van de luciferase assay voor het bepalen van de intracellulaire IC90 rifampicine.
| [G1-1H] | Rep 1 A570 | Rep 2 A570 | Rep 3 A570 | gemiddeld A570 | % Van de onbehandelde |
| 30 uM | 0,056 | 0,056 | 0,055 | 0,056 | 7 |
| 10 M | 0,518 | 0.488 | 0,492 | 0,499 | 62 |
| 3 uM | 0,652 | 0,638 | 0,656 | 0,649 | 80 |
| 0 uM | 0,822 | 0,782 | 0,815 | 0,806 | 100 |
Tabel 2: Raw Data uit de MTT-test voor de bepaling van de cytotoxiciteit van Test verbinding G1-1H bij Different Concentraties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van dit onderzoek was om een eenvoudige en kosteneffectieve HTS methode met behulp van een menselijke intracellulaire infectie model voor M. tuberculosis te creëren. Tuberculose is een menselijke ziekte gekenmerkt door de infectie van alveolaire macrofagen van M. tuberculosis. Als gevolg van bioveiligheid kwesties, heeft het onderzoek met biologische modellen van zowel de bacterie en de gastheercellen zijn gebruikt in het verleden. Er is echter aangetoond dat het gebruik van surrogaat bacteriën en niet-menselijke modellen zijn slechte voorspellers van hit-to-lead succes in de ontwikkeling van geneesmiddelen, wat aangeeft dat het screenen van geneesmiddelen het best wordt gedaan met menselijke cellen die geïnfecteerd zijn met M. tuberculosis 19, 20, 21, 22.
Bij deze methode, hebben we geavanceerde en aangepast huidige state-of-the-art screening protocollen voor humane macrofaag-achtige THP-1 cellijn. Met het oog op hoge bereikenthroughput, introduceerden we een aantal technische verbeteringen aan de infectie protocol. Eerst en vooral, we vervangen alle stappen die betrokken zijn bij CFU vastberadenheid en vervangen ze met een luciferase gebaseerde reporter systeem. Vuurvlieg luciferase werd gekozen vanwege de eenvoudige eindpunt assay, de snelle afbraak door gastheercel lysosoom enzymen en minima apparatuur. Deze substitutie effectief geëlimineerd 30 dagen incubatieperiode, en de arbeids- en verbruiksgoederen kosten platen en kolonies tellen stappen.
Een tweede belangrijke verbetering introduceerden wij was batchverwerking en infectie, die verder verbetert de doorvoer en de samenhang tussen de putjes met een eenvoudiger infectieprotocol. Door het combineren van de differentiatie en infectie stappen in een enkele stap, waren we in staat om het protocol te verkorten met een dag. Tegelijkertijd, waren we in staat om de drie rondes van wassen die normaal zou optreden tussen differentiatie en infectio verminderenn, die een bron van mogelijke THP-1 celverlies als gevolg van onthechting.
Dit protocol is ontwikkeld voor het screenen in de THP-1-cellijn, die verscheidene voordelen verleent. THP-1, als een geïmmortaliseerde cellijn, betrouwbaar kan worden gekweekt in vitro voor meer dan 20 passages 23 zijn. Dit is vooral belangrijk voor grote screening campagnes, waarbij het een uitdaging om voldoende cellen te behouden om een high-throughput setup leveren kan zijn. Daarnaast testen in THP-1 zorgt voor een homogene genetische achtergrond die variabiliteit minimaliseert in de resultaten. Dit is zeer gunstig voor testverbindingen die host celreacties 10 beïnvloeden. Als extra bonus, kan genexpressie in de THP-1 cellijn neergereguleerd door kleine interfererende RNA's (siRNA's) 24. Dit verschaft een waardevol instrument voor downstream onderzoeken naar het werkingsmechanisme van stoffen hit. Hoewel deze methode is gemaakt met behulp THP-1 cellijn iskan gemakkelijk worden aangepast voor humane primaire cellen, zoals perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC), zoals eerder werd aangetoond 10.
Om zo goed mogelijk na te bootsen de werkelijke interactie tussen alveolaire macrofagen en M. tuberculosis, de intracellulaire testprotocol omvat een stap om de bacteriën te opsoniseren. Opsonisatie met humaan serum jassen M. tuberculosis en vergemakkelijkt celinvoer via complementreceptor 3 (CR3) 25. Naakte bacteriën eerder macrofagen via de lectine receptor 8. Aangezien de bronchoalveolaire vloeistof bekend bestanddelen van humaan serum 25, opsonisatie of het ontbreken daarvan bevat, kan een fundamentele invloed op het screenen uitkomst. Echter, sommige kunnen aan deze stap over te slaan om het infectieproces 16 verder te vereenvoudigen, zal deze niet haalbaar om voldoende humaan serum te verkrijgen vanwege de grootte van de library gescreend 11.
De intracellulaire bepaling omvat een stap om alle vloeistof die ongebonden materiaal uit de putjes voorafgaand aan de toevoeging van het luciferase-reagens te verwijderen. Deze stap is bedoeld om de signaal-ruisverhouding te verhogen en tegelijkertijd de hoeveelheid toegepaste reactant per putje. Echter, de opname van deze stap vals-positieve resultaten voor verbindingen die THP-1 te doden, maar niet M. tuberculosis genereren, aangezien losgemaakt en gelyseerde THP-1 en vrijzwevende M. tuberculosis zou verdwijnen. Daarom moet de fabrikant gesuggereerde protocol van verschillende hoeveelheden van luciferase-reagens (100 pl) aan elk putje om te testen op M. tuberculosis overleving in putjes bevattende cytotoxische verbindingen te volgen.
In tegenstelling tot het vuurvlieg luciferase systeem maakt het bacteriële lux-systeem geen externe reagentia voor signaalgeneratie 26 vereisen. Echter,het vuurvlieg systeem heeft de voorkeur boven het lux-systeem om de volgende redenen: Ten eerste kan het bacteriële systeem toxisch mycobacteriën 26 zijn. Ten tweede, een complexer reporter (5 genen voor lux versus 1 gen van vuurvlieg) is gevoeliger voor belemmeringssignaal door testverbindingen. Tenslotte handel verkrijgbare reagentia voor de vuurvlieg luciferase assay de noodzakelijke voorwaarden voor een optimale signaal genereren. Anderzijds, het bacteriële luciferase systeem is gebaseerd op ATP productie en aanwezig in de bacteriën signaalgeneratie cofactoren. Deze kunnen variëren tussen de verschillende behandelingen en zijn niet zo gemakkelijk te controleren. Daarom is de toevoeging van het luciferase reagens aan het vuurvlieg systeem standaardiseert de reactieomstandigheden en levert meer betrouwbare metingen van luciferaseactiviteit in alle behandelingen.
CFU bepaling heeft lang de gouden standaard voor kwantificeren bacteriedichtheid. In contract, bioluminescence, zoals de meeste verslaggevers, is niet een directe maat van bacteriën. In plaats daarvan, RLU is een functie van zowel CFU en de metabole toestand van de bacteriën. Anderen hebben de veelal lineair verband tussen RLU en CFU bioluminescente mycobacteriën onder bepaalde omstandigheden 5 getoond. In elk geval een aanzienlijke vermindering van het luciferase-signaal, ongeacht de onderliggende oorzaak buiten de daadwerkelijke inhibitie van luciferase-enzymactiviteit zou duiden op een vermindering van het M. tuberculosis fitness in de gastheercel. Daarom zou deze verbindingen van belang uit een drug screening standpunt te zijn en mag niet worden uitgesloten methode ontwikkeling.
Een alternatief voor de luciferase-gebaseerde intracellulaire screening protocol is de geautomatiseerde fluorescentie-microscopie benadering 11, 27, 28, 29. de luciferasetest output wordt gemeten met een luminometer en de verkregen data is kwantitatief, terwijl fluorescentiemicroscopie beelden die kwalitatief zijn gegenereerd. Echter, door slim programmeren van computers, beelden kunnen worden geanalyseerd om kwantitatieve gegevens te genereren. Bovendien, fluorescentie microscopie kunnen meerdere fluoroforen gelijktijdig te gebruiken, wat erg handig is voor het verzamelen van waardevolle parameters zoals de levensvatbaarheid van de cel, celtellingen, en de werkelijke omvang van de besmetting. Zoals te voorspellen, deze voordelen komen met een aantal tegenslagen. De initiële investering op geautomatiseerde fluorescentie microscopie apparatuur is vele malen groter dan de kosten van een luminometer of fluorometer en is daarom buiten het bereik van vele onderzoekslaboratoria. Voor degenen die toegang hebben tot de apparatuur, moet het monster verwerking voorafgaand aan het capturen en data-analyse worden beschouwd. Deze twee stappen invloed op de totale tijdsinvestering met stijgingen in de bibliotheek grootte. Het opnemen van extra fluorescerende labels in gastheercellen requires bevestiging, vlekken, en wasstappen, waardoor extra interventie en keer gebruiker investeringen noodzakelijk. Bovendien fluorescente microscopie verzamelen en analyseren van gegevens, hoewel geautomatiseerde vereist nog aanzienlijk meer tijd en middelen dan de eenvoudige luciferasebepaling uitlezing. Daarom is de luciferase-gebaseerde screeningswerkwijze intracellulaire eenvoudiger en staat hogere doorvoersnelheid.
De luciferase-gebaseerde intracellulaire screeningswerkwijze heeft een belangrijke beperking in vergelijking met fluorescentie-microscoop gebaseerde screeningswerkwijzen. Dit komt door het feit dat de luciferase assay verschaft geen gegevens over de gezondheidstoestand van gastheer macrofagen. Cytotoxische verbindingen zouden de dood van macrofagen veroorzaken, en dus levende bacteriën kunnen vrijkomen in het medium en zou niet langer bijdragen tot de uiteindelijke luciferasetest signaal. Als gevolg daarvan zou cytotoxische verbindingen lijken de dood van intracellulaire M. tuberculosis en dus generat veroorzakenea groot aantal valse positieven. Om dit probleem aan te pakken, hebben we onze methode aangevuld met een MTT-bepaling van de cytotoxiciteit van de verbindingen te beoordelen op host macrofagen. Deze module van de screening methode geeft ons meer informatie over de specificiteit van stoffen van verbindingen van belang en maakt het mogelijk de vroege eliminatie van minder-dan-ideale kandidaat-geneesmiddelen.
Als alternatief kan men ook de luciferase-gebaseerde intracellulaire assay gebruikt voor het uitvoeren van geautomatiseerde fluorescentie microscopie. In schermen van grote collecties van chemische moleculen, dit zorgt voor de snelle en efficiënte evaluatie van de verbinding effectiviteit in de macrofaag infectie model. Als gevolg daarvan kan geautomatiseerde fluorescentie microscopie worden gereserveerd voor gedetailleerde studies over betere kandidaten, zoals blijkt uit een eerder gepubliceerde studie 11.
De lage kosten en eenvoudige aard van de luciferase-gebaseerde intracellulaire assay ook veel baat onderzoekers die willen testen kleiner chemische bibliotheken. Over het geheel genomen heeft de luciferase-gebaseerde intracellulaire test bewezen als een uiterst flexibel instrument voor onderzoekslaboratoria van alle kalibers en voor het screenen van projecten van verschillende grootte zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
- WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
- USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
- Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
- Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
- Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
- Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
- Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
- ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
- Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
- Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
- Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
- Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
- Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
- Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
- Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
- Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
- Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
- Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
- Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).
