Summary
Vi har utviklet en modulær high-throughput screening system for å oppdage nye forbindelser mot Mycobacterium tuberculosis, rettet mot intracellulær og i-buljong voksende bakterier, så vel som cytotoksisitet mot pattedyrvertscellen.
Introduction
Mycobacterium tuberculosis, det forårsakende middel for tuberkulose (TB), er en ledende årsak til morbiditet og dødelighet over hele verden. Medikament-sensitive TB er en behandle sykdom som krever flere antibiotika for en periode på 6 måneder. Til tross for å være en mulig å behandle sykdom, ble TB dødelighet beregnet til å være 1,5 millioner i 2015 1. I de siste 10 år har det vært økende bekymring over forekomsten av legemiddelresistent M. tuberculosis. Multidroge-resistente TB (MDR-TB) er definert som TB som er resistent overfor minst Isoniazid (INH) og Rifampicin (RMP), og de fleste MDR-TB stammer er også motstandsdyktig til å velge andre linjer TB medisiner, og begrenser således behandlingsmuligheter . Virkningene av medikamentresistens skape en større utfordring for behandling av pasienter som er infisert med humant immunsviktvirus (HIV); 400.000 pasienter over hele verden døde av HIV-assosiert TB i 2015 en. Skuffende, USA Food and Drug Administrasjon har godkjent bare en ny TB legemiddel mot MDR-TB, bedaquiline, de siste 40 år 2. Fremskritt i å finne bedre og kortere TB terapi er et presserende behov for å ligge i forkant i kampen mot tuberkulose og MDR-TB.
Tradisjonelt er TB narkotika-skjermer utført under in vitro-vekstbetingelser i vekstmedium, hvorved forbindelser tilsettes til en voksende kultur og deres effektivitet i å utrydde mikroorganismer bestemmes ved å telle kolonidannende enheter (CFU) på fast medium. Som CFU teller er arbeidskrevende, tidkrevende og kostbart, har ulike indirekte metoder er utviklet for å lindre dette problemet. Slike metoder omfatter Alamar blå levedyktighet assay 3, bestemmelse av fluorescens 4 fra grønt fluorescerende protein (GFP) eller luminescens 5 fra luciferase-uttrykkende bakterier, og estimering av det totale adenosintrifosfat (ATP) 6, 7.
Typisk TB er karakterisert ved en M. tuberculosis-infeksjon i lungen, hvor bakteriene befinner seg og replikere inne i phagosomes av alveolære makrofager 8. Den enkle i-buljong fenotypisk skjerm kan passe ekstracellulære patogener; imidlertid, i de historisk perspektiv, treffer forbindelsene overfor M. tuberculosis er identifisert ved hjelp av denne metoden ofte mislykkes i å leve opp til forventningene på nedstrømsvaliderings trinn i infeksjonsmodeller. Vi foreslår at TB stoffet er best utføres i en intracellulær vertscelle infeksjonsmodell. Ikke desto mindre, intracellulære modeller har mange tekniske og biologiske barrierer for high-throughput screening (HTS) utvikling. Et stort hinder er kompleksiteten av infeksjonsprosessen, eksemplifisert ved en rekke trinn, og den omstendelige fjernelse av ekstracellulære bakterier ved i mellom vasking. Et annet stort hinder er den lange tids remelsene, som vekst deteksjon, normalt ved å CFU telling på dyrkingsplater, er en prosess som tar over 3 uker å fullføre. En løsning for å erstatte CFU tellingene har blitt gitt av automatisert fluorescens mikroskopi i kombinasjon med fluoriserende bakterier. Dette krever imidlertid løsningen en innledende utstyr investering som er utenfor rekkevidde for mange forskningslaboratorier. En enkel, billig, og sykdomsrelevant HTS-metoden i stor grad vil forbedre drug discovery prosessen.
I denne studien, rapporterer vi en ny, modul HTS system som tar sikte på å gi en hurtig, og skalerbar, men økonomisk, analyse egnet for å bestemme aktiviteten av forbindelsene overfor intracellulær M. tuberculosis. Dette system er sammensatt av tre moduler: (i) intracellulære, (ii) cytotoksisitet, og (III) i-buljong analyser. Den kombinerte endelige resultatet gir en fullstendig beskrivelse av de sammensatte egenskaper, sammen med ytterligere informasjon med hensyn til potensielle virkningsmåte. dette screening system har vært brukt i flere prosjekter med ulike sammensatte biblioteker som er rettet mot virkningsmåte, inkludert analyse av stoffet synergi 9, stimulering av autophagy 10, og inhibering av M. tuberculosis -secreted virulens faktor (upublisert). Forbindelser med ukjent virkningsmekanisme har også blitt studert 11. En modifisert versjon av denne metode ble også tatt i bruk av vår industripartner som den primære undersøkelsesmetode for å identifisere nye forbindelser for intracellulær M. tuberculosis 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bakteriestamme og vekstmedium
- Gjør albumin dekstrose og saltløsning (ADS) ved å løse 25 g bovint serum-albumin, 10,0 g dekstrose, og 4,05 g natriumklorid i 460 ml deionisert vann. Filter-sterilisere ADS og oppbevar ved 4 ° C.
- Gjør Brook 7H9 buljong ved tilsetning av 4,7 g Brook 7H9 pulver og 2 ml glycerol og 900 ml renset vann. Autoklaver Brook 7H9 kokes ved 121 ° C i 10 minutter, og la den avkjøles til romtemperatur før man går videre. Gjør 7H9ADST ved å tilsette 100 ml ADS og 0,5 ml Tween80 til 900 ml av Brook 7H9 kjøttkraft. Oppbevar ved 4 ° C.
- Veier 50 mg kanamycinsulfat og oppløses i 1 ml deionisert vann; sluttkonsentrasjonen er 50 mg / ml. Filter-sterilisere og oppbevar ved -20 ° C. Tilsett 0,5 ml av kanamycin stamoppløsning per 1 liter 7H9ADST.
MERK: Dette mediet bør gjøres frisk, så skalere volumene med hensyn på kulturen størrelse. - Vokser M. tuberculosis in 7H9ADST supplert med kanamycin i stående kultur. Rist kultur daglig og fortynne det før OD600 når 1,0 for å unngå klumper.
MERK: M. tuberculosis stamme brukes til utvikling av denne metoden ble H37Rv transformert med plasmid pJAK2.A 12. pJAK2.A er en integrerende plasmid basert på den pMV361 vektor, som tillater ekspresjon på høyt nivå av den ildflue luciferase genet fra hsp60-promoteren og kan velges ved hjelp av kanamycin.
2. THP-1 medium og vedlikehold
- Tilsett 50 ml varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) og 5 ml 200 mM L-glutamin og 500 ml RPMI 1640 for å gjøre RPMI komplett medium (ca. 10% FBS og 2 mM glutamin).
- Opprettholde et THP-1 cellekultur i henhold til standard protokoll 13. I korthet, blir THP-1-celler i RPMI komplett medium mens det opprettholdes en celletetthet på 0,2 til 1 million per ml av medium mellom pasvismenn.
3. Høy-throughput screening ved anvendelse av Intracellulær Luciferase-uttrykkende M. tuberculosis H37Rv
- Måle den optiske tetthet av en aktivt voksende bakteriesuspensjon i et spektrofotometer ved en bølgelengde på 600 nm. Beregn bakterielle tetthet ved hjelp av omregningsfaktor på 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 bakterier per ml.
- Pipetter ut tilstrekkelig bakteriemengde for en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 10: 1 inn i en ny sentrifugerør. Pellet ved 3000 xg i 10 min og suge væske. Tilsett 50 pl av humant serum til 450 ul RPMI1640. Skaler volumet til passende verdier for forsøket.
- For å opsonisere bakterier, resuspender pelleten i en tetthet på 1 x 10 8 bakterier pr 500 ul av RPMI 1640 inneholdende 10% humant serum. La blandingen inkubert ved 37 ° C i 30 min. Bestem THP-1 cellekultur tetthet ved å telle med et hemocytometer og et invertert mikroskop, og såpe.
- Sentrifuger cellene i sterile sentrifugerør ved 100 xg og 37 ° C i 10 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i RPMI ufullstendig ved en tetthet på 1 million celler per ml. Legg forbol-12-myristat-13-acetat (PMA) til en 40 ng / ml sluttkonsentrasjon.
MERK: Dette vil bli referert til som differensiering mix. - Kombiner opsonisert M. tuberculosis med THP-1 differensiering blandingen ved en MOI på 10: 1 og alikvotere den endelige blanding på 100 ul per brønn i en 96-brønns flatbunnet plate hvit. Regelmessig blandingen omrøres for å sikre ensartethet. Tillat differensieringen og infeksjon forløpe over natten ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO2.
- Brønnene vaskes to ganger med 100 ul av RPMI hver. Legg forbindelser fortynnet til de ønskede konsentrasjoner i RPMI ufullstendig og inkuber i 3 dager.
- Aspirere mediet fra brønnene. Tilsett 50 ul av lusiferaseassayreagens til hver brønn. Forsegl platene med transparent klebe plateforseglere. Tillate 5 minutters inkubering ved 22 ° C og deretter oppnå en avlesning i et luminometer ved 1 s per brønn.
4. Cytotoksisitet analyse ved hjelp av et 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse 14
- Skille THP-1-celler i RPMI ufullstendig supplert med 40 ng / ml PMA i klare 96-brønners plater. Opprettholde en celletetthet på 1 million per mL og aliquot 100 mL per brønn. Tillat differensiering forløpe over natten ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO2.
- Aspirere mediet fra brønnene og vasker dem to ganger med RPMI 1640. Legg forbindelser fortynnet i RPMI ufullstendige til brønnene. Inkuber i 3 dager.
- Oppløs 0,5 g av MTT i 100 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) for å lage en stamløsning av 5 mg / ml. Sterilt filter og oppbevares ved -20 ° C, borte fra lys; det er best å gjøre denne løsningen frisk.
- 2,5 h Saudafe slutten av 3-dagers inkuberingsperiode, tilsett 25 ul MTT-løsning til hver brønn og full av inkubasjonsperioden.
- Forbered 50% N, N-dimetyl-formamid (DMF) ved blanding av 250 ml DMF med 250 ml deionisert vann.
- Forbered MTT ekstraksjonsbuffer som følger: Vei 100 g av SDS i en 500 ml flaske og tilsett 300 ml 50% DMF. Gjelde lav varme for å tillate SDS for å oppløse. Tilsett 10 ml ren eddiksyre og 12,5 ml 1 M HCl. Fyll opp til 500 ml merket med 50% DMF; den endelige sammensetningen av utvinning buffer er 50% DMF, 20% SDS, 2,5% eddiksyre og 2,5% 1 M saltsyre.
- Ved slutten av behandlingsperioden, tilsett 100 ul ekstraksjonsbuffer (oppvarmet til 45 ° C for å oppløse alle krystaller) til hver brønn. La blandingen inkuberes over natten ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO2. Les absorbansen ved 570 nm.
MERK: cytotoksisitetsprøve er best utføres i parallell med en intraular skjermen ved hjelp av samme-batch og alder av THP-1-celler.
5. I-buljong aktivitet analyse ved hjelp av en Resazurin Analyse 3
- Vokser M. tuberculosis i 7H9ADST til midt-log fase (~ 0,5 til 0,8 OD 600). Fortynn kultur med 7H9ADST til 0,01 OD600. Fortynn forbindelser i 7H9ADST 2x testing konsentrasjoner og delmengde 100 ul av hver fortynnet forbindelse i hver brønn.
- Overfør 100 ul av den fortynnede bakteriesuspensjonen i hver brønn. Tillat platene inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator i 5 dager. Oppløs 10 mg av resazurin i 100 ml avionisert vann og sterilfilter.
- Tilsett 30 mL av Resazurin løsning og overvåke fargeforandring etter 48 timer; bakterievekst er indikert av en fargekonvertering fra blått til rosa.
MERK: En kvantitativ analyse kan også bli utført ved å måle enten fluorescens ved 590 nm med eksitasjon ved 530 til 560nm eller absorbansen ved 570 nm og 600 nm 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
High-throughput screening ved hjelp av intracellulær M. tuberculosis uttrykker luciferasegenet
Figur 2A og tabell 1 inneholder de rå data samlet inn av luminometeret, uttrykt i relative enheter (RLU luminescens), som viser virkningen av en økende konsentrasjon av den TB medikament rifampicin på M. tuberculosis inne i THP-1-celler. Figur 2A er et spredningsdiagram av den rå luminescens målt i RLU for forskjellige konsentrasjoner av rifampicin. Feilstolpene indikerer standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Figur 2B viser den prosentvise reduksjon i luminescens i behandlede brønner sammenlignet med de ubehandlede brønner. Dataene viser at rifampicin er i stand til å redusere> 99,9% av RLU fra intracellulær M. tuberculosis ved en konsentrasjon på 0,1 pg / ml. Dette er i samsvar med previously publisert MIC mellom 0,1 og 0,4 ug / ml 16. Luminescence produsert i hver brønn er en indikasjon på den samlede luciferase uttrykt av M. tuberculosis, og således er en indikator på den metabolske status av M. tuberculosis inne i brønnen. Det er normalt for rå lysende nivåer for å variere mellom eksperimenter. Som sådan, vil en sammenligning av rådata generere upålitelige konklusjoner. Således bør dataene normalisert mot et definert negativ kontroll, noe som ville være prøvene som er behandlet med DMSO bare. De resulterende verdier kan uttrykkes som den prosentvise reduksjon i M. tuberculosis i brønnene (figur 2B).
Cytotoksisitets-analyse ved anvendelse av MTT-analysen
MTT-analysen er en veletablert assay for eukaryot cytotoksisitet. Denne kolorimetriske analyse indikerer levende celler gjennom konvertering av MTT (gul) tillilla-farget formazanforbindelsen. Denne analyse utføres uten en M. tuberculosis-infeksjon, fordi bakteriene er i stand til å metabolisere MTT, noe som reduserer den observerte giftighet av forbindelsene. En vanlig forslag for MTT-analysen er å anvende media uten pH-indikatoren fenolrødt på grunn av absorpsjonen ved 570 nm 17. Men det surgjorte ekstraksjonsbuffer som er beskrevet i denne metoden er i stand til å minimalisere interferens som forårsakes av fenolrødt 17.
Figur 3 viser cytotoksisiteten forårsaket av en økende konsentrasjon av en testforbindelse kodet G1-1H. Normalt er en 50% inhiberende konsentrasjon (IC50) benyttes for å indikere nivå av cytotoksisitet. I tilfelle av G1-1H, konsentrasjoner på 10 uM og 3 uM ligger klart under IC50 konsentrasjonen.
I-buljong aktivitet analyse ossing Resazurin analysen
Resazurin Analysen blir ofte brukt for analyse av cytotoksisitet i eukaryote celler, men den kan også brukes til å overvåke levende bakterier i buljong 3. Resazurin-analysen er en redoks-basert analyse som ligner på MTT-analysen. Den måler NADPH nivåer og NADPH dehydrogenase aktivitet gjennom konvertering av Resazurin inn resorufin, en rød fluorophore. Den enkleste og raskeste måte for å bestemme medikamentvirkningen er å se etter den laveste konsentrasjonen behandling hvor brønnene forblir blå i farge. Figur 4 viser en del av en 96-brønns plate som viser effekten av ulike konsentrasjoner av de antibiotiske apramycin har på Resazurin omdannelse av M. tuberculosis. Den in-buljong MIC ble bestemt til å være mellom 2,5 og 5 ug / ml. Dette er litt høyere enn den tidligere publiserte verdi på 1,5 ug / ml 18, men det er likevel godt innenfor acceptable-serien. I mange tilfeller er det fargeendring heller gradvis, så det er vanskelig å lage en trygg besluttsomhet. Under disse betingelser, er det bedre å kvantifisere den faktiske mengden av Resazurin omdannelse ved anvendelse av enten absorbans eller fluorescens. På grunn av de tilsvarende absorbansverdiene egenskapene av Resazurin og resorufin, MIC-bestemmelse under anvendelse av absorpsjon krever målinger ved hjelp av to forskjellige bølgelengder og kompliserte beregninger 15. Derfor er den beste metoden for å måle fluorescens ved hjelp av 530- til 560-nm eksitasjonsbølgelengdene og en 590-nm emisjonsbølgelengde, som beskrevet i produsentens litteratur 15.
Figur 4 illustrerer en potensiell kilde til inkonsistens i forbindelse med flerdags inkubasjoner som kan drastisk forandre screeningresultater. På grunn av feil fukting av 37 ° C inkubator benyttet for dette forsøket, brønner på kantene av p- lates lidd betydelig mer fordampning. Alle 15 DMSO-behandlede brønner er ment å være identiske, men brønnene langs venstre og øvre kanter hadde redusert volum. Disse brønnene synes også å ha forskjellige farger enn de andre DMSO-behandlede brønner i midten av platen. Den samme uoverensstemmelse kan også observeres på 2,5 ug / ml AMP-behandlede brønner. I dette tilfellet ville det reduserte volum også føre til en kvantitativ avlesning av et spektrofotometer og fluorometer. Fordampning blir betydelig for alle eksperimenter med lengre inkubasjonstid, så forsiktighet må tas for å holde inkubatorer godt befuktet å unngå denne kilden til inkonsekvens.
Figur 1: Skjematisk metode. Diagram som viser analyse skjema for 3 separate moduler i high-throughput screening system. _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative data fra et intracellulært for å undersøke effektiviteten av rifampicin i å eliminere M. tuberculosis inne i THP-1-celler. (A) Diagram av den midlere luminescens lesing (i relative luminescens-enheter) for hver behandlingskonsentrasjon (rifampicin). Feilstolpene betegner standardfeilen av middelverdien for hver triplikat. (B) Diagram av den beregnede prosent reduksjon i luminescens forårsaket av en behandling av rifampicin, der høyere verdier angir større effektivitet. Den 90% inhiberende konsentrasjon (IC90) i dette tilfellet er et eller annet sted mellom 0,01 og 0,1 pg / ml.nk "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representative data fra en cytotoksisitet (MTT) analyse for å undersøke de toksiske virkningene av forbindelse G1-1H på differensierte THP-1-celler. Diagram over den beregnede "prosent av kontroll" -verdier for hver konsentrasjon av behandlingsforbindelsen G1-1H, der høyere verdier angir sunnere THP-1-celler. IC 50 i dette tilfellet er et sted mellom 10 og 30 uM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representative data fra en Resazurin Forsøk til Undersøk Effectiveness av AMP til hemming av M. tuberculosis i-buljong. Bare kvalitative data samles i dette tilfellet på grunn av utstyrsbegrensninger i biosikkerhet trinn 3 (BSL3) lab. Bildet viser en del av en 96-brønners plate inneholdende M. tuberculosis behandlet med enten DMSO eller varierende mengder av apramycin. De DMSO-behandlede brønner som viste en omdannelse av Resazurin til resorufin, som indikert ved fargekonvertering fra blått til rosa. De AMP-behandlede prøvene gjennomgikk tydelig farge omdannelse under 5 pg / mL. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| [Rifampicin] | Rep1 | Rep2 | Rep3 | % reduksjon | |
| 4 ug / mL | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1 pg / ml | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0,1 ug / mL | 1037 | 731 | 976 | 915 | 98 |
| 0,01 ig / ml | 19200 | 24400 | 23919 | 22506 | 54 |
| 0 ug / mL | 39877 | 49655 | 57728 | 49087 | 0 |
Tabell 1: Rådata fra luciferase-assay for bestemmelse av den intracellulære IC 90 av rifampicin.
| [G1-1H] | Rep en A570 | Rep 2 A570 | Rep 3 A570 | Gjennomsnittlig A570 | % Av ubehandlet |
| 30 pM | 0,056 | 0,056 | 0,055 | 0,056 | 7 |
| 10 pM | 0,518 | 0,488 | 0,492 | 0,499 | 62 |
| 3 pM | 0,652 | 0,638 | 0,656 | 0,649 | 80 |
| 0 pM | 0,822 | 0,782 | 0,815 | 0,806 | 100 |
Tabell 2: Rådata fra MTT-analysen for bestemmelse av cytotoksisitet av testforbindelse G1-1H ved ulike geografiskent Konsentrasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne studien var å skape en enkel og kostnadseffektiv HTS-metoden ved anvendelse av et humant intracellulær infeksjonsmodell for M. tuberculosis. Tuberkulose er en human sykdom karakterisert ved infeksjon av alveolære makrofager av M. tuberculosis. På grunn av biosikkerhet problemer, har forskning som involverer biologiske modeller av både bakterien og vertsceller blitt brukt i det siste. Imidlertid har det vist seg at bruken av surrogat bakterier og ikke-humane modeller er fattige prediktorene for hit-til-bly suksess i legemiddelutvikling, noe som indikerer at legemiddelscreening gjøres best med humane celler som er infisert med M. tuberculosis 19, 20, 21, 22.
I denne metoden, har vi avanserte og tilpasset dagens state-of-the-art screeningprotokoller for det humane makrofag-lignende THP-1 cellelinje. For å oppnå høygjennomstrømning, innførte vi flere tekniske forbedringer infeksjonen protokollen. Først og fremst, vi erstattet alle trinnene involvert i CFU besluttsomhet og erstattet dem med en luciferase-baserte reporter system. Ildflueluciferase ble valgt på grunn av den enkle endepunktet forsøk, var den hurtige nedbrytning av vertscellen lysosom-enzymer, og de minimale krav til utstyr. Denne substitusjon effektivt elimineres med en 30-dagers inkubasjonstid, samt arbeids- og forbruksvarer kostnader i forbindelse med pletterings og koloni-telling trinn.
En annen viktig forbedring vi innført var satsvis behandling og infeksjon, noe som ytterligere forbedrer gjennomstrømning og konsistens mellom brønnene med en enklere infeksjon protokoll. Ved å kombinere de differensiering og infeksjonstrinn i ett eneste trinn, var vi i stand til å forkorte den protokoll med én dag. På samme tid var vi i stand til å redusere de tre runder med vask som normalt ville forekomme mellom differensiering og infection, som er en kilde for mulig THP-1-celler tap på grunn av løsgjøring.
Denne protokollen ble utviklet for screening inne i THP-1 cellelinjen, som gir flere fordeler. THP-1, som en immortalisert cellelinje kan være en pålitelig måte dyrkes in vitro i over 20 passasjer 23. Dette er spesielt viktig for store screening aksjoner, hvor det kan være vanskelig å opprettholde nok celler til å forsyne en high-throughput-oppsett. I tillegg gir testing i THP-1-en homogen genetisk bakgrunn som minimerer variasjon i resultatene. Dette er svært gunstig for å teste forbindelser som påvirker vertcellerespons 10. Som en ekstra bonus, kan genekspresjon i THP-1 cellelinjen bli nedregulert ved små interfererende RNA (sirnas) 24. Dette tilveiebringer et verdifullt verktøy for nedstrøms undersøkelser i virkningsmåten av hit-forbindelser. Selv om denne metoden ble utviklet ved hjelp av THP-1-cellelinje, detkan enkelt tilpasses for humane primære celler, slik som perifere mononukleære blodceller (PBMC), som tidligere ble vist 10.
For best å etterligne virkelige interaksjonen mellom alveolære makrofager og M. tuberculosis, inkluderer det intracellulære analysefremgangs et trinn for å opsonisere bakterier. Opsonisering med humane serum strøk M. tuberculosis og letter celleinntrengning via komplementreseptor 3 (CR3) 25. Nakne bakterier er mer sannsynlig å gå inn makrofager via lektin reseptoren 8. Gitt at den bronkoalveolare væsken er kjent for å inneholde komponenter av humant serum 25, opsonisering, eller mangel derav, kan det ha en fundamental virkning på utfallet screening. Noen kan imidlertid velge å hoppe over dette trinn for å ytterligere forenkle infiseringsprosessen 16, eller den kan ikke være mulig å oppnå nok human serum på grunn av størrelsen på library bli screenet 11.
Det intracellulære Analysen inkluderer et trinn for å fjerne all væske som inneholder fristilt materiale fra brønnene før tilsetningen av den luciferasereagens. Dette trinnet er utformet for å øke signal-til-støy-forhold og samtidig redusere mengden reagens som anvendes pr. Imidlertid kan inkludering av dette trinnet generere falske positive data for forbindelser som dreper THP-1, men ikke M. tuberculosis, ettersom frittliggende og lysert THP-1 og frittflytende M. tuberculosis ville bli fjernet. Derfor bør fabrikantens foreslåtte protokoll for å tilsette like mengder av luciferase-reagens (100 ul) til hver brønn bli fulgt for å analysere for M. tuberculosis overlevelse i brønner inneholdende cytotoksiske forbindelser.
I motsetning til den ildflue luciferase-systemet, gjør det bakterielle lux systemet ikke krever ekstern reagenser for signalgenerering 26. Derimot,at ildflue-systemet er foretrukket fremfor lux system av følgende grunner: For det første kan det bakterielle systemet være giftig i mykobakterier 26. For det andre, et mer komplekst system reporter (5 genene for lux mot 1 genet for ildflue) er mer utsatt for å signalisere hemning av testforbindelsene. Til slutt, kommersielt tilgjengelige reagenser for ildflue luciferase-analysen tilveiebringe de nødvendige betingelser for optimal signalgenerering. På den annen side baserer seg på bakteriell luciferase-systemet på ATP-produksjon, og de kofaktorer som er tilstede inne i bakteriene for signalgenerering. Disse kan variere mellom ulike behandlinger og er ikke så lett å kontrollere. Derfor er tilsetning av luciferase reagensen i ildflue systemet standardiserer reaksjonsbetingelsene og gir mer pålitelige målinger av luciferase-aktivitet i alle behandlinger.
CFU bestemmelse har lenge være gullstandard for kvantifisering av bakterietetthet. I kontrakten, bioluminescence, som de fleste journalister, er ikke et direkte mål på bakterier. I stedet er RLU en funksjon av både CFU og den metabolske tilstand i bakteriene. Andre har vist at stort sett lineært forhold mellom RLU og CFU for bioluminescerende mykobakterier under spesifikke betingelser 5. I alle fall, en betydelig reduksjon i luciferaseassay signal, uansett den underliggende årsaken til annet enn det faktiske inhibering av luciferase-enzymaktivitet ville indikere en reduksjon av M. tuberculosis trim inne i vertscellen. Derfor ville disse forbindelser være av interesse fra et medikament screenings standpunkt, og skal ikke utelukkes i metodeutvikling.
Et alternativ til den luciferase-baserte intracellulær screeningprotokollen er automatisert fluorescens mikroskopi basert tilnærming 11, 27, 28, 29. luciferaseAnalysen produksjon måles ved et luminometer, og de oppnådde data er kvantitativt, mens fluorescerende mikros genererer bilder som er kvalitative. Men gjennom smarte dataprogrammering, bilder kan bli analysert for å generere kvantitative data. Videre tillater fluorescens mikroskopi flere fluoroforer som skal benyttes samtidig, noe som er svært nyttig for oppsamling av verdifulle parametre som celleviabilitet, celletelling, og den faktiske hastighet for infeksjon. Som man kunne forutsi disse fordelene komme med noen tilbakeslag. Den innledende investeringen på automatisert fluorescerende mikroskopi utstyr er mange ganger større enn kostnaden for et luminometer eller fluorometer og er derfor ute av rekkevidde for mange forskningslaboratorier. For de som har tilgang til utstyr, må den type behandling tas i betraktning før bildeinnsamling og dataanalyse. De to trinn påvirke den totale investering med økning i biblioteket størrelse. Innlemmelsen av ytterligere fluorescerende markører i vertsceller requires fiksering, beising, og vasketrinn, noe som nødvendiggjør ytterligere innblanding fra brukeren og tids investeringer. Videre fluorescerende mikros datainnsamling og analyse, selv om automatisert, krever likevel betydelig mer tid og ressurser enn den enkle luciferaseanalysen avlesning. Derfor er det luciferase reporter-baserte intracellulær screening-metoden enklere og i stand til høyere gjennomstrømning.
Luciferase-baserte intracellulær screeningsmetode har en betydelig begrensning i forhold til fluorescerende mikroskop Baserte utsilingsmetoder. Dette skyldes det faktum at den luciferase-analysen gir ingen data vedrørende helsetilstanden til vertsmakrofager. Cytotoksiske forbindelser vil føre til døden av makrofager, og dermed levende bakterier kan bli frigjort i mediet, og vil ikke lenger kan bidra til den endelige luciferaseanalysen signal. Som et resultat, ville cytotoksiske forbindelser synes å føre til døden av intracellulære M. tuberculosis og således generatea stort antall falske positiver. For å løse dette problemet, har vi supplert vår metode med et MTT-assay for å bedømme cytotoksisiteten til forbindelsene på vertmakrofager. Denne modulen av screening-metoden gir oss tilleggsinformasjon om den drugability av forbindelser av interesse og tillater tidlig eliminering av mindre enn ideelle legemiddelkandidater.
Alternativt kan man også bruke luciferase-baserte intracellulær analyse forut for å utføre automatisert fluorescens mikroskopi. I skjermer av store sammensatte biblioteker, gjør dette for rask og effektiv vurdering av sammensatte effektivitet i makrofagen infeksjonsmodell. Som et resultat, kan automatisert fluorescerende mikros være reservert for detaljerte studier på bedre kandidater, som illustrert ved en tidligere publisert studie 11.
Den lave kostnader og enkel natur luciferase-baserte intracellulære analysen også i stor grad fordeler forskere som ønsker å teste småer kjemiske biblioteker. Totalt var luciferase-baserte intracellulær analysen har vist seg å være et svært fleksibelt verktøy for forskningslaboratorier av alle kalibre og for screening prosjekter av forskjellige størrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
- WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
- USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
- Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
- Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
- Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
- Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
- Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
- ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
- Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
- Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
- Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
- Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
- Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
- Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
- Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
- Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
- Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
- Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
- Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).
