Summary
Vi har utvecklat ett modulärt högeffektiv screening-system för att upptäcka nya föreningar mot Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellulära och i-buljong växande bakterier samt cytotoxicitet mot däggdjursvärdcellen.
Introduction
Mycobacterium tuberculosis, det medel som förorsakar tuberkulos (TB), är en ledande orsak till morbiditet och mortalitet över hela världen. Läkemedelskänslig TB är en behandlingsbar sjukdom som kräver flera antibiotika för en period av 6 månader. Trots att en behandlingsbar sjukdom, var TB dödligheten uppskattas till 1,5 miljoner 2015 1. Under de senaste 10 åren har det ökat oron över förekomsten av läkemedelsresistent M. tuberculosis. Multiresistent TB (MDR-TB) definieras som TB som är resistent mot åtminstone Isoniazid (INH) och Rifampicin (RMP), och de flesta MDR-TB stammar är också resistenta mot välja andra linjens TB-droger, vilket begränsar behandlingsalternativen . Effekterna av läkemedelsresistens skapa en större utmaning för behandling av patienter som samtidigt är infekterade med humant immunbristvirus (HIV); 400.000 patienter över hela världen dött av HIV-associerad TB 2015 1. Beklagansvärt, USA Food and Drug Administranson har godkänt endast en ny TB läkemedel mot MDR-TB, bedaquiline, under de senaste 40 åren 2. Framsteg i att hitta bättre och kortare TB terapier finns ett trängande behov för att ligga steget före i kampen mot tuberkulos och MDR-TB.
Traditionellt är TB drogskärmar utföras under in vitro odlingsbetingelser i tillväxtmedium, varvid föreningarna tillsätts till en växande kultur och deras effektivitet i att utrota mikroorganismerna bestäms genom att räkna kolonibildande enheter (CFU) på fast medium. Eftersom CFU räknas är arbetskrävande, tidskrävande och kostsamt, har olika indirekta metoder utvecklats för att lindra detta problem. Sådana metoder innefattar viabilitetsanalys den Alamar Blue 3, bestämningen av fluorescens 4 från grönt fluorescerande protein (GFP) eller luminescens 5 från luciferas-uttryckande bakterier, och uppskattningen av total adenosintrifosfat (ATP) 6, 7.
Typisk TB kännetecknas av en tuberkulos infektion i lungan, där bakterierna vistas och replikera inuti fagosomer av alveolära makrofager 8 M.. Den enkla in-buljong fenotypisk skärmen kan passa extracellulära patogener; emellertid, i historiskt perspektiv, slog föreningar mot M. tuberculosis identifierades med användning av denna metod misslyckas ofta med att leva upp till förväntningarna under nedströmsvalideringssteg i infektionsmodeller. Vi föreslår att TB läkemedel utförs bäst i en intracellulär värdcell infektion modell. Ändå intracellulära modeller har många tekniska och biologiska hinder för high-throughput screening (HTS) utveckling. Ett stort hinder är komplexiteten i infektionsprocessen, exemplifieras av ett stort antal steg och genomarbetade avlägsnande av extracellulära bakterier genom in-mellan tvätt. En andra stora hindret är den långa tid requirements, som tillväxtdetektering, normalt genom CFU räknar med odlingsplattor, är en process som tar över tre veckor att slutföra. En lösning för att ersätta CFU counts har tillhandahållits av automatiserad fluorescerande mikroskopi i kombination med fluorescerande bakterier. Detta förutsätter dock lösning en initial investeringar i utrustning som är utom räckhåll för många forskningslaboratorier. En enkel, billig, och sjukdomsrelevanta HTS metod skulle i hög grad öka läkemedelsupptäcktsprocessen.
I denna studie rapporterar vi en ny, modulärt HTS-system som syftar till att ge en snabb och mycket skalbar, men ekonomiska, analys lämplig för bestämning av aktiviteten hos föreningarna mot intracellulär M. tuberculosis. Detta system består av tre moduler: (i) intracellulära, (ii) cytotoxicitet, och (iii) i-buljong analyser. Den kombinerade slutresultatet ger en omfattande beskrivning av de sammansatta egenskaper, med ytterligare information beträffande den potentiella verkningsmekanism. denna screening systemet har använts i flera projekt med olika föreningsbibliotek som är inriktade verkningsmekanism, inklusive analys av läkemedels synergi 9, stimulering av autophagy 10, och inhiberingen av M. tuberculosis -secreted virulensfaktor (opublicerad). Föreningar av okänd verkningsmekanism har också studerats 11. En modifierad version av denna metod antogs också av vår industriell partner som den primära screeningmetod för att identifiera nya föreningar mot intracellulär M. tuberculosis 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriell Sila och tillväxtmedium
- Göra albumin dextros och saltförrådslösning (ADS) genom solubilisering 25 g bovint serumalbumin, 10,0 g dextros och 4,05 g natriumklorid i 460 ml avjoniserat vatten. Filter-sterilisera ADS och förvara vid 4 ° C.
- Göra 7H9-buljong genom att tillsätta 4,7 g av 7H9 pulver och 2 ml av glycerol till 900 ml renat vatten. Autoklavera 7H9 buljong vid 121 ° C under 10 minuter och låt den svalna till rumstemperatur innan man går vidare. Göra 7H9ADST genom att tillsätta 100 ml ADS och 0,5 ml Tween 80 till 900 ml 7H9-buljong. Lagra vid 4 ° C.
- Väger 50 mg kanamycinsulfat och lös upp i 1 ml avjoniserat vatten; den slutliga koncentrationen är 50 mg / ml. Filter-sterilisera och förvara vid -20 ° C. Lägga 0,5 ml kanamycin stamlösning per 1 L av 7H9ADST.
OBS: Detta medium bör göras färska, så skala volymerna lämpligt enligt kultur storlek. - Odla M. tuberculosis i 7H9ADST kompletterat med kanamycin i stående kultur. Skaka kulturen dagligen och späda ut det innan OD600 når 1,0 för att undvika klumpar.
OBS: M. tuberculosis-stam som används för utvecklingen av denna metod H37Rv transformerad med pJAK2.A plasmiden 12. pJAK2.A är en integrerande plasmid baserad på pMV361-vektorn, som möjliggör hög nivå uttryck av eldflugeluciferasgenen från hsp60-promotorn och kan väljas med kanamycin.
2. THP-1 medium och underhåll
- Lägga 50 ml värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) och 5 ml 200 mM L-glutamin till 500 ml av RPMI 1640 för att göra RPMI ofullständig medium (cirka 10% FBS och 2 mM glutamin).
- Upprätthålla en THP-1-cellkultur enligt standardprotokoll 13. I korthet, växa THP-1-celler i RPMI ofullständig mediet under bibehållande av en celldensitet av 0,2 till 1 miljon per ml medium mellan pasvise.
3. hög kapacitet Intracellulär Screening Använda luciferas-uttryckande M. tuberculosis H37Rv
- Mäta den optiska densiteten hos en aktivt växande bakteriesuspension i en spektrofotometer vid en våglängd av 600 nm. Beräkna bakterietäthet med användning av omvandlingsfaktor på 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 bakterier per ml.
- Pipettera ut tillräckligt med bakterier för en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10: 1 till en ny centrifugrör. Pellet vid 3000 xg under 10 min och aspirera vätska. Tillsätt 50 mikroliter av humant serum till 450 mikroliter av RPMI1640. Skala volymen till lämpliga värden för experimentet.
- Att opsonisera bakterierna, resuspendera pelleten i en densitet av 1 x 10 8 bakterier per 500 | il RPMI1640 innehållande 10% humanserum. Låt blandningen inkubera vid 37 ° C under 30 min. Bestämma den THP-1 cellkulturtäthet genom räkning med en hemocytometer och en inverterad microscope.
- Pelletera cellerna i sterila centrifugrör vid 100 xg och 37 ° C under 10 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i RPMI ofullständig vid en densitet av 1 miljon celler per ml. Lägga forbol-12-myristat-13-acetat (PMA) till en 40 ng / ml slutlig koncentration.
OBS: Detta kommer att kallas differentiering mix. - Kombinera opsoniserad M. tuberculosis med THP-1 differentiering blandningen vid en MOI av 10: 1 och delprov den slutliga blandningen på 100 mikroliter per brunn i en 96-brunnars flatbottnad vit platta. Regelbundet rör blandningen för att säkerställa enhetlighet. Tillåta differentiering och infektionen fortgå över natten vid 37 ° C i en fuktad inkubator innehållande 5% CO2.
- Tvätta brunnarna två gånger med 100 mikroliter av RPMI vardera. Lägga föreningar utspädda till de önskade koncentrationerna i RPMI ofullständiga och inkubera under 3 dagar.
- Aspirera mediet från brunnarna. Tillsätt 50 pl av luciferas analysreagens till varje brunn. Försegla plattorna med töppen för insyn adhesiva plattförslutare. Tillåta 5 min av inkubation vid 22 ° C och sedan erhålla en avläsning i en luminometer på 1 s per brunn.
4. Cytotoxicitet Analys Med användning av en 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) -analys 14
- Differentiera THP-1-celler i RPMI ofullständig kompletterat med 40 ng / ml PMA i klara 96-brunnars plattor. Upprätthålla en celltäthet av 1 miljon per ml och delprov 100 mikroliter per brunn. Tillåta differentiering fortgå över natten vid 37 ° C i en fuktad inkubator innehållande 5% CO2.
- Aspirera mediet från brunnarna och tvätta dem två gånger med RPMI 1640. Lägg föreningar utspädda i RPMI ofullständiga till brunnarna. Inkubera i 3 dagar.
- Lös upp 0,5 g av MTT i 100 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att göra en förrådslösning av 5 mg / ml. Sterilt filter och förvara vid -20 ° C, borta från ljus; är det bäst att göra denna lösning färskt.
- 2,5 h before slutet av 3-dagars inkubationsperioden tillsätt 25 | il av MTT-lösning till varje brunn och slutföra inkubationsperioden.
- Förbereda 50% N, N-dimetyl-formamid (DMF) genom att blanda 250 ml DMF med 250 ml avjoniserat vatten.
- Förbereda MTT extraktionsbuffert enligt följande: Väg upp 100 g av SDS i en 500-ml flaska och tillsätt 300 ml 50% DMF. Applicera låg värme för att göra det möjligt för SDS att upplösas. Tillsätt 10 ml ren ättiksyra och 12,5 ml 1 M HCl. Fyll upp till 500-ml märket med 50% DMF; den slutliga sammansättningen av extraktionsbufferten är 50% DMF, 20% SDS, 2,5% ättiksyra och 2,5% 1 M saltsyra.
- Vid slutet av behandlingsperioden, tillsätt 100 | il extraktionsbuffert (värmdes till 45 ° C för upplösning några kristaller) och varje brunn. Låt blandningen inkubera över natten vid 37 ° C i en fuktad inkubator innehållande 5% CO2. Läs absorbansen vid 570 nm.
OBS: cytotoxicitetsanalysen utförs bäst parallellt med en intracellular skärmen med hjälp av samma sats och ålder av THP-1-celler.
5. In-buljong Aktivitet Analys Med hjälp av en Resazurin Assay 3
- Växa M. tuberculosis i 7H9ADST till mitten av log-fasen (~ 0,5-0,8 OD 600). Späd kulturen med 7H9ADST till 0,01 OD 600. Späda föreningarna i 7H9ADST till 2x testkoncentrationer och alikvot 100 pl av varje utspädd förening i varje brunn.
- Överföra 100 mikroliter av den utspädda bakteriesuspension i varje brunn. Tillåta plattorna inkubera vid 37 ° C i en fuktad inkubator under 5 dagar. Lös upp 10 mg resazurin i 100 ml avjoniserat vatten och sterilfilter.
- Tillsätt 30 mikroliter av resazurin lösning och övervaka färgförändring efter 48 h; bakteriell tillväxt indikeras av en färgomvandling från blått till rosa.
OBS: En kvantitativ analys kan även utföras genom att mäta antingen fluorescensen vid 590 nm med excitation vid 530 till 560nm eller absorbansen vid 570 nm och 600 nm 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hög genomströmning intracellulär screening med hjälp av M. tuberculosis uttrycker luciferasgenen
Figur 2A och tabell 1 innehåller rådata som samlas in av luminometern, uttryckta i relativa luminiscerande heter (RLU), som visar effekten av en ökande koncentration av TB läkemedels rifampicin på M. tuberculosis inuti THP-1-celler. Figur 2A är ett spridningsdiagram av rå luminiscens uppmätt i RLU för olika koncentrationer av rifampicin. Felstaplarna visar standardfelet av medelvärdet (SEM). Figur 2B visar den procentuella reduktionen i luminescens i behandlade brunnar i jämförelse med de obehandlade brunnarna. Data visar att rifampicin är i stånd att reducera> 99,9% av RLU från intracellulär M. tuberculosis i en koncentration av 0,1 | ig / ml. Detta är i enlighet med previously publicerade MIC mellan 0,1 och 0,4 | ig / ml 16. Luminiscens som produceras i varje brunn är en indikation på den totala luciferas uttryckt av M. tuberculosis och sålunda är en indikator på den metaboliska statusen för M. tuberculosis inuti brunnen. Det är normalt att rå självlysande nivåer att variera mellan experiment. Som sådan skulle en jämförelse av rådata genererar otillförlitliga slutsatser. Sålunda bör de data som normaliseras mot en definierad negativ kontroll, vilket skulle vara proverna som behandlats med endast DMSO. De resulterande värdena kan uttryckas som minskningen i M. procent tuberculosis i brunnarna (Figur 2B).
Cytotoxicitet analys med användning av MTT-analysen
MTT-analysen är en väl etablerad analys för eukaryot cytotoxicitet. Denna kolorimetrisk analys indikerar levande celler genom omvandling av MTT (gul) tillpurpurfärgad formazan. Denna analys utförs utan en infektion av M. tuberculosis eftersom bakterierna har förmåga att metabolisera MTT, vilket reducerar den observerade toxiciteten hos föreningarna. Ett vanligt förslag för MTT-analysen är att använda media utan pH-indikatorn fenolrött grund av absorptionen vid 570 nm 17. Emellertid, är den surgjorda extraktionsbuffert som beskrivs i denna metod kunna minimera störningar som orsakas av fenolrött 17.
Figur 3 illustrerar cytotoxiciteten förorsakad av en ökande koncentration av en testförening kodad G1-1H. Normalt, är en 50% inhiberande koncentration (IC 50) som används för att indikera nivån av cytotoxicitet. I fallet med G1-1H, koncentrationer av 10 | iM och 3 ^ M är klart under IC 50 koncentration.
In-buljong aktivitetsanalys ossing av resazurin-analysen
Den resazurin-analysen används ofta för analys av cytotoxicitet i eukaryotiska celler, men det kan också användas för att övervaka levande bakterier i buljong 3. Den resazurin-analysen är en redox-baserad analys som liknar den MTT-analysen. Den mäter NADPH nivåer och NADPH-dehydrogenas aktivitet genom omvandling av resazurin till resorufin, en röd fluorofor. Det enklaste och snabbaste sättet att bestämma läkemedlets effektivitet är att leta efter den lägsta behandlingskoncentrationen där brunnarna förblir blå färg. Figur 4 visar en del av en 96-brunnsplatta som visar effekterna av olika koncentrationer av de antibiotiska apramycin har på resazurin omvandling av M. tuberculosis. I-buljong MIC bestämdes vara mellan 2,5 och 5 | ig / ml. Detta är något högre än den tidigare publicerade värdet av 1,5 | ig / ml 18, men det är fortfarande väl inom acceptable intervall. I många fall är färgförändring ganska gradvis, så det är svårt att göra en säker bestämning. Under dessa betingelser, är det bättre att kvantifiera den faktiska mängden resazurin omvandling med användning av antingen absorbans eller fluorescens. På grund av de liknande absorbansvärden egenskaper resazurin och resorufin, MIC-bestämning med användning av absorbans kräver mätningar med användning av två olika våglängder och komplexa beräkningar 15. Därför, är den bästa metoden för att mäta fluorescens med användning 530- till 560-nm exciteringsvåglängder och en 590-nm emissionsvåglängd, såsom beskrivits i tillverkarens litteratur 15.
Figur 4 illustrerar en potentiell källa till bristande överensstämmelse associerad med multiday inkubationer som drastiskt kan förändra screeningsresultat. Pga felaktig fukt av 37 ° C inkubator användes för detta experiment, brunnar på kanterna av p lates lidit väsentligt mer avdunstning. Alla 15 DMSO-behandlade brunnar ska vara identiska, men brunnarna längs vänster och övre kanterna hade minskade volymer. Dessa brunnar verkar också ha olika färger än de andra DMSO-behandlade brunnar i mitten av plattan. Samma inkonsekvens kan också observeras i 2,5 ug / ml apramycin-behandlade brunnar. I detta fall skulle den minskade volymen också leda till en kvantitativ avläsning av en spektrofotometer och fluorometer. Avdunstning blir betydande för alla experiment med förlängda inkubationstider, så man måste vara försiktig för att hålla inkubatorer väl fuktad för att undvika denna källa till inkonsekvens.
Figur 1: Metod Schematics. Schema som avbildar analysscheman för 3 separata moduler av high-throughput screening systemet. _upload / 55.273 / 55273fig1large.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representant Data från en Intracellulär att undersöka effektiviteten av Rifampicin i Eliminera M. tuberculosis inuti THP-1-celler. (A) Diagram av medel luminescens behandlingen (i relativa luminiscens enheter) för varje behandling (rifampicin) koncentration. Felstavarna anger standardfelet av medelvärdet för varje tre exemplar. (B) Diagram av den beräknade procentuella reduktionen i luminescens som orsakas av en behandling av rifampicin, där högre värden indikerar större effektivitet. Den 90% inhiberande koncentrationen (IC 90) i detta fall är någonstans mellan 0,01 och 0,1 | ig / ml.nk "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa uppgifter från en Cytotoxicitet (MTT) analys för att undersöka de toxiska effekterna av Förening G1-1H på Differentierade THP-1-celler. Diagram över den beräknade "procent av kontroll" värden för varje koncentration av behandlingsföreningen G1-1H, där högre värden indikerar mer sund THP-1-celler. IC 50 i detta fall är någonstans mellan 10 och 30 | iM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa Data från en Resazurin Assay att Undersök Effectiveness av Apramycin vid Inhiberande M. tuberculosis I-buljong. Endast kvalitativa data samlas i detta fall på grund av begränsningar i biosäkerhetsnivån 3 (BSL3) lab utrustning. Fotot visar en del av en 96-brunnsplatta innehållande M. tuberculosis behandlades med antingen DMSO eller varierande mängder av apramycin. De DMSO-behandlade brunnar uppvisade en omvandling av resazurin till resorufin, såsom indikeras av färgkonvertering från blått till rosa. De apramycin behandlade proverna undergick tydligt färgomvandlings under 5 | j, g / ml. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| [Rifampicin] | REP1 | REP2 | REP3 | % Reduktion | |
| 4 | ig / ml | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1 | ig / ml | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0,1 | ig / ml | 1037 | 731 | 976 | 915 | 98 |
| 0,01 | ig / ml | 19200 | 24400 | 23919 | 22.506 | 54 |
| 0 | ig / ml | 39.877 | 49655 | 57.728 | 49.087 | 0 |
Tabell 1: Rådata från luciferas analys för bestämning av den intracellulära IC 90 av rifampicin.
| [G1-1H] | Rep en A570 | Rep 2 A570 | Rep 3 A570 | genomsnittlig A570 | % Av obehandlad |
| 30 ^ M | 0,056 | 0,056 | 0,055 | 0,056 | 7 |
| 10 ^ M | 0,518 | 0,488 | 0,492 | 0,499 | 62 |
| 3 ^ M | 0,652 | 0,638 | 0,656 | 0,649 | 80 |
| 0 ^ M | 0,822 | 0,782 | 0,815 | 0,806 | 100 |
Tabell 2: Rådata från MTT-analys för bestämning av cytotoxicitet av testförening G1-1H vid different Koncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denna studie var att skapa en enkel och kostnadseffektiv HTS metoden med hjälp av en mänsklig intracellulär infektionsmodell för M. tuberculosis. Tuberkulos är en human sjukdom kännetecknad av infektion av alveolara makrofager av M. tuberculosis. På grund av biosäkerhet frågor har forskning med biologiska modeller av både bakterien och värdcellerna använts tidigare. Emellertid har det visat sig att användningen av surrogat bakterier och icke-mänskliga modeller är dåliga prediktorer för hit till bly framgång i läkemedelsutveckling, vilket indikerar att läkemedelsscreening görs bäst med mänskliga celler infekterade med M. tuberculosis 19, 20, 21, 22.
I denna metod har vi avancerat och anpassat nuvarande state-of-the-art screeningprotokoll för den humana makrofag-liknande THP-1-cell-linje. För att uppnå höggenomströmning, introducerade vi flera tekniska förbättringar av infektionsprotokollet. Först och främst, ersatte vi alla steg som ingår i CFU beslutsamhet och ersättas dem med en luciferas-baserad reporter system. Eldflugeluciferas valdes på grund av den enkla slutpunktsanalys, den snabba nedbrytning genom värdcell lysosomen enzymer, och de minimala krav på utrustning. Denna substitution elimineras effektivt en 30-dagars inkubationstid, samt arbetskostnader och förbrukningsartiklar i samband med plätering och koloniräkningssteg.
En andra stor förbättring vi infört var satsvis bearbetning och infektion, vilket ytterligare förbättrar genomströmningen och överensstämmelse mellan brunnarna med en enklare infektion protokoll. Genom att kombinera differentiering och infektionssteg i ett enda steg, kunde vi korta protokollet med en dag. Samtidigt kunde vi minska de tre omgångarna av tvätt som normalt skulle uppstå mellan differentiering och infection, som är en källa till eventuell THP-1-cellförlust på grund av lösgör.
Detta protokoll har utvecklats för screening inne i THP-1-cellinjen, som ger flera fördelar. THP-1, som en immortaliserad cellinje, kan vara tillförlitligt odlas in vitro under mer än 20 passager 23. Detta är särskilt viktigt för stora screeningkampanjer, där det kan vara svårt att upprätthålla tillräckligt med celler för att leverera en hög genomströmning setup. Dessutom ger testning i THP-1 en homogen genetisk bakgrund som minimerar variabiliteten i resultaten. Detta är mycket fördelaktigt för att testa föreningar som påverkar värdcellsresponser 10. Som en extra bonus, kan genuttrycket i THP-1-cellinjen vara nedregleras av små interfererande RNA (siRNA) 24. Detta ger ett värdefullt verktyg för nedströms undersökningar av verkningsträffföreningar. Även om denna metod utformades med användning THP-1-cellinjen, detkan lätt anpassas för humana primära celler, såsom perifera mononukleära blodceller (PBMC), som tidigare visats 10.
Att bäst efterliknar den faktiska samverkan mellan alveolära makrofager och M. tuberculosis innefattar den intracellulära analysprotokoll ett steg att opsonisera bakterierna. Opsonisering med humana serum rockar M. tuberculosis och underlättar cellinträde via komplementreceptor tre (CR3) 25. Nakna bakterier är mer benägna att gå in makrofager via lektin receptorn 8. Med tanke på att bronkoalveolär fluiden är känd för att innehålla komponenter av humant serum 25, opsonisering, eller bristen därav, kan ha en grundläggande inverkan på screening resultatet. Emellertid kan vissa väljer att hoppa över detta steg för att ytterligare förenkla infektionsprocessen 16, eller det kan inte vara möjligt att erhålla tillräckligt med humant serum på grund av storleken av library som screenas 11.
Den intracellulära analysen innefattar ett steg för att avlägsna all vätska innehållande obundet material från brunnarna före tillsatsen av luciferas reagenset. Detta steg är utformat för att öka signal-brusförhållande och samtidigt minska den mängd reagens som används per brunn. Emellertid kan inkluderandet av detta steg genererar falska positiva data för föreningar som dödar THP-1 men inte M. tuberculosis, eftersom fristående och lyserades THP-1 och fritt flytande M. tuberculosis skulle avlägsnas. Därför bör tillverkarens föreslagna protokoll av tillsats av lika mängder av luciferas-reagens (100 | il) till varje brunn följas för att analysera för M. tuberculosis överlevnad i brunnar innehållande cytotoxiska föreningar.
Till skillnad från eldfluga luciferas-systemet, inte bakterie lux systemet inte kräver externa reagens för signalgenerering 26. Dock,eldfluga systemet är att föredra över lux systemet av följande skäl: För det första kan det bakteriella systemet vara toxiska i mykobakterier 26. För det andra är en mer komplex reportersystem (5 gener för lux kontra en gen för firefly) mer känsliga för signal hämning med testföreningar. Slutligen, kommersiellt tillgängliga reagens för eldflugeluciferas-analysen ge förutsättningar för optimal signalgenerering. Å andra sidan förlitar sig bakteriellt luciferas-systemet på ATP-produktionen och de kofaktorer finns inuti bakterierna för signalgenerering. Dessa kan variera mellan olika behandlingar och är inte lika lätt att kontrollera. Därför tillsatsen av luciferas reagenset till eldfluga systemet standardiserar reaktionsbetingelserna och ger mer tillförlitliga mätningar av luciferasaktivitet över alla behandlingar.
CFU beslutsamhet har länge vara guldmyntfoten för att kvantifiera bakteriell densitet. I kontraktet, Bioluminescence, liksom de flesta reportrar, är inte ett direkt mått på bakterier. Istället är RLU en funktion av både CFU och metaboliska tillstånd bakterierna. Andra har visat att det mestadels linjärt förhållande mellan RLU och CFU för bioluminiscenta mykobakterier under specifika förhållanden 5. I varje fall, en betydande minskning av luciferasanalysen signalen, oavsett den underliggande orsaken-andra än den faktiska hämning av luciferas enzymaktivitet-skulle indikera en minskning av tuberkulos kondition M. inuti värdcellen. Därför skulle dessa föreningar vara av intresse från en drogscreening synvinkel och bör inte uteslutas i metodutveckling.
Ett alternativ till den luciferas-baserade intracellulära screeningprotokoll är den automatiserade fluorescerande mikroskopi baserat tillvägagångssätt 11, 27, 28, 29. luciferasanalys utgång mätes med en luminometer, och erhållna data är kvantitativ, medan fluorescensmikroskopi genererar bilder som är kvalitativa. Men genom smart datorprogrammering, bilder kan analyseras för att generera kvantitativa data. Vidare medger fluorescensmikroskopi multipla fluoroforer som skall användas samtidigt, vilket är mycket användbart för att samla värdefulla parametrar såsom cellviabilitet, cellräkningar, och faktiska andelen infektion. Som man kan förutsäga dessa fördelar kommer med några bakslag. Den initiala investeringen på automatiserad fluorescensmikroskopi utrustning är många gånger större än kostnaden för en luminometer eller fluorometer och är därför utom räckhåll för många forskningslaboratorier. För dem som har tillgång till den utrustning måste provet bearbetning anses före bildtagning och dataanalys. Dessa två steg påverkar den totala investering i tid med ökningar i biblioteket storlek. Införandet av ytterligare fluorescerande markörer i värdceller requires fastställande, färgning, och tvättningssteg, vilket sålunda nödvändiggör ytterligare åtgärder från användaren och tids investeringar. Dessutom fluorescerande insamling mikroskopi och analys av data, även om automatiserad, kräver fortfarande betydligt mer tid och resurser än den enkla luciferasanalysen avläsning. Därför är luciferas reporterbaserade intracellulära screeningsmetod enklare och som kan högre genomströmning.
Luciferas-baserad intracellulär screeningmetod har en signifikant begränsning jämfört med fluorescerande mikroskop baserad screeningmetoder. Detta beror på det faktum att luciferas-analysen ger inga uppgifter om hälsotillstånd värdmakrofager. Cytotoxiska föreningar skulle orsaka döden av makrofager, och således levande bakterier kan frisättas i mediet och skulle inte längre bidrar till den slutliga luciferasanalysen signal. Som ett resultat, skulle cytotoxiska föreningar verkar för att orsaka död av intracellulär M. tuberculosis och därmed geneea stort antal falska positiva resultat. För att lösa detta har vi kompletterat vår metod med en MTT-analys för att bedöma cytotoxiciteten av föreningar på värdmakrofager. Denna modul i screeningmetod ger oss ytterligare information om drugability av föreningar av intresse och möjliggör tidig eliminering av mindre än ideal läkemedelskandidater.
Alternativt kan man också använda luciferas-baserade intracellulära analys innan man utför automatiserad fluorescensmikroskopi. I skärmar av stora substansbibliotek, gör detta för snabb och effektiv utvärdering av förening effektivitet i makrofager infektionsmodell. Som ett resultat kan automatiserad fluorescensmikroskopi reserveras för detaljerade studier på bättre kandidater, vilket framgår av en tidigare publicerad studie 11.
Den låga kostnaden och enkel typ av luciferas baserade intracellulära analysen också i hög grad gynnar forskare som vill testa småer kemiska bibliotek. Sammantaget har luciferas baserade intracellulära analys visat sig vara ett mycket flexibelt verktyg för forskningslaboratorier i alla kalibrar och för screening av projekt av olika storlekar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
- WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
- USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
- Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
- Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
- Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
- Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
- Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
- ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
- Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
- Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
- Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
- Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
- Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
- Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
- Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
- Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
- Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
- Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
- Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).
