Zoogdiercelcapsulatie in Alginaatkralen Met Een Eenvoudig Verrijkt Vaartuig

Summary

Deze video en manuscript beschrijven een emulsie gebaseerde methode om zoogdiercellen in 0,5% tot 10% alginaatkralen te inkapselen die in grote batches kunnen worden geproduceerd onder gebruikmaking van een eenvoudig geroerd vat. De ingekapselde cellen kunnen in vitro worden gekweekt of getransplanteerd voor toepassingen op het gebied van cellotherapie.

Abstract

Cellincapsulatie in alginaatkralen is gebruikt voor geïmmobiliseerde celcultuur in vitro , alsmede voor immunoisolatie in vivo . Inbeslagneming van de alvleesklier is uitgebreid bestudeerd als middel om het overleving van het eiland te verhogen bij allogene of xenogene transplantaties. Alginale inkapseling wordt vaak bereikt door spuit extrusie en externe gelering. Met behulp van deze werkwijze vallen celhoudende alginaatdruppels die gevormd worden aan de punt van mondstukken in een oplossing die tweewaardige kationen bevat die ionotrope alginaatgelering veroorzaken als ze in de druppels diffunderen. De vereiste druppelvorming bij de mondstukpunt beperkt de volumetrische doorvoer en alginaatconcentratie die bereikt kan worden. Deze video beschrijft een schaalbare emulgeringswerkwijze om zoogdiercellen in 0,5% tot 10% alginaat te inkapselen met 70% tot 90% celoverleving. Door deze alternatieve werkwijze worden alginaatdruppeltjes die cellen en calciumcarbonaat bevatten geëmulgeerd in minerale olie, folVerminderd door een afname in de pH die leidt tot interne calciumvrijstelling en ionotrope alginaatgelering. De huidige methode laat de productie van alginaatkralen binnen 20 minuten emulgeren toe. De benodigde apparatuur voor de inkapselingstap bestaat uit eenvoudige geroerde vaten die beschikbaar zijn voor de meeste laboratoria.

Introduction

Mammale celincapsulatie is breedweg bestudeerd als een middel om getransplanteerde cellen te beschermen tegen immuunafwijzing ¹ of om een ​​driedimensionale ondersteuning voor geïmmobiliseerde celcultuur ^{2 , 3 , 4 te verschaffen} . Pancreatische holle capsule in alginaatkralen is gebruikt om diabetes in allogene ^{5 , 6} of xenogene ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} knaagdieren om te keren. Preklinische en klinische studies van ingekapselde transplantatie van het alvleesklier om typ 1 diabetes te behandelen zijn aan de gang ^{13 , 14 , 15} . Voor transplantatie toepassingen of grotere schaalIn vitro geïmmobiliseerde celproductie worden in de buisgeneratoren op mondstuk gebaseerde spuitgeneratoren algemeen gebruikt. Typisch wordt een mengsel van alginaat en cellen gepompt door een mondstuk om druppels te vormen die in een geroerde oplossing bevattende divalente kationen, resulterend in de externe gelering van de druppels, vallen. Coaxiale gasstroom ^{16 , 17} , spuitvibratie ¹⁸ , elektrostatische afstoting ¹⁹ of roterende draden ²⁰ vergemakkelijken druppelvorming bij de mondstukpunt.

De belangrijkste nadelen van conventionele kraalgeneratoren zijn hun beperkte doorvoer en het beperkte bereik van oplossingsviscositeiten die resulteren in voldoende kraalvorming ²¹ . Bij hoge stromingssnelheden breekt de vloeistof uit het mondstuk op in druppels kleiner dan de diameter van de mondstuk, afnemende maatregeling. Multi-nozzle kraalgeneratoren kunnen worden gebruikt om de doorvoer te verhogen, maarDe uniforme verdeling van de stroming tussen de mondstukken en het gebruik van oplossingen> 0.2 Pas is problematisch ²² . Ten slotte wordt verwacht dat alle mondstukken gebaseerd zijn op schade aan eilandjes, aangezien de diameter van de gebruikte spuitpunten tussen 100 μm en 500 μm bedraagt, terwijl ~ 15% van de menselijke holtes groter dan 200 μm ^{23 kan zijn} .

In deze video beschrijven we een alternatieve methode om zoogdiercellen te inkapselen door druppels te vormen in een enkele emulgeringsstap in plaats van drop-by-drop. Aangezien de kraalproductie in een eenvoudig geroerd vat wordt uitgevoerd, is de methode geschikt voor kleine (~ 1 ml) tot grootschalige (10 ³ L-range) kraalproductie met lage apparatuurskosten ²⁴ . Met deze methode kan de productie van kralen met hoge sfericiteit worden toegepast met behulp van een breed scala van alginaatviscositeiten met korte ( bijv. 20 min) kraal generatie tijden. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld door Poncelet et al. ^{25 , 26} en gebruikt om DNA ²⁷ , eiwitten ^{28 te} isoleren die insuline ²⁹ en bacteriën ³⁰ omvatten. Wij hebben deze methodes onlangs aangepast aan de inkapseling van zoogdiercellen met behulp van pancreas-bèta-cellijnen ^{31 , 32} en primaire pancreasweefsel ³² .

Het principe van de werkwijze is het opwekken van een water-in-olie emulsie die bestaat uit alginaatdruppels in minerale olie, gevolgd door inwendige gelering van de alginaatdruppels ( Figuur 1 ). Eerst wordt de inkapselende stof ( bijvoorbeeld cellen) gedispergeerd in een alginaatoplossing die een fijne korrelkalsiumzout bevat met een lage oplosbaarheid bij de initiële proces pH. Het alginaatmengsel wordt vervolgens toegevoegd aan een geroerde organische fase om een ​​emulsie te creëren, gewoonlijk in aanwezigheid van asurfactant. In het geval van zoogdiercelcapsulatie kunnen componenten aanwezig in serum fungeren als oppervlakteactieve stoffen. Vervolgens wordt de pH verminderd om het calciumzout te solubiliseren door een olieoplosbaar zuur dat in de waterfase verdeelt, toe te voegen. Azijnzuur, met een deeltjescoëfficiënt <0,005 ^{33 van} minerale olie / water, moet vooraf opgelost worden in olie, daarna aan de emulsie toegevoegd worden, waar het in de oliefase gemengd wordt en snel in de waterfase ³⁴ verdeelt. Figuur 2 illustreert de chemische reacties en diffusie die plaatsvinden tijdens de verzuring en de inwendige gelatingsstap. Tenslotte worden de ingekapselde cellen hersteld door fase-inversie, fasescheiding versneld door centrifugeren, herhaalde wasstappen en filtratie. Deze stappen kunnen vervolgens worden gevolgd door kraal- en celmonstering voor kwaliteitscontroleanalyses, in vitro celkweek en / of transplantatie van de ingekapselde cellen.

Figuur 1: Schematisch van het emulgeringsgebaseerde proces om zoogdiercellen te inkapselen. Kralen worden eerst geproduceerd door emulgeren van een alginaat-, cel- en CaCO3-mengsel in minerale olie (stappen 1 en 2 in het schema), waardoor inwendige gelering wordt geactiveerd door azijnzuur toe te voegen (stap 3). De geleerde kralen worden vervolgens gescheiden van de olie door een waterige buffer aan te brengen om fase-inversie aan te trekken (stap 4), gevolgd door centrifugeren en olie-aspiratie (stap 5) en vervolgens filtratie (stap 6). Tenslotte worden de kralen verzameld op het filter overgebracht in celkweekmedium voor in vitro kweek of voor transplantatie. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Reacties en diffusiestappen die zich voordoen tijdens interne gelatie. (1) azijnzuur wordt toegevoegd aan de organische fase en wordt door convectie naar de alginaatdruppels vervoerd. (2) Het azijnzuur verdeelt in de waterfase. (3) In aanwezigheid van water dissocieert en verspreidt het zuur de CaCO _3- korrels die in donkerblauw worden afgebeeld. (4) De H ⁺ -ionen worden uitgewisseld met de Ca2 ⁺ -ionen in CaC03, waardoor Ca2 ⁺ -ionen vrijkomen. (5) De calciumionen diffunderen tot ze ongereagd alginaat tegenkomen, wat leidt tot de ionotrope verknoping van de alginaatkettingen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

In tegenstelling tot conventionele nozzle-based cell encapsulators, is een brede kralengrootte verdeling expeCted uit dit proces door het mechanisme van druppelvorming in geroerde emulgatie. Voor een subset van applicaties kan deze kralengrootteverdeling problematisch zijn. Bijvoorbeeld, een grotere fractie van cellen kan worden blootgesteld aan het kralenoppervlak in kleinere kralen. Als beperkingen van voedingsstoffen ( bijv. Zuurstof) een zorg zijn, kunnen deze beperkingen in grotere kralen worden verergerd. Een voordeel van de geroerde emulgeringswerkwijze is dat de gemiddelde korrelgrootte gemakkelijk kan worden aangepast door de roering gedurende de emulgeringsstap te veranderen. De breedteverdeling kan ook worden uitgebuit om het effect van kraalgrootte op ingekapselde celprestaties te bestuderen.

Zoogdiercelcapsulatie door emulsificatie en inwendige gelering is een interessant alternatief voor laboratoria die niet zijn uitgerust met een kraalgenerator. Bovendien biedt deze methode gebruikers de mogelijkheid om de verwerkingstijd te verminderen of kralen te genereren bij zeer lage of zeer hoge alginaatconcentratenaties.

Het hieronder beschreven protocol beschrijft hoe cellen in 10,5 ml 5% alginaatoplossing bereid in 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) buffer worden ingekapseld. Het alginaat bestaat uit een 50:50 mengsel van transplantatiegraad LVM (laag viscositeit hoog mannnuronzuurgehalte) en MVG (medium viscositeit hoog guluronzuurgehalte) alginaat. Calciumcarbonaat bij een uiteindelijke concentratie van 24 mM wordt gebruikt als het fysieke verknopingsmiddel. Lichte minerale olie vormt de organische fase, terwijl azijnzuur wordt gebruikt om de emulsie te verzuren en interne gelering te activeren. Echter, het alginaat type en samenstelling, evenals de geselecteerde procesbuffer, hangt af van de gewenste toepassing ³² . Een verscheidenheid van alginaat types (zie tabel van materialen) zijn gebruikt om kralen te produceren met dit protocol.

Protocol

1. Bereid de alginaatoplossing, de CaCO _3- suspensie en de versuurde olie op

1. Bereid de procesbuffer en het medium voor.
   1. Bereid de typische procesbuffer aan die wordt gebruikt voor het genereren van hoge concentratie alginaatkralen door gebruik te maken van 10 mM HEPES, 170 mM NaCl. Stel de pH op op 7.4.
   2. Bereid het typische kweekmedium aan met behulp van Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) die 10% foetaal runder serum (FBS), 6 mM glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine bevat.
2. Bereid de alginaat voorraadoplossing op 1,17 voud de uiteindelijke gewenste concentratie in de kralen.
   1. Weeg eerst de juiste hoeveelheid alginaatpoeder. Bijvoorbeeld, om een ​​uiteindelijke concentratie van 5% alginaat te verkrijgen met 50:50 LVM en MVG alginaat, weeg in totaal 1,17 g natriumalginaat door 0,583 g LVM-alginaatpoeder en 0,583 g MVG-alginaatpoeder te combineren.
   2. Plaats 20 ml procesbuffer in een autocHoudbare glazen pot op een magnetische roerplaat en roeren bij ~ 200 rpm. Voeg het natriumalginaatpoeder geleidelijk toe aan de oplossing.
   3. Laat de oplossing overnacht roeren met een lage snelheid. Zet indien nodig de kolf op de roerplaat.
   4. Als de oplossing onvolledig is opgelost, zet de fles vast op een roterende mixer en blijf bij 37 ° C gedurende nog eens 24 uur.
   5. Steriliseer de alginaatoplossing door de oplossing 30 minuten te autoclaven in een vat dat minder dan half vol is. Laat de temperatuur onder 60 ° C dalen voordat u de oplossing ophaalt.
   6. Verwijder eventueel deeltjes door de alginaatoplossing kort na autoclaven te filteren voordat het kamertemperatuur bereikt, terwijl de viscositeit voldoende laag blijft.
3. Bereid de calciumcarbonaat suspensie op 21-voudig de uiteindelijke gewenste concentratie voor inwendige gelering.
   1. Weeg het CaCO ₃ poeder af. Bijvoorbeeld advertentieD 1 g CaCO3 tot 20 ml procesbuffer om 24 mM CaC03 te verkrijgen als de uiteindelijke concentratie van de geleringsmiddel.
   2. Autoclaaf de CaCO ₃ suspensie gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: De CaCO ₃ concentratie zal over de tijd veranderen door het bicarbonaat-CO ₂ -evenwicht. Vermijd het gebruik van dezelfde voorraad CaCO ₃ suspensie voor meer dan 10 inkapselingsprocedures.
4. Autoklaaf het geroerde vat dat gebruikt wordt voor het emulgeringsproces. Voor gebruik, verwijder eventueel sporen van gecondenseerd water in de spinnerfles.
5. Onmiddellijk voor het emulsificatieproces, bereide de verzuurde olie. Oplossen 44 μL azijnzuur per 11 ml minerale olie in een 50 ml conische buis.
   OPMERKING: een algemene fout is onvolledige ontbinding van het azijnzuur. Vermijd pipettering van kleine hoeveelheden azijnzuur en zorg ervoor dat het azijnzuur volledig wordt opgelost in olie door herhaalde vortexing.
   VOORZICHTIG: azijnzuur is een giftige an D vluchtig zuur. Hanteer dit reagens onder een afzuigkap en houd de azijnzuur / olieoplossing in een gesloten houder tot de emulgeringsstap. Raadpleeg de MSDS-informatie over dit reagens voor nadere informatie.
6. Laat alle oplossingen de kamertemperatuur bereiken voordat u verder gaat met de celincapsulatie.

2. Alginaat Kralen Generatie Door Emulsificatie En Interne Gelering

1. Plaats 10 ml lichte minerale olie in de spinnerkolf en start met een lage rotatiesnelheid ( bijvoorbeeld 250 rpm voor de spinnerfles die in deze video wordt gebruikt).
2. Als de cellen die voor het proces worden gebruikt, afkomstig zijn van hechtende culturen, past u trypsine op om de cellen op te schorten. Beëindig de reactie door FBS-bevattende medium of trypsine-inhibitor toe te voegen en een monster te verzamelen voor cellenetumeratie.
   1. Bepaal de celconcentratie en levensvatbaarheid na Trypan-blauwvlek met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller, zoals eerder beschrevenAss = "xref"> 32.
3. Centrifugeer de cellen gedurende 7 minuten bij 300 xg en was ze eenmaal in het gewenste medium voor celimmobilisatie. Zorg ervoor dat dit medium emulgatoren bevat, zoals FBS of boviene serumalbumine (BSA). Gebruik bijvoorbeeld DMEM die 10% FBS bevat.
4. Zet de celpelletje opnieuw op in hetzelfde medium om 10,5 keer de gewenste eindconcentratie in de kralen te verkrijgen.
5. Voeg 1,1 ml van de 10,5-voudige geconcentreerde cel voorraad toe aan 9,9 ml van de alginaatoplossing. Voeg vervolgens 550 μL CaCO ₃ suspensie toe en meng door roeren met een steriele spatel om een ​​gelijkmatige verdeling van de CaCO ₃ te waarborgen.
6. Breng onmiddellijk 10,5 ml van het alginaat-, cel- en CaCO3-mengsel over in de roerolie door een injectiespuit te gebruiken.
   OPMERKING: Voor zeer viskeuze oplossingen, aspireren en uitwerpen het mengsel langzaam om luchtbellen te vermijden. In sommige gevallen is het de voorkeur om de agitatie te stoppen terwijl het mengsel aan de kolf wordt toegevoegd om te vermijdenAlginaat inbrengen op de waaieras.
7. Onmiddellijk na het toevoegen van het alginaat-, cel- en CaC03-mengsel aan de olie, verhoogt de agitatietempo.
   OPMERKING: Voor het 5% LVM: MVG-alginaat dat hier wordt gebruikt, werd een rotatiesnelheid van 1025 rpm toegepast om kralen met een diameter van ongeveer 900 μm te produceren die geschikt zijn voor in vitro cultuur ³⁵ . Hogere rotatiesnelheden en lagere alginaatconcentraties zullen leiden tot lagere gemiddelde kraaldiameters, zoals beschreven in eerdere publicaties ^{25 , 32} . Geringe veranderingen in de waaier en de geometrie van de vaten, evenals alginaat eigenschappen, kunnen de gemiddelde diameter van de kraal sterk beïnvloeden. Voor elke verandering in vaartuigconfiguratie of alginaatpartij moet een standaardkromme met betrekking tot de gemiddelde diameter van de oppervlakte van de oppervlakte van het oppervlak op de rotatiesnelheid worden gegenereerd ³² .
8. Start de timer en emulgeer het alginaat gedurende 12 minuten.
9. Voeg 10 ml tHij olie- en azijnzuuroplossing om de emulsie te verzuren, de CaCO3 op te lossen en derhalve het alginaat fysiek te crosslinken in gelerende kralen. Laat 8 minuten toe voor deze verzuringstap.

3. Bead Recovery

1. Verminder de roering tot 400 rpm. Voeg 40 ml procesbuffer gemengd met 10% medium toe om de pH te verhogen en fase-inversie te veroorzaken.
2. Stop de roering 1 minuut later en laat het mengsel overbrengen naar 50 ml centrifuge buizen. Spoel de spinnerkolf met een extra 20 ml medium en voeg deze toe aan de buis. Zoveel mogelijk waterfase van de spinnerkolf afzetten alvorens de oliefase te aspireren om kraalcontact met de oliefase te minimaliseren.
   OPMERKING: Gebruik bij deze stap een grote boringpipet ( bijv. 25 ml pipet) en vanaf dit punt om de kralen te beschadigen. Voor kleinere volumes kan de kraalvering ook worden gemanipuleerd met snijpipetjes. Om dergelijke tips te krijgen, snijd het uiteinde van de pipetpunt met een schaar whIle dragen oogbescherming.
3. Centrifugeer de buizen gedurende 3 minuten bij 630 xg om de kraalafzetting en fasescheiding te versnellen.
4. Verwijder de olie en de overmaat waterige oplossing door te aspireren met een Pasteur pipette.
5. Was de kralen minstens een keer met medium. Filter de parelsuspensie op 40 μm nyloncelspanners en aspirate overmaat vloeistof die geassocieerd is met de kralen onder de zeef. Breng de kralen in een bekend volume medium door middel van een steriele spatel.
   OPMERKING: Kleiner of grotere poriegrootte filters kunnen in deze stap worden gebruikt, afhankelijk van de gewenste minimale kraaldiameter. Echter, zwaartekrachtfiltrering wordt aanbevolen in plaats van drukgedreven filtratie via sub-micron poriëngrootte filters om schade aan de kralen te vermijden.
6. Meet de kraalvolume volumeplaatje (volume na het toevoegen van de kralen, minus het volume voorafgaand aan het toevoegen van de kralen) en vul het medium op om de gewenste kraal te verkrijgen: totale volumeverhouding, die typisch 1: 5 of 1 ml kralen in4 ml medium. Gebruik vanaf dit punt altijd grote boringpijpen om de kralen te beschadigen.
7. De ingekapselde cellen overbrengen in T-kolven voor in vitro- kweek- of transplantatie-experimenten.

4. Kwaliteitscontrole en toepassingen

OPMERKING: Om de ingekapselde cel- en kraalkwaliteit te waarborgen, moet de grootte van de kralengrootte en de celoverleving na het proces worden gekwantificeerd. Omgekeerde de gel om de cellen van binnen de kralen te herstellen voor verdere analyse wordt gewoonlijk uitgevoerd.

1. Om de kralengrootteverdeling te beoordelen, vlek de kralen met toluidine blue-O.
   1. Plaats 0,5 ml kralen in 4 ml procesbuffer die 10% compleet medium bevat.
   2. Voeg 500 μl van een 1 g / l toluidineblauwe oplossing bereid in procesbuffer toe.
   3. Incubeer gedurende 60 minuten in een conische buis op een roterende shaker bij 50 rpm.
   4. Voeg 5 ml procesbuffer in die 10% compleet medium bevat en immedBreng de kralen en de oplossing over in een Petri-schotel en kopieer beelden op een kleine vergrootingsmicroscoop of gebruik een handheld digitale camera. Plaats indien gewenst de Petri-schotel op een lichtbox voordat u beelden met een handcamera ontvangt om het contrast te verbeteren en schaduwen te vermijden.
   5. Voer beeldanalyse uit om de grootte van de kralenmaat te kwantificeren zoals eerder beschreven ³² , bijvoorbeeld met behulp van beeldanalyse freeware ³⁶ .
2. Om de celoverleving kwalitatief te beoordelen, vlek de cellen met behulp van ethidium homodimer om dode cellen en calcein AM te identificeren om levende cellen te identificeren.
   1. Voeg 1 volume kralen toe aan 4 volumes procesbuffer die 10% compleet medium bevat.
   2. Voeg de juiste hoeveelheid calcein AM en ethidium homodimeren voorraadoplossingen toe om respectievelijk 4 μM en 2 μM concentraties te verkrijgen. Generate single stain controls door slechts één van de reagentia toe te voegen aan sommige kraalmonsters.
   3. Incubeer de kralen voor 20 minuten op ijs.
   4. Plaats de oplossing tussen een glijbaan en deklaag met behulp van een spacer zoals een o-ring om de kralen niet te comprimeren.
   5. Ga verder naar fluorescentiemicroscopie. Gebruik de enkele vlekken regelaars om fluorescentie bloeden door te gaan. Selecteer geschikte fluorescentiefilters op basis van de excitatie- / emissiegolflengten die geassocieerd zijn met calcein AM (494/517 nm) en ethidium homodimeer gebonden aan DNA (528/617 nm).
3. Om de cellen van de kralen te herstellen voor verdere analyse, degel de alginaat met behulp van citraat of een andere chelaterende oplossing.
   1. Bereid een verkleurende oplossing die 55 mM citraat, 10 mM HEPES en 95 mM NaCl bij pH 7,4 bevat.
   2. Meng deze oplossing met 10% medium en voeg vervolgens 1 ml alginaatkralen toe aan 9 ml van het mengsel.
   3. Degel de kralen op ijs met 75 rpm roering gedurende 20 minuten.
      OPMERKING: De cellen kunnen nu worden gebruikt om te analyseren of verwijderd te worden van de afgewerkte alginaatoplossingIon door centrifugeren. Bijvoorbeeld, kan de levensvatbaarheid van de cellen na afbellen gekwantificeerd worden door Trypan Blue-kleuring. Als alternatief kunnen de cellen gecentrifugeerd en gewassen worden, gevolgd door mRNA, DNA- en / of proteïne-monsterneming en analyse.

Representative Results

Aan het einde van het emulgerings- en inwendige geleringsproces moet een kraalvolume gelijk aan het initiële alginaat- en celmengselvolume worden hersteld. De kralen moeten zeer sferisch zijn met weinig gebreken ( figuur 3 ). De kralen moeten voldoende sterk zijn om pipettering door middel van grote boorpipetten te weerstaan. Bij hoge alginaatconcentraties kunnen ingekapselde olie- of luchtdruppels in de kralen worden waargenomen. Dit komt waarschijnlijk voor als gevolg van de verstopping van olie in alginaatdruppels tijdens de emulgeringsstap (olie / water / olie dubbele emulsie). In onze handen vertegenwoordigen deze kralen een kleine fractie (<5%) van het kraalvolume en de meeste van deze kralen werden verwijderd, terwijl de olie tijdens de kraalherstelstap werd geoogst, door hun lagere dichtheid.

Fig.> Figuur 3 : Representatieve 5% alginaatkralen die ingekapselde ßTC3-cellen bevatten, verkregen door het emulgeringsproces en het inwendige gelatingsproces. Fase contrastbeeld van 5% alginaatkralen die 5 x 10 ⁶ βTC3 cellen / ml kralen bevatten. Klik hier om een ​​grotere afbeelding te zien Versie van deze figuur.

De grootte van de verkregen kralen zal niet uniform zijn - dit is een intrinsieke eigenschap van geroerde emulsies ( Figuur 4A ). Gedurende emulgatie in turbulente stroom werken drukfluctuaties om de druppels ^{37 , 38} te verstoren, de oppervlaktespanning en de viscese krachten in de gedispergeerde fase ^{39 tegen te gaan} . Viscous krachten zijn niet te verwaarlozen indien de viscositeit van de gedispergeerde fase veel hoger is dan die van deE continue fase. Uitgaande van het feit dat de maximale lokale energieverspreidingssnelheid evenredig is aan de gemiddelde energieverspreidingssnelheid in het vat, kan de maximale stabiele druppeldiameter d _max (als >> dan de Kolmogorov-schaal) als volgt worden berekend: ^{39 , 40 , 41 , 42}

Waar ρ _c de dichtheid van de continue fase is, ε de gemiddelde energieverliespercentage in het vat is, σ de grensvlakspanning tussen de twee vloeistoffen is, μd de viscositeit van de gedispergeerde fase is en C een evenredigheidskonstante is. Wanneer de oppervlaktespanningskrachten boven de viskeuze krachten overheersen, vereenvoudigt de rechterkant naar C , terwijl als de viskeuze krachten overheersen, het vereenvoudigt om:

In geroerde vaten is de energie-invoer onder turbulente stromingsschalen evenredig aan de stroominvoer per volume van het volume, dwz aan N _i ³ D _i ² , waarbij N _i de agitatiegraad is en D _i de diameter van de waaier is. Daarom, in combinatie met vergelijking 1 en een constante D _i , als de oppervlaktespanningskrachten overheersen, wordt verwacht dat de d _max evenredig is aan N _i ^-1,2 ( Figuur 4B ), terwijl deze evenredig is aan N _i ^-0.75 indien viskeuze krachten binnen de Kralen overheersen als de belangrijkste retentie kracht. Figuur 4B en 4C suggereren dat interfaciale effecten de d bepalenRopletgrootte voor lage alginaatconcentraties, terwijl viskeuze krachten meer dominant worden bij hogere alginaatconcentratie ( bijv. 5% voor alginaat # 3 beschreven in de Tabel van materialen). Aangezien het onwerkelijk kan zijn om d _max experimenteel te bepalen, zijn er in plaats daarvan hoge kwantielwaarden ( bijvoorbeeld de 95ste kwantiel) van de diameter of de gemiddelde diameter van de oppervlakte ( d ₃₂ ) gebruikt, aangezien ze in het algemeen evenredig zijn aan d _max ⁴³ .

Voor het inkapselen van cellen wordt aanbevolen dat een kromme van d ₃₂ als functie van N wordt gegenereerd ( Figuur 4B ). Deze curve helpt bij het selecteren van de juiste N _i om een ​​gewenste gemiddelde kraalgrootte te verkrijgen. Een nieuwe standaardkromme zal waarschijnlijk ook nodig zijn voor verschillende batches olie of alginaat, of als de alginaatconcentraatTration is aangepast. Afhankelijk van de vatengeometrie en op de alginaatconcentraties, moet een betrekkelijk breed scala van gemiddelde kraaldiameters haalbaar zijn. Bijvoorbeeld, d ₃₂ waarden tussen 200 μm en> 1 mm kunnen worden verkregen met gebruik van 2% ( Figuur 2C in Hoesli et al. ³² ) tot 5% alginaat ( Figuur 4 ) onder toepassing van het hierboven beschreven protocol.

Figuur 4 : Beadgrootteverdeling. ( A ) Toluidine blauw-O-gekleurde 5% alginaatkralen. ( B ) d ₃₂ als een functie van de agitatie snelheid ( NI ) voor 1,5% en 5% alginaatkrullen onder gebruikmaking van een 50:50 mengsel van alginaten # 1 en # 2 (zie tabel van materialen). Een enkele punt wordt getoond voor de 5% algiNate kralen. ( C ) _d32 als een functie van NI voor 2% en 5% alginaat # 3 (zie tabel van materialen). De foutbalkjes vertegenwoordigen de standaardafwijking van kraalformaten in een monster (N> 150 kralen). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

De celoverleving van het emulgerings- en inwendige gelatingsproces hangt voornamelijk af van de mate en duur van de pH-daling die door de cellen wordt ervaren. Met behulp van het in deze video beschreven proces werd 76 ± 2% βTC3 celoverleving gemeten ³¹ . Bij het inkapselen van gedispergeerde cellen bij 10 ⁵ cellen / ml alginaat tot 10 ⁷ cellen / ml alginaat zaaddichtheden, zouden alle kralen cellen moeten bevatten. Bij het inkapselen van celclusters zoals pancreascellen kan een subset van kralen worden verwachty. Figuur 5 toont typische levende cel- / dode celkleuringresultaten verkregen bij gebruik van dit proces. Hogere celoverleving kan worden bereikt door de procesbuffercapaciteit te verhogen en door de duur van de verzuringstap te verminderen. Bijvoorbeeld werd 90 ± 2% MIN6-celoverleving verkregen door gebruik te maken van 60 mM MOPS (3- (N-morfolino) -propaansulfonzuur) als de procesbuffer en door de totale proces tijd tot 4 min ^{32 te verminderen} . Echter, de geproduceerde kralen waren significant sterker bij de 10 mM HEPES-procesbuffer dan bij de 60 mM MOPS-procesbuffer als gevolg van de verhoogde hoeveelheden Ca ^{2+ die} vrijkomen bij een lagere pH ³¹ . Zowel het korte MOPS-proces als het langer HEPES-proces zouden kralen moeten genereren die voldoende stabiel zijn voor> 2 weken in vitro- cultuur of transplantatie. Kralen kunnen echter geheel of gedeeltelijk zwellen of oplossen in oplossingen met laag calcium of met hoge chelatorconcentraties (bijvoorbeeld, Calciumvrije fosfaatgebufferde zoutoplossing).

Voor ingekapselde MIN6-cellen die in vitro zijn gegroeid, vormen na de 5 tot 7 dagen in vitro geïmmobiliseerde celuitbreiding en zichtbare celaggregaten na ~ 2 weken een oogst van 150 μm diameter. De groei van alginaat-geïmmobiliseerde cellen wordt verwacht lager dan in niet-geïmmobiliseerde culturen, met name voor gels met hogere alginaatconcentratie of hogere guluronzuurgehalte.

Figuur 5 : Ingesloten cellen onmiddellijk na het proces. ( A ) Live cel (groen, calcein AM) en dode cel (rood, ethidium homodimeer) kleuring van ingekapselde cellen. ( B ) Fase contrastbeeld van dezelfde kraal. De MIN6-cellen werden ingekapseld in 2%Alginaatkralen met behulp van de 12 minuten emulsificatie, 8 minuten verzuring en een 10 mM HEPES buffer zoals beschreven in dit protocol. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Verschillende stappen (afgebeeld in figuur 2 ) tijdens de interne gelatingsreactie kunnen de algemene kinetiek beperken. Voor calciumcarbonaatkorrels groter dan ~ 2,5 μm, is de snelheid van carbonaatoplossing aangetoond dat de snelheidsbeperkende ^{26 , 44 is} . De verzuringstap die leidt tot interne calciumvrijstelling is ook aangetoond dat deze de kritische procesvariabele is die de overleving van cellen ³² beïnvloedt. De voorwaarden die leiden tot inwendige gelering zijn daarom van cruciaal belang voor zowel de kwaliteit van de parels als de celoverleving. Afhankelijk van de uiteindelijke toepassing van de kralen kunnen verschillende optimale procesomstandigheden worden gekozen. Bijvoorbeeld kan een hogere pH-daling ( bijv. Gebruik van 10 mM HEPES om de alginaatoplossing te buffer) gewenst zijn voor transplantatie toepassingen waarbij de stabiliteit van de kralen op lange termijn van cruciaal belang is. Aan de andere kant, een lagere pH daling ( bijv. Met behulp van 60 mM MOPS te buffenR de alginaatoplossing) kunnen de voorkeur hebben voor in vitro toepassingen.

Naast het aanpassen van het niveau en de duur van de verzuring kunnen andere proceswijzigingen worden overwogen. Bijvoorbeeld kunnen andere geroerde vaatconfiguraties, alginaatconcentraties, procesbuffers, organische fasen en verzurende middelen worden gebruikt. Zoals eerder besproken, kan de gemiddelde korrelgrootte gemakkelijk worden aangepast door de roergrootte tijdens de emulgeringsstap te veranderen. Bovendien kunnen langere emulgeringstijden leiden tot kleinere kralenformaten, maar kan leiden tot verminderde cellevendigheid. De publicaties van Poncelet et al. ^{25 , 26 , 45} en Hoesli et al. ^{31 , 32} hebben enkele van deze opties getest en besproken.

Lichte veranderingen in het hierboven beschreven protocol kunnen een grote invloed hebben opKraalgeneratie, kraalkwaliteit en celoverleving. Tabel 1 geeft een probleemoplossingsgids om problemen die kunnen optreden, te begrijpen en op te lossen.

Probleem	Typische oorzaak	Voorgestelde oplossingen
De waaier stopt tijdens rotatie tijdens de toevoeging van alginaat of zuurolie	Het magnetisch veld is onvoldoende voor voldoende menging of de wielaschacht is onjuist	Zorg ervoor dat de spinnerfles goed centraal staat op de magnetische plaat en op een optimale positie op de plaat tapt voordat het alginaatmengsel wordt toegevoegd. Test zeer hoge agitatietarieven en verminder dan tot de gewenste agitatietempo voorafgaand aan het toevoegen van het alginaatmengsel.
		Zorg ervoor dat de impelleras goed uitgelijnd en stabiel is. Voor de BelLco spinnerflessen, zorg ervoor dat de wielophenger stevig vastgehouden wordt door bouten aan beide zijden van de spinnerflaskop. Zorg ervoor dat de beweging van de waaier beperkt is tot de radiale richting (de waaier mag niet op de as draaien).
Geen kralen verkregen	Het alginaat werd onjuist geëmulgeerd	Zorg ervoor dat alginatmicrodruppels tijdens de emulgatie zichtbaar zijn. Zo niet, controleer of de dichtheid van de oliefase en de geometrie van de vaartuig 23 vergelijkbaar zijn met die welke in dit protocol worden beschreven. Een dichte oliefase of vaartuiggeometrie die niet voldoende lokale energieafgifte biedt, kan niet leiden tot een goede alginaatemulsificatie.
Geen kralen verkregen	De interne gelering vond niet plaats	Een gemeenschappelijke fout is onvolledige ontbinding van het azijnzuur in de oliefase. Zorg ervoor dat het zuuroliemengsel voldoende vortex is en geen azijnzuur wordt waargenomen bij deOnderkant van de buis.
		Als de waaier niet de olie bereikt, kan meer olie worden toegevoegd voordat het alginaat wordt toegevoegd. De hoeveelheid azijnzuur moet echter worden aangepast volgens de volgende vergelijking: Waar 1 is de verhouding olie / waterfase voorafgaand aan modificaties (bijv. 0,525 voor 10,5 ml alginaat in 10 ml olie + 10 ml zure olie) 2 is de verhouding olie / waterfase na modificaties van het protocol en Dow is de verdelingscoëfficiënt van azijnzuur tussen de twee fasen. Deze verdelingscoëfficiënt kan experimenteel worden gemeten of benaderd door waarden uit de literatuur. Bijvoorbeeld is de verdelingscoëfficiënt van azijnzuur tussen heptaan en water 46 0,011.
Geen kraalS verkregen, of kralen zijn mechanisch onstabiel	De alginaatoplossing nul-schuifviscositeit ligt onder 0,004 Pa · s of hoger dan 112 Pa · s	Vanwege de hoge batch-to-batch variabiliteit van alginaatdelen, wordt aanbevolen de viscositeit van verschillende concentraties alginaatoplossingen te meten. De combinatie van een batch met hoge viscositeit met een laagviscositeitsketen kan nodig zijn om een ​​doelviscositeit te bereiken. Voor het 5% LVM- en MVG-mengsel dat hier gebruikt werd, was de nul-schuifviscositeit 3,3 Pa · s. Opgemerkt moet worden dat alginaten met te korte guluronzuurbloklengten of korte algehele ketenlengten mogelijk niet gelvorming kunnen toestaan.
De kralen zijn te groot of te klein	De roergrootte tijdens de emulsificatie is te laag of te hoog voor de alginaatconcentratie of viscositeit die wordt gebruikt	Toenemende turbulentie door het verhogen van de agitatie snelheid of het toevoegen van baffles zal de kraalgrootte verlagen. De alginaatconcentratie, de tempEraturatie, de geometrie van het schip en de waaier van de waaier zal allemaal de beadgrootte beïnvloeden.
Veel gebroken kralen worden waargenomen	Scherpe kraalbehandeling, schade tijdens de interne gelatingsstap of onvoldoende kraalsterkte.	Mechanische schade aan de kralen kan leiden tot kraalbreuk zodra de interne gelering is gestart. Verminder de roering onmiddellijk voor de verzuringstap en zorg ervoor dat de kralen voorzichtig worden behandeld door gebruik te maken van 25 ml pipetten of 1000 μL pipetten met snijpunten. Als beschadigde kralen worden waargenomen, zelfs bij zorgvuldige behandeling en verminderde roering tijdens verzuring, kan de kraalsterkte onvoldoende zijn. Dit kan het gevolg zijn van onvoldoende guluronzuurgehalte of onvolledige gelering (bijv. Onvoldoende verzuring).
Lage cel levensvatbaarheid	Beginproces pH te hoog of laatste pH te laag	Overleving van het zoogdiercellen kan worden verhoogd door de pH-daling en de verzuringstijd te beperken
Lage cel levensvatbaarheid in de kleinere kralen	Onvoldoende buffering van de alginaatoplossing	Een grotere pH-daling wordt verwacht in de kleinere kralen dan in de grotere kralen door de grotere oppervlakte / volume verhouding van deze kralen. Aangezien het bij de emulsie toegevoegde azijnzuur beperkt is, worden hogere azijnzuurconcentraties voorspeld in kleinere kralen voor dezelfde CaCO3-concentratie. Het vergroten van de alginaatoplossingsbuffercapaciteit (bijv. Gebruik van 60 mM MOPS in plaats van 10 mM HEPES) kan de celoverleving in de kleinere kralen 32 verhogen. Kleine kralen met hoge celverliezen kunnen selectief worden verwijderd door filtratie of sedimentatie zonder grote volumetrische verliezen te veroorzaken.
ikN volledige CaCO3-oplossing	Onvoldoende verzuring of verzuringstijd. Merk op dat dit probleem misschien niet problematisch is als de kraalstabiliteit voldoende is.	Onvolledige CaCO3-oplossing is waargenomen in de grotere kralen volgens dit protocol 32 . De mate van CaCO 3- oplossing kan variëren afhankelijk van de CaCO 3- korrelgrootte, de pH-daling tijdens het proces, de duur van de pH-daling, evenals de gebruikte alginatconcentratie. Dit probleem wordt niet als problematisch beschouwd zolang de kraal mechanische stabiliteit voldoende is voor de gewenste toepassing. Om de kruisverbindingen te verhogen, zorg ervoor dat de CaCO 3- korrel voldoende klein is (~ 2,5 μm). Sonicating de CaCO 3 suspensie kan helpen geaggregeerde korrels 26 te verstoren. Bij zeer lage of hoge alginaatconcentraties kunnen aanpassingen in de CaCO 3 concentratie worden verlangd. Ten slotte, chelators of oplossingen met lageNiveaus van divalente ionen zullen leiden tot het geleidelijke verlies van Ca 2+ in de gel. Als het geleidelijke verlies van kraal mechanische stabiliteit wordt waargenomen, controleer dan of de kraalopslag of kweekbuffer> 2 mM Ca 2+ bevat .

Tabel 1: Handleiding voor het oplossen van problemen. Lijst van problemen, mogelijke oorzaken en mogelijke oplossingen.

Potentiële beperkingen van het emulgatie- en inwendige geletteringsproces voor in vitro- kweek van zoogdiercellen en transplantatie-toepassingen omvatten: (1) de noodzaak voor voorbijgaande blootstelling aan lage pH, (2) de noodzaak om resterende olie te verwijderen, (3) de polydisperse kralenmaat Verdeling, (4) de potentiële schuifspanning tijdens de alginaatdruppelvorming en (5) de hogere porositeit van inwendig gegelde kralen in vergelijking met extern gelerende kralen ⁴⁷ .

Hoge cel overleving en functie van MIN6 en BTC3 zijn verkregenNa procesoptimalisatie ³² . Dit proces is echter niet geschikt voor meer pH-gevoelige cellen. De volledige eliminatie van olie uit de kralen kan ook uitdagend zijn en Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde olietypen zijn nodig voor eventuele klinische toepassingen. De polydisperse kraalverdeling kan ook een beetje problematisch zijn voor immunoisolatie-toepassingen, waarbij volledige celinkapseling en langetermijnceloverleving wenselijk zijn. Terwijl kleine kraalgroottes kan leiden tot een celuitsteeksel ⁴⁸ , kunnen grote kralen hinderen op de voedingsdiffusie en / of celfunctie ^{35 , 49} . Aan de andere kant biedt het emulgeringsproces een interessante kans om het effect van kraalgrootte op celoverleving na transplantatie te onderzoeken door zowel kleine als grote kralen in een enkel proces te genereren. De gemiddelde kraalgrootte kan gemakkelijk worden aangepast door de agitatiepercentage durin te wijzigenG de emulgeringsstap ( Figuur 4 ). Ten slotte kan de hogere porositeit van inwendig gegelde kralen ook nadelig zijn voor immunoisolatie, waarbij moleculen zoals antilichamen en cytokines uit de kralen moeten worden uitgesloten. Het emulgeringsproces maakt echter ook de vorming van kralen uit zeer geconcentreerde alginaatoplossingen mogelijk, waardoor de poriëngrootte van de alginaatpiraal wordt verminderd.

Het emulgatie- en inwendige gelatingsproces is een interessant alternatief voor spuitbussen voor laboratoria die cellencapsulatie willen schalen of toegang hebben tot een inkapselaar. Dit proces is een robuuste en eenvoudige methode om cellen in alginaatkralen te immobiliseren met behulp van zeer verdunde of zeer geconcentreerde alginaatoplossingen. Enkele van de daaropvolgende experimenten die met de geïmmobiliseerde cellen kunnen worden uitgevoerd, zijn het effect van de alginaatmatrix op beslissingen van het celgeval te bepalen, of om te bepalen in hoeverre de kralen een barrière tussen transplanteD cellen en het gastheer immuunsysteem. De emulsificatie- en interne gelatingsmethode verschaft een nieuwe aanpak om primaire holmen in grote batches te inkapselen. De werkwijze maakt ook de celinkapseling in zeer geconcentreerde alginaatkralen mogelijk met verminderde porositeit en derhalve verminderde antilichaam toegang tot de ingekapselde cellen. De emulsificatie- en inwendige gelatingsmethode verschaft daarom een ​​nieuw middel om klinisch relevante hoeveelheden ingekapselde therapeutische cellen te genereren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade)	Sigma	A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)	A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM	Life Technologies	11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin	Thermo Fisher Scientific	SH3039603
Glutamine	Life Technologies	25030
Penicillin and streptomycin	Sigma	P4333-100ML
HEPES, cell culture tested	Sigma	H4034-100G
NaCl	Thermo Fisher Scientific	S271-1
Fine-grain CaCO3	Avantor Materials	1301-01	After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil	Thermo Fisher Scientific	O121-4	Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid	Thermo Fisher Scientific	A38-500	Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas	Sigma	CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Sarstedt	86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Toluidine Blue-O	Sigma	T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks	Bellco	1965-00100	The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed	Bellco	7760-06005	The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter	Innovatis	Cedex AS20	This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box	Artograph	LightPad® PRO	This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera	Canon	PowerShot A590 IS	A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters	Olympus	IX81	Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software	Molecular Devices	Metamorph	A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware	CellProfiler	Non-applicable	A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).