Säugetierzellverkapselung in Alginatperlen unter Verwendung eines einfachen gerafften Gefäßes

Summary

Dieses Video und Manuskript beschreiben ein Emulsions-basiertes Verfahren zur Einkapselung von Säugetierzellen in 0,5% bis 10% Alginatperlen, die in großen Chargen unter Verwendung eines einfachen Rührkessels hergestellt werden können. Die eingekapselten Zellen können in vitro kultiviert oder für zelluläre Therapieanwendungen transplantiert werden.

Abstract

Die Zellverkapselung in Alginatperlen wurde für die immobilisierte Zellkultur in vitro sowie für die Immunisolierung in vivo verwendet . Die Pankreasinselverkapselung wurde weitgehend als Mittel zur Erhöhung des Überfalles der Insel in allogenen oder xenogenen Transplantaten untersucht. Die Alginatverkapselung wird üblicherweise durch Düsenextrusion und externe Gelierung erreicht. Unter Verwendung dieses Verfahrens fallen zellhaltige Alginat-Tröpfchen, die an der Spitze der Düsen gebildet werden, in eine Lösung, die zweiwertige Kationen enthält, die eine ionotrope Alginat-Gelierung verursachen, wenn sie in die Tröpfchen diffundieren. Die Forderung nach Tröpfchenbildung an der Düsenspitze begrenzt den volumetrischen Durchsatz und die Alginatkonzentration, die erreicht werden kann. Dieses Video beschreibt ein skalierbares Emulgierungsverfahren zum Einkapseln von Säugetierzellen in 0,5% bis 10% Alginat mit 70% bis 90% Zellüberleben. Durch dieses alternative Verfahren werden Alginat-Tröpfchen, die Zellen und Calciumcarbonat enthalten, in Mineralöl emulgiertDurch eine Abnahme des pH-Werts, die zu einer internen Calciumfreisetzung und einer ionotropen Alginat-Gelierung führt, Die aktuelle Methode ermöglicht die Herstellung von Alginatperlen innerhalb von 20 min Emulgierung. Die für den Einkapselungsschritt benötigte Ausrüstung besteht in einfachen Rührgefäßen, die für die meisten Laboratorien zur Verfügung stehen.

Introduction

Die Säugerzellverkapselung wurde weitgehend als Mittel zum Schutz transplantierter Zellen aus der Immunabstoßung ¹ oder zur Bereitstellung eines dreidimensionalen Trägers für die immobilisierte Zellkultur ^{2 , 3 , 4 untersucht} . Eine Pankreasinselverkapselung in Alginatperlen wurde verwendet, um Diabetes in allogenen ^{5 , 6} oder xenogenen ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} Nagetieren umzukehren. Präklinische und klinische Studien der eingekapselten Pankreasinsel-Transplantation zur Behandlung von Typ-1-Diabetes sind im Gange ^{13 , 14 , 15} . Für Transplantationsanwendungen oder größeres SkalierenE in vitro immobilisierte Zellproduktion, Düsen-basierte Wulstgeneratoren werden im allgemeinen verwendet. Typischerweise wird ein Gemisch aus Alginat und Zellen durch eine Düse gepumpt, um Tröpfchen zu bilden, die in eine gerührte Lösung fallen, die zweiwertige Kationen enthält, was zu einer externen Gelierung der Tröpfchen führt. Der koaxiale Gasfluss ^{16 , 17} , die Düsenvibration ¹⁸ , die elektrostatische Abstoßung ¹⁹ oder die rotierenden Drähte ²⁰ erleichtern die Tröpfchenbildung an der Düsenspitze.

Die Hauptnachteile herkömmlicher Wulstgeneratoren sind ihr begrenzter Durchsatz und der begrenzte Bereich der Lösungsviskositäten, der zu einer adäquaten Wulstbildung führen wird. Bei hohen Strömungsraten zerfällt das aus der Düse austretende Fluid in Tröpfchen, die kleiner sind als der Düsendurchmesser, wodurch die Größensteuerung verringert wird. Multi-Düse Wulstgeneratoren können verwendet werden, um den Durchsatz zu erhöhen, aberDie gleichmäßige Verteilung der Strömung zwischen den Düsen und die Verwendung von Lösungen> 0,2 Pas ist problematisch ²² . Schließlich wird erwartet, dass alle Düsen-basierten Vorrichtungen den Inselchen einen gewissen Schaden zufügen, da der Durchmesser der verwendeten Düsen zwischen 100 μm und 500 μm beträgt, während ~ 15% der menschlichen Inseln größer als 200 μm ^{23 sein können} .

In diesem Video beschreiben wir ein alternatives Verfahren zur Einkapselung von Säugetierzellen durch Bildung von Tröpfchen in einem einzigen Emulgierungsschritt anstelle von Tropfen-zu-Tropfen. Da die Wulstproduktion in einem einfachen Rührkessel durchgeführt wird, eignet sich das Verfahren für kleine (~ 1 mL) bis großformatige (10 ³ L) Perlenproduktion mit geringen Ausrüstungskosten ²⁴ . Diese Methode ermöglicht die Herstellung von Perlen mit hoher Sphärizität unter Verwendung eines breiten Bereichs von Alginat-Viskositäten mit kurzen ( z. B. 20 min) Wulst-Erzeugungszeiten. Diese Methode wurde ursprünglich von Poncelet et alL. ^{25 , 26} und verwendet, um DNA ²⁷ , Proteine ²⁸ einschließlich Insulin ²⁹ und Bakterien ³⁰ zu immobilisieren. Wir haben diese Methoden vor kurzem an die Verkapselung von Säugetierzellen angepasst, wobei die pankreatischen Beta-Zelllinien ^{31 , 32} und das primäre Pankreasgewebe ^{32 verwendet wurden} .

Das Prinzip des Verfahrens besteht darin, eine Wasser-in-Öl-Emulsion zu erzeugen, die aus Alginat-Tröpfchen in Mineralöl besteht, gefolgt von einer internen Gelierung der Alginat-Tröpfchen ( Abbildung 1 ). Zuerst wird das Verkapselungsmittel ( z. B. Zellen) in einer Alginatlösung dispergiert, die ein feinkörniges Calciumsalz mit geringer Löslichkeit bei dem anfänglichen pH-Wert enthält. Die Alginatmischung wird dann zu einer gerührten organischen Phase zugegeben, um eine Emulsion zu erzeugen, üblicherweise in Gegenwart von aTensid Im Falle der Säugerzellverkapselung können im Serum vorhandene Komponenten als Tenside wirken. Als nächstes wird der pH-Wert reduziert, um das Calciumsalz durch Zugabe einer öllöslichen Säure, die sich in die wässrige Phase einteilt, zu lösen. Essigsäure mit einem Mineralöl / Wasser-Verteilungskoeffizienten <0,005 ³³ sollte in Öl vorgelöst und dann der Emulsion zugesetzt werden, wo sie in der Ölphase gemischt wird und sich schnell in die wässrige Phase ^{34 einteilt} . Fig. 2 zeigt die chemischen Reaktionen und die Diffusion, die während der Versauerung und des inneren Gelierungsschrittes stattfinden. Schließlich werden die eingekapselten Zellen durch Phaseninversion, Phasentrennung, die durch Zentrifugation, wiederholte Waschschritte und Filtration beschleunigt wird, gewonnen. Auf diese Schritte können dann Perlen- und Zellproben für Qualitätskontrollanalysen, in vitro Zellkultur und / oder Transplantation der eingekapselten Zellen verfolgt werden.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des emulgierungsbasierten Prozesses zur Einkapselung von Säugetierzellen. Perlen werden zuerst durch Emulgieren einer Alginat-, Zell- und CaCO ₃ -Mischung in Mineralöl (Schritte 1 und 2 im Schema) hergestellt, wobei die innere Gelierung durch Zugabe von Essigsäure ausgelöst wird (Schritt 3). Die gelierten Perlen werden dann durch Zugabe eines wässrigen Puffers zur Triggerphaseninversion (Schritt 4) von dem Öl abgetrennt, gefolgt von Zentrifugation und Ölabsaugung (Schritt 5) und dann Filtration (Schritt 6). Schließlich werden die auf dem Filter gesammelten Kügelchen in Zellkulturmedium für in vitro Kultur oder zur Transplantation überführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Reaktionen und Diffusionsschritte bei interner Gelierung. (1) Essigsäure wird der organischen Phase zugesetzt und durch Konvektion zu den Alginattropfen transportiert. (2) Die Essigsäure trennt sich in die wässrige Phase. (3) In Gegenwart von Wasser dissoziiert und diffundiert die Säure, um die CaCO ₃ -Körner zu erreichen, die in dunkelblau dargestellt sind. (4) Die H ⁺ -Ionen werden mit Ca ²⁺ -Ionen in CaCO ₃ ausgetauscht, wobei Ca ²⁺ -Ionen freigesetzt werden. (5) Die Calciumionen diffundieren, bis sie auf nicht umgesetztes Alginat stoßen, was zur ionotropen Vernetzung der Alginatketten führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Im Gegensatz zu herkömmlichen Düsen-basierten Zellverkapselungen ist eine breite Wulstgrößenverteilung zu erwartenAus diesem Verfahren aufgrund des Mechanismus der Tröpfchenbildung bei gerührter Emulgierung. Für eine Teilmenge von Anwendungen kann diese Perlengrößenverteilung problematisch sein. Beispielsweise kann ein größerer Anteil an Zellen an der Wulstoberfläche in kleineren Perlen belichtet werden. Wenn Nährstoff ( z. B. Sauerstoff) Einschränkungen ein Anliegen sind, können diese Einschränkungen in größeren Perlen verschärft werden. Ein Vorteil des gerührten Emulgierverfahrens besteht darin, daß die mittlere Wulstgröße leicht durch Ändern der Rührgeschwindigkeit während des Emulgierungsschritts eingestellt werden kann. Die breite Wulstgrößenverteilung kann auch genutzt werden, um die Wirkung der Perlengröße auf die eingekapselte Zellleistung zu untersuchen.

Säugetierzellverkapselung durch Emulgierung und interne Gelierung ist eine interessante Alternative für Laboratorien, die nicht mit einem Wulstgenerator ausgestattet sind. Darüber hinaus bietet diese Methode den Anwendern die Möglichkeit, die Verarbeitungszeit zu reduzieren oder Perlen in sehr niedrigem oder sehr hohem Alginatkonzentrat zu erzeugenAtions

Das nachstehend beschriebene Protokoll beschreibt die Einkapselung von Zellen in 10,5 ml einer 5% igen Alginatlösung, hergestellt in 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) -Puffer. Das Alginat besteht aus einer 50: 50-Mischung aus Transplantationsgrad-LVM (niedrigviskoser hoher Mannuronsäuregehalt) und MVG (mittlerer Viskosität hoher Guluronsäuregehalt) Alginat. Calciumcarbonat mit einer Endkonzentration von 24 mM wird als physikalisches Vernetzungsmittel verwendet. Leichtes Mineralöl bildet die organische Phase, während Essigsäure verwendet wird, um die Emulsion zu säuern und interne Gelierung auszulösen. Jedoch hängen der Alginattyp und die Zusammensetzung sowie der ausgewählte Prozesspuffer von der gewünschten Anwendung ^{32 ab} . Eine Vielzahl von Alginattypen (siehe Tabelle der Materialien) wurden verwendet, um Perlen mit diesem Protokoll herzustellen.

Protocol

1. Die Alginatlösung, die CaCO ₃ Suspension und das Acidified Oil vorbereiten

1. Vorbereiten des Prozesspuffers und des Mediums.
   1. Bereiten Sie den typischen Prozesspuffer vor, der zur Erzeugung von hochkonzentrierten Alginatperlen unter Verwendung von 10 mM HEPES, 170 mM NaCl verwendet wird. Den pH-Wert auf 7,4 einstellen.
   2. Bereiten Sie das typische Kulturmedium mit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 6 mM Glutamin, 100 U / mL Penicillin und 100 mg / mL Streptomycin vor.
2. Bereiten Sie die Alginat-Stammlösung bei 1,17-fach der endgültigen gewünschten Konzentration in den Perlen vor.
   1. Zuerst wiegen die entsprechende Menge an Alginatpulver. Um beispielsweise eine Endkonzentration von 5% Alginat mit 50: 50 LVM und MVG-Alginat zu erhalten, wiegen wir insgesamt 1,17 g Natriumalginat durch Kombinieren von 0,583 g LVM-Alginatpulver und 0,583 g MVG-Alginatpulver.
   2. Platzieren Sie 20 ml Prozesspuffer in ein AutocLavable Glasgefäß auf einem magnetischen Rührblech und rührt bei ~ 200 U / min. Progressiv das Natriumalginatpulver zur Lösung hinzufügen.
   3. Lassen Sie die Lösung über Nacht bei niedriger Geschwindigkeit rühren. Falls nötig, den Kolben auf die Rührplatte aufkleben.
   4. Wenn die Lösung unvollständig aufgelöst ist, die Flasche auf einen Rotationsmischer aufkleben und weitere 24 h bei 37 ° C mischen.
   5. Sterilisieren der Alginatlösung durch Autoklavieren der Lösung für 30 min in einem Gefäß, das weniger als halb voll ist. Lassen Sie die Temperatur unter 60 ° C abnehmen, bevor Sie die Lösung abholen.
   6. Entfernen Sie ggf. Partikel durch Filtrieren der Alginatlösung kurz nach dem Autoklavieren, bevor sie Raumtemperatur erreichen, während die Viskosität ausreichend niedrig bleibt.
3. Bereiten Sie die Calciumcarbonat-Suspension bei der 21fachen der endgültigen gewünschten Konzentration für die interne Gelierung vor.
   1. Wiegen Sie das CaCO ₃ Pulver ab. Zum Beispiel adD 1 g CaCO ₃ bis 20 ml Prozesspuffer, um 24 mM CaCO ₃ als die endgültige Geliermittelkonzentration zu erhalten.
   2. Autoklavieren Sie die CaCO ₃ Suspension für 30 min.
      HINWEIS: Die CaCO ₃ -Konzentration ändert sich im Laufe der Zeit aufgrund des Bicarbonat-CO ₂ -Konzentrats. Vermeiden Sie die Verwendung der gleichen Lager CaCO ₃ Suspension für mehr als 10 Verkapselung Verfahren.
4. Autoklav das für den Emulgierungsprozess verwendete Rührkessel Vor dem Gebrauch entfernen Sie Spuren von kondensiertem Wasser, das in der Spinnkolben verbleibt.
5. Unmittelbar vor dem Emulgierungsvorgang das angesäuerte Öl vorbereiten. Man löst 44 μl Essigsäure pro 11 ml Mineralöl in ein 50 ml konisches Röhrchen.
   HINWEIS: Ein häufiger Fehler ist eine unvollständige Auflösung der Essigsäure. Vermeiden Sie es, kleine Mengen an Essigsäure zu pipettieren und sicherzustellen, dass die Essigsäure vollständig durch Öl durch wiederholtes Vortexen aufgelöst wird.
   ACHTUNG: Essigsäure ist eine giftige und D flüchtige Säure. Behandeln Sie dieses Reagenz unter einer Abzugshaube und halten Sie die Essigsäure / Öl-Lösung in einem geschlossenen Behälter bis zum Emulgierungsschritt. Weitere Informationen finden Sie in den MSDS-Informationen zu diesem Reagenz.
6. Lassen Sie alle Lösungen auf Raumtemperatur zugreifen, bevor Sie mit der Zellverkapselung fortfahren.

2. Alginat-Perlenerzeugung durch Emulgierung und innere Gelierung

1. Legen Sie 10 ml leichtes Mineralöl in den Spinnkolben und starten Sie das Rühren mit einer niedrigen Drehzahl ( z. B. 250 U / min für die Spinnkolben in diesem Video).
2. Wenn die für den Prozess verwendeten Zellen aus adhärenten Kulturen bestehen, wenden Sie Trypsin an, um die Zellen zu suspendieren. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von FBS-haltigem Medium oder Trypsin-Inhibitor und sammeln Sie eine Probe für die Zell-Enumeration.
   1. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und die Lebensfähigkeit nach Trypan-Blau-Färbung mit einem Hämocytometer oder einem automatisierten Zellzähler, wie zuvor beschriebenAss = "xref"> 32.
3. Zentrifugieren der Zellen für 7 min bei 300 xg und waschen sie einmal im gewünschten Medium zur Zellimmobilisierung. Stellen Sie sicher, dass dieses Medium Emulgatoren wie entweder FBS oder Rinderserumalbumin (BSA) enthält. Verwenden Sie zum Beispiel DMEM mit 10% FBS.
4. Das Zellpellet in demselben Medium erneut suspendieren, um die gewünschte Endkonzentration in den Perlen 10,5-fach zu erhalten.
5. Füge 1,1 ml des 10,5-fach konzentrierten Zellstoffs zu 9,9 ml der Alginatlösung hinzu. Dann fügen Sie 550 μl CaCO ₃ -Suspension hinzu und mischen durch Rühren mit einem sterilen Spatel, um eine gleichmäßige Verteilung des CaCO ₃ zu gewährleisten.
6. Sofort 10,5 ml der Alginat-, Zell- und CaCO ₃ -Mischung in das Rühröl unter Verwendung einer Spritze überführen.
   HINWEIS: Für hochviskose Lösungen aspirieren und ausströmen die Mischung sehr langsam, um Luftblasen zu vermeiden. In einigen Fällen ist es bevorzugt, das Rühren zu stoppen, während das Gemisch dem Kolben zugesetzt wird, um zu vermeidenAlginat-Mitnahme auf die Laufradwelle.
7. Unmittelbar nach Zugabe der Alginat-, Zell- und CaCO ₃ -Mischung zum Öl erhöhen Sie die Rührgeschwindigkeit.
   HINWEIS: Für das hier verwendete 5% LVM: MVG-Alginat wurde eine Rotationsgeschwindigkeit von 1025 U / min angewendet, um Perlen von etwa 900 μm Durchmesser zu erzeugen, die für die in vitro Kultur geeignet sind ³⁵ . Höhere Drehzahlen und niedrigere Alginatkonzentrationen führen zu niedrigeren mittleren Wulstdurchmessern, wie in den vorangegangenen Publikationen ^{25 , 32 beschrieben} . Leichte Änderungen der Laufrad- und Gefäßgeometrie sowie Alginat-Eigenschaften können den mittleren Wulstdurchmesser stark beeinflussen. Für jede Änderung der Gefäßkonfiguration oder des Alginat-Loses sollte eine Standardkurve erzeugt werden, die den Flächenweitenmoment-Durchschnitt-Wulstdurchmesser auf die Drehzahl bezieht.
8. Starten Sie den Timer und emulgieren Sie das Alginat für 12 min.
9. 10 ml t hinzufügenEr Öl- und Essigsäurelösung, um die Emulsion zu säuern, das CaCO ₃ aufzulösen und somit das Alginat physikalisch zu gelierten Perlen zu vernetzen. 8 min für diesen Versauerungsschritt zulassen.

3. Bead Recovery

1. Reduzieren Sie die Rührgeschwindigkeit auf 400 U / min. Füge 40 ml Prozesspuffer hinzu, der mit 10% Medium gemischt wurde, um den pH-Wert zu erhöhen und eine Phaseninversion zu bewirken.
2. Stoppen Sie die Rührung 1 min später und übergeben Sie die Mischung auf 50 ml Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie den Spinnkolben mit einem zusätzlichen 20 ml Medium und fügen Sie diese dem Schlauch hinzu. Aspirieren Sie so viel wässrige Phase wie möglich aus dem Spinnkolben, bevor die Ölphase angesaugt wird, um den Wulstkontakt mit der Ölphase zu minimieren.
   HINWEIS: Bei diesem Schritt eine Großbohrpipette ( zB 25 mL Pipette) verwenden und von da an eine Beschädigung der Perlen vermeiden. Bei kleineren Volumina kann die Wulstaufhängung auch mit Schnittpipettenspitzen manipuliert werden. Um solche Spitzen zu erhalten, schneide das Ende der Pipettenspitze mit einer Schere abIle tragender Augenschutz.
3. Die Röhrchen für 3 min bei 630 xg zentrifugieren, um die Wulstablagerung und die Phasentrennung zu beschleunigen.
4. Das Öl und die überschüssige wässrige Lösung durch Ansaugen mit einer Pasteurpipette entfernen.
5. Waschen Sie die Perlen mindestens einmal mit Medium. Filzen Sie die Wulstaufhängung auf 40 μm Nylon-Zell-Siebe und saugt überschüssige Flüssigkeit, die mit den Perlen von unterhalb des Siebes verbunden ist. Übertragen Sie die Perlen in ein bekanntes Mediumvolumen mit einem sterilen Spatel.
   HINWEIS: Je nach Ziel-Mindestwulstdurchmesser können kleinere oder größere Porengrößenfilter verwendet werden. Jedoch wird die Schwerkraftfiltration eher empfohlen als die druckgetriebene Filtration durch Sub-Mikron-Porengrßenfilter, um eine Beschädigung der Perlen zu vermeiden.
6. Messen Sie das Perlenvolumen nach Volumenverdrängung (Volumen nach dem Hinzufügen der Perlen, abzüglich des Volumens vor dem Hinzufügen der Perlen) und auffüllen das Medium, um die gewünschte Perle zu erhalten: Gesamtvolumenverhältnis, das typischerweise 1: 5 oder 1 ml Kügelchen ist4 mL mittel. Verwenden Sie ab diesem Zeitpunkt immer große Bohrpipetten, um eine Beschädigung der Perlen zu vermeiden.
7. Übertragen der eingekapselten Zellen in T-Flaschen für in vitro Kultur- oder Transplantationsexperimente.

4. Qualitätskontrolle und Anwendungen

HINWEIS: Um die eingekapselte Zell- und Perlenqualität zu gewährleisten, sollten die Wulstgrößenverteilung und das Zellüberleben nach dem Prozess quantifiziert werden. Das Umkehren des Gels, um die Zellen aus den Perlen zur weiteren Analyse zurückzugewinnen, wird üblicherweise durchgeführt.

1. Um die Perlengrößenverteilung zu beurteilen, färben Sie die Perlen mit Toluidinblau-O.
   1. Legen Sie 0,5 ml Perlen in 4 ml Prozesspuffer mit 10% Vollmedium.
   2. Fügen Sie 500 μl einer 1 g / l Toluidinblau-Lösung in Prozesspuffer vor.
   3. Inkubieren für 60 min in einem konischen Rohr auf einem Rotationsschüttler bei 50 U / min.
   4. Füge 5 ml Prozesspuffer hinzu, der 10% vollständiges Medium und sofort enthältIch benutze die Perlen und die Lösung in eine Petrischale und erhalte Bilder auf einem Mikroskop mit geringer Vergrößerung oder mit einer handgehaltenen Digitalkamera. Wenn nötig, legen Sie die Petrischale auf eine leichte Box, bevor Sie Bilder mit einer Handkamera erhalten, um den Kontrast zu verbessern und Schatten zu vermeiden.
   5. Führen Sie eine Bildanalyse durch, um die Wulstgrößenverteilung zu quantifizieren, wie zuvor beschrieben, z. B. mit der Bildanalyse Freeware ³⁶ .
2. Um das Zellüberleben qualitativ zu beurteilen, färben Sie die Zellen mit Ethidium-Homodimer, um tote Zellen zu identifizieren und Calcein AM, um lebende Zellen zu identifizieren.
   1. Füge 1 Volumen der Perlen zu 4 Volumen des Prozesspuffers hinzu, der 10% vollständiges Medium enthält.
   2. Fügen Sie die entsprechende Menge an Calcein-AM- und Ethidium-Homodimer-Stammlösungen hinzu, um 4 & mgr; M bzw. 2 & mgr; M-Konzentrationen zu erhalten. Generieren Sie einzelne Fleckkontrollen, indem Sie nur eines der Reagenzien zu einigen Perlenproben hinzufügen.
   3. Inkubieren Sie die Perlen auf Eis für 20 min.
   4. Legen Sie die Lösung zwischen einem Objektträger und einem Deckglas mit einem Abstandshalter wie einem O-Ring, um die Kompression der Perlen zu vermeiden.
   5. Weiter zur Fluoreszenzmikroskopie. Verwenden Sie die einzelnen Fleckkontrollen, um die Fluoreszenz-Durchblutung zu beurteilen. Wählen Sie geeignete Fluoreszenzfilter auf der Basis der Anregung / Emissionswellenlängen, die mit Calcein AM (494/517 nm) und Ethidiumhomodimer an DNA (528/617 nm) gebunden sind.
3. Um die Zellen aus den Perlen zur weiteren Analyse zurückzugewinnen, degel das Alginat unter Verwendung von Citrat oder einer anderen Chelatlösung.
   1. Eine Degelling-Lösung mit 55 mM Citrat, 10 mM HEPES und 95 mM NaCl bei pH 7,4 vorbereiten.
   2. Mischen Sie diese Lösung mit 10% Medium und fügen Sie dann 1 ml Alginatperlen zu 9 ml der Mischung hinzu.
   3. Degel die Perlen auf Eis mit 75 U / min Agitation für 20 min.
      HINWEIS: Die Zellen können nun zur Analyse verwendet oder aus dem degelierten Alginatlösungsmittel entfernt werdenIonen durch Zentrifugation. Zum Beispiel kann die Zelllebensfähigkeit nach Degelling durch Trypan-Blau-Färbung quantifiziert werden. Alternativ können die Zellen zentrifugiert und gewaschen werden, gefolgt von mRNA, DNA und / oder Proteinabtastung und -analyse.

Representative Results

Am Ende des Emulgierens und des internen Gelierungsverfahrens sollte ein Perlenvolumen ähnlich dem anfänglichen Alginat- und Zellgemischvolumen gewonnen werden. Die Perlen sollten mit wenigen Defekten sehr sphärisch sein ( Abbildung 3 ). Die Perlen sollten ausreichend stark sein, um Pipettieren durch großporige Pipetten zu widerstehen. Bei hohen Alginatkonzentrationen können eingekapselte Öl- oder Lufttröpfchen in den Kügelchen beobachtet werden. Dies tritt wahrscheinlich aufgrund des Einbruchs von Öl in Alginat-Tröpfchen während des Emulgierungsschrittes (Öl / Wasser / Öl-Doppelemulsion) auf. In unseren Händen stellten diese Perlen eine kleine Fraktion (<5%) des Wulstvolumens dar, und die meisten dieser Perlen wurden entfernt, während das Öl während des Wulstrückgewinnungsschrittes aufgrund ihrer geringeren Dichte angesaugt wurde.

Abb. 3 : Repräsentative 5% Alginatperlen, die eingekapselte βTC3-Zellen enthalten, die durch Emulgierung und internes Gelierungsverfahren erhalten wurden Phasenkontrastbild von 5% Alginatperlen mit 5 x 10 ⁶ βTC3 Zellen / ml Kügelchen Klicken Sie hier um eine größere Ansicht zu sehen Version dieser Figur.

Die Größe der erhaltenen Perlen ist nicht einheitlich - dies ist ein intrinsisches Merkmal von gerührten Emulsionen ( Fig. 4A ). Während der Emulgierung in turbulenter Strömung wirken Druckschwankungen, um die Tröpfchen ^{37 , 38} zu stören, die der Oberflächenspannung und den viskosen Kräften in der dispergierten Phase ^{39 entgegenwirken} . Viskose Kräfte sind nicht vernachlässigbar, wenn die Viskosität der dispergierten Phase viel höher ist als die von thE kontinuierliche Phase. Unter der Annahme, dass die maximale lokale Energieableitungsrate proportional zur durchschnittlichen Energieableitungsrate im Gefäß ist, kann der maximale stabile Tröpfchendurchmesser d _max (wenn >> als die Kolmogorov-Skala) wie folgt berechnet werden ^{39 , 40 , 41 , 42}

Wobei ρ _c die Dichte der kontinuierlichen Phase ist, ε die mittlere Energieverteilungsrate im Gefäß ist, σ die Grenzflächenspannung zwischen den beiden Fluiden ist, μ _d die Viskosität der dispergierten Phase und C eine Proportionalitätskonstante ist. Wenn oberflächliche Zugkräfte über viskose Kräfte vorherrschen, vereinfacht sich die rechte Seite zu C , wohingegen die viskosen Kräfte, wenn die viskosen Kräfte vorherrschen, vereinfacht wird:

Bei Rührkesseln ist der Energieeintrag unter turbulenten Strömungsskalen proportional zur Leistungsaufnahme pro Volumeneinheit, dh zu N _i ³ D _i ² , wobei N _i die Rührgeschwindigkeit ist und D _i der Flügelraddurchmesser ist. In Verbindung mit Gleichung 1 und mit einer Konstante D _{i wird} , wenn die Oberflächenspannungskräfte vorherrschen, d _max vorausgesetzt, dass sie proportional zu N _i ^{-1.2 sind} ( Abbildung 4B ), während sie proportional zu N _i ^{-0,75 ist,} wenn viskose Kräfte innerhalb der Perlen dominieren als die wichtigste retentive Kraft. Die 4B und 4C deuten darauf hin, dass die Grenzflächeneffekte die d bestimmenRoplet-Größe für niedrige Alginat-Konzentrationen, während viskose Kräfte bei höherer Alginat-Konzentration ( z. B. 5% für Alginat # 3, die in der Tabelle der Materialien beschrieben sind) dominanter werden. Da es unpraktisch sein kann, d _max experimentell zu bestimmen, wurden stattdessen hohe Quantilwerte ( z. B. das 95. Quantil) des Durchmessers oder der Flächenmomentmitteldurchmesser ( d ₃₂ ) verwendet, da sie im allgemeinen proportional zu d _max ^{43 sind} .

Vor dem Einkapseln von Zellen empfiehlt es sich, eine Kurve von d ₃₂ als Funktion von N _i zu erzeugen ( Fig. 4B ). Diese Kurve wird dazu beitragen, das adäquate N _i auszuwählen, um eine gewünschte durchschnittliche Wulstgröße zu erhalten. Eine neue Standardkurve wird wahrscheinlich auch für verschiedene Chargen von Öl oder Alginat erforderlich sein, oder wenn das Alginatkonzentrat istTration wird geändert. Abhängig von der Gefäßgeometrie und den Alginatkonzentrationen sollte ein relativ breiter Bereich von mittleren Wulstdurchmessern erreichbar sein. Beispielsweise können d ₃₂ -Werte zwischen 200 μm und> 1 mm unter Verwendung von 2% ( 2C in Hoesli et al., ³² ) bis 5% Alginat ( 4 ) unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls erhalten werden.

Abbildung 4 : Perlengrößenverteilung ( A ) Toluidin-blau-O-gefärbte 5% Alginatperlen. ( B ) d ₃₂ als Funktion der Rührgeschwindigkeit ( N _i ) für 1,5% und 5% Alginatperlen unter Verwendung eines 50: 50-Gemisches aus Alginaten Nr. 1 und Nr. 2 (siehe Tabelle der Materialien). Ein einziger Punkt wird für die 5% algi gezeigtNate Perlen ( C ) d ₃₂ als Funktion von N _i für 2% und 5% Alginat # 3 (siehe Tabelle der Materialien). Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung der Perlengrößen innerhalb eines Samples (N> 150 Perlen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Das Zellüberleben aus der Emulgierung und dem internen Gelierungsprozess hängt hauptsächlich von dem Ausmaß und der Dauer des pH-Wertes ab, der von den Zellen erfahren wird. Unter Verwendung des in diesem Video beschriebenen Verfahrens wurden 76 ± 2% βTC3-Zellüberleben gemessen ³¹ . Beim Einkapseln von dispergierten Zellen bei 10 & sup5; Zellen / ml Alginat zu 10 & sup7; Zellen / ml Alginat-Seededichten sollten alle Perlen Zellen enthalten. Beim Einkapseln von Zellclustern wie Pankreaszellen kann man erwarten, dass eine Untermenge von Perlen entleert wirdY Fig. 5 zeigt typische lebende Zelle / tote Zellfärbeergebnisse, die unter Verwendung dieses Verfahrens erhalten wurden. Ein höheres Zellüberleben kann durch Erhöhen der Prozesspufferkapazität und durch Verringern der Dauer des Versauerungsschrittes erreicht werden. Beispielsweise wurden 90 ± 2% MIN6-Zellüberleben durch Verwendung von 60 mM MOPS (3- (N-Morpholino) propansulfonsäure) als Prozesspuffer und durch Verringern der Gesamtprozesszeit auf 4 min ^{32 erhalten} . Allerdings waren die erzeugten Perlen mit dem 10 mM HEPES-Prozesspuffer signifikant stärker als bei dem 60 mM MOPS-Prozesspuffer aufgrund der erhöhten Ca ^{2+ -Vermengen,} die bei einem niedrigeren pH-Wert von ³¹ freigesetzt wurden. Sowohl das kurze MOPS-Verfahren als auch das längere HEPES-Verfahren sollen Perlen erzeugen, die für> 2 Wochen in vitro Kultur oder Transplantation ausreichend stabil sind. Allerdings können Perlen ganz in Lösungen mit niedrigem Kalzium oder mit hohen Chelatorkonzentrationen quellen oder degelieren (z, Calcium-freie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung).

Für eingekapselte MIN6-Zellen, die in vitro gezüchtet wurden , bilden sich nach zwei 5-7 Tagen in vitro immobilisierte Zellexpansion und ~ 150 μm Durchmesser Sphäroiden nach 2 Wochen. Es wird erwartet, dass die Wachstumsrate von Alginat-immobilisierten Zellen niedriger ist als in nicht immobilisierten Kulturen, insbesondere für Gele mit einer höheren Alginatkonzentration oder einem höheren Guluronsäuregehalt.

Abbildung 5 : Eingekapselte Zellen unmittelbar nach dem Prozess. ( A ) lebende Zelle (grün, calcein AM) und tote Zelle (Rot, Ethidium Homodimer) Färbung von verkapselten Zellen. ( B ) Phasenkontrastbild der gleichen Perle. Die MIN6-Zellen wurden in 2%Alginatperlen unter Verwendung der 12-minütigen Emulgierung, 8 min Versauerung und eines 10 mM HEPES-Puffers, wie in diesem Protokoll beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Verschiedene Schritte (dargestellt in Abbildung 2 ) während der internen Gelierungsreaktion können die Gesamtkinetik begrenzen. Für Calciumcarbonatkörner, die grßer als ~ 2,5 um sind, hat sich gezeigt, daß die Rate der Carbonatauflösung eine ratenbegrenzende ^{26 , 44 aufweist} . Der Säuerungsschritt, der zur internen Calciumfreisetzung führt, hat sich auch als die kritische Prozeßvariable erwiesen, die das Zellüberleben beeinflußt ³² . Die Bedingungen, die zur internen Gelierung führen, sind daher sowohl für die Perlenqualität als auch für das Zellüberleben entscheidend. Abhängig von der endgültigen Anwendung für die Perlen können unterschiedliche optimale Prozessbedingungen gewählt werden. Zum Beispiel kann ein höherer pH-Wert ( z. B. unter Verwendung von 10 mM HEPES, um die Alginatlösung zu puffern) für Transplantationsanwendungen wünschenswert sein, wo die Langzeitstabilität der Perlen entscheidend ist. Auf der anderen Seite ein niedrigerer pH-Wert ( zB mit 60 mM MOPS zu buffeR die Alginatlösung) kann für in vitro Anwendungen bevorzugt sein.

Neben der Anpassung des Niveaus und der Dauer der Versauerung können auch andere Prozessänderungen vorgestellt werden. Beispielsweise können andere Rührgefäßkonfigurationen, Alginatkonzentrationen, Prozeßpuffer, organische Phasen und Säuerungsmittel verwendet werden. Wie oben diskutiert, kann die durchschnittliche Wulstgröße leicht durch Ändern der Rührgeschwindigkeit während des Emulgierungsschrittes eingestellt werden. Darüber hinaus können längere Emulgierzeiten zu kleineren Wulstgrößen führen, können aber eine verminderte Zelllebensfähigkeit verursachen. Die Publikationen von Poncelet et al. ^{25 , 26 , 45} und Hoesli et al. ^{31 , 32} haben einige dieser Optionen getestet und diskutiert.

Leichte Änderungen in dem oben beschriebenen Protokoll können einen tiefen Einfluss habenPerlenerzeugung, Perlenqualität und Zellüberleben. Tabelle 1 enthält eine Fehlersuche, um Probleme zu verstehen und zu lösen, die auftreten können.

Problem	Typische Ursache	Lösungsvorschläge
Das Laufrad stoppt das Drehen während der Alginat- oder Säureöl-Zugabe	Das Magnetfeld ist unzureichend für eine ausreichende Vermischung oder die Laufradwelle ist fehlausgerichtet	Stellen Sie sicher, dass der Spinnkolben auf der Magnetplatte gut zentriert ist und vor der Zugabe der Alginatmischung in optimaler Position auf die Platte aufgeklebt wird. Testen Sie sehr hohe Rührgeschwindigkeiten und verringern Sie sich dann vor der Zugabe der Alginatmischung auf die gewünschte Rührgeschwindigkeit.
		Sicherstellen, dass die Laufradwelle gut ausgerichtet und stabil ist. Für den BelLco Spinnkolben sorgen dafür, dass das Laufrad durch Schrauben an beiden Seiten der Spinnkolbenkappe fest gehalten wird. Sicherstellen, dass die Laufradbewegung auf die radiale Richtung begrenzt ist (das Laufrad darf nicht auf der Welle wackeln).
Keine Perlen erhalten	Das Alginat wurde falsch emulgiert	Stellen Sie sicher, dass Alginat-Mikrotröpfchen während der Emulgierung sichtbar sind. Wenn nicht, vergewissern Sie sich, dass die Ölphasendichte und die Gefäßgeometrie 23 den in diesem Protokoll beschriebenen ähnlich sind. Eine dichte Ölphase oder Gefäßgeometrie, die keine ausreichende lokale Energieableitung bereitstellt, kann keine korrekte Alginat-Emulgierung zulassen.
Keine Perlen erhalten	Die innere Gelierung trat nicht auf	Ein häufiger Fehler ist eine unvollständige Auflösung der Essigsäure in der Ölphase. Sicherstellen, dass das Säureölgemisch ausreichend verwirbelt ist und keine Essigsäure amBoden der Tube.
		Wenn das Laufrad das Öl nicht erreicht, kann vor der Zugabe des Alginats mehr Öl zugegeben werden. Die Menge an Essigsäure sollte jedoch nach folgender Gleichung eingestellt werden: Woher 1 ist das Öl / Wasser-Phasenverhältnis vor Modifikationen (z. B. 0,525 für 10,5 ml Alginat in 10 ml Öl + 10 ml saurem Öl), 2 ist das Öl / Wasser-Phasenverhältnis nach Modifikationen des Protokolls, und Dow ist der Essigsäure-Verteilungskoeffizient zwischen den beiden Phasen. Dieser Verteilungskoeffizient kann experimentell gemessen oder durch Werte aus der Literatur angenähert werden. Beispielsweise beträgt der Verteilungskoeffizient von Essigsäure zwischen Heptan und Wasser 46 0,011.
Keine PerleS erhalten, oder Perlen sind mechanisch instabil	Die Nulldurchgangsviskosität der Alginatlösung liegt unter 0,004 Pa · s oder über 112 Pa · s	Aufgrund der hohen Batch-to-Batch-Variabilität von Alginat-Losen wird empfohlen, die Viskosität verschiedener Konzentrationen von Alginatlösungen zu messen. Die Kombination eines hochviskosen Ansatzes mit einer niedrigviskosen Charge kann erforderlich sein, um eine Zielviskosität zu erreichen. Für die hier verwendete 5% LVM- und MVG-Mischung betrug die Null-Scherviskosität 3,3 Pa · s. Es ist anzumerken, dass Alginate mit zu kurzen Guluronsäureblocklängen oder kurzen Gesamtkettenlängen keine Gelbildung ermöglichen können.
Perlen sind zu groß oder zu klein	Die Rührgeschwindigkeit während der Emulgierung ist zu niedrig oder zu hoch für die eingesetzte Alginatkonzentration oder Viskosität	Eine Erhöhung der Turbulenz durch Erhöhung der Rührgeschwindigkeit oder Hinzufügen von Schikanen verringert die Perlengröße. Die Alginatkonzentration, die TempErature, das Gefäß und die Laufradgeometrie werden alle die Wulstgröße beeinflussen.
Viele gebrochene Perlen werden beobachtet	Harte Beadhandhabung, Beschädigung während des internen Gelierungsschrittes oder unzureichende Perlenstärke.	Eine mechanische Beschädigung der Perlen kann zu einem Wulstbruch führen, sobald die interne Gelierung eingeleitet wird. Reduzieren Sie die Rührgeschwindigkeit unmittelbar vor dem Versauerungsschritt und stellen Sie sicher, dass die Perlen sanft mit 25 ml Pipetten oder 1000 μl Pipetten mit Schnittspitzen behandelt werden. Wenn beschädigte Perlen auch bei sorgfältiger Handhabung und reduziertem Rühren während der Versauerung beobachtet werden, kann die Perlenstärke unzureichend sein. Dies könnte auf einen unzureichenden Guluronsäuregehalt oder eine unvollständige Gelierung (zB unzureichende Versauerung) zurückzuführen sein.
Niedrige Zelllebensfähigkeit	Anfangs-Prozess pH-Wert zu hoch oder endgültiger pH-Wert zu niedrig	Das Überleben von Säugetierzellen kann durch die Begrenzung des pH-Wertes und die Versauerungszeit erhöht werden
Niedrige Zelllebensfähigkeit in den kleineren Perlen	Unzureichende Alginat-Lösungspufferung	Ein größerer pH-Wert wird in den kleineren Perlen als in den größeren Perlen aufgrund des größeren Oberflächen / Volumen-Verhältnisses dieser Perlen erwartet. Da die der Emulsion zugegebene Essigsäure begrenzt ist, werden höhere Essigsäurekonzentrationen in kleineren Perlen für die gleiche CaCO 3 -Konzentration vorhergesagt. Eine Erhöhung der Pufferkapazität der Alginatlösung (z. B. unter Verwendung von 60 mM MOPS anstelle von 10 mM HEPES) kann das Zellüberleben in den kleineren Perlen 32 erhöhen. Kleine Kügelchen mit hohen Zellverlusten konnten selektiv durch Filtration oder Sedimentation entfernt werden, ohne große volumetrische Verluste zu verursachen.
ichKomplett CaCO 3 Auflösung	Unzureichende Versauerung oder Versauerungszeit. Beachten Sie, dass dieses Problem möglicherweise nicht problematisch ist, wenn die Wulststabilität ausreichend ist.	Unvollständige CaCO 3 -Lösung wurde in den größeren Perlen nach diesem Protokoll 32 beobachtet . Das Ausmaß der CaCO 3 -Lösung kann in Abhängigkeit von der CaCO 3 -Korngröße, dem pH-Wert während des Verfahrens, der Dauer des pH-Wertes sowie der verwendeten Alginatkonzentration variieren. Dieses Problem gilt nicht als problematisch, solange die mechanische Stabilität des Wulstes für die gewünschte Anwendung ausreicht. Um die Wulstvernetzung zu erhöhen, ist darauf zu achten, dass das CaCO 3 -Korn ausreichend klein ist (~ 2,5 μm). Sonicating der CaCO 3 Suspension kann dazu beitragen, aggregierte Körner zu zerstören 26 . Bei sehr niedrigen oder hohen Alginatkonzentrationen können Anpassungen in der CaCO 3 -Konzentration erforderlich sein. Schließlich, Chelatoren oder Lösungen mit niedrigenEbenen von zweiwertigen Ionen führen zum allmählichen Verlust von Ca 2+ im Gel. Wenn ein allmählicher Verlust der mechanischen Stabilität des Wulstes beobachtet wird, vergewissern Sie sich, dass der Wulstspeicher oder Kulturpuffer> 2 mM Ca 2+ enthält .

Tabelle 1: Leitfaden zur Fehlerbehebung. Liste der Probleme, wahrscheinliche Ursachen und mögliche Lösungen.

Mögliche Einschränkungen der Emulgierung und des internen Gelierungsprozesses für die in vitro- Kultur von Säugetierzellen und Transplantationsanwendungen sind: (1) die Notwendigkeit einer vorübergehenden Exposition gegenüber niedrigem pH-Wert, (2) die Notwendigkeit, restliches Öl zu entfernen, (3) die polydisperse Perlengrße Verteilung, (4) die potentielle Scherspannung während der Alginattröpfchenbildung und (5) die höhere Porosität von intern gelierten Perlen im Vergleich zu extern gelierten Perlen ⁴⁷ .

Das hohe Zellüberleben und die Funktion von MIN6 und βTC3 wurde erhaltenNach Prozessoptimierung ³² . Dieses Verfahren kann jedoch nicht für mehr pH-empfindliche Zellen geeignet sein. Die vollständige Beseitigung von Öl aus den Perlen kann auch eine Herausforderung sein, und Food and Drug Administration (FDA) -Angebot Öl-Typen sind für eventuelle klinische Anwendungen erforderlich. Die polydisperse Perlengrößenverteilung kann auch für Immunisolationsanwendungen etwas problematisch sein, wo eine vollständige Zellverkapselung und ein langfristiges Zellüberleben wünschenswert sind. Während kleine Wulstgrößen zum Zellvorsprung ^{48 führen können} , können große Perlen die Nährstoffdiffusion und / oder die Zellfunktion ^{35 , 49} behindern. Auf der anderen Seite bietet der Emulgierungsprozess eine interessante Gelegenheit, die Wirkung der Perlengröße auf das Zellüberleben nach der Transplantation zu untersuchen, indem sowohl kleine als auch große Perlen in einem einzigen Prozess erzeugt werden. Die durchschnittliche Wulstgröße kann leicht durch Modifizieren der Rührgeschwindigkeit bestimmt werdenG der Emulgierungsschritt ( Abbildung 4 ). Schließlich kann die höhere Porosität von intern gelierten Perlen auch für die Immunisolierung schädlich sein, wo Moleküle wie Antikörper und Cytokine von den Perlen ausgeschlossen werden sollten. Das Emulgierungsverfahren ermöglicht jedoch auch die Wulsterzeugung aus sehr konzentrierten Alginatlösungen, wodurch die Alginatperlenporengröße reduziert wird.

Die Emulgierung und der interne Gelierungsprozess ist eine interessante Alternative zu Düsen-basierten Einkapselern für Laboratorien, die die Zellverkapselung oder den Zugang zu einem Einkapselung vergrößern möchten. Dieser Prozess ist ein robustes und einfaches Verfahren zur Immobilisierung von Zellen in Alginatperlen unter Verwendung sehr verdünnter oder sehr konzentrierter Alginatlösungen. Einige der nachfolgenden Experimente, die mit den immobilisierten Zellen durchgeführt werden können, sind die Bestimmung der Wirkung der Alginat-Matrix auf Zell-Schicksalsentscheidungen oder um zu bestimmen, inwieweit die Perlen eine Barriere zwischen transplante liefernD-Zellen und dem Wirts-Immunsystem. Die Emulgierung und das interne Gelierungsverfahren bieten einen neuen Ansatz, um primäre Inselchen in großen Chargen zu verkapseln. Das Verfahren ermöglicht auch die Zellverkapselung in hochkonzentrierten Alginatperlen mit reduzierter Porosität und damit reduziertem Antikörperzugang zu den eingekapselten Zellen. Die Emulgierung und das interne Gelierverfahren bieten daher ein neues Mittel, um klinisch relevante Mengen von eingekapselten therapeutischen Zellen zu erzeugen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade)	Sigma	A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)	A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM	Life Technologies	11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin	Thermo Fisher Scientific	SH3039603
Glutamine	Life Technologies	25030
Penicillin and streptomycin	Sigma	P4333-100ML
HEPES, cell culture tested	Sigma	H4034-100G
NaCl	Thermo Fisher Scientific	S271-1
Fine-grain CaCO3	Avantor Materials	1301-01	After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil	Thermo Fisher Scientific	O121-4	Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid	Thermo Fisher Scientific	A38-500	Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas	Sigma	CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Sarstedt	86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Toluidine Blue-O	Sigma	T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks	Bellco	1965-00100	The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed	Bellco	7760-06005	The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter	Innovatis	Cedex AS20	This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box	Artograph	LightPad® PRO	This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera	Canon	PowerShot A590 IS	A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters	Olympus	IX81	Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software	Molecular Devices	Metamorph	A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware	CellProfiler	Non-applicable	A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).