Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

אנקפסולציה תא יונקים ב Alginate חרוזים באמצעות כלי פשוט מתערבל

Published: June 29, 2017 doi: 10.3791/55280
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1, 1, 2
1Department of Chemical Engineering, McGill University, 2Michael Smith Laboratories & Department of Chemical and Biological Engineering, University of British Columbia, 3Michael Smith Laboratories & Department of Pharmaceutical Sciences, University of British Columbia

Summary

זה וידאו כתב היד לתאר שיטה המבוססת על תחליב לתמצת תאים יונקים 0.5% עד 10% חרוזים alginate אשר ניתן לייצר בקבוצות גדולות באמצעות כלי זעיר זעיר. תאים המארז יכול להיות מתורבת במבחנה או המושתלים עבור יישומים טיפול סלולרי.

Abstract

תאים אנקפסולציה של חרוזים אלגינט שימש לתרבות תאים משותקת במבחנה, כמו גם עבור immunoisolation in vivo . אנקפסולציה איון הלבלב נחקרה בהרחבה כאמצעי להגביר את הישרדות האיון בהשתלות אלוגניות או קסנוגניות. Alginate אנקפסולציה מושגת בדרך כלל על ידי שחול זרבובית ו gelation חיצוני. באמצעות שיטה זו, המכיל תאים alginate המכילים תאים בקצה החרירים נופלים לתוך פתרון המכיל קטיונים divalent שגורמים ionotropic alginate gelation כפי שהם מפוזרים לתוך טיפות. הדרישה להיווצרות טיפה בקצה קצה הזרבובית מגבילה את התפוקה הנפחית ואת הריכוז אלגינט שניתן להשיג. וידאו זה מתאר שיטה מתחלבת להרחבה לתמצת תאים יונקים ב 0.5% אלגינט 10% עם 70% עד 90% הישרדות התא. בשיטה חלופית זו, טיפות alginate המכילות תאים סידן פחמתי הם emulsified בשמן מינרלי, Folנמוך על ידי ירידה ב pH המוביל שחרור סידן פנימי ו gotation ionotropic alginate. השיטה הנוכחית מאפשרת ייצור של חרוזים אלגינט בתוך 20 דקות של תחליב. הציוד הנדרש לשלב אנקפסולציה מורכב כלי זעירים זעירים לרשות מעבדות ביותר.

Introduction

אנקפסולציה תא יונקים נחקרה באופן רחב כאמצעי להגן על תאים המושתלים של דחייה החיסונית 1 או לספק תמיכה תלת מימדי לתרבות תאים משותקת 2 , 3 , 4 . אנקפסולציה איון הלבלב ב alginate חרוזים שימש כדי להפוך סוכרת ב 5 , 6 או xenogeneic 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 מכרסמים. ניסויים פרה-קליניים וקליניים של השתלת איבר הלבלב המבוצעת לטיפול בסוכרת מסוג 1 נמשכים 13 , 14 , 15 . עבור יישומים להשתלה או גדול יותרE במבחנה ייצור תאים משותקים, חרוזים מבוססי זרבובית חרוז משמשים בדרך כלל. בדרך כלל, תערובת של alginate ותאים נשאבים דרך זרבובית כדי ליצור טיפות נופל לתוך פתרון נסער המכיל קטיונים divalent, וכתוצאה מכך gelation חיצוני של טיפות. זרימת גז קואקסיאלית 16 , 17 , רטט זרבובית 18 , דחייה אלקטרוסטטית 19 או חוטים מסתובבים 20 להקל על היווצרות טיפות בקצה קצה הזרבובית.

החסרונות העיקריים של גנרטורים חרוז קונבנציונאלי הם התפוקה המוגבלת שלהם ואת טווח מוגבל של צמיגות פתרון אשר יביא ליצירת חרוז נאותה 21 . בשיעורי זרימה גבוהים, הנוזל היוצא מן הזרבובית נשבר לתוך טיפות קטנות יותר מקוטר הזרבובית, ומקטין את בקרת הגודל. Multi-nozzle חרוזים חרוזים ניתן להשתמש כדי להגדיל את התפוקה, אבלהתפלגות אחידה של הזרימה בין החרירים והשימוש בפתרונות> 0.2 PAS הוא בעייתי 22 . לבסוף, כל ההתקנים מבוססי נחיר צפויים להקנות נזק כלשהו איים, שכן קוטר החרירים המשמשים הוא בין 100 מיקרומטר ו 500 מיקרומטר, בעוד ~ 15% של איים האדם יכול להיות גדול מ 200 מיקרומטר 23 .

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה חלופית לתמצת תאים יונקים על ידי יצירת טיפות בשלב אמולסיפיקציה אחת במקום טיפה אחר טיפה. מאז ייצור חרוז מבוצע בכלי זעיר זעיר, השיטה מתאימה קטן (~ 1 מ"ל) בקנה מידה גדול (10 3 L טווח) חרוז הייצור עם עלויות ציוד נמוך 24 . שיטה זו מאפשרת ייצור של חרוזים עם sphericity גבוהה באמצעות מגוון רחב של צמיגות alginate עם קצר ( למשל 20 דקות) פעמים חרוז הדור. שיטה זו פותחה במקור על ידי Poncelet et aL. 25 , 26 ו משמש immobilize DNA 27 , חלבונים 28 כולל אינסולין 29 , חיידקים 30 . יש לנו לאחרונה התאמת שיטות אלה כדי אנקפסולציה של תאים יונקים באמצעות תאים בלבלב בלבלב 31 , 32 ורקמת הלבלב העיקרי 32 .

העיקרון של השיטה היא ליצור מים ב-שמן תחליב המורכב טיפות alginate בשמן מינרלי, ואחריו gelation פנימי של טיפות alginate ( איור 1 ). ראשית encapsulant ( למשל, תאים) הוא התפזר פתרון alginate המכיל מלח סידן בסדר גרגר עם מסיסות נמוכה בתהליך pH הראשונית. תערובת אלגינט הוא הוסיף אז לשלב אורגני agitated ליצור תחליב, בדרך כלל בנוכחות של פעילי שטח. במקרה של אנקפסולציה תא יונקים, רכיבים הנוכחי בסרום יכול לשמש surfactants. לאחר מכן, pH מופחת על מנת solubilize מלח סידן על ידי הוספת שמן מסיס חומצה כי מחיצות לתוך השלב מימית. חומצה אצטית, עם מקדם מחצבים שמן / מים <0.005 33 , צריכה להתמוסס מראש בשמן, ולאחר מכן להוסיף את התחליב שבו הוא מעורבב בשלב השמן ומחיצות במהירות לתוך שלב מימית 34 . איור 2 ממחיש את התגובות הכימיות ודיפוזיה המתרחשות במהלך החמצון ואת שלב gelation פנימי. לבסוף, תאים encapsulated הם התאושש על ידי היפוך פאזה, הפרדת פאזה מואצת על ידי צנטריפוגה, צעדים כביסה חוזרת וסינון. צעדים אלה יכולים להיות ואחריו חרוז דגימה התא עבור ניתוחי בקרת איכות, בתרבית תאים חוץ גופית ו / או השתלת תאים encapsulated.

S = "jove_content" עבור: keep-together.within-page = "1"> איור 1
איור 1: סכמטי של תהליך המבוסס על תחליב לתמצת תאים יונקים. חרוזים מיוצרים לראשונה על ידי emulsifying alginate, תא CaCO 3 תערובת בשמן מינרלי (שלבים 1 ו 2 ב סכמטי), המפעילה gelation פנימי על ידי הוספת חומצה אצטית (שלב 3). החרוזים gelled מופרדים מכן מן השמן על ידי הוספת חיץ מימית כדי להפעיל היפוך פאזה (שלב 4), ואחריו צנטריפוגה ושאיפה שמן (שלב 5), ולאחר מכן סינון (שלב 6). לבסוף, החרוזים שנאספו על המסנן מועברים לתרבות תרבות תאים לתרבות חוץ גופית או להשתלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: תגובות ושלבי דיפוזיה המתרחשים במהלך גלאציה פנימית. (1) חומצה אצטית מתווסף לשלב אורגני ומועבר לטיפות אלגינט על ידי הסעה. (2) מחיצות חומצה אצטית לתוך השלב מימית. (3) בנוכחות מים, חומצה dissociates ו מתפזרת להגיע CaCO 3 גרגרים מתואר כחול כהה. (4) יונים H + מוחלפים עם Ca 2 + יונים CaCO 3 , שחרור Ca 2 + יונים. (5) יוני סידן מפוזרים עד שהם נתקלים alginate unreacted, המוביל הצטלבות יונוטרופית של שרשראות אלגינט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

בניגוד קונבנציונאלי מבוססי זרבובית תא encapsulators, הפצה גודל חרוז גדול expeCted מתהליך זה בשל מנגנון של היווצרות טיפות ב emulsification עורר. עבור קבוצת משנה של יישומים, הפצה זו גודל חרוז עשוי להיות בעייתי. לדוגמה, חלק גדול יותר של תאים עשוי להיות חשוף על פני חרוז חרוזים קטנים יותר. אם מזין ( למשל חמצן) מגבלות הן דאגה, מגבלות אלה עשויים להיות החריפו ב גדול חרוזים. יתרון של שיטת אמולסיפיקציה מעוררת היא כי גודל החרוז הממוצע יכול בקלות להיות מותאם על ידי שינוי קצב התסיסה במהלך שלב תחליב. הפצה גודל חרוז רחב יכול גם להיות מנוצל כדי לחקור את ההשפעה של גודל חרוז על ביצועי התא encapsulated.

אנקפסולציה תא יונקים על ידי emulsification ו gelation פנימי הוא חלופה מעניינת עבור מעבדות שאינן מצוידים גנרטור חרוז. יתר על כן, שיטה זו נותנת למשתמשים את האפשרות של צמצום זמן העיבוד, או יצירת חרוזים ברמה נמוכה מאוד או גבוהה מאוד alginate concentrAtions.

פרוטוקול המתואר להלן מתאר כיצד לתמצת תאים 10.5 מ"ל של 5% פתרון alginate מוכן 10 מ"מ -4 (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) חיץ. Alginate מורכב תערובת של 50:50 של LVM כיתה השתלה (צמיגות נמוכה תוכן חומצה גבוהה mannuronic) ו MVG (צמיגות בינונית גבוהה חומצה guluronic תוכן) alginate. סידן קרבונט בריכוז סופי של 24 מ"מ משמש כסוכן פיזי מקשר. שמן מינרלי קל מהווה את השלב האורגני, בעוד חומצה אצטית משמש לחומציות תחליב ולהפעיל gelation פנימי. עם זאת, סוג alginate והרכב, כמו גם המאגר תהליך שנבחרו תלויים ביישום הרצוי 32 . מגוון של סוגים alginate (ראה טבלה של חומרים) שימשו לייצור חרוזים עם פרוטוקול זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הכן את פתרון Alginate, את CaCO 3 השעיה ואת שמן Acidified

  1. הכן את המאגר תהליך בינוני.
    1. הכן את המאגר תהליך טיפוסי המשמש לייצור חרוזים alginate ריכוז גבוהה באמצעות 10 מ"מ HEPES, 170 מ"מ NaCl. התאם את pH 7.4.
    2. הכינו את המדיום תרבות טיפוסי באמצעות Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS), 6 מ"מ גלוטמין, 100 פניקסילין U / מ"ל, ו 100 מ"ג / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
  2. הכן את פתרון המניות alginate ב 1.17 לקפל את הריכוז הרצוי הסופי החרוזים.
    1. ראשית, לשקול את הכמות המתאימה של אבקת alginate. לדוגמה, כדי לקבל ריכוז סופי של 5% alginate עם 50:50 LVM ו- MVG alginate, לשקול את סך של 1.17 גרם alginate נתרן על ידי שילוב של אבקת אלגינט LVM 0.583 גרם ו 0.583 גרם אבקת Alginate MVG.
    2. מקום 20 למאגר תהליך מ"ל לתוך autocצנצנת זכוכית lavable על מגש מערבבים צלחת ו להסעיר ב ~ 200 סל"ד. באופן מתקדם להוסיף את אבקת alginate נתרן לפתרון.
    3. השאירו את הפתרון ערבוב בן לילה במהירות נמוכה. אם יש צורך, להדק את הבקבוק על צלחת מערבל.
    4. אם הפתרון הוא מומס לחלוטין, להדק את הבקבוק על מערבל סיבוב ולהמשיך ערבוב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות נוספות.
    5. לעקר את פתרון alginate ידי מעוקר הפתרון למשך 30 דקות בכלי שיט פחות מחצי מלא. אפשר לטמפרטורה לרדת מתחת 60 מעלות צלזיוס לפני אחזור הפתרון.
    6. במידת הצורך, להסיר חלקיקים על ידי סינון הפתרון alginate זמן קצר לאחר מעוקר לפני שהוא מגיע לטמפרטורת החדר, בעוד צמיגות נשאר מספיק נמוך.
  3. הכן את ההשעיה סידן פחמתי ב 21 פי ריכוז הסופי הרצוי עבור gelation פנימי.
    1. לשקול את אבקת CaCO 3 . לדוגמה, מודעהD 1 גרם CaCO 3 עד 20 מ"ל תהליך חיץ להשיג 24 מ"מ CaCO 3 כמו ריכוז סוכן gelling הסופי.
    2. החיטוי השעיית CaCO 3 למשך 30 דקות.
      הערה: ריכוז CaCO 3 ישתנה עם הזמן עקב שיווי המשקל של ביקרבונט - CO 2 . הימנע משימוש באותו מלאי CaCO 3 השעיה במשך יותר מ -10 הליכי אנקפסולציה.
  4. החיטוי הספינה נעה המשמש בתהליך ההרכבה. לפני השימוש, להסיר את כל עקבות של מים מרוכז הנותרים בקבוק ספינר.
  5. מיד לפני תהליך האמולסיפיקציה, להכין את שמן acidified. ממיסים 44 חומצה אצטית μL לכל שמן מינרלי 11 מ"ל להציב צינור 50 מ"ל חרוטי.
    הערה: טעות נפוצה היא פירוק חלקי של חומצה אצטית. הימנע pipetting כמויות קטנות של חומצה אצטית ולוודא כי חומצה אצטית הוא מומס לחלוטין בשמן על ידי vortexing חוזרות.
    זהירות: חומצה אצטית היא רעילה חומצה נדיפה. טיפול זה מגיב מתחת למכסה המנוע קטר ולשמור על פתרון חומצה אצטית / שמן במיכל סגור עד שלב האמולסיפיקציה. לקבלת מידע נוסף, עיין במידע של MSDS על מגיב זה.
  6. אפשר את כל הפתרונות להגיע לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך אנקפסולציה התא.

2. Alginate חרוז הדור על ידי אמולסיפיקציה פנימית Gelation

  1. מקום 10 מ"ל שמן מינרלי אור בבקבוק ספינר ולהתחיל תסיסה במהירות סיבוב נמוכה ( למשל 250 סל"ד עבור בקבוק ספינר בשימוש בסרטון זה).
  2. אם התאים המשמשים את התהליך הם מתרבויות חסיד, להחיל טריפסין להשעות את התאים. סיים את התגובה על ידי הוספת FBS המכיל בינוני או מעכב טריפסין ולאסוף מדגם עבור ספירה התא.
    1. קביעת ריכוז התא הכדאיות לאחר מכתים כחול Trypan באמצעות hemocytometer או מונה תא אוטומטי, כפי שתואר לעילהתחת = "xref"> 32.
  3. צנטריפוגה התאים 7 דקות ב XG 300 ו לשטוף אותם פעם אחת במדיום הרצוי immobilization תא. ודא כי המדיום מכיל תחליבים כגון FBS או אלבומין בסרום שור (BSA). לדוגמה, השתמש DMEM המכיל 10% FBS.
  4. Re- להשעות את גלולה התא באותו בינוני להשיג 10.5 לקפל את הריכוז הסופי הרצוי החרוזים.
  5. הוסף 1.1 מ"ל של 10.5 קפל מלאי תאים מרוכזים ל 9.9 מ"ל של פתרון alginate. לאחר מכן, להוסיף 550 μL של השעיה CaCO 3 ומערבבים על ידי ערבוב עם מרית סטרילית כדי להבטיח הפצה אפילו של CaCO 3 .
  6. מיד להעביר 10.5 מ"ל של אלגינט, תא CaCO 3 תערובת לתוך שמן agitating באמצעות מזרק.
    הערה: לקבלת פתרונות צמיגה גבוהה, לשאוב ולהוציא את התערובת לאט מאוד, כדי למנוע בועות אוויר. במקרים מסוימים, עדיף לעצור את התסיסה תוך הוספת תערובת בקבוק כדי להימנעאלגינט entryment על פיר האימפלר.
  7. מיד לאחר הוספת alginate, תא CaCO 3 תערובת לשמן, להגדיל את שיעור התסיסה.
    הערה: עבור 5% LVM: MVG alginate בשימוש כאן, מהירות סיבוב של 1025 סל"ד הוחל לייצר חרוזים של כ 900 מיקרומטר קוטר מתאים לתרבות חוץ גופית 35 . מהירויות סיבוב גבוהות יותר וריכוזי אלגינט נמוכים יותר יובילו לקוטר חרוז ממוצע נמוך יותר, כפי שתואר בפרסומים קודמים 25 , 32 . שינויים קלים במודע וגיאומטריה כלי, כמו גם תכונות alginate יכול מאוד להשפיע על קוטר חרוז הממוצע. עבור כל שינוי בתצורה כלי או alginate הרבה, עקומה סטנדרטית המתייחסת את השטח משטח רגע קוטר חרוז הממוצע מהירות סיבוב צריך להיווצר 32 .
  8. הפעל את הטיימר emulsify את alginate במשך 12 דקות.
  9. הוסף 10 מ"ל של tהוא שמן פתרון חומצה אצטית לחמצן את תחליב, להמיס את CaCO 3 ומכאן פיזית לחצות את alginate לתוך חרוזים gelled. אפשר 8 דקות עבור צעד זה החמצה.

3. שחזור חרוז

  1. להפחית את קצב התסיסה עד 400 סל"ד. הוסף 40 מ"ל של המאגר תהליך מעורבב עם בינוני 10% כדי להגדיל את ה- pH ולגרום היפוך פאזה.
  2. עצור את התסיסה 1 דקות מאוחר יותר ולהעביר את התערובת צינורות 50 צנטריפוגה מ"ל. יש לשטוף את הבקבוק ספינר עם בינוני נוסף 20 מ"ל ולהוסיף זה לצינור. לשאוב כמה שלב מימית ככל האפשר מן הבקבוק ספינר לפני aspirating השלב בשלב כדי למזער את חרוז קשר עם השמן בשלב.
    הערה: השתמש פיפטה גדולה נשא ( למשל 25 פיפטה מ"ל) בשלב זה ומנקודה זו על מנת למנוע נזק חרוזים. עבור כרכים קטנים יותר, ההשעיה חרוז יכול גם להיות מניפולציה עם טיפים לחתוך פיפטה. כדי להשיג עצות כאלה, לחתוך את קצה קצה פיפטה עם מספריים WHאייל מגן עין הגנה.
  3. צנטריפוגה צינורות במשך 3 דקות ב XG 630 כדי להאיץ חרוז יישוב הפרדת פאזה.
  4. הסר את השמן תמיסת מימית עודף על ידי aspirating עם פיפטה פסטר.
  5. שטפו את החרוזים לפחות פעם אחת עם המדיום. סינון ההשעיה חרוז על 40 מיקרומטר ניילון מסננים תא, וכן לשאוב נוזלים עודף הקשורים החרוזים מתחת מסננת. מעבירים את החרוזים לתוך אמצעי ידוע של בינוני באמצעות מרית סטרילית.
    הערה: מסננים בגודל קטן או גדול יותר של הנקבוביות ניתן להשתמש בשלב זה, בהתאם לקוטר חרוז המינימום היעד. עם זאת, סינון הכבידה מומלץ במקום סינון בלחץ מונע באמצעות תת מסננים הנקבוביות משנה מיקרון כדי למנוע נזק חרוזים.
  6. למדוד את נפח החרוז על ידי נפח עקירה (נפח לאחר הוספת חרוזים, מינוס נפח לפני הוספת חרוזים) ואת למעלה בינוני כדי להשיג את החרוז הרצוי: יחס נפח הכולל, אשר בדרך כלל 1: 5, או 1 mL חרוזים ב4 מ"ל בינוני. מנקודה זו ואילך, תמיד להשתמש גדול pipettes נשא כדי למנוע נזק חרוזים.
  7. מעבירים את התאים encapsulated לתוך T- צלוחיות עבור תרבות חוץ גופית או ניסויים להשתלות.

4. בקרת איכות ויישומים

הערה: על מנת להבטיח איכות תא חרוז ו חרוז, הפצה גודל חרוז הישרדות התא לאחר התהליך צריך לכמת. היפוך הג'ל כדי לשחזר את התאים מתוך חרוזים לניתוח נוסף מבוצע בדרך כלל.

  1. כדי להעריך את גודל חרוז הפצה, הכתם את החרוזים עם toluidine כחול-O.
    1. המקום 0.5 חרוז מ"ל לתוך 4 מאגר תהליך מ"ל המכיל 10% בינוני מלא.
    2. הוסף 500 μL של 1 גרם / L toluidine פתרון כחול מוכן למאגר התהליך.
    3. דגירה של 60 דקות בצינור חרוטי על שייקר סיבוב ב 50 סל"ד.
    4. הוסף למאגר 5 מ"ל התהליך המכיל 10% בינוני מלא immedלהעביר את החרוזים ואת הפתרון לתוך צלחת פטרי לרכוש תמונות על מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה או באמצעות מצלמה דיגיטלית ביד. אם יש צורך, מניחים את צלחת פטרי על תיבת אור לפני רכישת תמונות עם מצלמה ביד כדי לשפר את הניגוד ולהימנע צללים.
    5. בצע ניתוח תמונה לכמת את גודל הפצה חרוז כפי שתואר לעיל 32 , למשל באמצעות ניתוח תמונה חופשית 36 .
  2. כדי להעריך את הישרדות התא מבחינה איכותית, הכתם את התאים באמצעות homodimer ethidium לזהות תאים מתים calcein AM לזהות תאים חיים.
    1. הוסף נפח 1 של חרוזים ל 4 כרכים של המאגר תהליך המכיל 10% בינוני מלא.
    2. הוסף את הכמות המתאימה של Calcein AM ו ethidium homodimer פתרונות המניות להשיג 4 מיקרומטר ו 2 מיקרומטר ריכוזים, בהתאמה. יצירת פקדים כתם יחיד על ידי הוספת רק אחד ריאגנטים כמה דגימות חרוז.
    3. דגירה החרוזים על הקרח במשך 20 דקות.
    4. מניחים את הפתרון בין שקופית ו coverslip באמצעות spacer כגון o טבעת כדי לדחוס את החרוזים.
    5. המשך מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש בפקדים כתם בודד להעריך הקרינה דימום דרך. בחר מסננים הקרינה המתאימים מבוסס על אורכי גל / פליטה פליטה הקשורים calcein AM (494/517 ננומטר) ו ethidium homodimer קשור DNA (528/617 ננומטר).
  3. כדי לשחזר את התאים מן חרוזים לניתוח נוסף, degel אלגינט באמצעות ציטראט או פתרון chelating אחר.
    1. הכן פתרון degelling המכיל 55 מ"מ ציטראט, 10 מ"מ HEPES ו 95 מ"מ NaCl ב pH 7.4.
    2. מערבבים את הפתרון עם בינוני 10%, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל alginate חרוזים ל 9 מ"ל של התערובת.
    3. Degel החרוזים על הקרח עם 75 תסיסה סל"ד במשך 20 דקות.
      הערה: התאים יכולים כעת לשמש לניתוח או להסיר מן solgin אלגינט degelledיון על ידי צנטריפוגה. לדוגמה, כדאיות התא לאחר degelling ניתן לכמת על ידי מכתים כחול Trypan. לחלופין, התאים ניתן centrifuged ו שטף, ואחריו mRNA, DNA ו / או דגימה חלבון וניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בסוף תהליך ההטמעה ותהליך הגלאציה הפנימיים, יש לשחזר נפח חרוז הדומה לקומבינציה ההתחלתית הראשונה. חרוזים צריך להיות כדורית ביותר עם פגמים מעטים ( איור 3 ). החרוזים צריכים להיות חזקים מספיק כדי לעמוד pipetting דרך pipettes גדול נשא. בריכוז גבוה alginate, שמן encapsulated או טיפות אוויר ניתן לצפות חרוזים. זה סביר מתרחשת עקב מלכודת של שמן טיפות alginate במהלך שלב תחליב (שמן / מים / שמן תחליב כפול). בידיים שלנו, אלה חרוזים ייצג חלק קטן (<5%) של נפח חרוז ואת רוב החרוזים האלה הוסרו תוך aspirating השמן במהלך צעד החרוז התאוששות, בשל צפיפות נמוכה שלהם.

איור 3
איור 3 : חרוזים אלגינט 5% מייצגים המכילים תאים βTC3 מקובצים המתקבלים על ידי תהליך ההטמעה ותהליך הגלאציה הפנימיים.תמונה שלב 5 של חרוזי אלגינט 5% המכילים 5 x 10 6 βTC3 תאים / חרוזים mL לחץ כאן כדי לראות גרסה של דמות זו.

גודל החרוזים המתקבלים לא יהיה אחיד - זוהי תכונה מהותית של אמולסיות מעורבים ( איור 4 א ). במהלך תחליב בזרימה סוערת, תנודות הלחץ לפעול לשבש טיפות 37 , 38 , counteracting מתח הפנים ואת הכוחות צמיגה בשלב 39 מפוזרים. כוחות צמיגה אינם זניחים אם צמיגות השלב המפוזר גבוהה בהרבה מזו של הצמח שלב רציף. בהנחה כי קצב פיזור האנרגיה המקסימלי המקסימלי הוא פרופורציונלי לשיעור הפיזור הממוצע באנרגיה, קוטר הטיפה היציב המרבי d מקסימלי (אם ניתן למדוד את הסולם של Kolmogorov) כדלקמן 39 , 40 , 41 , 42
משוואה 1
כאשר ρ c הוא הצפיפות של השלב המתמשך, ε הוא קצב פיזור האנרגיה הממוצע בכלי השיט, σ הוא המתח הבין-מיני בין שני הנוזלים, μ d הוא צמיגות השלב המפוזר ו- C הוא קבוע המידתיות. כאשר כוחות מתיחה פנימיים שולטים על כוחות צמיגיים, הצד הימני של הצד מפשט ל- C , ואילו אם הכוחות הפיסיקליים שולטים בו הוא מפשט את:

Ss = "jove_content" עבור: keep-together.within-page = "1"> משוואה 2

ב כלי נעה, קלט האנרגיה תחת קשקשים זרימה סוערת הוא פרופורציונלי קלט הכוח ליחידת נפח, כלומר N i 3 D i 2 , כאשר N אני הוא שיעור תסיסה D אני הוא קוטר האימפלר. לכן, בשילוב עם משוואה 1 וניתנה D קבוע i , אם כוחות מתח פני השטח שולטים d מקסימום צפוי להיות פרופורציונלי ל- N אני -1.2 ( איור 4 ב ), בעוד שהוא יחסי ל- N i -0.75 אם כוחות צמיג בתוך חרוזים שולטים ככוח החוזרים העיקרי. איורים 4B ו- 4C מצביעים על כך שהשפעות בין-פנים קובעות את dRoplet עבור ריכוז אלגינט נמוך, בעוד כוחות צמיגה להיות דומיננטי יותר בריכוז alginate גבוה יותר ( למשל 5% עבור alginate # 3 המתואר בטבלה של חומרים). מכיוון שלא ניתן לקבוע את הניסוי המקסימלי , ערכי קוואנייל גבוהים ( למשל , הקומפילציה ה 95) של הקוטר או שטח פני השטח, השתמשו בקוטר ממוצע ( d 32 ) במקום זאת, מכיוון שהם בדרך כלל פרופורציונליים ל - d מקסימום 43 .

לפני encapsulating תאים, מומלץ כי עקומת D 32 כפונקציה של N אני להיות שנוצר ( איור 4 ב ). עקומה זו תסייע לבחור את ה N נאותה כדי לקבל את גודל החרוז הממוצע הרצוי. עקומת תקן חדש יהיה גם נדרש עבור קבוצות שונות של שמן או alginate, או אם אלגינט concenTration הוא שונה. בהתאם לגיאומטריה כלי על ריכוזים alginate, מגוון רחב יחסית של בקוטר חרוז הממוצע צריך להיות בר השגה. לדוגמה, D 32 ערכים בין 200 מיקרומטר ו 1 מ"מ ניתן להשיג באמצעות 2% ( איור 2C ב Hoesli ואח '32 ) אל 5% אלגינט ( איור 4 ) באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל.

איור 4
איור 4 : התפלגות גודל חרוז. ( א ) Toluidine כחול- O מוכתמים 5% אלגינט חרוזים. ( B ) d 32 כפונקציה של קצב התסיסה ( N i ) עבור 1.5% ו 5% alginate חרוזים באמצעות תערובת 50:50 של alginates # 1 ו # 2 (ראה טבלה של חומרים). נקודה אחת מוצגת עבור 5% algiחרוזים nate. ( C ) d 32 כפונקציה של N i עבור 2% ו 5% alginate # 3 (ראה טבלה של חומרים). סורגי השגיאה מייצגים את סטיית התקן של גדלי חרוזים בתוך מדגם (N> 150 חרוזים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

הישרדות התא מן ההשתלה ואת תהליך gelation פנימי בעיקר תלוי בהיקף ומשך של ירידה pH מנוסה על ידי התאים. באמצעות התהליך המתואר בסרטון זה, 76 ± 2% βTC3 הישרדות התא נמדדה 31 . כאשר encapsulating תאים מתפזרים ב 10 5 תאים / מ"ל ​​alginate ל 10 7 תאים / מ"ל ​​alginate זריעת צפיפות, כל חרוזים צריך להכיל תאים. כאשר encapsulating אשכולות תאים כגון תאים בלבלב, תת קבוצה של חרוזים ניתן לצפות להיות ריקY. איור 5 מראה תא חי אופייני / תאים מתים מכתים תוצאות שהושגו באמצעות תהליך זה. שרידות תאים גבוהה יותר יכולה להיות מושגת על ידי הגדלת קיבולת חיץ התהליך ועל ידי הפחתת משך שלב החמצון. לדוגמה, 90% 2% הישרדות התא הושג באמצעות 60 מ"מ MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic חומצה) כמו חיץ התהליך ועל ידי הקטנת זמן התהליך הכולל עד 4 דקות 32 . עם זאת, חרוזים שנוצר היו חזקים משמעותית עם 10 מ"מ HEPES חיץ התהליך מאשר עם המאגר 60 mPS תהליך MOPS בשל כמויות מוגברות של Ca 2 + שפורסמו ב pH 31 נמוך. הן תהליך MOPS קצר תהליך HEPES ארוך צריך לייצר חרוזים יציבים מספיק עבור> 2 שבועות בתרבות חוץ גופית או השתלה. עם זאת, חרוזים עשויים להתנפח או degel לחלוטין פתרונות עם סידן נמוך או עם ריכוז גבוה chelator (למשל, סידן ללא פוספט שנאגרו תמיסת מלח).

עבור תאים בתאי MIN6 גדל במבחנה , אגרטלים התא גלוי טופס לאחר ~ 5-7 ימים של במבחנה תא תאים משותקים ~ 150 קוטר מיקרומטר קרום יכול להיות שנקטפו לאחר 2 שבועות. קצב הגידול של תאים אלגינט- immobilized צפוי להיות נמוך יותר מאשר בתרבויות שאינם משותקים, במיוחד עבור ג 'לים עם ריכוז alginate גבוה או תוכן חומצה guluronic.

איור 5
איור 5 : תאים מצורפים מיד לאחר התהליך. ( A ) תא חי (ירוק, calcein AM) ותא מת (אדום, ethidium homodimer) מכתים של תאים encapsulated. ( ב ) בניגוד שלב התמונה של חרוז אותו. תאים MIN6 היו במארז 2%חרוזים אלגינט באמצעות 12 דקות emulsification, 8 דקות החמצה 10 חיץ HEPES מ"מ כמתואר בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צעדים שונים (המתואר באיור 2 ) במהלך התגובה gelation פנימי יכול להגביל את הקינטיקה הכוללת. עבור סידן פחמתי גרגרי גדול מ ~ 2.5 מיקרומטר, שיעור הפירוק קרבונט הוכח להיות שיעור הגבלת 26 , 44 . צעד החמצון שמוביל לשחרור סידן פנימי הוכח גם הוא כמשתנה תהליך קריטי המשפיע על הישרדות התא. התנאים המביאים gelation פנימי ולכן הם חיוניים הן עבור איכות חרוז, כמו גם הישרדות התא. בהתאם ליישום הסופי עבור חרוזים, התנאים האופטימליים תהליך שונים עשויים להיבחר. לדוגמה, ירידה pH גבוהה יותר ( למשל באמצעות 10 מ"מ HEPES למאגר הפתרון alginate) עשוי להיות רצוי ליישומים להשתלות שבו יציבות לטווח ארוך של חרוזים הוא קריטי. מצד שני, ירידה pH נמוך ( למשל באמצעות 60 מ"מ MOPS כדי buffeR פתרון alginate) עשוי להיות עדיף עבור יישומים במבחנה .

בנוסף להתאמת רמת ומשך החמצון, שינויים בתהליך אחרים ניתן לצפות. לדוגמה, אחרים תצורות כלי מערבים, ריכוז אלגינט, מאגרים תהליך, שלבים אורגניים סוכני חומצה ניתן להשתמש. כפי שפורט בעבר, גודל החרוז הממוצע יכול בקלות להיות מותאם על ידי שינוי קצב תסיסה במהלך שלב תחליב. בנוסף, פעמים emulsification עוד יכול להוביל גדלים חרוז קטן יותר, אבל יכול לגרום לכדאיות התא ירד. פרסומים של Poncelet et al. 25 , 26 , 45 ו Hoesli et al. 31 , 32 בדקו ו דנו כמה אפשרויות אלה.

שינויים קלים בפרוטוקול המתואר לעיל יכולה להיות השפעה עמוקה עלהדור חרוז, איכות חרוז הישרדות התא. טבלה 1 מספקת מדריך לפתרון בעיות כדי להבין ולפתור בעיות שעלולות להתרחש.

בְּעָיָה סיבה אופיינית פתרונות מוצעים
האימפלר מפסיק להסתובב במהלך האלגינט או תוספת חומצת השמן השדה המגנטי אינו מספיק כדי ערבוב נאות או פיר האימפלס הוא misaligned ודא כי בקבוק ספינר הוא מרוכז היטב על צלחת מגנטית מוקלטים על הצלחת במצב אופטימלי לפני הוספת תערובת alginate. בדוק מאוד שיעורי תסיסה גבוהה ולאחר מכן ירד לשיעור תסיסה הרצוי לפני הוספת תערובת alginate.
ודא כי מוט האימפלר הוא מיושר היטב ויציב. עבור בלצלוחיות lco ספינר, להבטיח כי האימפלר מוחזק היטב במקום על ידי ברגים משני צדי מכסה ספינר הבקבוקון. ודא כי התנועה impeller מוגבל לכיוון רדיאלי (האימפלר לא צריך להתנודד על פיר).
לא חרוזים שהושגו האלגינט היה מחומצן שלא כהלכה ודא microdroplets alginate גלויים במהלך emulsification. אם לא, ודא כי השלב בשלב השמן ואת הגיאומטריה כלי 23 דומים לאלה המתוארים בפרוטוקול זה. שלב שמן צפוף או גיאומטריה כלי אשר אינו מספק מספיק פיזור האנרגיה המקומית לא יכול לאפשר emginification הנכון alginate.
לא חרוזים שהושגו הגלאציה הפנימית לא התרחשה טעות נפוצה היא פירוק חלקי של חומצה אצטית בשלב השמן. ודא כי תערובת שמן חומצה הוא מספיק wortexed ולא חומצה אצטית הוא ציין בבתחתית הצינור.
אם האימפלר אינו מגיע לשמן, ניתן להוסיף עוד שמן לפני הוספת האלגינט. עם זאת, כמות החומצה אצטית צריך להיות מותאם על פי המשוואה הבאה:
משוואה 3
איפה משוואה 4 1 הוא יחס השמן / מים לפני שינוי (למשל 0.525 עבור 10.5 מ"ל alginate ב 10 מ"ל שמן + 10 מ"ל שמן חומצה), משוואה 4 2 הוא יחס השמן / מים לאחר שינוי הפרוטוקול, ודאו הוא מקדם חלוקת חומצה אצטית בין שני השלבים. מקדם הפצה זה ניתן למדידה ניסויית או קרובה לערכים שנלקחו מהספרות. לדוגמה, מקדם ההפצה של חומצה אצטית בין heptane ומים 46 הוא 0.011.
אין חרוזS, או חרוזים אינם יציבים מבחינה מכנית הפתרון alginate אפס גזירה צמיגות הוא מתחת 0.004 אבא · s או מעל 112 אבא · s בשל השתנות אצווה גבוהה אל אצווה של מגרשים alginate, מומלץ למדוד את צמיגות של ריכוזים שונים של פתרונות alginate. השילוב של אצווה צמיגות גבוהה עם אצווה צמיגות נמוכה עשוי להיות נדרש להגיע צמיגות היעד. עבור 5% LVM ו MVG תערובת בשימוש כאן, צמיגות אפס גזירה היה 3.3 אבא · s. יש לציין כי alginates עם קצר מדי guluronic חומצה אורכים או קצר אורך שרשרת הכולל עשוי לא לאפשר היווצרות ג 'ל.
חרוזים גדולים מדי או קטנים מדי קצב התסיסה בזמן ההרכבה נמוך מדי או גבוה מדי לריכוז האלגינט או לצמיגותו הגדלת מערבולת על ידי הגדלת קצב תסיסה או הוספת התסכול תקטין את גודל החרוז. הריכוז אלגינט, טמפבוגר, הספינה ואת הגיאומטריה impeller יהיה כל השפעה על גודל חרוז שהושג.
חרוזים שבורים רבים הם נצפו טיפול חרוז קשה, נזק במהלך שלב gelation פנימי או כוח חרוז מספיק. נזק מכני חרוזים יכול להוביל קרע חרוז לאחר gelation פנימי הוא יזם. להקטין את קצב התסיסה מיד לפני השלב החמצון ולוודא כי חרוזים מטופלים בעדינות באמצעות 25 טפיחות מ"ל או 1000 pipettes μL עם טיפים לחתוך. אם חרוזים פגום הם נצפו גם עם טיפול זהיר ותסיסה מופחתת במהלך החמצה, כוח חרוז עשוי להיות לקוי. זה יכול להיות בגלל תוכן חומצה guluronic מספיק או gelling חלקית (למשל החמצה לא מספיק).
הכדאיות התא נמוכה תהליך ראשוני pH גבוה מדי או גבוה pH נמוך מדי יונקים תהליך הישרדות התא יכול להיות מוגברת על ידי הגבלת ירידה pH וזמן החמצה
הכדאיות התא נמוכה בחרוזים קטנים יותר קיבולת לא מספקת של קיבולת אגירה ירידה גדולה יותר pH צפוי חרוזים קטנים יותר מאשר חרוזים גדולים יותר בשל יחס פני השטח / נפח גדול יותר של חרוזים אלה. מאז חומצה אצטית הוסיף תחליב מוגבל, ריכוזי חומצה אצטית גבוהה יותר חזו בחרוזים קטנים יותר עבור אותו ריכוז 3 CaCO. הגדלת קיבולת חציצה פתרון alginate (למשל באמצעות 60 מ"מ MOPS במקום 10 HEPES מ"מ) יכול להגדיל את הישרדות התא בחרוזים קטנים 32 . חרוזים קטנים עם הפסדים תא גבוה ניתן להסיר באופן סלקטיבי על ידי סינון או שקיעה ללא נגרם הפסדים גדולים volumetric.
אניחסר השלכות CaCO 3 החמצה מספקת או זמן החמצה. שים לב, בעיה זו עלולה שלא להיות בעייתית אם יציבות החרוז מספיקה. השלמה מלאה CaCO 3 מומסה נצפתה חרוזים גדולים יותר בעקבות פרוטוקול זה 32 . היקף המסה CaCO 3 יכול להשתנות בהתאם CaCO 3 גודל גרגר, ירידה pH במהלך התהליך, משך טיפת ה- pH, כמו גם ריכוז alginate בשימוש. בעיה זו אינה נחשבת בעייתי כל עוד היציבות מכני חרוז מספיק ליישום הרצוי. כדי להגדיל חרוז חוצה המקשר, להבטיח כי דגנים CaCO 3 הוא קטן מספיק (~ 2.5 מיקרומטר). Sonicating ההשעיה CaCO 3 יכול לעזור לשבש דגנים מצטברים 26 . בריכוז נמוך מאוד או גבוה alginate, התאמות בריכוז CaCO 3 עשוי להיות נדרש. לבסוף, chelators או פתרונות עם נמוךרמות של יונים divalent יוביל הפסד הדרגתי של Ca 2 + בג'ל. אם הפסד הדרגתי של יציבות מכנית חרוז הוא ציין, ודא כי אחסון חרוז או מאגר חיץ מכיל> 2 מ"מ Ca 2 + .

טבלה 1: מדריך לפתרון בעיות. רשימת בעיות, סיבות אפשריות ופתרונות אפשריים.

המגבלות הפוטנציאליות של האמולסיפיקציה ותהליך גלאציה פנימי לתרבות חוץ גופית בתאי יונקים ויישומי השתלות כוללים:) 1 (הצורך בחשיפה חולפת ל - pH נמוך,) 2 (הצורך להסיר שמן שיורי,) 3 (גודל החרוז polydisperse (4) מתח הגזירה הפוטנציאלי במהלך היווצרות אגל אלגינט ו (5) נקבוביות גבוהה יותר של חרוזים gelled פנימי לעומת חרוזים gelled חיצוני 47 .

הישרדות התא גבוהה ותפקוד של MIN6 ו βTC3 הושגולאחר אופטימיזציה של תהליכים 32 . עם זאת, תהליך זה עשוי שלא להיות מתאים יותר תאים רגישים pH. השמדה מלאה של שמן מן חרוזים עשוי גם להיות מאתגר, ו Food and Drug Administration (FDA) שמן סוגי מאושרים נדרשים עבור יישומים קליניים בסופו של דבר. התפלגות גודל החרוז polydisperse עשוי גם להיות בעייתי במקצת עבור יישומים immunoisolation, שבו אנקפסולציה תא מלא הישרדות תאים לטווח ארוך רצוי. בעוד גודל חרוז קטן יכול להוביל לבליטה תאים 48 , חרוזים גדולים יכולים לעכב דיפוזיה מזין ו / או פונקציה התא 35 , 49 . מצד שני, תהליך ההטענה מציע הזדמנות מעניינת לחקור את ההשפעה של גודל חרוז על הישרדות התא לאחר השתלה על ידי יצירת חרוזים קטנים וגדולים כאחד בתהליך אחד. גודל החרוז הממוצע יכול בקלות להיות מותאם על ידי שינוי durin שיעור תסיסהG שלב האמולסיפיקציה ( איור 4 ). לבסוף, הנקבוביות הגבוהה יותר של חרוזים בג'ל פנימי עשויה גם להיות מזיקה לאימונוזולציה, שבה יש להרחיק מולקולות כגון נוגדנים וציטוקינים מהחרוזים. עם זאת, תהליך אמולסיפיקציה גם מאפשר חרוז הדור מן פתרונות מרוכזים מאוד alginate, ובכך להפחית את גודל החרוז אלגינט חרוז.

תהליך ההטמעה ותהליך הגלאציה הפנימיים הוא חלופה מעניינת לאנקסולטורים מבוססי חרירי מעבדה המעוניינים להרחיב את אנקפסולציה התא או חוסר גישה encapsulator. תהליך זה הוא שיטה פשוטה ופשוטה לשתק תאים חרוזים אלגינט באמצעות מאוד לדלל או מאוד מרוכז alginate פתרונות. כמה ניסויים הבאים שניתן לבצע עם תאים משותקים הם לקבוע את ההשפעה של המטריצה ​​אלגינט על החלטות גורל התא, או לקבוע עד כמה החרוזים לספק מחסום בין transplanteתאים D ומערכת החיסון המארחת. אמולסיפיקציה ושיטה gelation פנימי מספק גישה חדשה לתמצת איים ראשוניים בקבוצות גדולות. השיטה גם מאפשרת אנקפסולציה התא בחרוזים אלגינט מרוכזים מאוד עם נקבוביות מופחתת ולכן גישה נוגדנים מופחתת לתאים encapsulated. שיטת האמולסיפיקציה ושיטת הגלאציה הפנימית מספקת אפוא אמצעי חדש ליצירת כמויות קליניות רלוונטיות של תאים טיפוליים מקופלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgments

אנו מודים לג'יל אוסבורן על עבודתה על תהליך ההטמעה ועל לורן וילקינסון לתמיכה טכנית. אנו מודים לד"ר איגור לאסיק, לד"ר טימותי ג 'קיפר וד"ר ג'יימס ד' ג 'ונסון על הקלט שלהם ושיתוף פעולה. אנו מודים ל- Diabète Québec, JDRF, ThéCell, המרכז לחקר תאי גזע (CQMF) של המרכז למדעי הטבע והנדסה (NSERC), המרכז להשתלת תאי אדם והתאוששות ביתא, רשת תאי הגזע הקנדית, קרן מייקל סמית 'לחקר הבריאות, לה פונדס דה לה ריצ'רשה סור לה טבע et les טכנולוגיות ו COST 865 לתמיכה כספית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade) Novamatrix Non-applicable Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade) Novamatrix Non-applicable Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade) Sigma A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity) A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM Life Technologies 11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin Thermo Fisher Scientific SH3039603
Glutamine Life Technologies 25030
Penicillin and streptomycin Sigma P4333-100ML
HEPES, cell culture tested Sigma H4034-100G
NaCl Thermo Fisher Scientific S271-1
Fine-grain CaCO3 Avantor Materials 1301-01 After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil Thermo Fisher Scientific O121-4 Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid Thermo Fisher Scientific A38-500 Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas Sigma CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm Thermo Fisher Scientific 08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) Sarstedt 86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes VWR 14673-043
Toluidine Blue-O Sigma T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks Bellco 1965-00100 The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed Bellco 7760-06005 The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter Innovatis Cedex AS20 This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box Artograph LightPad® PRO This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera Canon PowerShot A590 IS A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters Olympus IX81 Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software Molecular Devices Metamorph A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware CellProfiler Non-applicable A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scharp, D. W., Marchetti, P. Encapsulated islets for diabetes therapy: history, current progress, and critical issues requiring solution. Adv Drug Deliv Rev. 67-68, 35-73 (2014).
  2. Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31 (3), 505-514 (2010).
  3. Sidhu, K., Kim, J., Chayosumrit, M., Dean, S., Sachdev, P. Alginate microcapsule as a 3D platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hESC) to different lineages. J Vis Exp. (61), (2012).
  4. Tostoes, R. M., et al. Perfusion of 3D encapsulated hepatocytes--a synergistic effect enhancing long-term functionality in bioreactors. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 41-49 (2011).
  5. Duvivier-Kali, V. F., Omer, A., Parent, R. J., O'Neil, J. J., Weir, G. C. Complete protection of islets against allorejection and autoimmunity by a simple barium-alginate membrane. Diabetes. 50 (8), 1698-1705 (2001).
  6. Omer, A., et al. Long-term normoglycemia in rats receiving transplants with encapsulated islets. Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).
  7. Rayat, G. R., Rajotte, R. V., Ao, Z., Korbutt, G. S. Microencapsulation of neonatal porcine islets: protection from human antibody/complement-mediated cytolysis in vitro and long-term reversal of diabetes in nude mice. Transplantation. 69 (6), 1084-1090 (2000).
  8. Korbutt, G. S., Mallett, A. G., Ao, Z., Flashner, M., Rajotte, R. V. Improved survival of microencapsulated islets during in vitro culture and enhanced metabolic function following transplantation. Diabetologia. 47 (10), 1810-1818 (2004).
  9. Luca, G., et al. Improved function of rat islets upon co-microencapsulation with Sertoli's cells in alginate/poly-L-ornithine. AAPS PharmSciTech. 2 (3), E15 (2001).
  10. Omer, A., et al. Survival and maturation of microencapsulated porcine neonatal pancreatic cell clusters transplanted into immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 52 (1), 69-75 (2003).
  11. Schneider, S., et al. Long-term graft function of adult rat and human islets encapsulated in novel alginate-based microcapsules after transplantation in immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 54 (3), 687-693 (2005).
  12. Cui, H., et al. Long-term metabolic control of autoimmune diabetes in spontaneously diabetic nonobese diabetic mice by nonvascularized microencapsulated adult porcine islets. Transplantation. 88 (2), 160-169 (2009).
  13. Krishnan, R., Alexander, M., Robles, L., Foster, C. E. 3rd, Lakey, J. R. Islet and stem cell encapsulation for clinical transplantation. Rev Diabet Stud. 11 (1), 84-101 (2014).
  14. Robles, L., Storrs, R., Lamb, M., Alexander, M., Lakey, J. R. Current status of islet encapsulation. Cell Transplant. 23 (11), 1321-1348 (2014).
  15. Desai, T., Shea, L. D. Advances in islet encapsulation technologies. Nat Rev Drug Discov. , (2016).
  16. Anilkumar, A. V., Lacik, I., Wang, T. G. A novel reactor for making uniform capsules. Biotechnol Bioeng. 75 (5), 581-589 (2001).
  17. Wolters, G. H., Fritschy, W. M., Gerrits, D., van Schilfgaarde, R. A versatile alginate droplet generator applicable for microencapsulation of pancreatic islets. J Appl Biomater. 3 (4), 281-286 (1991).
  18. Heinzen, C., Marison, I., Berger, A., von Stockar, U. Use of vibration technology for jet break-up for encapsulation of cells, microbes and liquids in monodisperse microcapsules. Practical Aspects of Encapsulation Technologies. , 19-25 (2002).
  19. Poncelet, D., et al. A Parallel plate electrostatic droplet generator: Parameters affecting microbead size. Applied Microbiology and Biotechnology. 42 (2-3), 251-255 (1994).
  20. Prüße, U., Dalluhn, J., Breford, J., Vorlop, K. D. Production of Spherical Beads by JetCutting. Chemical Engineering & Technology. 23 (12), 1105-1110 (2000).
  21. Hoesli, C. A. Bioprocess development for the cell-based treatment of diabetes (PhD thesis). , University of British Columbia. (2010).
  22. Brandenberger, H., Widmer, F. A new multinozzle encapsulation/immobilisation system to produce uniform beads of alginate. J Biotechnol. 63 (1), 73-80 (1998).
  23. Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95 (12), 1449-1461 (2008).
  24. Reis, C. P., Neufeld, R. J., Vilela, S., Ribeiro, A. J., Veiga, F. Review and current status of emulsion/dispersion technology using an internal gelation process for the design of alginate particles. J Microencapsul. 23 (3), 245-257 (2006).
  25. Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. I. Methodology. Appl Microbiol Biotechnol. 38 (1), 39-45 (1992).
  26. Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. II. Physicochemistry. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (4), 644-650 (1995).
  27. Alexakis, T., et al. Microencapsulation of DNA within alginate microspheres and crosslinked chitosan membranes for in vivo application. Appl Biochem Biotechnol. 50 (1), 93-106 (1995).
  28. Vandenberg, G. W., De La Noue, J. Evaluation of protein release from chitosan-alginate microcapsules produced using external or internal gelation. J Microencapsul. 18 (4), 433-441 (2001).
  29. Silva, C. M., Ribeiro, A. J., Figueiredo, I. V., Goncalves, A. R., Veiga, F. Alginate microspheres prepared by internal gelation: development and effect on insulin stability. Int J Pharm. 311 (1-2), 1-10 (2006).
  30. Larisch, B. C., Poncelet, D., Champagne, C. P., Neufeld, R. J. Microencapsulation of Lactococcus lactis subsp. cremoris. J Microencapsul. 11 (2), 189-195 (1994).
  31. Hoesli, C. A., et al. Reversal of diabetes by betaTC3 cells encapsulated in alginate beads generated by emulsion and internal gelation. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100 (4), 1017-1028 (2012).
  32. Hoesli, C. A., et al. Pancreatic cell immobilization in alginate beads produced by emulsion and internal gelation. Biotechnol Bioeng. 108 (2), 424-434 (2011).
  33. Reinsel, M. A., Borkowski, J. J., Sears, J. T. Partition Coefficients for Acetic, Propionic, and Butyric Acids in a Crude Oil/Water System. Journal of Chemical & Engineering Data. 39 (3), 513-516 (1994).
  34. Xiu-Dong, L., Wei-Ting, Y., Jun-Zhang, L., Xiao-Jun, M., Quan, Y. Diffusion of acetic acid across oil/water interface in emulsification-internal gelation process for preparation of alginate gel beads. Chemical Research in Chinese Universities. 23 (5), 579-584 (2007).
  35. Fernandez, S. A., et al. Emulsion-based islet encapsulation: predicting and overcoming islet hypoxia. Bioencapsulation Innovations. (220), 14-15 (2014).
  36. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
  37. Hinze, J. O. Fundamentals of the hydrodynamic mechanism of splitting in dispersion processes. AIChE Journal. 1 (3), 289-295 (1955).
  38. Kolmogorov, A. N. On the breakage of drops in a turbulent flow (translated from Russian). Doklady Akademii Nauk. 66, 825-828 (1949).
  39. Davies, J. T. Drop Sizes of Emulsions Related to Turbulent Energy-Dissipation Rates. Chemical Engineering Science. 40 (5), 839-842 (1985).
  40. Pacek, A. W., Chamsart, S., Nienow, A. W., Bakker, A. The influence of impeller type on mean drop size and drop size distribution in an agitated vessel. Chemical Engineering Science. 54 (19), 4211-4222 (1999).
  41. Steiner, H., et al. Numerical simulation and experimental study of emulsification in a narrow-gap homogenizer. Chemical Engineering Science. 61 (17), 5841-5855 (2006).
  42. Tcholakova, S., Denkov, N. D., Lips, A. Comparison of solid particles, globular proteins and surfactants as emulsifiers. Phys Chem Chem Phys. 10 (12), 1608-1627 (2008).
  43. Lagisetty, J. S., Das, P. K., Kumar, R., Gandhi, K. S. Breakage of viscous and non-Newtonian drops in stirred dispersions. Chemical Engineering Science. 41 (1), 65-72 (1986).
  44. Draget, K. I., Ostgaard, K., Smidsrod, O. Homogeneous Alginate Gels - a Technical Approach. Carbohydrate Polymers. 14 (2), 159-178 (1990).
  45. Poncelet, D., Dulieu, C., Jacquot, M. Immobilized Cells. Wijffels, R. H. , Springer. Berlin Heidelberg. 15-30 (2001).
  46. Islam, A. W., Zavvadi, A., Kabadi, V. N. Analysis of Partition Coefficients of Ternary Liquid-Liquid Equilibrium Systems and Finding Consistency Using Uniquac Model. Chemical and Process Engineering-Inzynieria Chemiczna I Procesowa. 33 (2), 243-253 (2012).
  47. Quong, D., Neufeld, R. J., Skjak-Braek, G., Poncelet, D. External versus internal source of calcium during the gelation of alginate beads for DNA encapsulation. Biotechnol Bioeng. 57 (4), 438-446 (1998).
  48. De Vos, P., De Haan, B. J., Van Schilfgaarde, R. Upscaling the production of microencapsulated pancreatic islets. Biomaterials. 18 (16), 1085-1090 (1997).
  49. Gross, J. D., Constantinidis, I., Sambanis, A. Modeling of encapsulated cell systems. J Theor Biol. 244 (3), 500-510 (2007).

Tags

הנדסה ביולוגית גליון 124 לבלב איון אנקפסולציה אלגינט הידרוג'ל תחליב גלטיון פנימי אימונויסולציה הנדסת רקמות בידול
אנקפסולציה תא יונקים ב Alginate חרוזים באמצעות כלי פשוט מתערבל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hoesli, C. A., Kiang, R. L. J.,… More

Hoesli, C. A., Kiang, R. L. J., Raghuram, K., Pedroza, R. G., Markwick, K. E., Colantuoni, A. M. R., Piret, J. M. Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel. J. Vis. Exp. (124), e55280, doi:10.3791/55280 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter