L'incapsulamento delle cellule dei mammiferi nei branelli di Alginate usando un vaso semplice mescolato

Summary

Questo video e il manoscritto descrivono un metodo basato sull'emulsione per incapsulare le cellule di mammiferi da 0,5% a 10% di branchi alginato, che possono essere prodotti in grandi lotti utilizzando un recipiente semplice mescolato. Le cellule incapsulate possono essere coltivate in vitro o trapiantate per applicazioni di terapia cellulare.

Abstract

L'incapsulamento cellulare in branchi alginato è stato utilizzato per la coltura cellulare immobilizzata in vitro e per l'immunoisolamento in vivo . L'incapsulamento delle isole pancreatiche è stato studiato in modo estensivo come mezzo per aumentare la sopravvivenza delle isole nei trapianti allogenici o xenogeneici. L'incapsulamento di Alginate è comunemente ottenuto mediante estrusione degli ugelli e gelazione esterna. Utilizzando questo metodo, le gocce di alginato contenenti cellule formate alla punta degli ugelli cadono in una soluzione contenente cationi bidimensionali che causano la gelazione ionotropica di alginato quando si diffondono nelle goccioline. Il requisito per la formazione di gocce alla punta dell'ugello limita la portata volumetrica e la concentrazione di alginato che può essere raggiunta. Questo video descrive un metodo di emulsionazione scalabile per incapsulare le cellule di mammiferi da 0,5% a 10% di alginato e dal 70% al 90% di sopravvivenza cellulare. Con questo metodo alternativo, le gocce di alginato contenenti le cellule e il carbonato di calcio vengono emulsionati in olio minerale,Minacciata da una diminuzione del pH che porta alla liberazione interna del calcio e alla gelazione ionotropica di alginato. Il metodo attuale consente la produzione di branchi alginati entro 20 minuti di emulsionazione. L'attrezzatura necessaria per la fase di incapsulamento è costituita da navi semplici agitate disponibili presso la maggior parte dei laboratori.

Introduction

L'incapsulamento delle cellule di mammiferi è stato ampiamente studiato come mezzo per proteggere le cellule trapiantate dal rifiuto immunitario ¹ o per fornire un supporto tridimensionale per la coltura cellulare immobilizzata ^{2 , 3 , 4} . L'incapsulamento delle isole pancreatiche in branchi alginato è stato usato per invertire il diabete in roditori allogenici di ^{5 , 6} o xenogeneic ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} . I trial preclinici e clinici del trapianto di isole pancreatiche incapsulati per il trattamento del diabete di tipo 1 sono in corso ^{13 , 14 , 15} . Per le applicazioni di trapianto o di grandi dimensioniE in vitro produzione di cellule immobilizzate, sono generalmente utilizzati generatori a base di ugelli a ugello. Tipicamente, una miscela di alginato e cellule viene pompata attraverso un ugello per formare gocce che cadono in una soluzione agitata contenente cationi bivalenti, con conseguente gelazione esterna delle goccioline. Il flusso del gas coassiale ^{16 , 17} , la vibrazione dell'ugello ¹⁸ , la repulsione elettrostatica ¹⁹ oi fili rotanti ²⁰ facilitano la formazione di gocce alla punta dell'ugello.

Gli inconvenienti principali dei generatori convenzionali di perline sono la loro limitata produttività e la limitata gamma di viscosità delle soluzioni che porteranno ad un'adeguata formazione del tallone ²¹ . A elevate portate, il fluido che esce dall'ugello si rompe in goccioline più piccole del diametro dell'ugello, diminuendo il controllo della dimensione. Possono essere utilizzati generatori a branelli a più ugelli per aumentare il throughput, maLa distribuzione uniforme di flusso tra gli ugelli e l'impiego di soluzioni> 0,2 Pas è problematica ²² . Infine, tutti i dispositivi basati sugli ugelli dovrebbero dare un po 'di danno alle isole, poiché il diametro degli ugelli utilizzati è compreso tra 100 μm e 500 μm, mentre ~ 15% degli isolotti umani può essere maggiore di 200 μm ²³ .

In questo video, descriviamo un metodo alternativo per incapsulare le cellule dei mammiferi formando goccioline in un singolo passaggio di emulsionazione anziché drop-by-drop. Poiché la produzione di branelli viene eseguita in un vaso semplice miscelato, il metodo è adatto per produzione di piccole dimensioni (~ 1 mL) su larga scala (gamma di 10 ³ L) con bassi costi di attrezzatura ²⁴ . Questo metodo consente la produzione di perline ad alta sfericità utilizzando una vasta gamma di viscosità alginica con brevi ( ad esempio 20 minuti) tempi di generazione del branco. Questo metodo è stato originariamente sviluppato da Poncelet et all. ^{25 , 26} e utilizzato per immobilizzare DNA ²⁷ , proteine ²⁸ tra cui insulina ²⁹ e batteri ³⁰ . Recentemente abbiamo adattato questi metodi all'incapsulazione di cellule di mammiferi usando le linee beta ^{31 del} pancreas ^{, 31} e il tessuto pancreatico primario ³² .

Il principio del metodo è quello di generare un'emulsione in acqua in olio costituita da gocce di alginato in olio minerale, seguita da una gelazione interna delle goccioline di alginato ( figura 1 ). In primo luogo l'incapsulante ( ad es. Le cellule) viene disperso in una soluzione alginata contenente un sale di calcio a grana fina con bassa solubilità al pH iniziale del processo. La miscela alginata viene quindi aggiunta ad una fase organica agitata per creare un'emulsione, di solito in presenza di unatensioattivo. Nel caso dell'incapsulamento cellulare di mammiferi, i componenti presenti nel siero possono agire come tensioattivi. Successivamente, il pH viene ridotto per solubilizzare il sale di calcio aggiungendo un acido solubile in olio che divide nella fase acquosa. L'acido acetico, con un coefficiente di ripartizione dell'olio / acqua minerale <0,005 ³³ , deve essere pre-disciolto in olio, quindi aggiunto all'emulsione dove viene mescolato in fase olio e rapidamente diviso nella fase acquosa ³⁴ . La Figura 2 illustra le reazioni chimiche e la diffusione che si verificano durante l'acidificazione e la fase di gelazione interna. Infine, le cellule incapsulate vengono recuperate per inversione di fase, la separazione di fase accelerata mediante centrifugazione, ripetuti gradini di lavaggio e filtrazione. Questi passaggi possono quindi essere seguiti da un campionamento di branelli e cellule per analisi di controllo di qualità, cultura cellulare in vitro e / o trapianto delle cellule incapsulate.

Figura 1: Schema del processo basato sulla emulsionazione per incapsulare le cellule dei mammiferi. Le perle vengono prima prodotte emulsionando una miscela di alginato, cella e CaCO ₃ in olio minerale (passi 1 e 2 nello schema), innescando la gelazione interna aggiungendo acido acetico (fase 3). Le branche gelate vengono quindi separate dall'olio aggiungendo un tampone acquoso per innescare l'inversione di fase (fase 4), seguita da centrifugazione e aspirazione di olio (fase 5), quindi filtrazione (fase 6). Infine, le perle raccolte sul filtro vengono trasferite in terreno di coltura cellulare per coltura in vitro o per il trapianto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Reazioni e fasi di diffusione che si verificano durante la gelazione interna. (1) L'acido acetico viene aggiunto alla fase organica ed è trasportato alle gocce di alginato per convezione. (2) L'acido acetico divide nella fase acquosa. (3) In presenza di acqua, l'acido si dissocia e diffonde per raggiungere i grani CaCO ₃ raffigurati in blu scuro. (4) Gli ioni H ⁺ vengono scambiati con gli ioni Ca ²⁺ in CaCO ₃ , rilasciando ioni Ca ²⁺ . (5) Gli ioni di calcio si diffondono fino a quando non incontrano un alginato non reagito, portando alla traversatura ionotropica delle catene alginiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Contrariamente agli incapsulatori convenzionali a base di ugelli convenzionali, è un'esperienza di grande distribuzione del beadCeduto da questo processo a causa del meccanismo di formazione di goccioline in emulsionazione mescolata. Per un sottoinsieme di applicazioni, questa distribuzione di dimensioni del tallone può essere problematica. Ad esempio, una frazione più grande delle cellule può essere esposta alla superficie del tallone in perle più piccole. Se i limiti di nutrienti ( ad es. Ossigeno) sono preoccupanti, queste limitazioni possono essere esacerbate in branelli più grandi. Un vantaggio del metodo di emulsionazione mescolato è che la dimensione del tallone medio può essere facilmente regolata cambiando il tasso di agitazione durante la fase di emulsionazione. La distribuzione di dimensioni larghe può essere sfruttata anche per studiare l'effetto della dimensione del bead sulle prestazioni delle cellule incapsulate.

L'incapsulamento delle cellule dei mammiferi mediante emulsionazione e gelazione interna è un'alternativa interessante per i laboratori che non sono dotati di un generatore di branelli. Inoltre, questo metodo consente agli utenti di ridurre il tempo di lavorazione o di generare perline a concentrato di alginato molto basso o molto altozioni.

Il protocollo descritto di seguito descrive come incapsulare le cellule in 10,5 ml di soluzione alginata al 5% preparata in 10 mM di tampone di acido 4- (2-idrossietil) -1-piperazinattanesolfonico (HEPES). L'alginato è costituito da una miscela 50:50 di alginato di LVM a livello di trapianto (acido ad alto contenuto di acido a bassa viscosità) e MVG (alta viscosità ad alta concentrazione di acido guluronico). Il carbonato di calcio a una concentrazione finale di 24 mM viene utilizzato come agente fisico di reticolazione. L'olio minerale leggero costituisce la fase organica, mentre l'acido acetico viene utilizzato per acidificare l'emulsione e attivare la gelazione interna. Tuttavia, il tipo e la composizione del alginato, così come il tampone di processo selezionato, dipendono dall'applicazione desiderata ³² . Per produrre perline con questo protocollo sono stati utilizzati diversi tipi di alginato (vedi tabella dei materiali).

Protocol

1. Preparare la soluzione Alginate, la sospensione CaCO ₃ e l'olio acidificato

1. Preparare il buffer e il mezzo di processo.
   1. Preparare il tampone di processo tipico usato per generare branelli alginato ad alta concentrazione utilizzando 10 mM HEPES, 170 mM NaCl. Regolare il pH a 7,4.
   2. Preparare il mezzo di coltura tipico utilizzando il DMEM di Dulbecco contenente 10% di siero fetale fetale (FBS), 6mM glutammina, 100 U / mL penicillina e 100 mg / mL streptomicina.
2. Preparare la soluzione di riserva alginata a 1,17 volte la concentrazione finale desiderata nelle perle.
   1. In primo luogo, pesare la quantità appropriata di polvere di alginato. Ad esempio, per ottenere una concentrazione finale del 5% alginato con 50:50 LVM e MVG alginato, pesare un totale di 1,17 g di alginato sodico combinando 0,583 g di polvere di alginato LVM e 0,583 g di polvere di alginato MVG.
   2. Inserire un tampone di processo di 20 mL in un autocLavare il vaso di vetro su una piastra di agitazione magnetica e agitare a ~ 200 giri / min. Aggiungere progressivamente la polvere alginato di sodio alla soluzione.
   3. Lasciare la soluzione mescolandola per una notte a bassa velocità. Se necessario, fissare il pallone alla piastra di mescolanza.
   4. Se la soluzione non è completamente disciolta, fissare la bottiglia su un miscelatore rotante e continuare a miscelare a 37 ° C per ulteriori 24 ore.
   5. Sterilizzare la soluzione alginata autoclavando la soluzione per 30 minuti in un recipiente inferiore a metà pieno. Lasciare che la temperatura scenda sotto i 60 ° C prima di recuperare la soluzione.
   6. Se necessario, rimuovere le particelle filtrando la soluzione alginata poco dopo l'autoclave prima di raggiungere la temperatura ambiente, mentre la viscosità rimane abbastanza bassa.
3. Preparare la sospensione di carbonato di calcio a 21 volte la concentrazione finale desiderata per la gelazione interna.
   1. Pesare la polvere di CaCO ₃ . Ad esempio, annuncioD 1 g CaCO da ₃ a 20 mL di tampone di processo per ottenere 24 mM CaCO3 come concentrazione finale dell'agente gelificante.
   2. Autoclave la sospensione CaCO ₃ per 30 min.
      NOTA: la concentrazione di CaCO ₃ cambierà nel tempo a causa del equilibrio del bicarbonato - CO ₂ . Evitare di utilizzare lo stesso sacco CaCO ₃ per più di 10 procedure di incapsulamento.
4. Autoclave il vaso agitato utilizzato per il processo di emulsionazione. Prima dell'uso, rimuovere eventuali tracce di acqua condensata rimasta nel pallone.
5. Immediatamente prima del processo di emulsionazione preparare l'olio acidificato. Sciogliere 44 μl di acido acetico per 11 ml di olio minerale posto in un tubo conico da 50 ml.
   NOTA: Un errore comune è la dissoluzione incompleta dell'acido acetico. Evitare di pipettare piccole quantità di acido acetico e di assicurare che l'acido acetico sia completamente sciolto in olio mediante vortex ripetuta.
   ATTENZIONE: l'acido acetico è un tossico D acido volatile. Maneggiare questo reagente sotto una cappa di fumo e mantenere l'acido acetico / soluzione olio in un contenitore chiuso fino alla fase di emulsionazione. Per ulteriori informazioni, fare riferimento alle informazioni sulla scheda di sicurezza di questo reagente.
6. Lasciare che tutte le soluzioni raggiungano la temperatura ambiente prima di procedere all'incapsulamento cellulare.

2. Generazione di branelli di Alginate per emulsione e gelato interno

1. Posizionare 10 ml di olio minerale leggero nel pallone e iniziare ad agitare con una bassa velocità di rotazione ( ad es. 250 giri / min per il pallone da filo utilizzato in questo video).
2. Se le cellule utilizzate per il processo sono da colture aderenti, applicare la tripsina per sospendere le cellule. Terminare la reazione aggiungendo un mezzo contenente FBS o inibitore della tripsina e raccogliendo un campione per l'enumerazione cellulare.
   1. Determinare la concentrazione e la vitalità delle cellule dopo la colorazione Trypan blu usando un emocitometro o un contatore di cellule automatiche, come descritto in precedenzaAss = "xref"> 32.
3. Centrifugare le cellule per 7 minuti a 300 xg e lavare una volta nel mezzo desiderato per l'immobilizzazione cellulare. Assicurarsi che questo supporto contiene emulsionanti come FBS o albumina di siero bovina (BSA). Ad esempio, utilizzare DMEM contenente il 10% di FBS.
4. Riposizionare il pellet di cellula nello stesso mezzo per ottenere 10,5 volte la concentrazione finale desiderata nelle perle.
5. Aggiungere 1,1 mL di 10,5 volte la concentrazione di cellule concentrate a 9,9 mL di soluzione alginato. Aggiungere quindi 550 μL di sospensione CaCO ₃ e mescolare mescolando con una spatola sterile per assicurare una distribuzione uniforme del CaCO ₃ .
6. Trasferire immediatamente 10,5 ml di miscela di alginato, cella e CaCO ₃ nell'olio agitante usando una siringa.
   NOTA: per soluzioni altamente viscose, aspirare e espellere la miscela molto lentamente per evitare le bolle d'aria. In alcuni casi, è preferibile interrompere l'agitazione aggiungendo la miscela al pallone per evitareAllungare l'entrainment sull'albero della girante.
7. Subito dopo l'aggiunta di alginato, cella e CaCO ₃ all'olio, aumentare il tasso di agitazione.
   NOTA: Per il 5% LVM: alginato MVG utilizzato qui, è stata applicata una velocità di rotazione di 1025 giri / min per generare branelli di diametro di circa 900 μm adatti alla coltura in vitro ³⁵ . Le velocità di rotazione più elevate e le basse concentrazioni di alginato portano a un diametro medio inferiore del tallone, come descritto nelle pubblicazioni precedenti ^{25 , 32} . Le leggide modifiche nella geometria del girante e della vasca, nonché le proprietà alginate possono influire notevolmente sul diametro medio del tallone. Per ogni modifica della configurazione della nave o del lotto alginato, deve essere generata una curva standard relativa al diametro del tallone medio del momento della superficie della superficie rispetto alla velocità di rotazione ³² .
8. Avviare il timer e emulsionare l'alginato per 12 minuti.
9. Aggiungere 10 ml di tOlio e acido acetico per acidificare l'emulsione, sciogliere il CaCO3 e quindi fisicamente incrociare l'alginato in branchi gelati. Lasciare 8 min per questa fase di acidificazione.

3. Recupero di branelli

1. Ridurre la velocità di agitazione a 400 giri / min. Aggiungere 40 ml di tampone di processo mescolato con il 10% di media per aumentare il pH e provocare l'inversione di fase.
2. Fermare l'agitazione 1 min dopo e trasferire la miscela a 50 ml di centrifuga. Risciacquare il pallone con un altro mezzo di 20 ml e aggiungerlo al tubo. Aspirare il più possibile la fase acquosa dalla fiala di spinner prima di aspirare la fase dell'olio per minimizzare il contatto del tallone con la fase dell'olio.
   NOTA: Usare una pipetta di grandi dimensioni ( ad es. Pipetta da 25 ml) a questo punto e da questo punto in modo da evitare di danneggiare le perle. Per i volumi più piccoli, la sospensione del tallone può anche essere manipolata con punte di pipetta tagliate. Per ottenere tali punte, tagliare l'estremità della punta pipetta con forbici whIle che indossa la protezione dell'occhio.
3. Centrifugare i tubi per 3 minuti a 630 xg per accelerare la sedimentazione del fascio e la separazione di fase.
4. Rimuovere l'olio e la soluzione acquosa in eccesso aspirando con una pipetta Pasteur.
5. Lavare le perle almeno una volta con il mezzo. Filtrare la sospensione del tallone sui filtri a cellule in nylon da 40 μm e aspirare l'eccesso di liquido associato alle perle dal basso del filtro. Trasferire le perle in un volume noto di mezzo usando una spatola sterile.
   NOTA: In questo passaggio possono essere utilizzati filtri di dimensioni più piccole o superiori, a seconda del diametro minimo del bead target. Tuttavia, la filtrazione di gravità è consigliata piuttosto che la filtrazione a pressione mediante filtri di dimensioni pori sub micron per evitare di danneggiare le perle.
6. Misurare il volume del branzino per volume di volume (volume dopo aver aggiunto le perle, meno il volume prima di aggiungere le perle) e caricare il mezzo per ottenere il brano desiderato: rapporto volume totale, che è tipicamente 1: 5 o 1 mL di branelli in4 ml di media. Da questo punto in poi, utilizzare sempre pipette di grandi dimensioni per evitare di danneggiare le perle.
7. Trasferire le cellule incapsulate in T-palloni per esperimenti di coltura in vitro o trapiantati.

4. Controllo di qualità e applicazioni

NOTA: Per garantire la qualità delle cellule e del bead incapsulato, la distribuzione del formato del tallone e la sopravvivenza delle cellule dopo il processo dovrebbero essere quantificate. L'invertimento del gel per recuperare le cellule all'interno delle perle per ulteriori analisi viene comunemente eseguito.

1. Per valutare la distribuzione del diametro del tallone, macchiare le perle con toluidina blu-O.
   1. Posare 0,5 ml di branchi in 4 mL di tampone di processo contenente il 10% di mezzo completo.
   2. Aggiungere 500 μl di una soluzione di blu toluidina 1 g / l preparata in tampone di processo.
   3. Incubare per 60 minuti in un tubo conico su un agitatore rotativo a 50 giri / min.
   4. Aggiungere 5 mL di tampone di processo contenente il mezzo completo del 10% e immedTrasferire le perle e la soluzione in un piatto di Petri e acquisire immagini su un microscopio a basso ingrandimento o utilizzando una fotocamera digitale a mano. Se necessario, posizionare il piatto di Petri in una scatola chiara prima di acquisire immagini con una fotocamera portatile per aumentare il contrasto e evitare le ombre.
   5. Esegui un'analisi delle immagini per quantificare la distribuzione del formato del tallone come descritto in precedenza ³² , ad esempio utilizzando l'immagine freeware ³⁶ .
2. Per valutare qualitativamente la sopravvivenza delle cellule, macchia le cellule usando homodimer ethidium per identificare le cellule morte e la calceina AM per identificare le cellule vive.
   1. Aggiungere 1 volume di perline a 4 volumi di tampone di processo contenenti il ​​mezzo completo del 10%.
   2. Aggiungere la quantità appropriata di soluzioni calcein AM e etidum homodimer per ottenere rispettivamente concentrazioni di 4 μM e 2 μM. Genera controlli monocomponenti aggiungendo solo uno dei reagenti ad alcuni campioni di branelli.
   3. Incubare le perline sul ghiaccio per 20 min.
   4. Mettere la soluzione tra una diapositiva e la copertura con un distanziale come un O-ring per evitare la compressione delle perle.
   5. Procedi alla microscopia a fluorescenza. Utilizzare i singoli controlli di macchia per valutare la perdita di fluorescenza. Selezionare i filtri fluorescenti appropriati in base alle lunghezze d'onda di eccitazione / emissione associate con calceina AM (494/517 nm) e l'etodimide omodimero legato al DNA (528/617 nm).
3. Per recuperare le cellule dalle perle per ulteriori analisi, degel l'alginato utilizzando citrato o un'altra soluzione chelante.
   1. Preparare una soluzione degenerante contenente 55 mM citrato, 10 mM HEPES e 95 mM NaCl a pH 7,4.
   2. Mescolare questa soluzione con il 10% di media e quindi aggiungere 1 ml di branchi alginato per 9 ml della miscela.
   3. Degel le perline sul ghiaccio con agitazione di 75 rpm per 20 minuti.
      NOTA: le cellule possono ora essere utilizzate per l'analisi o rimosse dalla cellula degradata di alginatoIon per centrifugazione. Ad esempio, la vitalità cellulare dopo la degenerazione può essere quantificata dalla colorazione Trypan Blue. In alternativa, le cellule possono essere centrifugate e lavate, seguite da campioni e analisi di mRNA, DNA e / o proteine.

Representative Results

Al termine dell'emulsionamento e del processo di gelazione interna, è necessario recuperare un volume di branzine simile al volume iniziale del alginato e della miscela cellulare. Le perline dovrebbero essere altamente sferiche con pochi difetti ( Figura 3 ). Le perle dovrebbero essere sufficientemente forti per resistere alla pipettazione tramite pipette a grande larghezza. Alle concentrazioni di alginato elevato, nelle perle possono essere osservate goccioline o olio incapsulato. Ciò si verifica probabilmente a causa del blocco di olio in goccioline alginato durante la fase di emulsionazione (olio / acqua / olio doppia emulsione). Nelle nostre mani, queste perline rappresentavano una piccola frazione (<5%) del volume del branello e la maggior parte di queste perline veniva rimossa durante l'aspirazione dell'olio durante il passo di recupero del tallone, a causa della loro densità inferiore.

Fig. "> Figura 3 : Percentuali di alginato da 5% contenenti cellule ßTC3 incapsulate ottenute mediante processo di emulsionazione e processo di gelazione interna. Immagine di contrasto di fase del 5% di perline di alginato contenente 5 x 10 ⁶ cellule βTC3 / ​​mL. Versione di questa figura.

La dimensione delle perle ottenute non sarà uniforme - questa è una caratteristica intrinseca delle emulsioni agitate ( figura 4A ). Durante l'emulsionamento in flusso turbolento, le fluttuazioni di pressione agiscono per interrompere le gocce ^{37 , 38} , contrastando la tensione superficiale e le forze viscose nella fase dispersa ³⁹ . Le forze viscose sono non trascurabili se la viscosità della fase dispersa è molto superiore a quella di thE fase continua. Supponendo che la massima percentuale di dissipazione dell'energia locale sia proporzionale alla velocità media di dissipazione dell'energia nel recipiente, il diametro massimo della gocciolata stabile d _max (se >> della scala Kolmogorov) può essere calcolato come segue ^{39 , 40 , 41 , 42}

Dove ρ _c è la densità della fase continua, ε è la velocità media di dissipazione dell'energia nel recipiente, σ è la tensione fra i due fluidi, μd è la viscosità della fase dispersa e C è una costante di proporzionalità. Quando le forze di tensione superficiale predominano sulle forze viscose, il lato destro semplifica a C , mentre se le forze viscose predomina semplificano:

Nei recipienti in scatola, l'ingresso di energia sotto scale di turbolenza è proporzionale all'input di potenza per unità di volume, cioè a N _i ³ D _i ² , dove N _i è la velocità di agitazione e D _i è il diametro della girante. Pertanto, combinato con l'equazione 1 e dato una costante D _i , se le forze di tensione superiori predominano il d _max è previsto proporzionale a N _i ^-1.2 ( Figura 4B ), mentre è proporzionale a N _i ^-0.75 se forze viscose all'interno del Le perline predominano come la forza di ritenzione principale. Le figure 4B e 4C suggeriscono che gli effetti di interfaccia determinano il dMentre le forze viscose diventano più dominanti per la concentrazione di alginato superiore ( ad es. 5% per l'alginato # 3 descritto nella Tabella dei materiali). Dal momento che può essere impossibile determinare d _{max in modo} sperimentale, invece sono stati usati elevati valori quantitativi ( es. Il 95 ^° quantile) del diametro o del diametro medio del momento ( d ₃₂ ), in quanto sono generalmente proporzionali a d _max ⁴³ .

Prima di incapsulare le cellule, si consiglia di generare una curva di d ₃₂ in funzione di N _i ( Figura 4B ). Questa curva aiuterà a selezionare l'adeguata N _i per ottenere la dimensione media del bead desiderata. Sarà probabilmente necessaria una nuova curva standard per diversi lotti di olio o alginato, o se il concentrato di alginatoModificato. A seconda della geometria del vaso e delle concentrazioni di alginato, è opportuno realizzare una gamma relativamente ampia di diametri medaglione medi. Ad esempio, i valori di d ₃₂ compresi tra 200 μm e> 1 mm possono essere ottenuti usando il 2% ( Figura 2C in Hoesli et al ³² ) al 5% di alginato ( Figura 4 ) utilizzando il protocollo sopra descritto.

Figura 4 : Distribuzione del diametro del bead. ( A ) Toluidina blu-O colorato 5% di perline alginato. ( B ) d ₃₂ in funzione della velocità di agitazione ( N _i ) per 1,5% e 5% di brani alginati usando una miscela 50:50 di alginati # 1 e # 2 (vedi tabella dei materiali). Un unico punto è indicato per il 5% algiPerline nate. ( C ) d ₃₂ in funzione di N _i per il 2% e al 5% alginato # 3 (vedi tabella dei materiali). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard delle dimensioni del tallone all'interno di un campione (N> 150 perline). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La sopravvivenza della cellula dall'emulsionazione e dal processo di gelazione interna dipende principalmente dall'entità e dalla durata della caduta di pH sperimentata dalle cellule. Utilizzando il processo descritto in questo video, 76 ± 2% di sopravvivenza cellulare βTC3 è stata misurata ³¹ . Quando incapsulano le cellule disperse a 10 ⁵ cellule / ml di alginato a 10 ⁷ cellule / ml di densità di semina di alginato, tutte le perline devono contenere le cellule. Quando si incapsulano i cluster di cellule come le cellule pancreatiche, si può prevedere che un sottoinsieme di perle sia empty. La Figura 5 mostra i risultati tipici di colorazione delle cellule vive / cellule morte ottenute utilizzando questo processo. La sopravvivenza superiore delle cellule può essere raggiunta aumentando la capacità del buffer di processo e diminuendo la durata della fase di acidificazione. Per esempio, la sopravvivenza di cellule MIN6 di 90 ± 2% è stata ottenuta usando 60 mM di MOPS (3- (N-morfolino) propanesulfonic acid) come buffer di processo e diminuendo il tempo complessivo di processo a 4 min ³² . Tuttavia, le perline generate erano significativamente più forti con il buffer di processo HEPES da 10 mM che con il buffer di processo MOPS da 60 mM a causa delle maggiori quantità di Ca ²⁺ rilasciate a basso pH ³¹ . Sia il breve processo MOPS che il più lungo processo HEPES dovrebbero generare perline sufficientemente stabili per> 2 settimane di cultura o trapianto in vitro . Tuttavia, le perle possono gonfiarsi o degenerare interamente in soluzioni a basso contenuto di calcio o ad elevate concentrazioni di chelatore (ad esempio, Soluzione salina con tampone fosfato privo di calcio).

Per le cellule MIN6 incapsulate in vitro , gli aggregati cellulari visibili si formano dopo 5-7 giorni di espansione cellulare immobilizzata in vitro e spheroidi di diametro di 150 μm possono essere raccolti dopo 2 settimane. Si prevede che il tasso di crescita delle cellule immobilizzate con alginato sia inferiore a quello delle colture non immobilizzate, in particolare per i gel con concentrazione di alginato superiore o con un elevato contenuto di acido guluronico.

Figura 5 : Celle incapsulate subito dopo il processo. ( A ) Cella viva (verde, calceina AM) e cellula morta (rosso, etidio omodimero) colorazione delle cellule incapsulate. ( B ) Immagine di contrasto di fase dello stesso bead. Le cellule MIN6 sono state incapsulate in 2%Branchi alginati usando l'emulsionazione di 12 min, 8 min di acidificazione e un 10 mM di HEPES buffer come descritto in questo protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Varie fasi (illustrate nella Figura 2 ) durante la reazione di gelazione interna possono limitare la cinetica complessiva. Per i granuli di carbonato di calcio superiore a ~ 2,5 μm, è stato dimostrato che la velocità di dissoluzione del carbonato è limitata dai tassi ^{26 , 44} . La fase di acidificazione che porta al rilascio interno del calcio è stata anche dimostrata come la variabile di processo critica che pregiudica la sopravvivenza cellulare32. Le condizioni che portano alla gelazione interna sono dunque cruciali sia per la qualità del tallone che per la sopravvivenza cellulare. A seconda dell'applicazione finale per le perle, possono essere scelte diverse condizioni di processo ottimali. Ad esempio, una goccia di pH più elevata ( ad esempio utilizzando 10 mM HEPES per bufferizzare la soluzione alginato) può essere auspicabile per applicazioni di trapianto in cui la stabilità a lungo termine delle perle è cruciale. D'altra parte, una diminuzione del pH più bassa ( ad esempio utilizzando 60 mM MOPS a buffeR la soluzione alginato) può essere preferibile per applicazioni in vitro .

Oltre a regolare il livello e la durata dell'acidificazione, si possono prevedere altre modifiche di processo. Ad esempio, possono essere utilizzate altre configurazioni di vasche, concentrazioni di alginato, tamponi di processo, fasi organiche e agenti acidificanti. Come discusso in precedenza, la dimensione media del tallone può essere facilmente regolata cambiando il tasso di agitazione durante la fase di emulsionazione. Inoltre, tempi di emulsionamento più lunghi possono portare a piccole dimensioni del tallone, ma possono causare una ridotta vitalità cellulare. Le pubblicazioni di Poncelet et al. ^{25 , 26 , 45} e Hoesli et al. ^{31 , 32} hanno testato e discusso alcune di queste opzioni.

Le modifiche leggere del protocollo sopra descritto possono avere un impatto profondoLa generazione del branco, la qualità del tallone e la sopravvivenza delle cellule. La tabella 1 fornisce una guida per la risoluzione dei problemi per comprendere e risolvere i problemi che possono verificarsi.

Problema	Causa tipica	Soluzioni suggerite
La girante smette di ruotare durante l'aggiunta di alginato o acido acido	Il campo magnetico è insufficiente per una miscelazione adeguata o l'albero della girante è disallineato	Assicurarsi che il pallone di filettatura sia ben centrato sulla piastra magnetica e sia incollato sulla lastra in posizione ottimale prima di aggiungere la miscela alginato. Testare velocità di agitazione molto elevate e quindi diminuire al tasso di agitazione desiderato prima di aggiungere la miscela di alginato.
		Assicurarsi che l'albero della girante sia ben allineato e stabile. Per il BelLco, assicurarsi che la girante sia saldamente tenuta in posizione da bulloni su entrambi i lati del tappo a flangia. Assicurarsi che il movimento della girante sia limitato alla direzione radiale (la girante non deve oscillare sull'albero).
Nessun branello ottenuto	L'alginato era impropriamente emulsionato	Assicurarsi che i microdropletti alginati siano visibili durante l'emulsionazione. In caso contrario, verificare che la densità di fase olio e la geometria del vaso 23 siano simili a quelle descritte nel presente protocollo. Una fitta densità di olio o una geometria del vaso che non fornisce una sufficiente dispersione di energia locale può non consentire una corretta emulsionazione alginica.
Nessun branello ottenuto	La gelazione interna non si è verificata	Un errore comune è la dissoluzione incompleta dell'acido acetico nella fase dell'olio. Assicurarsi che la miscela di olio acido sia sufficientemente vortexata e che non sia osservato acido acetico alFondo del tubo.
		Se la girante non raggiunge l'olio, è possibile aggiungere più olio prima di aggiungere l'alginato. Tuttavia, la quantità di acido acetico deve essere regolata in base alla seguente equazione: Dove 1 è il rapporto di fase dell'olio / acqua prima delle modifiche (p.es. 0,525 per 10,5 ml di alginato in 10 ml di olio + 10 ml di acido olio) 2 è il rapporto di fase dell'olio / acqua dopo le modifiche al protocollo e Dow è il coefficiente di distribuzione dell'acido acetico tra le due fasi. Questo coefficiente di distribuzione può essere misurato sperimentalmente o approssimato dai valori presi dalla letteratura. Ad esempio, il coefficiente di distribuzione dell'acido acetico tra eptano e acqua 46 è di 0,011.
Nessun branelloO le perle sono meccanicamente instabili	La viscosità zero-shear della soluzione alginata è inferiore a 0,004 Pa · s o superiore a 112 Pa · s	A causa dell'elevata variabilità batch-to-batch di lotti alginati, si consiglia di misurare la viscosità di diverse concentrazioni di soluzioni alginato. La combinazione di un lotto ad alta viscosità con un lotto a bassa viscosità può essere richiesto per raggiungere una viscosità di destinazione. Per la miscela LVM e MVG del 5% utilizzata qui, la viscosità zero-shear era 3,3 Pa · s. Va notato che gli alginati con lunghezze di blocchi di acido guluronico troppo corti o lunghe lunghezze di catena complesse non possono consentire la formazione di gel.
I branelli sono troppo grandi o troppo piccoli	Il tasso di agitazione durante l'emulsionazione è troppo basso o troppo alto per la concentrazione o la viscosità del alginato	L'aumento della turbolenza aumentando il tasso di agitazione o l'aggiunta di deflettori diminuirà la dimensione del tallone. La concentrazione di alginato, la tempLa geometria del vaso e della girante influenzerà tutte le dimensioni del tallone ottenuto.
Molti branelli rotti sono osservati	Gestione del tallone duro, danni durante la fase di gelazione interna o insufficienza della resistenza del tallone.	I danni meccanici alle perle possono portare alla rottura del tallone una volta avviata la gelazione interna. Ridurre il tasso di agitazione immediatamente prima della fase di acidificazione e assicurare che le perle siano trattate con delicatezza utilizzando pipette da 25 ml o pipette da 1000 μL con punte tagliate. Se le perle danneggiate vengono osservate anche con un'attenta manipolazione e una agitazione ridotta durante l'acidificazione, la resistenza del tallone può essere inadeguata. Ciò potrebbe essere dovuto al contenuto di acido guluronico insufficiente o alla gelificazione incompleta (ad esempio acidificazione insufficiente).
Sostenibilità bassa cellula	Processo iniziale pH troppo elevato o pH finale troppo basso	La sopravvivenza del processo di cellule dei mammiferi può essere aumentata limitando la caduta del pH e il tempo di acidificazione
La vitalità delle cellule basse nelle perle più piccole	Capacità insufficiente di bufferizzazione di alginato	Si prevede una diminuzione del pH maggiore nelle perline più piccole che nei bordi più grandi a causa del maggiore rapporto superficie / volume di queste perle. Poiché l'acido acetico aggiunto all'emulsione è limitato, sono previste concentrazioni di acido acetico più elevate in perle più piccole per la stessa concentrazione di CaCO3. Aumentando la capacità di buffering della soluzione alginata (ad es. Utilizzando 60 mM MOPS invece di 10 mM HEPES) può aumentare la sopravvivenza cellulare nelle perle più piccole 32 . Le perline piccole con perdite di cellule elevate possono essere eliminate selettivamente mediante filtrazione o sedimentazione senza incorrere in grandi perdite volumetriche.
ioDissoluzione nca completa di CaCO 3	Tempo di acidificazione o di acidificazione insufficiente. Si noti che questo problema potrebbe non essere problematico se la stabilità del tallone è sufficiente.	La dissoluzione incompleta di CaCO 3 è stata osservata nelle perle più grandi seguendo questo protocollo 32 . L'estensione della dissoluzione di CaCO3 può variare a seconda della dimensione del grano CaCO 3 , la caduta del pH durante il processo, la durata della goccia di pH, nonché la concentrazione di alginato utilizzata. Questo problema non è considerato problematico finché la stabilità meccanica del tallone è sufficiente per l'applicazione desiderata. Per aumentare la reticolazione del tallone, assicurarsi che il grano CaCO 3 sia sufficientemente piccolo (~ 2,5 μm). Sonicare la sospensione di CaCO 3 può aiutare a interrompere i granuli aggregati 26 . A concentrazioni molto alte o alte di algini possono essere necessari aggiustamenti nella concentrazione di CaCO 3 . Infine, chelatori o soluzioni a basso livelloI livelli di ioni bivalenti porteranno alla graduale perdita di Ca 2+ nel gel. Se si osserva una graduale perdita di stabilità meccanica del tallone, verificare che il contenitore o il tampone di coltura del tallone contiene> 2 mM Ca 2+ .

Tabella 1: Guida alla risoluzione dei problemi. Elenco dei problemi, cause probabili e soluzioni potenziali.

Le limitazioni potenziali del processo di emulsionazione e di gelazione interna per la coltura in vitro di cellule di mammiferi e le applicazioni di trapianto comprendono: (1) la necessità di esposizione transitoria a basso pH, (2) la necessità di rimuovere l'olio residuo, (3) la dimensione del tallone polidisperse Distribuzione, (4) la potenziale tensione di taglio durante la formazione di gocciolato alginato e (5) la maggiore porosità di branelli gellati internamente rispetto a perline gellate esternamente ⁴⁷ .

Sono state ottenute sopravvivenza e funzione di cellule elevate di MIN6 e βTC3Dopo l'ottimizzazione del processo ³² . Tuttavia, questo processo potrebbe non essere adatto a più cellule sensibili al pH. L'eliminazione completa dell'olio dalle perle può anche essere impegnativa e sono necessari tipi di olio approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) per eventuali applicazioni cliniche. La distribuzione del diametro dei branelli polidispersi può anche essere un po 'problematica per le applicazioni di immunoisolamento, in cui è richiesta l'incapsulamento completo della cellula e la sopravvivenza cellulare a lungo termine. Mentre le piccole dimensioni del tallone possono portare alla protuberanza delle cellule ⁴⁸ , le perline di grandi dimensioni possono ostacolare la diffusione dei nutrienti e / o la funzione cellulare ^{35 , 49} . D'altra parte, il processo di emulsionazione offre un'opportunità interessante per studiare l'effetto della dimensione del tallone sulla sopravvivenza cellulare dopo il trapianto generando sia piccole che grandi granuli in un unico processo. La dimensione media del tallone può essere facilmente regolata modificando il tasso di agitazione durinG la fase di emulsionamento ( Figura 4 ). Infine, la porosità più alta di branelli gellati internamente può anche essere dannosa per l'immunoisolamento, in cui molecole come anticorpi e citochine dovrebbero essere esclusi dalle perle. Tuttavia, il processo di emulsionamento consente anche la generazione di branelli da soluzioni alginato molto concentrate, riducendo così la dimensione dei pori del tallone alginato.

L'emulsione e il processo di gelazione interna sono un'interessante alternativa agli incapsulatori a base di ugelli per laboratori che desiderano scalare l'incapsulamento cellulare o non avere accesso ad un encapsulatore. Questo processo è un metodo robusto e semplice per immobilizzare le cellule in perline alginiche utilizzando soluzioni alginato molto diluite o molto concentrate. Alcuni degli esperimenti successivi che possono essere eseguiti con le cellule immobilizzate sono quello di determinare l'effetto della matrice alginato sulle decisioni del fato cellulare o di determinare in che misura le perline forniscono una barriera tra i trapiantiD e il sistema immunitario ospitante. Il metodo di emulsionazione e di gelazione interna fornisce un nuovo approccio per incapsulare isole primarie in grandi partite. Il metodo consente anche l'incapsulamento cellulare in branelli alginato altamente concentrati con porosità ridotta e quindi ridotto l'accesso degli anticorpi alle cellule incapsulate. Il metodo di emulsionazione e di gelazione interna offre quindi un nuovo mezzo per generare quantità clinicamente rilevanti di cellule terapeutiche incapsulate.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade)	Sigma	A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)	A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM	Life Technologies	11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin	Thermo Fisher Scientific	SH3039603
Glutamine	Life Technologies	25030
Penicillin and streptomycin	Sigma	P4333-100ML
HEPES, cell culture tested	Sigma	H4034-100G
NaCl	Thermo Fisher Scientific	S271-1
Fine-grain CaCO3	Avantor Materials	1301-01	After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil	Thermo Fisher Scientific	O121-4	Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid	Thermo Fisher Scientific	A38-500	Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas	Sigma	CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Sarstedt	86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Toluidine Blue-O	Sigma	T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks	Bellco	1965-00100	The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed	Bellco	7760-06005	The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter	Innovatis	Cedex AS20	This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box	Artograph	LightPad® PRO	This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera	Canon	PowerShot A590 IS	A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters	Olympus	IX81	Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software	Molecular Devices	Metamorph	A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware	CellProfiler	Non-applicable	A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).