Summary
このビデオと原稿は、簡単な撹拌容器を用いて大きなバッチで製造することができるアルギン酸ビーズ0.5％〜10％の哺乳動物細胞をカプセル化するエマルジョンベースの方法を記載しています。カプセル化された細胞は、インビトロで培養され得るか、または細胞治療用途のために移植され得る。
Abstract
アルギン酸ビーズにおける細胞のカプセル化は、インビトロでの固定培養およびインビボでの免疫隔離のために用いられてきた。膵島のカプセル化は、同種異系移植または異種移植における膵島生存を増加させる手段として広範囲に研究されている。アルギン酸塩カプセル化は、一般に、ノズル押出および外部ゲル化によって達成される。この方法を使用して、ノズルの先端に形成された細胞含有アルギン酸液滴は、液滴中に拡散する際にイオン性アルギン酸ゲル化を引き起こす二価カチオンを含む溶液に落ちる。ノズルチップにおける液滴形成の要件は、達成可能な容積スループットおよびアルギン酸塩濃度を制限する。このビデオでは、哺乳類の細胞を70％〜90％の細胞生存率で0.5％〜10％のアルギン酸塩にカプセル化するスケーラブルな乳化方法について説明します。この代替の方法により、細胞および炭酸カルシウムを含有するアルギネート液滴を鉱油中で乳化し、内部カルシウム放出およびイオノトロピックアルギン酸塩ゲル化をもたらすpHの低下によって低下した。現在の方法は、乳化の20分以内にアルギン酸ビーズの生成を可能にする。カプセル化工程に必要とされる装置は、大部分の実験室で利用可能な単純攪拌容器からなる。
Introduction
哺乳動物細胞のカプセル化は、免疫拒絶1から移植された細胞を保護する手段として、または固定化された細胞培養のための三次元支持体を提供するための手段として広く研究されている2,3,4 。アルギン酸ビーズ中の膵島封入は、同種異系の5,6または異種7,8,9,10,11,12齧歯類における糖尿病を逆転させるために使用されている。 1型糖尿病を治療するためのカプセル化された膵島移植の前臨床試験および臨床試験が進行中である13,14,15。移植用途またはより大きいスケールのためにインビトロで固定化された細胞生産では、ノズルベースのビーズ発生器が一般に使用される。典型的には、アルギン酸塩と細胞との混合物をノズルを通してポンプ輸送して、二価カチオンを含有する攪拌溶液に落ちる液滴を形成し、液滴の外部ゲル化をもたらす。同軸ガス流16,17 、ノズル振動18 、静電反発力19または回転ワイヤ20は、ノズル先端での液滴形成を容易にする。
従来のビーズ発生器の主な欠点は、スループットが限られていることと、十分なビード形成をもたらす溶液粘度の限定された範囲であることである21 。高い流速では、ノズルを出る流体は、ノズル直径よりも小さい液滴に砕かれ、サイズ制御を減少させる。スループットを向上させるためにマルチノズルビードジェネレータを使用できますが、ノズル間の流れの均一な分布と溶液> 0.2 Pasの使用は問題である22 。最後に、使用されるノズルの直径が100μmと500μmの間であり、人間の島の〜15％が200μmより大きくてもよいため、ノズルベースのデバイスのすべてが島にいくらかの損傷を与えると予想される。
このビデオでは、1滴ずつではなく、1回の乳化ステップで液滴を形成することによって、哺乳動物細胞をカプセル化する別の方法について説明します。ビーズ製造は単純な撹拌容器で行われるため、この方法は、設備コストが低くても、小（〜1mL）から大規模（10 3L範囲）のビーズ製造に適しています。この方法は、ビーズ生成時間が短い（ 例えば、 20分間）広範囲のアルギン酸塩粘度を用いて、高い球形度を有するビーズの製造を可能にする。この方法はもともとPoncelet et all。 DNA27 、インスリン29を含むタンパク質28 、および細菌30を固定化するために使用された。私たちは、最近、これらの方法を、膵β細胞株31,32および一次膵臓組織32を用いた哺乳動物細胞のカプセル化に適用した。
この方法の原理は、鉱油中のアルギネート液滴からなる油中水型エマルジョンを生成し、続いてアルギン酸塩液滴を内部でゲル化させることである（ 図1 ）。最初に、封入剤（ 例えば、細胞）を、初期プロセスpHにおいて低い溶解度を有する微粒子カルシウム塩を含有するアルギン酸塩溶液に分散させる。次いで、アルギン酸塩混合物を撹拌した有機相に添加して、通常は界面活性剤。哺乳類細胞のカプセル化の場合、血清中に存在する成分は界面活性剤として作用することができる。次に、水相に分配する油溶性酸を添加することによってカルシウム塩を可溶化するためにpHを低下させる。鉱物油/水分配係数<0.005〜33を有する酢酸は、油中に予め溶解され、次いで乳濁液に添加され、油相中で混合され、水相34に急速に分配される。 図2は、酸性化および内部ゲル化工程中に起こる化学反応および拡散を示す。最後に、カプセル化された細胞は、転相、遠心分離によって加速された相分離、繰り返し洗浄工程および濾過によって回収される。次いで、これらの工程の後に、品質管理分析、 インビトロ細胞培養および/またはカプセル化細胞の移植のためのビーズおよび細胞サンプリングを行うことができる。
図1：哺乳動物細胞をカプセル化するための乳化に基づくプロセスの概略図。ビーズは、鉱油中のアルギン酸塩、細胞およびCaCO 3混合物を乳化させることによって（酢酸塩を添加することにより内部ゲル化を誘発する（工程3））、最初に製造される（工程1および工程2）。次いで、ゲル反転ビーズを水性緩衝液を添加して転相（工程4）、次に遠心分離および油吸引（工程5）、次いで濾過（工程6）を加えることにより、油から分離する。最後に、フィルター上に集められたビーズは、インビトロ培養または移植のために細胞培養培地に移される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
従来のノズルベースの細胞カプセル化装置とは対照的に、広いビーズサイズ分布が達成される攪拌乳化における液滴形成のメカニズムのために、このプロセスから生じる。アプリケーションのサブセットでは、このビードサイズの分布に問題がある可能性があります。例えば、細胞のより大きな部分が、より小さいビーズのビーズ表面に露出され得る。栄養素（ 例えば酸素）の制限が懸念される場合、これらの制限は、より大きなビーズで悪化する可能性がある。撹拌乳化法の利点は、平均ビーズサイズが、乳化工程の間の撹拌速度を変えることによって容易に調節できることである。広範なビーズサイズ分布は、カプセル化された細胞性能に対するビーズサイズの影響を研究するために利用することもできる。
乳化および内部ゲル化による哺乳動物細胞のカプセル化は、ビーズ発生器を備えていない研究室にとって興味深い代替物である。さらに、この方法は、処理時間を短縮するか、非常に低いまたは非常に高いアルギネート濃度でビーズを生成するという選択肢をユーザに与えるations。
10mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝液中で調製した10.5mLの5％アルギン酸溶液中に細胞をカプセル化する方法を下記に概説する。アルギン酸塩は、移植グレードLVM（低粘度高マンヌロン酸含量）およびMVG（中粘度高グルロン酸含量）アルギン酸塩の50:50混合物からなる。物理的架橋剤として、最終濃度24mMの炭酸カルシウムを使用する。軽質鉱物油は有機相を構成し、酢酸はエマルジョンを酸性化し、内部ゲル化を誘発するために使用される。しかしながら、選択されるアルギン酸塩の種類および組成、ならびにプロセス緩衝液は、所望の用途32に依存する。このプロトコールを用いて様々なアルギネート型（表の表を参照）を使用してビーズを作製した。
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Protocol
アルギネート溶液、CaCO 3懸濁液および酸性化された油を調製する
- プロセスバッファーと培地を準備する。
- 10 mM HEPES、170 mM NaClを使用して高濃度アルギン酸ビーズを生成するために使用される典型的なプロセスバッファーを調製します。 pHを7.4に調整する。
- 10％ウシ胎仔血清（FBS）、6mMグルタミン、100U / mLペニシリンおよび100mg / mLストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を用いて典型的な培地を調製する。
- ビーズ中の最終所望濃度の1.17倍でアルギン酸ストック溶液を調製する。
- まず、適切な量のアルギン酸塩粉末を計量する。例えば、50:50のLVMおよびMVGアルギン酸塩を含む5％アルギネートの最終濃度を得るために、0.583gのLVMアルギネート粉末および0.583gのMVGアルギネート粉末を合わせることによって、合計1.17gのアルギン酸ナトリウムを計量する。
- 20 mLのプロセスバッファをautoc磁気攪拌プレート上でガラス張りガラス容器に入れ、約200rpmで攪拌する。溶液にアルギン酸ナトリウム粉末を徐々に加える。
- 溶液を一晩低速で撹拌したままにします。必要に応じて、フラスコを攪拌プレートに固定します。
- 溶液が完全に溶解していない場合は、ボトルを回転ミキサーに固定し、さらに24時間37℃で混合を続けます。
- 半分以下の容量の容器で30分間溶液をオートクレーブすることによりアルギン酸塩溶液を滅菌する。溶液を回収する前に、温度を60℃以下に下げてください。
- 必要に応じて、室温に達する前にオートクレーブ直後にアルギン酸溶液をろ過することにより粒子を除去するが、粘度は十分に低いままである。
- 内部ゲル化のための最終的な所望の濃度の21倍で炭酸カルシウム懸濁液を調製する。
- CaCO 3粉末を秤量する。たとえば、広告d 1 g CaCO 3を20 mLプロセス緩衝液に添加して、最終ゲル化剤濃度として24 mM CaCO 3を得る。
- CaCO 3懸濁液を30分間オートクレーブ処理する。
注：CaCO 3濃度は、重炭酸塩-CO 2平衡のために経時的に変化する。同じストックCaCO 3サスペンションを10回以上のカプセル化手順に使用することは避けてください。
- 乳化プロセスのために使用された撹拌容器をオートクレーブする。使用する前に、スピナーフラスコ内に残っている凝結水の痕跡を取り除いてください。
- 乳化プロセスの直前に、酸性化油を調製する。 50mLコニカルチューブに入れた11mLの鉱油あたり44μLの酢酸を溶解する。
注記：一般的な間違いは、酢酸の溶解が不完全であることです。少量の酢酸をピペッティングすることを避け、ボルテックスを繰り返して酢酸が完全に油に溶解するようにしてください。
注意：酢酸は有毒であり、揮発性酸。この試薬はフュームフードの下で取り扱い、乳化ステップまで酢酸/油溶液を密閉容器に入れてください。詳細については、この試薬に関するMSDSの情報を参照してください。 - 細胞のカプセル化に進む前に、すべての溶液が室温に達するようにしてください。
2.乳化および内部ゲル化によるアルギン酸ビーズの生成
- スピンナーフラスコに軽い鉱物油10 mLを入れ、低回転速度（ 例：このビデオで使用したスピナーフラスコの場合は250 rpm）で攪拌を開始します。
- プロセスに使用される細胞が接着性培養由来である場合、細胞を懸濁させるためにトリプシンを適用する。 FBS含有培地またはトリプシンインヒビターを添加して反応を終了させ、細胞計数のためのサンプルを収集する。
- トリパンブルー染色後の細胞濃度および生存率を、前述したように、血球計または自動セルカウンターを用いて決定するass = "xref"> 32。
- 細胞を300xgで7分間遠心分離し、細胞固定化のために所望の培地で1回それらを洗浄する。この培地にFBSやウシ血清アルブミン（BSA）などの乳化剤が含まれていることを確認してください。たとえば、10％FBSを含むDMEMを使用します。
- ビーズ中の所望の最終濃度の10.5倍を得るために、同じ培地中で細胞ペレットを再懸濁する。
- 9.9mLのアルギン酸溶液に1.1mLの10.5倍濃縮細胞ストックを加える。次に、550μLのCaCO 3懸濁液を添加し、CaCO 3の均一な分布を確実にするために滅菌スパチュラを用いて攪拌することによって混合する。
- 直ちに、アルギン酸塩、細胞およびCaCO 3混合物10.5mLをシリンジを用いて撹拌油に移す。
注意：粘性の高い溶液の場合、気泡を避けるために非常にゆっくりと混合物を吸引して排出してください。ある場合には、混合物をフラスコに添加しながら撹拌を停止してアルギン酸塩の羽根車軸への同伴。 - アルギン酸塩、細胞およびCaCO 3混合物を油に添加した直後に、撹拌速度を増加させる。
注：ここで使用した5％LVM：MVGアルギン酸塩については、1025rpmの回転速度を適用して、in vitro培養に適した約900μmのビーズを生成させた35 。以前の刊行物25,32に記載されているように、より高い回転速度およびより低いアルギン酸塩濃度は、平均ビーズ直径を低下させる。インペラーおよび血管の幾何学的形状のわずかな変化、ならびにアルギン酸塩の特性は、平均ビーズ直径に大きく影響し得る。血管構成またはアルギン酸塩ロットの各変化について、表面積モーメント平均ビーズ直径と回転速度とを関連付ける標準曲線を生成する必要がある32 。 - タイマーをスタートさせ、アルギン酸塩を12分間乳化する。
- 10mLのtエマルジョンを酸性化し、CaCO 3を溶解させ、したがってアルギン酸塩をゲル化したビーズに物理的に架橋させる。この酸性化工程では8分を要する。
ビーズの回復
- 撹拌速度を400 rpmに下げる。 10％培地と混合したプロセス緩衝液40mLを添加してpHを上昇させ、転相を起こさせる。
- 1分後に攪拌を停止し、混合物を50mLの遠心管に移す。スピナーフラスコをさらに20mLの培地ですすぎ、これをチューブに加える。ビーズと油相との接触を最小限にするために、油相を吸引する前にスピナーフラスコからできるだけ多くの水相を吸引する。
注：ビーズの損傷を避けるために、この段階で大口径ピペット（ 例： 25 mLピペット）を使用してください。小容量の場合、ビーズ懸濁液を切断ピペットチップで操作することもできます。このようなヒントを得るには、ハサミでピペットチップの端を切る眼の保護具を着用してください。 - ビーズの沈降および相分離を加速するために、チューブを630xgで3分間遠心分離する。
- パスツールピペットで吸引して油分と過剰の水溶液を除去する。
- ビーズを培地で少なくとも1回洗浄する。ビーズ懸濁液を40μmナイロンセルストレーナーで濾過し、ビーズに付随する余分な液体をストレーナーの下から吸引する。滅菌スパチュラを使用してビーズを既知量の培地に移す。
注：目標最小ビーズ径に応じて、この段階でより小さいまたはより大きい孔径のフィルターを使用することができます。しかし、ビーズの損傷を避けるために、サブミクロンの孔サイズのフィルターによる圧力駆動による濾過ではなく、重力濾過が推奨されます。 - ビーズの容量を容積変位（ビーズ添加後の容量からビーズを添加する前の容量から引いた量）で測定し、媒体を上にして、所望のビーズ：全容量比（典型的には1：5）またはビーズ培地4mL。この時点から、大きなビアピペットを使用してビーズを損傷しないようにしてください。
- インビトロ培養または移植実験のために 、カプセル化された細胞をTフラスコに移す。
4.品質管理とアプリケーション
注：カプセル化された細胞およびビーズの品質を確実にするために、ビーズサイズ分布およびプロセス後の細胞生存を定量化する必要があります。さらなる分析のためにビーズ内から細胞を回収するためにゲルを逆転させるのが一般的に行われる。
- ビーズサイズ分布を評価するために、ビーズをトルイジンブルーOで染色する。
- 10％完全培地を含む4mLのプロセス緩衝液に0.5mLのビーズを入れる。
- プロセスバッファーで調製した1 g / Lトルイジンブルー溶液500μLを加えます。
- 50rpmの回転シェーカー上のコニカルチューブ中で60分間インキュベートする。
- 10％完全培地を含有する5mLのプロセス緩衝液を添加し、ビーズおよび溶液をペトリ皿に移し、低倍率顕微鏡または手持ち式デジタルカメラを用いて画像を取得する。必要に応じて、ライトボックスにペトリ皿を置き、手持ち式のカメラで画像を取得してコントラストを向上させ、影を避けます。
- 前述の32のように、例えば画像解析フリーウェア36を使用して、ビーズサイズ分布を定量化するために画像解析を行う。
- 細胞生存を定性的に評価するために、エチジウムホモダイマーを用いて細胞を染色し、死細胞およびカルセインAMを同定して生細胞を同定する。
- 10容量％の完全培地を含む4容量のプロセス緩衝液に1容量のビーズを加える。
- 適切な量のカルセインAMおよびエチジウムホモダイマー原液を加えて、それぞれ4μMおよび2μMの濃度を得る。いくつかのビーズサンプルに試薬の1つだけを加えることによって、単一染色コントロールを生成します。
- ビーズを氷上で20分間インキュベートする。
- ビーズの圧縮を避けるために、Oリングなどのスペーサーを使用してスライドとカバーガラスの間に溶液を置きます。
- 蛍光顕微鏡に進む。蛍光ブリースルーを評価するために、単一の染色コントロールを使用します。カルセインAM（494/517 nm）およびDNAに結合したエチジウムホモダイマー（528/617 nm）に関連する励起/発光波長に基づいて、適切な蛍光フィルターを選択する。
- さらなる分析のためにビーズから細胞を回収するために、クエン酸塩または別のキレート化溶液を用いてアルギン酸塩を脱気する。
- pH7.4で55mMのクエン酸塩、10mMのHEPESおよび95mMのNaClを含有する脱ゲル溶液を調製する。
- この溶液を10％培地と混合し、次いで混合物9mLにアルギン酸ビーズ1mLを加える。
- ビーズを75rpmで20分間氷上で脱ゲルする。
注：細胞は、分析のために使用することができ、またはアルギネート溶菌液から取り出すことができますイオンを遠心分離により除去する。例えば、脱泡後の細胞生存率は、トリパンブルー染色によって定量することができる。あるいは、細胞を遠心分離し、洗浄し、続いてmRNA、DNAおよび/またはタンパク質のサンプリングおよび分析を行うことができる。
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Representative Results
乳化および内部ゲル化プロセスの終わりに、最初のアルギネートおよび細胞混合物の体積と同様のビーズ容量を回収する必要がある。ビーズは非常に球状であり、欠陥はほとんどありません（ 図3 ）。ビーズは、大口径ピペットを介したピペッティングに耐えるほど十分に強くなければなりません。高いアルギン酸塩濃度では、カプセル化された油または空気小滴がビーズ中に観察され得る。これは、乳化段階（油/水/油の二重乳濁液）中のアルギン酸塩小滴への油の捕捉のために起こりそうである。本発明者らの手では、これらのビーズはビーズ体積の小さい部分（<5％）を表し、これらのビーズの大部分は、その低い密度のためにビーズ回収段階の間に油を吸引しながら除去された。
図3 ：乳化および内部ゲル化プロセスによって得られたカプセル化βTC3細胞を含有する代表的な5％アルギン酸ビーズ 5×10 6βTC3細胞/ mLビーズを含む5％アルギン酸ビーズの位相差画像。 この図のバージョン。
得られるビーズのサイズは均一ではありません - これは攪拌エマルションの本質的特徴です（ 図4A ）。乱流における乳化の間、圧力変動は、液滴37,38を破壊し、分散相39の表面張力および粘性力に対抗するように作用する。粘性力は、分散相の粘度がthよりもずっと高い場合に無視できないものであるe連続相。最大局所エネルギー散逸率が容器内の平均エネルギー散逸率に比例すると仮定すると、最大安定液滴直径d max （Kolmogorovスケールより>>）は、39,40,41,42 
ここで、 ρcは連続相の密度、 εは容器内の平均エネルギー散逸率、 σは2つの流体間の界面張力、 μdは分散相の粘度、 Cは比例定数である。表面張力が粘性力よりも優勢である場合、右辺はCに単純化されますが、粘性力が支配的であれば、簡単になります。
攪拌容器では、乱流スケール下で入力されるエネルギーは単位体積当たりの投入電力、 すなわち N i 3 D i 2に比例する.N iは攪拌速度であり、 D iはインペラ直径である。したがって、式1と組み合わせて定数D iを与えた場合、表面張力が優勢であれば、 d maxはN i -1.2 （ 図4B ）に比例すると予測され、 N i -0.75に比例すると予測されるビーズは主要な保持力として優位を占める。 図4Bおよび4Cは、界面効果がd粘性力はより高いアルギン酸塩濃度（ 例えば 、材料の表に記載されたアルギン酸塩＃3については5％）でより支配的になる一方で、低アルギン酸塩濃度についてはロプレットサイズである。実験的にd maxを決定することは実用的ではないことがあるので、一般にd max 43に比例するので、直径または表面積モーメント平均直径（ d 32 ）の高分位値（ 例えば 、95分位数）を代わりに使用した。
細胞をカプセル化する前に、 N iの関数としてのd 32の曲線を生成することが推奨される（ 図4B ）。この曲線は、所望の平均ビーズサイズを得るために適切なN iを選択するのに役立つ。新しい標準曲線は、油またはアルギン酸塩の異なるバッチにも必要とされるであろうし、またはアルギン酸塩濃度変化が修正されます。血管形状およびアルギン酸塩濃度に依存して、比較的広い範囲の平均ビーズ直径が達成可能であるべきである。例えば、上述のプロトコールを用いて2％（Hoesli ら 32の 図2C ）から5％アルギネート（ 図4 ）を用いて、200μmと> 1mmとの間のd 32値を得ることができる。
図4 ：ビーズサイズ分布。 （ A ）トルイジンブルーO染色した5％アルギン酸ビーズ。アルギン酸塩＃1および＃2の50:50混合物（材料の表を参照）を用いた1.5％および5％アルギン酸ビーズの攪拌速度（ N i ）の関数としての（ B ） d 32を示す。 5％algiの単一点が示されていますnateビーズ。 （ C ） d 32は2％および5％アルギン酸塩＃3についてのN iの関数である（材料の表参照）。エラーバーは、サンプル（N> 150ビーズ）内のビーズサイズの標準偏差を表す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
乳化および内部ゲル化プロセスからの細胞生存は、主に、細胞が経験するpH低下の程度および持続時間に依存する。このビデオで説明されているプロセスを使用して、76±2％のβTC3細胞生存が測定された31 。 10 5細胞/ mLのアルギン酸塩から10 7細胞/ mLのアルギン酸塩播種密度で分散した細胞をカプセル化する場合、全てのビーズは細胞を含むべきである。膵臓細胞のような細胞クラスターをカプセル化する場合、ビーズのサブセットは空になると予想することができるy。 図5は、このプロセスを用いて得られた典型的な生細胞/死細胞染色結果を示す。プロセス緩衝液容量を増加させ、酸性化工程の持続時間を短縮することによって、より高い細胞生存を達成することができる。例えば、プロセス緩衝液として60mM MOPS（3-（N-モルホリノ）プロパンスルホン酸）を使用し、全プロセス時間を4分32に減少させることにより、90±2％MIN6細胞の生存を得た。しかし、生成されたビーズは、より低いpH31で放出されたCa 2+の量の増加のために、60mM MOPSプロセス緩衝液よりも10mM HEPESプロセス緩衝液で有意に強かった。短いMOPSプロセスおよびより長いHEPESプロセスの両方が、 インビトロ培養または移植の> 2週間以上十分に安定なビーズを生成するはずである。しかしながら、ビーズは、低カルシウムまたは高キレート剤濃度を有する溶液中で完全に膨潤または脱ゲルし得る（例えば、、カルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水）。
インビトロで増殖させたカプセル化MIN6細胞では 、5〜7日間のインビトロで固定化された細胞拡張の後に目に見える細胞凝集体が形成され 、直径が150μmのスフェロイドを2週間後に収穫することができる。アルギン酸塩固定化細胞の増殖速度は、特に高アルギン酸濃度またはより高いグルロン酸含量を有するゲルについて、非固定化培養物よりも低いと予想される。
図5 ：プロセス直後のカプセル化された細胞。 （ A ）カプセル化細胞の生細胞（緑、カルセインAM）および死細胞（赤、エチジウムホモ二量体）染色。 （ B ）同じビーズの位相差画像。 MIN6細胞を2％12分の乳化、8分間の酸性化およびこのプロトコールに記載の10mMのHEPES緩衝液を使用して、アルギン酸ビーズに添加した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
内部ゲル化反応中の様々なステップ（ 図2に図示）は、全体的な反応速度を制限する可能性がある。 〜2.5μmより大きい炭酸カルシウムの場合、炭酸塩の溶解速度は速度制限26,44であることが示されている。内部のカルシウム放出をもたらす酸性化段階もまた、細胞生存に影響を及ぼす重要なプロセス変数であることが示されている32 。したがって、内部ゲル化をもたらす条件は、ビーズ品質および細胞生存の両方にとって決定的に重要である。ビーズの最終用途に応じて、異なる最適プロセス条件を選択することができる。例えば、ビーズの長期安定性が重要である移植用途には、より高いpH低下（ 例えば 、アルギン酸塩溶液を緩衝するための10mM HEPESの使用）が望ましいことがある。一方、より低いpHの低下（ 例えば 、60mMのMOPSを用いてバフアルギン酸塩溶液）は、インビトロの用途には好ましい可能性がある。
酸性化のレベルおよび持続時間を調整することに加えて、他のプロセス改変も想定することができる。例えば、他の攪拌容器構成、アルギネート濃度、プロセス緩衝液、有機相および酸性化剤を使用することができる。前述したように、平均ビーズサイズは、乳化工程中の撹拌速度を変えることによって容易に調整することができる。さらに、より長い乳化時間は、より小さいビーズサイズを導くことができるが、細胞生存率を低下させる可能性がある。 Poncelet らによる刊行物25,26,45およびHoesli et al。これらのオプションのいくつかをテストし、説明しました。
上記のプロトコルのわずかな変更は、ビーズ生成、ビーズ品質および細胞生存を含む。 表1は、発生する可能性のある問題を理解し解決するためのトラブルシューティングガイドです。
| 問題 | 典型的な原因 | 推奨されるソリューション |
| インペラーは、アルギン酸塩または酸性油の添加中に回転を停止する | 適切な混合のために磁場が不十分であるか、またはインペラシャフトの位置がずれている | アルギン酸塩混合物を添加する前に、スピナーフラスコが磁気プレートの中心にくるようにし、最適な位置にプレートにテープで貼り付けます。非常に高い撹拌速度を試験し、次いでアルギン酸塩混合物を添加する前に所望の撹拌速度まで低下させる。 |
| 羽根車の軸が整列して安定していることを確認してください。ベルのためにlcoスピナーフラスコでは、スピンナーフラスコキャップの両側のボルトでインペラーがしっかりと固定されていることを確認してください。羽根車の動きが半径方向に制限されていることを確認します（羽根車が軸に揺動しないようにしてください）。 | ||
| ビーズは得られません | アルギン酸塩は不適切に乳化していた | 乳化中にアルギン酸微小液滴が目に見えることを確認する。そうでなければ、油相密度および容器形状23がこのプロトコルに記載されたものと同様であることを確認する。十分な局所エネルギー散逸をもたらさない高密度の油相または血管形状は、適切なアルギネート乳化を可能にしない。 |
| ビーズは得られません | 内部のゲル化は起こらなかった | 一般的なエラーは、油相における酢酸の不完全な溶解である。酸性油の混合物が十分にボルテックスされ、酢酸が観察されないことを確認する。チューブの底。 |
インペラがオイルに達していない場合、アルギン酸塩を添加する前に、より多くのオイルを添加することができる。しかしながら、酢酸の量は、以下の式に従って調整されるべきである：  どこで  1は、修飾前の油/水相比（例えば、10mLの油中の10.5mLのアルギン酸塩については0.525 + 10mLの酸性油）であり、 2はプロトコールの変更後の油/水相比であり、Dowは2相間の酢酸分配係数である。この分布係数は、実験的に測定することもできるし、文献から得た値で近似することもできる。例えば、ヘプタンと水46との間の酢酸の分配係数は0.011である。 | ||
| ビードなし得られた、またはビーズが機械的に不安定である | アルジネート溶液のゼロ剪断粘度は、0.004Pa・s未満または112Pa・s超である | アルギン酸塩ロットの高いバッチ間バラツキのため、アルギン酸塩溶液の異なる濃度の粘度を測定することが推奨されます。高粘度バッチと低粘度バッチとの組合せは、目標粘度に到達するために必要とされることがある。ここで使用した5％LVMおよびMVG混合物について、剪断粘度は3.3Pa・sであった。短すぎるグルロン酸ブロック長または短い全鎖長を有するアルギン酸塩はゲル形成を可能にしないことに留意すべきである。 |
| ビーズが大きすぎるか小さすぎます | 乳化中の撹拌速度は、使用されるアルギン酸塩の濃度または粘度に対して低すぎるかまたは高すぎる | 撹拌速度を増加させるかバッフルを追加することによって乱流を増加させると、ビーズサイズが減少する。アルギン酸塩濃度、温度容器およびインペラの幾何学的形状はすべて、得られたビードの大きさに影響を与える。 |
| 多くの壊れたビーズが観察される | 過酷なビード処理、内部ゲル化工程中の損傷、または不十分なビーズ強度。 | 一旦内部ゲル化が開始されると、ビーズに対する機械的損傷はビーズ破裂につながり得る。酸性化工程の直前に攪拌速度を下げ、ビーズが25mLのピペットまたは1000μLのピペットチップを使用して穏やかに取り扱われるようにします。慎重に取り扱ってもビーズが見え、酸性化中に攪拌が減った場合、ビーズの強度が不十分な場合があります。これは、不十分なグルロン酸含量または不完全なゲル化（例えば、不十分な酸性化）に起因し得る。 |
| 低細胞生存率 | 初期プロセスのpHが高すぎるか、または最終pHが低すぎる | 哺乳類の細胞プロセスの生存は、pH低下および酸性化時間を制限することによって増加させることができる |
| 小さなビーズでの低い細胞生存率 | 不十分なアルギン酸塩溶液緩衝能 | 小さなビーズでは、これらのビーズの表面/体積比が大きいため、大きなビーズよりも大きなpH低下が予想される。エマルジョンに添加された酢酸は限られているので、同じCaCO 3濃度のより小さいビーズでより高い酢酸濃度が予測される。アルギン酸塩溶液緩衝能を増加させること（例えば、10mM HEPESの代わりに60mM MOPSを用いる）は、より小さいビーズ32における細胞生存を増加させることができる32 。高い細胞損失を有する小さなビーズは、大きな容積損失を招くことなく、濾過または沈降によって選択的に除去することができた。 |
| 私CaCO 3の溶解が完了した | 不十分な酸性化または酸性化時間。ビーズの安定性が十分であれば、この問題は問題ではないことに注意してください。 | このプロトコル32に従うより大きなビーズでは、不完全なCaCO 3の溶解が観察されている32 。 CaCO 3の溶解の程度は、CaCO 3の粒径、プロセス中のpH降下、pH降下の持続時間、および使用されるアルギン酸塩の濃度に依存して変化し得る。この問題は、ビードの機械的安定性が所望の用途に十分である限り問題ではないと考えられる。ビード架橋を増加させるには、CaCO 3粒子が十分に小さい（〜2.5μm）ことを確認します。 CaCO 3懸濁液を超音波処理することは、凝集した結晶粒を破壊するのに役立つ可能性がある26 。非常に低いまたは高いアルギン酸塩濃度では、CaCO 3濃度の調節が必要とされ得る。最後に、低いキレート剤または溶液二価イオンのレベルは、ゲル中のCa 2+の徐々の消失をもたらす。ビーズの機械的安定性が徐々に低下する場合は、ビーズの保存または培養バッファーが2 mM以上のCa 2+を含むことを確認してください。 |
表1：トラブルシューティングガイド問題のリスト、考えられる原因および潜在的な解決策。
哺乳動物細胞のインビトロ培養および移植適用のための乳化および内部ゲル化プロセスの潜在的な限界は、（1）低pHへの一過性曝露の必要性、（2）残留油の除去の必要性、（3）多分散ビーズサイズ（4）アルギン酸塩液滴形成中の潜在的せん断応力、および（5）外部ゲル化ビーズ47と比較した、内部ゲル化ビーズのより高い多孔性。
MIN6およびβTC3の高い細胞生存および機能が得られているプロセス最適化後32 。しかしながら、このプロセスは、よりpH感受性の細胞には適していない可能性がある。ビーズからの油の完全除去は困難であり、最終的な臨床応用には食品医薬品局（FDA）で承認された油の種類が必要である。多分散性のビーズサイズ分布はまた、完全な細胞カプセル化および長期間の細胞生存が望ましい免疫隔離用途にはいくらか問題がある可能性がある。小さいビーズサイズは細胞突起48につながるが、大きなビーズは栄養素拡散および/または細胞機能を妨げる可能性がある35,49。一方、乳化プロセスは、単一のプロセスで小さなビーズおよび大きなビーズの両方を生成することによって、移植後の細胞生存に対するビーズサイズの影響を調べる興味深い機会を提供する。平均ビーズサイズは、攪拌速度durin乳化工程（ 図4 ）。最後に、内部ゲル化ビーズのより高い多孔性は、抗体およびサイトカインのような分子がビーズから除外されるべき免疫隔離にも有害であり得る。しかしながら、乳化プロセスはまた、非常に濃縮されたアルギネート溶液からのビーズ生成を可能にし、それによってアルギネートビーズの孔サイズを減少させる。
乳化および内部ゲル化プロセスは、細胞カプセル化を拡大したい、またはカプセル化装置へのアクセスがないことを望む研究室のためのノズルベースのカプセル化剤の興味深い代替物である。このプロセスは、非常に希薄または非常に濃縮されたアルギン酸溶液を用いてアルギン酸ビーズ中の細胞を固定する堅牢で単純な方法である。固定化された細胞を用いて行うことができるその後の実験のいくつかは、細胞運命の決定に対するアルギネートマトリックスの影響を決定すること、またはビーズがどの程度トランスファーd細胞および宿主免疫系に影響を及ぼす。乳化および内部ゲル化法は、一次島を大バッチでカプセル化するための新しいアプローチを提供する。この方法はまた、多孔度が低く、したがって封入された細胞への抗体接近を減少させた高濃度のアルギン酸ビーズにおける細胞封入を可能にする。したがって、乳化および内部ゲル化法は、臨床的に関連する量のカプセル化された治療用細胞を生成するための新しい手段を提供する。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
乳化プロセスに関する彼女の敷設作業と技術サポートのためのLauren Wilkinsonに感謝します。 IgorLaçik博士、Timothy J. Kieffer博士、James D. Johnson博士のご協力とご協力に感謝いたします。 DiabèteQuébec、JDRF、ThéCell、CQMF、自然科学および工学研究評議会（NSERC）、ヒト膵島移植センターおよびベータ細胞再生センター、カナダの幹細胞ネットワーク、健康研究のためのマイケルスミス財団、財政的支援のためのCOST 865、そして自然保護技術のための財団法人である。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and consumables | |||
| LVM alginate (transplantation-grade) | Novamatrix | Non-applicable | Referred to as "alginate #1" in the results. |
| MVG alginate (transplantation-grade) | Novamatrix | Non-applicable | Referred to as "alginate #2" in the results. |
| Alginate (cell culture-grade) | Sigma | A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity) | A2033 is referred to as "alginate #3" in the results. |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin | Thermo Fisher Scientific | SH3039603 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| HEPES, cell culture tested | Sigma | H4034-100G | |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | S271-1 | |
| Fine-grain CaCO3 | Avantor Materials | 1301-01 | After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month. |
| Light mineral oil | Thermo Fisher Scientific | O121-4 | Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use. |
| Glacial acetic acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | Handle with caution: refer to MSDS. |
| Sterile spatulas | Sigma | CLS3004-100EA | |
| Sterile nylon cell strainers, 40 µm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001 | |
| Pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Toluidine Blue-O | Sigma | T3260 | |
| Equipment | |||
| 100 mL microcarrier spinner flasks | Bellco | 1965-00100 | The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet. |
| Magnetic stir plate with adjustable speed | Bellco | 7760-06005 | The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use. |
| Cell counter | Innovatis | Cedex AS20 | This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer. |
| LED light box | Artograph | LightPad® PRO | This item can be replaced by other types of illuminators. |
| Handheld camera | Canon | PowerShot A590 IS | A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images. |
| Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters | Olympus | IX81 | Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives. |
| Image aquisition software | Molecular Devices | Metamorph | A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images. |
| Image analysis freeware | CellProfiler | Non-applicable | A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ). |
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