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Immunology and Infection

टी सेल Alloreactivity का मापन इमेजिंग फ्लो का उपयोग करना

Published: April 19, 2017 doi: 10.3791/55283
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 4
1Division of Respirology, Departments of Medicine and Immunology, Toronto Lung Transplant Program, Multiorgan Transplant Program, Toronto General Research Institute, University of Toronto and University Health Network, 2Latner Thoracic Surgery Laboratories, Toronto General Research Institute, University Health Network, 3National Institutes of Health Research, Oxford Biomedical Research Centre, Translational Immunology Laboratory, NDORMS, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, 4Transplantation Research Immunology Group, Nuffield Department of Surgical Sciences, John Radcliffe Hospital, University of Oxford

Summary

इस पत्र इमेजिंग फ्लो का उपयोग कर टी कोशिकाओं की एक मिश्रित आबादी में alloreactivity मापने के लिए एक विधि का वर्णन है।

Abstract

प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में दाता एंटीजन को प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रिया की माप सफल कमी या प्रतिरक्षादमन की वापसी के लिए महत्वपूर्ण होने की संभावना है। मिश्रित ल्युकोसैट प्रतिक्रिया (एमएलआर), सीमित कमजोर पड़ने assays, और ट्रांस-विवो विलंबित प्रकार अतिसंवेदनशीलता (डीटीएच) परख सब इस सवाल का लागू किया गया है, लेकिन इन तरीकों भविष्य कहनेवाला क्षमता और / या महत्वपूर्ण व्यावहारिक सीमाओं कि उनकी उपयोगिता को कम सीमित है। इमेजिंग फ्लो एक तकनीक है कि cytometry फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के इमेजिंग क्षमताओं के साथ प्रवाह की multiparametric मात्रात्मक शक्तियों को जोड़ती है। हमने हाल ही में एक इमेजिंग फ्लो दृष्टिकोण के उपयोग प्राप्तकर्ता टी कोशिकाओं दाता प्रतिजन-प्रस्तोता कोशिकाओं (APCs) के साथ परिपक्व प्रतिरक्षा synapses बनाने में सक्षम के अनुपात में परिभाषित करने के लिए बनाया है। एक अच्छी तरह से विशेषता माउस हृदय प्रत्यारोपण मॉडल का उपयोग करना, हम पता चला है कि टी एपीसी membr के बीच इन विट्रो प्रतिरक्षा synapses की आवृत्तिane संपर्क घटनाओं दृढ़ता से अस्वीकृति, सहिष्णुता में allograft परिणाम है, और एक स्थिति है जहाँ प्रत्यारोपण अस्तित्व प्रेरित विनियामक टी कोशिकाओं पर निर्भर करता है की भविष्यवाणी की। टी एपीसी संपर्कों की आवृत्ति तीव्र अस्वीकृति के दौरान चूहों से टी कोशिकाओं के साथ वृद्धि हुई है और alloantigen का जवाब नहीं देता गाया चूहों से टी कोशिकाओं के साथ की कमी हुई। इन विट्रो प्रणाली के लिए विनियामक टी कोशिकाओं के अलावा लंबे समय तक टी एपीसी संपर्क कम कर दिया। गंभीर, इस आशय भी विस्तार मानव polyclonally साथ देखा गया था स्वाभाविक रूप से विनियामक टी कोशिकाओं है, जो मानवीय माउस मॉडल में मानव ऊतकों की अस्वीकृति को नियंत्रित करने के लिए जाने जाते हैं होने वाली। इस दृष्टिकोण के आगे विकास के प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में alloreactive टी सेल डिब्बे की एक गहरी लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दे सकता है। भविष्य में, आगे के विकास और इस विधि मानव कोशिकाओं का उपयोग कर के मूल्यांकन प्रतिरक्षादमन न्यूनीकरण के लिए रोगियों का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता assays के लिए आधार के रूप में हो सकता है, और यह tolerogen के प्रभाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताआईसी क्लिनिक में उपचार।

Introduction

ठोस अंग प्रत्यारोपण गुर्दे, जिगर, हृदय और फेफड़ों के अंतिम चरण में रोगों के साथ रोगियों की देखभाल बदल गया है। बड़ी और छोटी उतक अनुरूपता एंटीजन में असमानताओं के कारण, तथापि, allografts तुरंत प्राप्तकर्ता टी कोशिकाओं द्वारा अस्वीकार किए जाते हैं, तो प्रतिरक्षा को दबाने वाली दवाओं का प्रयोग नहीं किया जाता है। ये एजेंट कैंसर और अंग में शिथिलता के लिए जोखिम सहित कई प्रतिकूल प्रभाव है। एक प्रमुख नैदानिक ​​लक्ष्य allograft अस्वीकृति को रोकने के लिए आवश्यक न्यूनतम स्तर तक प्रतिरक्षादमन की खुराक कम करने के लिए इसलिए है। इस स्तर पर सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के सक्रियण की डिग्री के आधार पर भिन्न होने की संभावना है; दाता प्राप्तकर्ता alloantigen बेमेल की डिग्री; और प्रतिरक्षा समारोह, फार्माकोकाइनेटिक्स और pharmacodynamics में अंतर-रोगी मतभेद।

दुर्भाग्य से, प्रत्यारोपण चिकित्सकों सही रूप में व्यक्तिगत रोगियों 1 में दाता प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए किसी भी उपकरण नहीं है। मिश्रितल्युकोसैट प्रतिक्रिया (एमएलआर) दाता प्रतिक्रियात्मकता का पता लगा सकते हैं, लेकिन यह मज़बूती से भ्रष्टाचार परिणाम 2, 3 की भविष्यवाणी करने में विफल रहता है। सीमित कमजोर पड़ने assays, साइटोकाइन ELISPOTs, और ट्रांस-विवो परख या तो प्रतिक्रियाओं की एक सीमित रेंज को मापने या व्यावहारिक परिचालन सहिष्णुता 9, 10, 11 से संबंधित 4, 5, 6, 7, 8 .Gene अभिव्यक्ति प्रोफाइल से पता चला है हस्ताक्षर नहीं कर रहे हैं, 12 और अस्वीकृति 13, 14, 15, लेकिन ये हमेशा आबादी 16 के पार generalizable नहीं हैं और अंत में अलग-अलग रोगियों में उपयोगिता सीमित हो सकता है। अनुक्रम आधारित analyपरिधीय रक्त 17 या proliferating में टी सेल रिसेप्टर (TCR) एमएलआर 18 में टी कोशिकाओं की की सत्र भी विकसित किया गया है, लेकिन आगे सत्यापन की आवश्यकता।

वैचारिक रूप से, यह एक परख है कि एक दाता प्रतिजन द्वारा प्राप्तकर्ता टी सेल सक्रियण में जल्द से जल्द आवश्यक चरणों का पता लगाता है के लिए वांछनीय होगा। दिनों में कोशिकाओं संवर्धन (एमएलआर के रूप में) कलाकृतियों लागू कर सकते हैं के बाद से, इस तरह के एक परीक्षण आदर्श रूप में इस तरह के प्रसार या प्रेरक क्रिया के रूप में नीचे की ओर की घटनाओं, के माप की आवश्यकता नहीं होगी। समान रूप से, तथापि, यह भी वांछनीय के लिए परीक्षण विशुद्ध रूप से वर्णनात्मक आकलन के बाद से टी सेल समारोह के कुछ तत्व पर निर्भर रहना, होगा (जैसे, TCR अनुक्रमण) anergic और कार्यात्मक टी कोशिकाओं के बीच भेद करने में असमर्थ हो सकता है।

कई अध्ययनों से संकेत दिया है कि लंबे समय तक टी एपीसी संपर्क एक प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन के गठन, जो एक आवश्यक पहला है के लिए आवश्यक हैटी सेल प्रतिक्रिया 19, 20, 21, 22 में कदम। हमने हाल ही में खबर दी है कि, इन विट्रो समय चूक इमेजिंग, के बारे में 5 में गतिशील दौरान - माउस का 10% सीडी 4+ टी कोशिकाओं अनुवांशिक रूप से भिन्न अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं (BMDCs) 23 के साथ लंबे समय से स्थायी संपर्क के रूप में। लंबे समय तक संपर्क की आवृत्ति कि जानवरों, एक भ्रष्टाचार को अस्वीकार कर दिया है, जबकि चूहों में पहले से ही एंटीजन को सहिष्णु गाया में वृद्धि की गई थी, यह untransplanted चूहों 23 में देखा स्तर पर बने रहे। लंबे समय तक बातचीत प्राप्तकर्ता Tregs की उपस्थिति में कम हो गई थी और उनकी अनुपस्थिति में वृद्धि हुई है, और हम मानव टी कोशिकाओं और अनुवांशिक रूप से भिन्न monocyte व्युत्पन्न डीसी (MoDCs) 23 का उपयोग करते हुए समान घटना मनाया।

हालांकि, लंबे समय तक संपर्क का गणन एक पॉलीक्लोनल टी सेल populatio के भीतर कियाn समय लेने वाली और श्रम प्रधान है। इसलिए हम प्रवाह cytometry इमेजिंग के उपयोग के अनुवांशिक रूप से भिन्न प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन गठन जांच करने के लिए बनाया है। इमेजिंग फ्लो cytometry प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के एकल सेल इमेजिंग क्षमताओं के साथ पारंपरिक प्रवाह की multiparametric डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण क्षमताओं को शामिल किया गया। इस तकनीक को अन्य जांचकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है मोनोक्लोनल टी कोशिकाओं 24, 26, 27 या 28 superantigens की उपस्थिति में प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन गठन का अध्ययन करने के। जैसे सेटिंग में, हालांकि, जवाब टी कोशिकाओं की आवृत्ति 30-100% से पर्वतमाला alloreactive टी कोशिकाओं आम तौर पर कुल टी सेल प्रदर्शनों की सूची 29, 30, 31, 32 के 5-15% का प्रतिनिधित्व करने का अनुमान है, जबकि। महत्वपूर्ण रूप से, हम पता चला है कि इमेजिंग फ्लो av उत्पादन कर सकते हैंery alloreactive टी सेल आवृत्ति 23 की और कहा कि एक पॉलीक्लोनल टी सेल आबादी के भीतर अन्तर्ग्रथन आवृत्ति में परिवर्तन भ्रष्टाचार परिणाम 23 की भविष्यवाणी कर रहे हैं तुलनीय उपाय। वर्तमान में, इस दृष्टिकोण सीडी 4+ टी कोशिकाओं के प्रत्यक्ष alloreactivity को मापने के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन, सिद्धांत रूप में, यह भी CD8 + टी कोशिकाओं और अप्रत्यक्ष मार्ग की जांच के लिए विकसित किया जा सकता। अप्रत्यक्ष alloreactivity लम्बे समय के बाद प्रत्यारोपण 33 पर तेजी से प्रासंगिक हो माना जाता है। वर्तमान में हम मानव कोशिकाओं है, जो रोगियों में परीक्षण के लिए अनुमति देगा का उपयोग करने के लिए इस विधि विकसित कर रहे हैं। इस प्रकार, भविष्य में, समग्र दृष्टिकोण प्रत्यारोपण से पहले प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में टी सेल प्रतिक्रियाओं के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए उपयोगी हो सकता है; तुरंत प्रत्यारोपण के बाद; और लंबी अवधि में, जब दवा न्यूनतम एक महत्वपूर्ण लक्ष्य बन जाता है।

Protocol

1. तैयार अभिकर्मकों और सामग्री की आवश्यकता

  1. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) युक्त 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) ( "धोने बफर") तैयार करें। 2% 0.1% गैर ईओण डिटर्जेंट युक्त FCS के साथ पीबीएस तैयार ( "पर्म धोने बफर", सामग्री की तालिका देखें)। 1.5% formaldehyde के साथ पीबीएस तैयार करें।
    नोट: चेतावनी! Formaldehyde संक्षारक और संभावित कैंसर है और जब तक उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  2. पीबीएस 2% एफबीएस और चुंबकीय सेल जुदाई ( "एमसीएस बफर") के लिए 0.5 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) युक्त तैयार करें।
  3. तैयार 50 माइक्रोग्राम डाइमिथाइल sulfoxide में / एमएल phalloidin-fluorescein आइसोथियोसाइनेट (Phalloidin-FITC) (DMSO)। एक 1 मिलीग्राम / एमएल परमाणु दाग तैयार (जैसे 1 मिलीग्राम / DMSO या बिस-benzimide डाई में एमएल 7-Aminoactinomycin (7-एएडी); सामग्री की तालिका देखें) DMSO में। ब्याज की कोशिकाओं के लिए उपयुक्त fluorochrome लेबल एंटीबॉडी तैयार करें औरइमेजिंग कोशिकामापी प्रवाह।
  4. टी कोशिकाओं और अनुवांशिक रूप से भिन्न जानवरों के ऊतकों (जैसे, तिल्ली और अस्थि मज्जा) के एक स्रोत के प्रतिजन-प्रस्तोता कोशिकाओं या पूर्वज के स्रोत के रूप के रूप में जानवरों के ऊतकों (जैसे, लिम्फ नोड्स और तिल्ली) प्राप्त करें।
  5. सेल संस्कृति मध्यम (जैसे, रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान मध्यम (RPMI) 1640 या Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% एफबीएस के साथ पूरक), 50 माइक्रोन 2-mercaptoethanol, पेनिसिलिन, और स्ट्रेप्टोमाइसिन तैयार करें और प्राप्त 24 और / या 96- अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों।

2. प्रतिजन-प्रस्तोता कोशिकाओं को तैयार

नोट: सिद्धांत रूप में, किसी भी एपीसी आबादी इस विधि के साथ जांच की जा सकती है। अपरिपक्व माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) के रूप में APCs इस मामले में मुकदमा दायर किया गया था। कई प्रोटोकॉल इन कोशिकाओं (उदाहरण के लिए, संदर्भ 34 और 35) पैदा करने के लिए मौजूद हैं। संक्षेप में, निम्नलिखित प्रोटोकॉल इस्तेमाल किया गया था।

  1. femurs और tibias आरपीएम में से फ्लश मज्जामैं 1640 या DMEM।
  2. हड्डी और मलबे के छोटे टुकड़े को दूर करने के एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से निलंबित कर दिया कोशिकाओं गुजरती हैं।
  3. centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं और फिर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक अमोनियम क्लोराइड बफर का उपयोग कर लाल कोशिकाओं lyse।
  4. centrifugation (400 XG, 5 मिनट) द्वारा गोली कोशिकाओं और सेल गोली resuspend।
  5. centrifugation (400 XG, 5 मिनट) द्वारा धोने बफर, गोली के 10 एमएल, और सेल गोली फिर से निलंबित - 5 में कोशिकाओं को धो लें।
  6. biotinylated विरोधी CD3 (5 माइक्रोग्राम / एमएल), विरोधी B220 (5 माइक्रोग्राम / एमएल), विरोधी MHC वर्ग द्वितीय (1 माइक्रोग्राम / एमएल), और विरोधी CD11b के साथ कोशिकाओं लेबल करके एक सेल जुदाई स्तंभ पर hematopoietic पूर्ववर्ती को बेहतर बनाने के (5 माइक्रोग्राम / एमएल) एंटीबॉडी।
  7. centrifugation (400 XG, 5 मिनट) द्वारा गोली कोशिकाओं और सेल गोली फिर से रोक देते हैं।
  8. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर विरोधी बायोटिन चुंबकीय microbeads (सामग्री की तालिका देखें) के साथ कोशिकाओं सेते हैं।
  9. धो लें और कोशिकाओं गोली (400 XG, 5 मिनट) और फिर से suspenउन्हें घ (एल एस) चुंबकीय सेल जुदाई स्तंभ एमसीएस बफर के 3 एमएल के साथ दुरुस्त और उसके चुंबक में रखा एक बड़ा सकारात्मक चयन का उपयोग कर लेबल कोशिकाओं को हटाने से पहले 1 एमसीएस की एमएल बफर में। एमसीएस बफर के 3 एमएल के साथ स्तंभ धो 3 बार; प्रवाह के माध्यम से वांछित कोशिकाओं शामिल होंगे।
  10. संस्कृति कोशिकाओं है कि 1640 RPMI या DMEM में 6 दिन के लिए स्तंभ के माध्यम से पारित 2 एनजी / एमएल पुनः संयोजक माउस granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) और 2 एनजी के साथ पूरक / पुनः संयोजक मानव रूपांतरित होने वृद्धि कारक β1 की एमएल (TGFβ1) । ताजा पूरा मध्यम 2 एनजी / एमएल जीएम-सीएसएफ और TGFβ1 युक्त साथ हर 2 दिनों आधा मध्यम बदलें।
    नोट: मानव TGFβ1 माउस कोशिकाओं में गतिविधि है। डाटा इन अपरिपक्व डीसी का उपयोग कर बनाई गईं। अन्य कोशिकाओं (जैसे, बी कोशिकाओं और परिपक्व डीसी) APCs के रूप में उपयुक्त हो सकता है, लेकिन इस परख में परीक्षण नहीं किया गया।
  11. 90% सीरम / 10% DMSO और तरल नाइट्रोजन में दुकान में डीसी cryopreserve; पर ठीक होउपयोग की दिन। का उपयोग करने से पहले, trypan नीले अपवर्जन का उपयोग कर एक hemocytometer में व्यवहार्य डीसी की संख्या की गणना। उचित घनत्व पर संवर्धन माध्यम में सेल गोली फिर से निलंबित (कदम 4.1 देखें) अनुभाग 4 में उपयोग करने से पहले।

3. टी कोशिकाओं की तैयारी

  1. नकारात्मक चयन के तरीकों का प्रयोग करें अनजाने कोशिकाओं को संचारण सक्रिय या निरोधात्मक संकेतों से बचने के लिए।
    नोट: इस उदाहरण में, सीडी 4+ टी कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए तैयार हैं।
    1. माउस तिल्ली से सीडी 4+ टी कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, एक 70 सुक्ष्ममापी सेल एक सिरिंज के सवार का उपयोग कर छन्नी के माध्यम से तिल्ली मैश। धोने बफर के साथ सेल छन्नी धो लें।
    2. centrifugation द्वारा निलंबित कर दिया कोशिकाओं (400 XG, 5 मिनट) गोली और फिर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक अमोनियम क्लोराइड बफर में गोली फिर से निलंबित करके लाल कोशिकाओं lyse।
    3. centrifugation (400 XG, 5 मिनट) द्वारा गोली कोशिकाओं और गोली फिर से रोक देते हैं।
    4. सेल धो5 में रों - centrifugation द्वारा धो बफर और गोली के 10 एमएल (400 XG, 5 मिनट)। गोली फिर से रोक देते हैं।
    5. CD8, प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल वर्ग द्वितीय (MHC द्वितीय, 1 माइक्रोग्राम / एमएल), और CD19 (5 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए biotinylated एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं दाग। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    6. centrifugation द्वारा धो बफर और गोली के 10 एमएल (400 XG, 5 मिनट) में कोशिकाओं को धो लें। गोली फिर से रोक देते हैं।
    7. विरोधी बायोटिन चुंबकीय microbeads (सामग्री की तालिका देखें) निर्माता के निर्देशों के अनुसार के साथ कोशिकाओं सेते हैं।
    8. centrifugation (400 XG, 5 मिनट) द्वारा धोने बफर और गोली के 10 एमएल में कोशिकाओं को धो लें; गोली फिर से रोक देते हैं।
    9. एमसीएस बफर के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने और एक चुंबकीय सेल जुदाई कॉलम 3 एमसीएस की एमएल एक चुंबक पर बफर के साथ दुरुस्त से अधिक सीडी 4+ टी कोशिकाओं को बेहतर बनाने के। एमसीएस बफर के 3 एमएल के साथ स्तंभ धो 3 बार। कॉलम फ्लो-थ्रू समृद्ध टी कोशिकाओं में शामिल होंगे।
  2. मानक प्रवाह cytome तककोशिश, नकारात्मक चयनित कोशिकाओं के एक विभाज्य का उपयोग कर टी सेल पवित्रता का आकलन। एक fluorochrome-streptavidin संयुग्म के उपयोग से हित टी सेल आबादी (इस मामले में सीडी 4) की पहचान करने और एंटीबॉडी या एंटीबॉडी (उस स्तंभ पर हटा दिया गया है चाहिए किसी भी बायोटिन लेबल कोशिकाओं की पहचान के लिए) कोशिकाओं दाग; ≥85% की एक पवित्रता स्वीकार्य 23 है।
    1. Trypan नीले अपवर्जन (≥90% व्यवहार्यता स्वीकार्य है) द्वारा एक hemocytometer में टी कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: एमसीएस बफर EDTA, जो पहले परख करने के लिए हटा दिया जाना चाहिए होता है। इसे पूरा करने के centrifugation (400 XG, 5 मिनट) द्वारा गोली कोशिकाओं और धोने बफर के 1 एमएल में धोएं। फिर कोशिकाओं गोली (400 XG, 5 मिनट) और उचित घनत्व पर संवर्धन माध्यम में फिर से निलंबित (कदम 4.1 देखें)।

4. सह सेते टी कोशिकाओं और डीसी

  1. बीज टी कोशिकाओं और डीसी में एक 2: 1 टी: एक 24 अच्छी तरह से या 96-अच्छी तरह सेल संस्कृति थाली में डीसी अनुपात। सुनिश्चित करें कि अंतिम संस्कृति मात्रा ≤500 या 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए μL 96-अच्छी तरह प्लेटें के लिए ≤50 μL है।
    नोट: छोटे संस्करणों सेल सेल बातचीत को प्रोत्साहित करने और बाद के निर्धारण बफर के लिए जगह की अनुमति है।
    1. अनुभव सटीक सेल नंबर समायोजित करें, लेकिन एक सामान्य गाइड के रूप में, 1 x 10 6 टी कोशिकाओं और अच्छी तरह से (96-अच्छी तरह प्लेट) प्रति 0.5 x 10 6 डीसी का उपयोग करें। ये कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या में माना जाना चाहिए क्योंकि कम कोशिकाओं के इस्तेमाल से मुश्किल प्रतिरक्षा synapses की गणना करता है।
      1. सेल नंबर बढ़ाने के लिए, दोहराने कुओं और पूल की स्थापना के बाद चरण 5 (निर्धारण)।
        नोट: जब दोहराने कुओं की स्थापना, यह और कुओं के सभी में तो बीज टी कोशिकाओं पहले कुओं के सभी में डीसी बीज की सलाह दी जाती है, इस कुओं के बीच ऊष्मायन समय में विसंगतियों को कम करता है।
  2. एक 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
e_title "> 5। प्लेट में कोशिकाओं को ठीक करें

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पीबीएस में 1.5% formaldehyde के 3 बार संस्कृति मात्रा जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं; टीटी उन्हें थाली से दूर करने सेल सेल बातचीत के कम से कम व्यवधान से पहले कोशिकाओं को ठीक करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. बाद में धोने और धुंधला के लिए नालियों में थाली में कोशिकाओं स्थानांतरण। इस स्तर पर, एकल दाग नियंत्रण के लिए अतिरिक्त सेल में अलग रख दें। इसके अलावा इन नियंत्रणों से, पूरी संस्कृति एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ दाग किया जाना चाहिए (कदम 4.1.1 देखें)।

6. दाग कोशिकाओं

  1. धोने कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए वांछित fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी का कॉकटेल युक्त बफर के 100 μL में दाग कोशिकाओं, प्रकाश से संरक्षित किया।
    ध्यान दें: कॉकटेल टी सेल विशिष्ट और एपीसी विशेष एंटीबॉडी भी शामिल है। Fluorochromes इस तरह से चुना जाना चाहिए कि वे इमेजिंग के विन्यास कोशिकामापी प्रवाह का उपयोग कर प्रतिष्ठित किया जा सकता। टी मेंवह यहाँ दिखाया गया है प्रयोगों, नीले फ्लोरोफोरे-संयुग्मित CD11b और एपीसी-संयुग्मित CD90.2 (5 माइक्रोग्राम / एमएल) का उपयोग किया गया (5 माइक्रोग्राम / एमएल, सामग्री की तालिका देखें)।
  2. कोशिकाओं जी 400 पर 5 मिनट के लिए धोने बफर और अपकेंद्रित्र के 1 एमएल में धो एक्स। सतह पर तैरनेवाला छानना। 0.05-0.5 माइक्रोग्राम / एमएल पर पर्म धोने phalloidin FITC युक्त बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने और कमरे के तापमान प्रकाश से संरक्षित पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: लगभग 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल की Phalloidin FITC सांद्रता माउस कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन उचित एकाग्रता आपूर्तिकर्ता, कोशिका प्रकार के हिसाब से बदलती है, और इमेजिंग कोशिकामापी प्रवाह की उम्मीद है।
  3. पर 400 x छ 5 मिनट के लिए पर्म / धोने बफर और अपकेंद्रित्र के 1 एमएल में कोशिकाओं को धो लें। सतह पर तैरनेवाला छानना। उचित एकाग्रता में परमाणु डाई (जैसे, लगभग 25 माइक्रोग्राम / एमएल 7-एएडी) युक्त पर्म / धोने बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने और कमरे के तापमान प्रकाश से संरक्षित पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. सेल धोपर 400 x छ 5 मिनट के लिए पर्म / धोने बफर और अपकेंद्रित्र के 1 एमएल में रों। सतह पर तैरनेवाला छानना। धोने बफर, गोली में एक बार कोशिकाओं को धो लें, और 50 में फिर से निलंबित - धोने बफर के 100 μL, छोटे, छाया हुआ microcentrifuge ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं के हस्तांतरण।
  5. तुरंत डाटा अधिग्रहण के लिए आगे बढ़ें या 4 डिग्री सेल्सियस प्रकाश से संरक्षित ऊपर कई दिनों के लिए इमेजिंग पर अधिग्रहण से पहले के लिए कोशिकामापी प्रवाह पर कोशिकाओं की दुकान।
    नोट: कोशिकाओं को सफलतापूर्वक से 7 दिनों के लिए इस तरह से संग्रहित किया गया है। लंबे समय तक भंडारण संभव हो सकता है, लेकिन परीक्षण नहीं किया गया।

7. मोल डाटा

  1. प्रारंभ और निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिकामापी इमेजिंग प्रवाह कॉन्फ़िगर करें। प्रवाह कोर की स्थिरता को सुनिश्चित किसी भी डेटा इकट्ठा करने से पहले।
  2. brightfield छवि अधिग्रहण के लिए एक चैनल सुरक्षित रखते हैं। एकल दाग नियंत्रण डेटा प्राप्त brightfield चैनल के साथ बंद कर दिया।
    1. "लोड" बटन और INSE क्लिक करेंएक ट्यूब एक पूरी तरह से रंगीन नमूने (एक नमूना है कि सभी आवश्यक fluorochromes के साथ दाग दिया गया है) होल्डर में युक्त आर टी।
    2. "कार्यस्थान" विंडो में, का चयन करें और जहां पहलू अनुपात करीब है क्षेत्र और फाटक singlets से अधिक पहलू अनुपात के साथ एक नया scatterplot बनाने 1. (क्षैतिज अक्ष में चैनल की तीव्रता) का इस्तेमाल किया प्रत्येक चैनल के लिए एक नया scatterplot बनाने के लिए ।
    3. प्रत्येक fluorochrome के लिए, सकारात्मक जनसंख्या की जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो, "रोशनी" बॉक्स में लेजर वोल्टेज समायोजित करें।
    4. ट्यूब अनलोड और पहली एकल से सना हुआ ट्यूब लोड।
    5. "अधिग्रहण सेटिंग्स" बॉक्स में, नमूना नाम टाइप करें और घटनाओं को एकत्र किया जाना चाहिए की संख्या निर्धारित; अगर यह एक भी दाग ​​(मुआवजा नियंत्रण के लिए) है, 1,000 - 2,000 घटनाओं पर्याप्त हैं।
    6. "चैनल" बॉक्स में, चैनलों कि प्रत्येक नमूने के साथ दाग कर दिया गया है का चयन करें। एकल दाग नियंत्रण के लिए, सभी चैनलों brightf साथ चयन किया जाना चाहिएield और पक्ष बिखराव बंद। "अधिग्रहण" बॉक्स के तहत "रिकॉर्ड" बटन पर क्लिक करें; जब घटनाओं की संख्या निर्दिष्ट सीमा तक पहुंच जाता अधिग्रहण स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा।
    7. ट्यूब अनलोड करने के लिए "द रिटर्न" बटन क्लिक करें। दोहराएँ 7.2.4 कदम - 7.2.6 प्रत्येक एकल दाग नियंत्रण के लिए। कोशिकामापी और सॉफ्टवेयर के आधार पर इसे फाटकों अधिग्रहण के दौरान चित्रा 1 में दिखाया गया के सभी स्थापित करने के लिए संभव नहीं हो सकता (और अधिक सटीक gating विश्लेषण के दौरान किया जाता है, धारा 8 देखें)।
  3. एकल से सना हुआ नमूने (कदम 7.2 में) के लिए के रूप में नमूने प्राप्त है, लेकिन "चैनल" बॉक्स में, सभी चैनलों कि आवश्यक हैं, brightfield चैनल सहित का चयन करें।
    1. डेटा रिकॉर्डिंग से पहले, पुष्टि करने के लिए है कि चैनल तीव्रता वांछित सेल आबादी की पहचान करने के लिए उपयुक्त है की जाँच करें। यदि नहीं, तो कदम 7.2 में वर्णित है, नई सेटिंग का उपयोग लेजर सेटिंग्स और फिर से रिकॉर्ड एकल दाग नियंत्रण समायोजित करें।
    2. प्रत्येक के लिएनमूना, कई घटनाओं की हजारों प्राप्त करते हैं।
      नोट: सबसे शर्तों के तहत, सेल सेल संपर्क घटनाओं कुल सेल नंबर (सबसे एकल कोशिकाओं कर रहे हैं) के एक छोटे से अल्पसंख्यक हैं। सामान्य तौर पर, यह अंतिम झिल्ली संपर्क गेट में कम से कम 100 घटनाओं के लिए वांछनीय है।

8. डेटा का विश्लेषण करें

  1. डेटा इमेजिंग प्रवाह निर्माता की वेबसाइट से मुक्त करने के लिए विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर उपलब्ध का उपयोग कर कोशिकामापी पर हासिल कर ली विश्लेषण (एक उपयोगकर्ता खाते बनाया जाना चाहिए; सामग्री की तालिका देखें)।

आकृति 1
चित्र 1 गेटिंग रणनीति Alloreactive इम्यून अन्तर्ग्रथन की पहचान करते थे। ए में फोकस घटनाओं जड़ के आधार पर सेल छवियों की समीक्षा करके सभी घटनाओं से गेटेड रहे brightfield चान का उपयोग कर छवि तीव्रता प्रोफ़ाइल (ढाल आरएमएस) के परिवर्तन की दर के वर्ग मतलबनेल (चैनल 4, Ch04), पाठ में वर्णित है। बी में फोकस घटनाओं के अलावा, दोहरी brightfield चैनल के लिए क्षेत्र बनाम पहलू अनुपात की साजिश रचने के द्वारा एकल कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जाता है। एकल कोशिकाओं, 1 की पहलू अनुपात के करीब क्लस्टर और जब दोहरी 0.5 के करीब हैं और एक बड़े क्षेत्र है एक छोटे क्षेत्र है कर रहे हैं। सी। एपीसी की प्रतिदीप्ति तीव्रता (इस मामले में, एक वृक्ष के समान सेल [डीसी] मार्कर, CD11c) तो टी सेल मार्कर की प्रतिदीप्ति तीव्रता (इस मामले में, CD90.2) के खिलाफ साजिश रची है, और डबल सकारात्मक घटनाओं गेटेड कर रहे हैं। गेट का सीमावर्ती सीमा के निकट घटनाओं की छवियों की समीक्षा करके परिष्कृत किया जा सकता। डी टी एपीसी दोहरी तो परिष्कृत कर रहे हैं ताकि वे एपीसी मार्कर (CD11c, CH02) के क्षेत्र बनाम पहलू अनुपात की साजिश रचने से केवल एक एपीसी होते हैं। ई ये एकल एपीसी दोहरी तो परिष्कृत कर रहे हैं ताकि वे क्षेत्र बनाम पहलू अनुपात की साजिश रचने से केवल एक टी सेल होते हैंटी सेल मार्कर की (CD90.2, Ch06)। एफ अंत में, केवल दो नाभिक युक्त घटनाओं परमाणु दाग चैनल (7-एएडी, Ch05) पर जगह गिनती का एक हिस्टोग्राम की साजिश रचने और घटनाओं है कि केवल 2 7-एएडी पॉजिटिव स्पॉट (यानी, नाभिक) होते हैं gating के द्वारा चुना जाता है। चित्रा 2 में वर्णित के रूप में इस गेट में घटनाओं, झिल्ली संपर्क और अन्तर्ग्रथन गठन के लिए विश्लेषण किया जाता है। डेटा उपचार काम के संबंध में एक अंधा फैशन में विश्लेषण किया है और एक पहले प्रकाशित प्रयोग 23 से कर रहे हैं कर रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ध्यान दें: gating रणनीति इस खंड में वर्णित है और चित्र 1 में दिखाया गया है। इमेजिंग प्रवाह cytometry डेटा के विश्लेषण से उपचार काम के संबंध में एक अंधा फैशन में किया जाना चाहिए। हालांकि हम प्रतिरक्षा synapses और गैर synapti कि विश्वास करते हैंग संपर्कों आम तौर पर आसानी से पहचाना जाता है (नीचे देखें और 2 आंकड़े और 3), चकाचौंध आत्मीयता छवि विश्लेषण के लिए निहित से उत्पन्न होने वाली पूर्वाग्रह कम करना चाहिए।

  1. मुआवजा जादूगर में एकल दाग नियंत्रण डेटा फ़ाइलों को लोड करके मुआवजा मैट्रिक्स उत्पन्न करें। एकल दाग फ़ाइलें लोड करने के बाद, फ्लोरोसेंट प्रयोग में उपयोग किए चैनलों का चयन।
    ध्यान दें: सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से एक मुआवजा मैट्रिक्स उत्पन्न करता है, लेकिन इस मैन्युअल रूप से यह सुनिश्चित करें कि सही सकारात्मक आबादी चयन किया गया था सत्यापित की जानी चाहिए।
    1. मैट्रिक्स में एक मूल्य पर डबल क्लिक करें और विश्लेषण क्षेत्र के लिए ग्राफ जोड़ें। एक नया द्वार बनाएं यदि कोई मृत कोशिकाओं / दोहरी / झूठे सकारात्मक बाहर करने के लिए आवश्यक; इस नए परिष्कृत सकारात्मक जनसंख्या प्रत्येक चैनल के लिए ड्रॉप डाउन मेनू में मैट्रिक्स बॉक्स में चुना जा सकता है।
    2. प्रत्येक चैनल के लिए इस दोहराएँ। compensatio को बचाने के लिए "समाप्त" पर क्लिक करेंn मैट्रिक्स (.ctm फ़ाइल)।
  2. विश्लेषण सॉफ्टवेयर में .rif फ़ाइल लोड करने और मुआवजा मैट्रिक्स लगाने से कच्चे फ़ाइल (.rif) से एक डेटा विश्लेषण फ़ाइल (.daf) प्राप्त करें।
  3. एक बार जब डेटा लोड किए गए हैं, टी सेल-एपीसी संपर्क घटनाओं की पहचान करने के gating प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: एक ठेठ gating रणनीति में फोकस ईवेंट की पहचान शामिल है, आकार मापदंड (बनाम घटना के पहलू अनुपात क्षेत्र), और के आधार पर दोहरी का चयन घटनाओं कि टी सेल के लिए डबल सकारात्मक रहे हैं के रूप में टी सेल-एपीसी दोहरी का चयन और एपीसी मार्कर (चित्रा 1 ए-सी)।
    नोट: पहलू अनुपात उसकी ऊंचाई करने के लिए एक घटना है, जो एकल कोशिकाओं के भेदभाव दोहरी से (1 करने के लिए अनुपात करीब) (0.5 करने के लिए अनुपात करीब) की अनुमति देता है की चौड़ाई का अनुपात है।
  4. साजिश रचने जड़ इमेजिंग तीव्रता प्रोफ़ाइल (ढाल आरएमएस) brightfield चैनल (चित्रा 1 ए) में परिवर्तन की दर के वर्ग मतलब द्वारा में फोकस घटनाओं को पहचानें। वें पर क्लिक करेंई ढाल आरएमएस हिस्टोग्राम व्यक्ति डिब्बे में सेल की घटनाओं को प्रदर्शित करने के लिए और फिर एक गेट के बाहर के फोकस घटनाओं को छोड़कर जगह।
  5. बनाम brightfield चैनल के पहलू अनुपात क्षेत्र प्लॉट और एक गेट है कि घटना आकृति और आकार (चित्रा 1 बी) के आधार पर दोहरी पहचान करता है आकर्षित। बस के अंदर और इस गेट की सीमा के बाहर की घटनाओं के चित्रों के लिए समीक्षा गेट के आकार और स्थिति को परिष्कृत करने के विश्लेषक कर सकते हैं। फिर, इन नक़ल किसी घटना के समय टी सेल मार्कर की तीव्रता एक धुरी पर दिखाई देता है और एपीसी मार्कर की तीव्रता अन्य पर प्रकट होता है की एक साजिश का निर्माण। एक टी एपीसी नक़ल दोनों मार्करों के लिए सकारात्मक घटनाओं से युक्त फाटक ड्रा।
  6. टी सेल-एपीसी नक़ल घटनाओं, चयन की घटनाओं है कि केवल एक टी सेल और एक एपीसी शामिल हुए।
    1. एपीसी मार्कर के लिए क्षेत्र बनाम पहलू अनुपात की साजिश रचने के द्वारा और एक एकल एपीसी (चित्रा 1 डी) युक्त दोहरी पर gating ऐसा करें। टी सेल निशान के लिए क्षेत्र बनाम पहलू अनुपात प्लॉटएर और एक भी टी सेल (चित्रा 1E) युक्त दोहरी पर गेट।
      नोट: अगले परिष्करण के रूप में केवल दो स्थानों (चित्रा 1F) के साथ घटनाओं पर परमाणु दाग प्रतिदीप्ति और gating के लिए लागू स्थान गिनती समारोह का हिस्टोग्राम की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
  7. कुछ मामलों में, एक नक़ल के भीतर दो कोशिकाओं के संपर्क में नहीं होगा; एक-दूसरे के साथ संपर्क में कोशिकाओं की पहचान APCs और टी कोशिकाओं के लिए वस्तु मास्क परिभाषित करने के लिए।
    1. मास्क प्रबंधक खोलने और एक नया मुखौटा परिभाषित करने के लिए विश्लेषण मेनू में "मास्क" विकल्प का उपयोग। जैसे कोई नाम लिखें, "टी सेल वस्तु मुखौटा।" "फंक्शन" बटन क्लिक करें और संवाद बॉक्स में, चुनें "ऑब्जेक्ट।"
    2. चैनल, जिसमें टी सेल मार्कर का पता चला है (जैसे, Ch06) का चयन करें। ओके पर क्लिक करें।"
      नोट: "ऑब्जेक्ट (M06, Ch06, तंग)" समारोह बॉक्स में प्रदर्शित होता है। यह डिफ़ॉल्ट वस्तु मुखौटा आमतौर पर worअच्छी तरह से ks लेकिन अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती।
    3. उचित चैनल में एक एपीसी वस्तु मुखौटा बनाने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  8. एपीसी और टी सेल मास्क पहचान करने के बाद, टी सेल वस्तु नकाब में एपीसी प्रतिदीप्ति तीव्रता के खिलाफ एपीसी वस्तु नकाब में टी सेल मार्कर प्रतिदीप्ति तीव्रता की साजिश रचने से झिल्ली संपर्क निर्धारण करते हैं। इस भूखंड पर, एक गेट ही एक-दूसरे के साथ संपर्क में कोशिकाओं शामिल है कि आकर्षित।
    नोट: आमतौर पर, काफी स्पष्ट डबल सकारात्मक और डबल नकारात्मक आबादी (चित्रा 2A) कर रहे हैं। डबल सकारात्मक और डबल नकारात्मक आबादी के बीच की सीमा सीमा क्षेत्र में कोशिकाओं की brightfield छवियों की समीक्षा करने के लिए सुनिश्चित करें कि संपर्क में कोशिकाओं गेट के भीतर और कहा कि संपर्क में नहीं कोशिकाओं बाहर रखा गया है द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
  9. इस स्तर पर, मैन्युअल रूप से इस गेट के भीतर घटनाओं के phalloidin FITC छवियों की समीक्षा सरल सेल सेल संपर्क में आने से परिपक्व प्रतिरक्षा synapses भेद करने के लिए। यू"टैग छवियों" समारोह इन छवियों को चिह्नित करने के लिए एसई।
    नोट: टैग किया घटनाओं (प्रतिरक्षा synapses) इस गेट के अंदर का प्रतिशत टी सेल आबादी में प्रत्यक्ष alloreactivity के एक सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता का अध्ययन किया जा रहा है।

Representative Results

इस विधि Heterotopic हृदय allograft प्रत्यारोपण से पहले दाता alloantigens सहिष्णु गाया चूहों में सीडी 4+ टी सेल alloreactivity जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। CBA चूहों (एच -2 के) (एच -2 बी बी -6) एक बी -6 हृदय प्रत्यारोपण प्राप्त करने से पहले रक्त एक गैर घट सीडी 4 एंटीबॉडी एक महीने के साथ संयुक्त आधान एक tolerizing एक दाता विशेष से मिलकर प्रोटोकॉल दिए गए थे। लंबी अवधि के allograft अस्तित्व कि Foxp3 + विनियामक टी कोशिकाओं 36, 37 पर निर्भर है में यह प्रोटोकॉल का परिणाम है। सात दिन के बाद प्रत्यारोपण, प्लीहा सीडी 4+ टी कोशिकाओं tolerized और बी -6 हृदय allografts के गैर tolerized प्राप्तकर्ताओं और सह इनक्यूबेट इस प्रोटोकॉल के अनुसार बी -6 अस्थि मज्जा व्युत्पन्न डीसी के साथ थे से प्राप्त किया गया। चित्र 2 इस प्रयोग से प्रतिनिधि डेटा दिखाता है। झिल्ली संपर्क गेट चित्र 2 में दिखाया गया हैएक, हरे रंग की क्रॉसहेयर एक synaptic घटना पर रखा के साथ (बाएं पैनल, 1) और (सही पैनल) एक गैर अन्तर्ग्रथनी घटना पर। चित्रा 2 बी इस घटना के लिए brightfield और प्रतिदीप्ति चैनलों को दर्शाता है। पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, डेटा एक पर्यवेक्षक उपचार काम 23 को अंधा द्वारा विश्लेषण किया गया। 3 चित्र में कई उदाहरण में दिखाया गया है, दोनों से गैर tolerized (चित्रा 3 ए-बी) और tolerized (चित्रा -3 सी-डी) बी -6 दिलों की CBA प्राप्तकर्ताओं, synapses गैर अन्तर्ग्रथनी टी एपीसी इंटरफेस पर एक घने FITC पॉजिटिव रिज की उपस्थिति से संपर्कों से आसानी से बिल्कुल अलग है। इन परिणामों कि प्रतिरक्षा प्राप्तकर्ता टी कोशिकाओं द्वारा किए गए synapses के दृश्य का पता लगाने के प्राप्तकर्ता में alloreactivity की डिग्री के साथ पटरियों को दिखाते हैं।

चित्र 2
चित्रा 2. झिल्ली के साथ टी एपीसी दोहरी की पहचानसंपर्क और इम्यून अन्तर्ग्रथन गठन। अंतिम नक़ल गेट (चित्रा 1F) में घटनाक्रम का विश्लेषण किया जाता है। ए एपीसी वस्तु नकाब में टी सेल मार्कर प्रतिदीप्ति डीसी वस्तु नकाब में एपीसी मार्कर प्रतिदीप्ति के खिलाफ साजिश रची है। कुछ नक़ल घटनाओं सेल सेल संपर्क के बिना एक एपीसी और एक टी सेल है और साजिश के निचले बाएँ कोने में दिखाई देते हैं (चित्र नहीं दिखाया गया है)। एक झिल्ली संपर्क गेट इस प्रकार तैयार किया जा सकता केवल दोहरी जिसमें टी कोशिकाओं और APCs संपर्क में हैं शामिल हैं। इस द्वार में प्रत्येक घटना की छवियाँ phalloidin-FITC चैनल में actin cytoskeletal पुनर्व्यवस्था के सबूत के लिए समीक्षा की जाती है और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर टैग किया जा सकता। जबकि सही पैनल प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन गठन के बिना एक झिल्ली संपर्क घटना को इंगित करता है बाएं पैनल, एक प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन घटना (लेबल 1 और हरे रंग की क्रॉसहेयर द्वारा इंगित) इंगित करता है (लेबल 2 और हरे रंग की क्रॉसहेयर द्वारा इंगित)। अन्तर्ग्रथन गठन के निर्धारण इनमें से मैन्युअल समीक्षा आवश्यक हैछवियों, बी बी में दिखाया गया है शीर्ष पंक्ति brightfield और प्रतिदीप्ति चैनल छवियों एक प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन के साथ एक नक़ल के लिए (ए में घटना 1 से मेल खाती है) पता चलता है; निचली पंक्ति झिल्ली संपर्क लेकिन कमी अन्तर्ग्रथन गठन (ए में घटना 2 से मेल खाती है) के साथ एक नक़ल को दर्शाता है। डेटा उपचार काम के संबंध में एक अंधा फैशन में विश्लेषण किया है और एक पहले प्रकाशित प्रयोग 23 से कर रहे हैं कर रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. टी एपीसी अन्तर्ग्रथन गठन के उदाहरण। CBA चूहों या तो कोई पूर्व उपचार (एबी) के बाद या एक गैर घट विरोधी सीडी 4 एंटीबॉडी की आड़ में बी -6 पूरे रक्त के साथ सहिष्णुता प्रेरण के बाद (बी -6 दाताओं से हृदय allografts प्राप्त रोंग> सीडी)। 7 दिनों के बाद, प्लीहा सीडी 4+ टी कोशिकाओं बी -6 डीसी के साथ अन्तर्ग्रथन गठन के लिए परीक्षण किया गया। ए एक गैर tolerized जानवर से झिल्ली संपर्क के साथ गैर अन्तर्ग्रथनी दोहरी के तीन उदाहरण हैं। बी एक गैर tolerized पशु से प्रतिरक्षा synapses के तीन उदाहरण हैं। सी एक tolerized जानवर से झिल्ली संपर्क के साथ गैर अन्तर्ग्रथनी दोहरी के तीन उदाहरण हैं। डी एक tolerized पशु से प्रतिरक्षा synapses के तीन उदाहरण हैं। अन्तर्ग्रथन गठन टी एपीसी इंटरफेस (Ch03) पर एक उज्ज्वल, FITC पॉजिटिव रिज की उपस्थिति ने संकेत दिया है। डेटा उपचार काम के संबंध में एक अंधा फैशन में विश्लेषण किया है और एक पहले प्रकाशित प्रयोग 23 से कर रहे हैं कर रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ays "> एंटीबॉडी / डाई fluorochrome चैनल एकाग्रता CD11c eF450 CH02 5 माइक्रोग्राम / एमएल, मूल रूप अनुमापन CD90.2 एपीसी Ch06 5 माइक्रोग्राम / एमएल, मूल रूप अनुमापन phalloidin FITC Ch03 0.05 - 0.5 ग्राम / एमएल 7-एएडी - Ch05 25 माइक्रोग्राम / एमएल

तालिका 1. एंटीबॉडी और रंगों इस अध्ययन में इस्तेमाल। Fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी, रंग, आपूर्तिकर्ताओं, और सिफारिश की सांद्रता तालिका में प्रस्तुत कर रहे हैं। चैनल कोशिकामापी इमेजिंग प्रवाह कि प्रत्येक fluorochrome पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था तालिका में दिखाया गया है।

Discussion

इमेजिंग फ्लो मोनोक्लोनल टी कोशिकाओं और APCs के बीच या superantigens 24, 25, 26, 27, 28 की उपस्थिति में प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन गठन प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस विधि तथ्य यह है कि एक उत्पादक टी सेल-एपीसी संपर्क के बाद, टी सेल अपने actin cytoskeleton rearranges, संपर्क 21 के स्थल की ओर ध्रुवीकरण का लाभ लेता है। यह पुनर्व्यवस्था TCR संकेत के बिना नहीं होती है, और इसलिए यह टी सेल सक्रियण 19, 20, 21 का एक प्रारंभिक सहसंबंधी है। यहाँ प्रस्तुत विधि पॉलीक्लोनल टी सेल आबादी में alloreactive टी सेल आवृत्ति की माप के लिए इस दृष्टिकोण adapts। इस प्रकार, यह भविष्य में दाता reactivi के लिए assays के विकास के लिए आधार के रूप में सेवा कर सकता है नैदानिक ​​प्रत्यारोपण में Ty।

हालांकि सीधे तुलना अभी तक नहीं बनाया गया है, alloreactive प्रतिरक्षा synapses का पता लगाने के पारंपरिक एमएलआर की तुलना में बेहतर भविष्यवाणी करने की शक्ति प्रतीत होता है। उदाहरण के लिए, पिछले काम, पता चला है कि में tolerizing प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित है, एक एमएलआर के परिणामों मज़बूती से भ्रष्टाचार परिणाम 2 के साथ संबंध स्थापित करने के लिए असफल।

Assays के एक नंबर, मनुष्य 9, 10, 11 में प्रचालन सहिष्णु राज्य के लिए विकसित किया गया है, हालांकि इन alloantigen के जवाब में प्रेरक सेल की कार्यक्षमता की माप नहीं है। इसके विपरीत, IFNγ ELISPOT 8 उपाय प्रेरक टी सेल समारोह assays लेकिन इस तरह के आईएल 17 38 के रूप में साइटोकाइन स्राव के पूरे स्पेक्ट्रम कि तीव्र और जीर्ण allograft अस्वीकृति के लिए प्रासंगिक हो सकता है, पर कब्जा नहीं कर सकते हैं,> 39। सीमित कमजोर पड़ने परख 4, जो श्रम गहन है, और ट्रांस विवो परख 6, जो चूहों की आवश्यकता है, महत्वपूर्ण व्यावहारिक सीमाओं कि एक नैदानिक सेटिंग में अपने आवेदन में बाधा आएगी है। एमएलआर में जवाब टी कोशिकाओं की TCR अनुक्रम विश्लेषण का उपयोग proliferating कोशिकाओं के विश्लेषण पर हाल ही के सुधार मूल्य का हो सकता है लेकिन यहां प्रस्तुत परख की तरह, नैदानिक अध्ययन 18 में आगे सत्यापन की आवश्यकता होगी, 40।

प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन का पता लगाने परख के आगे विकास की आवश्यकता होगी कि महत्वपूर्ण सवाल का जवाब दिया जा। सबसे पहले, परख के रूप में विकसित केवल प्रत्यक्ष alloreactivity को मापता है। प्रत्यक्ष मार्ग दाता व्युत्पन्न APCs पर अनुवांशिक रूप से भिन्न एमएचसी / पेप्टाइड परिसरों की प्रस्तुति शामिल है। बाद आम तौर पर जल्दी से प्रत्यारोपण के बाद समाप्त हो जाते हैं, और आगे alloantigen प्रस्तुति carri हैबरकरार दाता एमएचसी (अर्द्ध सीधा मार्ग) पेश प्राप्तकर्ता APCs या स्वयं एमएचसी (अप्रत्यक्ष मार्ग) पर कार्रवाई की दाता एंटीजन से बाहर एड। अप्रत्यक्ष मार्ग पुरानी allograft अस्वीकृति 33, 41 का एक महत्वपूर्ण ड्राइवर है।

सिद्धांत रूप में, यह इस परख का उपयोग कर अप्रत्यक्ष प्रतिरक्षा synapses पता लगाने के लिए संभव होना चाहिए, लेकिन परोक्ष रूप से alloreactive टी कोशिकाओं प्रत्यक्ष वाले 42, 43 की तुलना में काफी कम आवृत्ति है, जिसका अर्थ है कि घटनाओं की एक बड़ी संख्या के विश्लेषण की आवश्यकता होगी। एक दूसरा विचार यह है कि हम केवल सीडी 4+ टी कोशिकाओं का उपयोग कर, जबकि सीडी 8+ टी कोशिकाओं में भी विरोधी दाता प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक हैं इस परख का परीक्षण किया है है। फिर, यह इस पद्धति का उपयोग सीडी 8+ टी सेल एपीसी synapses पता लगाने के लिए संभव हो जाना चाहिए। एक और सीमा यह है कि विधि अंतिम memb में मैन्युअल समीक्षा और सेल छवियों के विश्लेषण की आवश्यकता हैराणे संपर्क फाटक, और हम वर्तमान में इस कदम के स्वचालन पर काम कर रहे हैं।

अंत में, विधि मानव विषयों में परीक्षण और विकास की आवश्यकता है, और मानव नमूनों के साथ प्रारंभिक पढ़ाई वर्तमान में किया जा रहा है। प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में प्रतिरक्षा synapses का पता लगाने के साथ आगे प्ररूपी टी सेल सबसेट विश्लेषण (यानी, प्रेरक, स्मृति, नियामक, आदि) संयोजन में alloreactive टी सेल प्रदर्शनों की सूची की विशेषताओं के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं और के लिए एक महत्वपूर्ण ध्यान केंद्रित किया जाएगा भविष्य का कार्य।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

SCJ दिल के लिए एक इंटरनेशनल सोसायटी और फेफड़ों प्रत्यारोपण रिसर्च फेलोशिप और चिकित्सकों की एक रॉयल कॉलेज और कनाडा Detweiler Fellowship.SM यात्रा के सर्जन द्वारा समर्थित किया गया हृदय और फेफड़ों प्रत्यारोपण कैरियर के विकास के पुरस्कार (SCJ करने के लिए) के लिए एक इंटरनेशनल सोसायटी द्वारा भाग में समर्थित किया गया। एसएस स्वास्थ्य अनुसंधान ऑक्सफोर्ड जैव चिकित्सा अनुसंधान Centre.JH के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया एक गुर्दा रिसर्च यूके वरिष्ठ गैर क्लीनिकल फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है। एक वेलकम ट्रस्ट कार्यक्रम अनुदान (082519Z07Z), एक ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन कार्यक्रम अनुदान (पीजी / 10 / ६२.२८,५०४), और यूरोपीय संघ फ्रेमवर्क कार्यक्रम 7 (; BioDRIM एक अध्ययन): यह काम एबी और किलोवाट के लिए निम्न अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखकों ImageStream मार्क X साधन के साथ करने के लिए उपयोग और समर्थन प्रदान करने के लिए माइकल पार्सन्स और Lunenfeld-Tanenbaum रिसर्च इंस्टीट्यूट में फ्लो Cytometry कोर सुविधा, सिनाई स्वास्थ्य प्रणाली, टोरंटो का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline Various Varies
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5 M solution Thermo Fisher Scientific AM9260G
Triton X-100 nonionic detergent Sigma-Aldrich X100
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution
Cell strainers, 70 μm pore size Fisher Scientific 08-771-2
Phalloidin-fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich P5282
7-aminoactinomycin D Thermo Fisher Scientific A1310 Reconstitute in DMSO
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2 eBioscience 17-0902
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11b eBioscience 48-0112 Pacific blue has been replaced by eFluor 450
Biotinylated anti-mouse CD3 eBioscience 13-0032
Biotinylated anti-mouse MHC class II eBioscience 13-5321
Biotinylated anti-mouse B220 eBioscience 13-0452
Biotinylated anti-mouse CD8 eBioscience 13-0081
Biotinylated anti-mouse CD19 eBioscience 13-0193
Anti-biotin microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MidiMACS magnetic cell separator MIltenyi Biotec 130-042-302
recombinant mouse GM-CSF Peprotech 315-03
recombinant human TGFβ1 Peprotech 100-21 Human TGFβ1 has activity on mouse cells
Amnis ImageStream X Mark II Amnis/EMD Millipore N/A Imaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/
IDEAS Software Amnis/EMD Millipore N/A Free download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Cell culture medium  Various Varies
Fetal bovine serum Various Varies
Cell culture plates Various Varies

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References

  1. Cravedi, P., Heeger, P. S. Immunologic monitoring in transplantation revisited. Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).
  2. Pearson, T. C., et al. The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model. Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).
  3. Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity. Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).
  4. Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation. Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).
  5. Roelen, D. L., et al. Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation. Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).
  6. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).
  7. Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates. J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).
  8. Zitzner, J. R., Tambur, A. R. Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation. Cells. 1 (2), 100-110 (2012).
  9. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  10. Brouard, S., et al. Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).
  11. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  12. Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples. Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).
  13. Li, L., et al. Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection. PLoS One. 8 (12), e82153 (2013).
  14. Khatri, P., et al. A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation. J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).
  15. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  16. Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).
  17. Miqueu, P., et al. Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients. Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).
  18. Morris, H., et al. Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients. Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210 (2015).
  19. Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).
  20. Goldsmith, M. A., Weiss, A. Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation. Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).
  21. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  22. Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
  23. Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection. Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).
  24. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).
  25. Burbach, B. J., et al. Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP. J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).
  26. Markey, K. A., et al. Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen. J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).
  27. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
  28. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  29. Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex. J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).
  30. Macedo, C., et al. Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response. Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).
  31. Noorchashm, H., et al. A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency. Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).
  32. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
  33. Lee, R. S., et al. Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).
  34. Pickl, W. F., et al. Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes. J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).
  35. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  36. Francis, R. S., et al. Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells. Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).
  37. Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).
  38. Faust, S. M., et al. Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection. J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).
  39. Yuan, X., et al. A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy. J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).
  40. Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture. PLoS One. 9 (11), e111943 (2014).
  41. Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis. Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).
  42. Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice. J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).
  43. Liu, Z., et al. Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity. J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).

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इम्यूनोलॉजी अंक 122 प्रत्यारोपण प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन इमेजिंग फ्लो सहिष्णुता allograft अस्वीकृति टी सेल प्रतिजन-प्रस्तोता सेल वृक्ष के समान सेल
टी सेल Alloreactivity का मापन इमेजिंग फ्लो का उपयोग करना
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Juvet, S. C., Moshkelgosha, S.,… More

Juvet, S. C., Moshkelgosha, S., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (122), e55283, doi:10.3791/55283 (2017).

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