Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Mätning av T-cell alloreaktivitet Använda Imaging Flow Cytometry

doi: 10.3791/55283 Published: April 19, 2017

Summary

Detta dokument beskriver ett förfarande för mätning alloreaktivitet i en blandad population av T-celler med användning av avbildning flödescytometri.

Abstract

Mätningen av immunologiska reaktivitet mot donatorantigener i transplanterade patienter kommer sannolikt att vara avgörande för en framgångsrik minskning eller indragning av immunosuppression. Den blandade leukocytreaktion (MLR), begränsande spädningsanalyser, och trans-vivo fördröjd överkänslighet (DTH) assay alla har tillämpats på denna fråga, men dessa metoder har begränsad prediktiv förmåga och / eller betydande praktiska begränsningar som minskar deras användbarhet. Imaging flödescytometri är en teknik som kombinerar de multiparametrisk kvantitativa befogenheter flödescytometri med avbildningsfunktioner av fluorescensmikroskopi. Vi nyligen använt sig av en avbildnings flödescytometri tillvägagångssätt för att definiera andelen mottagande T-celler med förmåga att bilda mogna immun synapser med donatorantigenpresenterande celler (APC). Med användning av en väl karakteriserad mus hjärttransplantat-modellen, har vi visat att frekvensen av in vitro immun synapser bland T-APC Membrane kontakthändelser förutspådde kraftigt allograft utfall avslag, tolerans och en situation där transplantation överlevnad är beroende av inducerade regulatoriska T-celler. Frekvensen av T-APC kontakter ökade med T-celler från möss under akut avstötning och minskas med T-celler från möss utförda svarar mot alloantigen. Tillsatsen av regulatoriska T-celler i systemet in vitro minskas förlängda T-APC kontakter. Kritiskt, var denna effekt ses också med humant polyklonalt expanderad, naturligt förekommande regulatoriska T-celler, vilka är kända för att kontrollera avstötning av mänskliga vävnader i humaniserade musmodeller. Vidareutveckling av denna metod kan möjliggöra en djupare karakterisering av alloreaktiva T-cellavdelningen i transplantatmottagare. I framtiden kan ytterligare utveckling och utvärdering av denna metod använder mänskliga celler utgör grunden för analyser används för att välja patienter för immunosuppression minimering, och det kan användas för att mäta effekterna av tolerogenic terapier i kliniken.

Introduction

Solid organtransplantation har förändrat vården av patienter med gravt sjukdomar i njure, lever, hjärta och lungor. På grund av skillnader i större och mindre histokompatibilitetsantigener dock allografter omgående avvisas av mottagande T-celler om immunosuppressiva läkemedel inte används. Dessa medel har många negativa effekter, inklusive risken för cancer och organdysfunktion. En stor klinisk mål är därför att minska dosen av immunosuppression till den miniminivå som krävs för att förhindra allograftavstötning. Denna nivå kommer sannolikt att variera beroende på graden av aktivering av det medfödda immunsystemet; graden av givare och mottagare alloantigen mismatch; och mellan patienter skillnader i immunförsvar, farmakokinetik och farmakodynamik.

Tyvärr har transplantations kliniker inte har några verktyg för att noggrant utvärdera donator reaktivitet i enskilda patienter 1. den blandadeleukocytreaktion (MLR) kan detektera donator reaktivitet, men den misslyckas med att tillförlitligt förutsäga transplantat utfall 2, 3. Begränsande utspädningsanalyser, cytokinreceptorer ELISPOTs och det trans vivo analys antingen mäta ett begränsat område av svar eller är inte praktiskt 4, 5, 6, 7, 8 .Gene uttryck profiler har avslöjat signaturer relaterade till operativ tolerans 9, 10, 11, 12 och avvisande 13, 14, 15, men dessa är inte alltid generaliserbart över populationer 16 och kan i slutänden har begränsad användbarhet i enskilda patienter. Sekvensbaserad Analyses av T-cellreceptor (TCR) av T-celler i det perifera blodet 17 eller prolifererande i MLR 18 har också utvecklats, men kräver ytterligare validering.

Begreppsmässigt skulle det vara önskvärt att ha en analys som detekterar de tidigaste nödvändiga stegen i mottagaren T-cellaktivering av ett donatorantigen. Eftersom odling av celler över dagar (som i MLR) kan introducera artefakter, skulle ett sådant test idealt inte kräva mätning av nedströms händelser, såsom proliferation eller effektorfunktion. Lika, skulle det emellertid också vara önskvärt för testet att vara beroende av någon form av T-cellfunktion, eftersom rent beskrivande bedömningar (T ex TCR sekvense) kan vara oförmögen att skilja mellan anerga och funktionella T-celler.

Talrika studier har visat att långvarig T-APC kontakt krävs för bildandet av ett immun synaps, vilket är ett nödvändigt förstasteg i T-cellsvaret 19, 20, 21, 22. Vi rapporterade nyligen att, under dynamisk i tidsförloppet vitro avbildning, cirka 5 - 10% av mus-CD4 + T-celler bildar långvariga kontakter med allogen benmärgshärledda dendritiska celler (BMDCs) 23. Frekvensen av långvarig kontakt ökades i djur som avvisade en graft, medan i möss som tidigare göres toleranta mot samma antigener, förblev det vid nivåer som ses i untransplanted möss 23. Långvarig interaktioner reducerades i närvaro av mottagaren tregs och ökade i deras frånvaro, och vi observerade liknande fenomen med användning av humana T-celler och allogena monocyt-härledda DCs (MoDCs) 23.

Men uppräkning av långa kontakter inom en polyklonal T-cells population är tidsödande och arbetsintensivt. Vi gjorde därför användning av avbildning flödescytometri för att undersöka allogen immun synaps bildning. Imaging flödes inkorporerar cytometry de multiparametrisk datainsamlings och analysmöjligheter av konventionell flödescytometri med de encelliga avbildnings förmågor av fluorescensmikroskopi. Denna teknik har använts av andra forskare för att studera immun synaps bildning av monoklonala T-celler 24, 26, 27 eller i närvaro av superantigener 28. I sådana inställningar, emellertid varierar frekvensen av svarande T-celler från 30-100%, medan alloreaktiva T-celler är i allmänhet uppskattas representera 5-15% av den totala T-cellrepertoaren 29, 30, 31, 32. Viktigt visade vi att bild flödescytometri kan producera AVery jämförbart mått på alloreaktiva T-cellfrekvens 23 och att ändringar i synapsen frekvens inom en polyklonal T-cellpopulationen är prediktiva för transplantat utfall 23. För närvarande har denna metod har optimerats för att mäta direkt alloreaktivitet av CD4 + T-celler, men i princip kan det också utvecklas för att undersöka CD8 + T-celler och indirekt väg. Indirekt alloreaktivitet tros bli allt viktigare vid längre tider efter transplantation 33. Vi håller på att utveckla denna metod för att använda mänskliga celler, som gör det möjligt för att testa patienter. Sålunda, i framtiden, kan den övergripande strategin vara användbara för den funktionella utvärderingen av T-cellsvar i transplantatmottagare före transplantation; omedelbart efter transplantation; och på lång sikt, när läkemedel minimering blir ett viktigt mål.

Protocol

1. Förbered Reagens och material som krävs

  1. Förbereda fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 2% fetalt bovint serum (FBS) ( "tvättbuffert"). Förbereda PBS med 2% FCS innehållande 0,1% nonjonisk detergent ( "perm-tvättbuffert", se tabell of Materials). Förbereda PBS med 1,5% formaldehyd.
    OBS: VARNING! Formaldehyd är frätande och potentiellt cancerframkallande och måste hanteras samtidigt bär lämplig personlig skyddsutrustning.
  2. Förbereda PBS innehållande 2% FBS och 0,5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) för magnetisk cellseparation ( "MCS-buffert").
  3. Förbereda 50 | ig / ml falloidin-fluoresceinisotiocyanat (falloidin-FITC) i dimetylsulfoxid (DMSO). Bered en 1 mg / ml nukleär färgning (t ex 1 mg / ml 7-aminoaktinomycin D (7-AAD) i DMSO eller bis-benzimide färgämne; se tabell of Materials) i DMSO. Förbered fluorokrommärkta antikroppar lämpliga för cellerna av intresse ochavbildnings flödescytometer.
  4. Erhålla djurvävnader (t ex lymfknutor och mjälte) som en källa av T-celler och allogena djurvävnader (t ex mjälte och benmärg) som en källa för antigenpresenterande celler eller stamceller.
  5. Förbereda cellodlingsmedium (t.ex., Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 1640 eller Dulbeccos modifierade Eagles-medium (DMEM) kompletterat med 10% FBS), 50 pM 2-merkaptoetanol, penicillin och streptomycin och erhålla 24- och / eller 96- brunnars cellkulturplattor.

2. Förbered antigenpresenterande celler

OBS: I teorin skulle varje APC population undersökas med denna metod. Omogna mus benmärgshärledda dendritiska celler (DC) som APC var stämt i detta fall. Många protokoll existerar för att generera dessa celler (till exempel Referenser 34 och 35). Kortfattat, följande protokoll används.

  1. Flush märg från lårben och skenben i RPMI 1640 eller DMEM.
  2. Passerar de suspenderade cellerna genom en 70-im cellfilter för att avlägsna små benbitar och skräp.
  3. Pelletera cellerna genom centrifugering och därefter lysera röda blodkroppar med användning av en ammonium-kloridbuffert under 5 min vid rumstemperatur.
  4. Pelletera cellerna genom centrifugering (400 xg, 5 min) och resuspendera cellpelleten.
  5. Tvätta celler i 5 - 10 ml tvättbuffert, pellet genom centrifugering (400 xg, 5 min) och återsuspendera cellpelleten.
  6. Berika hematopoietiska prekursorer över en cellseparationskolonn genom att märka cellerna med biotinylerad anti-CD3 (5 | ig / ml), anti-B220 (5 | ig / ml), anti-MHC klass II (1 | ig / ml), och anti-CD11b (5 ug / ml) antikroppar.
  7. Pellets cellerna genom centrifugering (400 xg, 5 min) och återsuspendera cellpelleten.
  8. Inkubera cellerna med anti-biotin magnetiska mikropärlor (se tabell of Materials) vid 4 ° C under 10 min.
  9. Tvätta och pellets cellerna (400 xg, 5 min) och re-suspend dem i en ml MCS buffert före avlägsnande av de märkta cellerna med användning av en stor positiv selektering (LS) magnetisk cellseparationskolonn primad med 3 ml MCS-buffert och placerades i sin magnet. Tvätta kolonnen 3 gånger med 3 ml av MCS-buffert; genomflödet kommer att innehålla de önskade cellerna.
  10. Odla cellerna som passerar genom kolonnen i 6 dagar i RPMI 1640 eller DMEM kompletterat med 2 ng / ml rekombinant mus granulocyt makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF) och 2 ng / ml av rekombinanta humana transformerande tillväxtfaktor β1 (TGFβ1) . Byt halv mediet var 2 dagar med färskt komplett medium innehållande 2 ng / ml GM-CSF och TGFβ1.
    OBS: Human TGFβ1 har aktivitet i musceller. Data har genererats med hjälp av dessa omogna DC. Andra celler (t ex B-celler och mogna DC) kan vara lämpliga som APC men har inte testats i denna analys.
  11. Cryopreserve DCs i 90% serum / 10% DMSO och förvara i flytande kväve; recover påanvändningsdagen. Före användning, räkna antalet livskraftiga DCs i en hemocytometer med hjälp av trypan blå utslagning. Återsuspendera cellpelleten i odlingsmedium vid lämplig densitet (se steg 4,1) före användning i avsnitt 4.

3. Bered T-celler

  1. Använda negativa selektionsmetoder för att undvika oavsiktligt sända aktiverande eller inhiberande signaler till cellerna.
    OBS: I detta exempel, är CD4 + T-celler preparerades för analys.
    1. Att framställa CD4 + T-celler från musmjälte, mosa mjälten genom en 70-im cellfilter med användning av kolven i en spruta. Tvätta cellfilter med tvättbuffert.
    2. Pelletera de suspenderade cellerna genom centrifugering (400 xg, 5 min) och sedan lysera de röda cellerna genom återsuspendering av pelleten i en ammoniumkloridbuffert för 5 min vid rumstemperatur.
    3. Pellets cellerna genom centrifugering (400 xg, 5 min) och återsuspendera pelleten.
    4. Tvätta cellensi 5 - 10 ml av tvättbuffert och pellet genom centrifugering (400 xg, 5 min). Återsuspendera pelleten.
    5. Färga cellerna med biotinylerade antikroppar mot CD8, större histokompatibilitetskomplex klass II (MHC II, 1 | ig / ml), och CD19 (5 pg / ml). Inkubera i 10 min vid 4 ° C.
    6. Tvätta cellerna i 10 ml tvättbuffert och pellet genom centrifugering (400 xg, 5 min). Återsuspendera pelleten.
    7. Inkubera cellerna med anti-biotin magnetiska mikropärlor (se Tabell över material) i enlighet med tillverkarens anvisningar.
    8. Tvätta cellerna i 10 ml tvättbuffert och pellet genom centrifugering (400 xg, 5 min); återsuspendera pelleten.
    9. Återsuspendera cellerna i 1 ml av MCS-buffert och berika CD4 + -T-celler över ett magnetiskt cellseparationskolonn primad med 3 ml MCS buffert på en magnet. Tvätta kolonnen 3 gånger med 3 ml av MCS-buffert. Kolonn genomflöde kommer att innehålla de anrikade T-celler.
  2. Genom standardflödes cytomeprova, bedöma T-cell renhet med användning av en alikvot av de negativt selekterade cellerna. Färga cellerna med användning av en fluorokrom-streptavidin-konjugat (för att identifiera eventuella biotinmärkta celler som borde ha avlägsnats på kolonnen) och en antikropp eller antikroppar för att identifiera T-cellpopulationen av intresse (CD4 i detta fall); en renhet av ≥85% är acceptabelt 23.
    1. Räkna T-cellerna i en hemocytometer genom trypanblåexklusion (≥90% viabilitet är acceptabelt).
      OBS: MCS bufferten innehåller EDTA, som måste avlägsnas före analysen. För att åstadkomma detta, pelletera cellerna genom centrifugering (400 xg, 5 min) och tvätta i en ml tvättbuffert. Pellets cellerna igen (400 xg, 5 min) och återsuspendera i odlingsmedium vid lämplig densitet (se steg 4,1).

4. Co-inkubera T-celler och DC

  1. Utsädes T-celler och DC: er vid en 2: 1 T: DC-förhållande i en 24-brunn eller 96-brunnars cellodlingsplatta. Se till att den slutliga odlingsvolymen är ≤500 pl för 24-brunnsplattor eller ≤50 pl för 96-brunnsplattor.
    OBS: mindre volymer uppmuntra cell-cell-interaktioner och ge utrymme för efterföljande fixering buffert.
    1. Justera exakta celltal empiriskt, men som en allmän vägledning, använda 1 x 10 6 T-celler och 0,5 x 10 6 DCs per brunn (96-brunnsplatta). Dessa bör övervägas minimi antal celler, eftersom att använda färre celler gör uppräkning av immun synapser svårt.
      1. För att öka antalet celler, inrätta replikera brunnar och pool efter steg 5 (fixering).
        OBS: När du ställer in replikatbrunnar, är det lämpligt att utsäde DC i alla brunnarna första och sedan frö T-celler i alla brunnar; Detta minimerar skillnader i inkubationstid mellan brunnar.
  2. Inkubera plattan under 4 h vid 37 ° C i en 5% CO 2 atmosfär.
e_title "> 5. Fix Celler i Plate

  1. Lägg 3 gånger odlingsvolymen av 1,5% formaldehyd i PBS till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur i 30 min; tt är viktigt att fixera celler före avlägsna dem från plattan för att minimera störning av cell-cellinteraktioner.
  2. Överföra celler i plattan i rör för efterföljande tvättning och färgning. I detta skede, avsätta ytterligare celler för enkelfläck kontroller. Bortsett från dessa kontroller, bör hela kulturen färgas med antikroppen cocktail (se steg 4.1.1).

6. Fläck Celler

  1. Fläck celler i 100 mikroliter tvättbuffert innehållande en cocktail av de önskade fluorokromkonjugerade antikroppar för 30 min vid rumstemperatur, skyddad från ljus.
    OBS! Cocktail inkluderar T-cellspecifika och APC-specifika antikroppar. Fluorokromer bör väljas så att de kan särskiljas med användning av konfigurationen av avbildnings flödescytometer. i than experiment som visas här, blå fluorofor-konjugerad CD11b (5 | ig / ml, se Tabell över Materials) och APC-konjugerad CD90.2 (5 | j, g / ml) användes.
  2. Tvätta cellerna i 1 ml tvättbuffert och centrifugera i 5 min vid 400 x g. Dekantera supernatanten. Återsuspendera cellerna i perm-tvättbuffert innehållande falloidin FITC vid 0,05-0,5 pg / ml och inkubera i 30 min vid rumstemperatur skyddad från ljus.
    OBS: falloidin FITC koncentrationer av omkring 0,1 | ig / ml fungerar bra för musceller, men den lämpliga koncentrationen förväntas variera från leverantör, celltyp, och avbildning flödescytometer.
  3. Tvätta cellerna i 1 ml perm / tvättbuffert och centrifugera i 5 min vid 400 x g. Dekantera supernatanten. Återsuspendera cellerna i perm / tvättbuffert innehållande kärnfärgämnet vid lämplig koncentration (t ex ca 25 | j, g / ml 7-AAD) och inkubera under 30 min vid rumstemperatur skyddad från ljus.
  4. Tvätta cellens i 1 ml perm / tvättbuffert och centrifugera i 5 min vid 400 x g. Dekantera supernatanten. Tvätta cellerna en gång i tvättbuffert, pellet, och återsuspendera i 50 - 100 mikroliter tvättbuffert, överföring av cellerna till små, capped mikrocentrifugrör.
  5. Fortsätt till datainsamling omedelbart eller förvara cellerna vid 4 ° C i skydd mot ljus i upp till flera dagar före förvärvet på bildåtergivnings flödescytometer.
    OBS: Celler har lagrats på detta sätt i upp till 7 dagar. Längre lagring kan vara möjligt, men har inte testats.

7. Skaffa Data

  1. Initiera och konfigurera bild flödescytometer enligt tillverkarens anvisningar. Säkerställa stabilitet av kärnflödet före uppsamling några data.
  2. Reservera en kanal för brightbildtagning. Förvärva enkelfläckstyrdata med brightkanalen avstängd.
    1. Klicka på "Load" -knappen och insert ett rör innehållande en fullt färgade prov (ett prov som har färgats med alla nödvändiga fluorokromer) i hållaren.
    2. I "arbetsytan" fönstret, välja och skapa en ny spridningsdiagram med sidförhållandet över området och grindsingletter där sidförhållandet är nära 1. Skapa en ny spridningsdiagram för varje kanal som används (intensitet av kanalen på den horisontella axeln) .
    3. För varje fluorokrom, kontrollera den positiva befolkningen och vid behov justera laser spänningen i "Illumination" box.
    4. Lasta röret och laddar den första singel-färgade rör.
    5. I "Förvärvs Settings" rutan provnamnet och ange antalet händelser som ska samlas in; om det är en enda fläck (för styrningar kompensations), 1000 - 2000 händelser är tillräckliga.
    6. I "kanaler" Markera de kanaler som varje prov har färgats med. För enkelfläckkontroller bör alla kanaler väljas med brightfield och sidospridning av. Klicka på "Record" knappen under "Acquisition" box; när antalet händelser når den angivna tröskeln kommer förvärvet stannar automatiskt.
    7. Klicka på "Return" knappen för att lasta röret. Upprepa steg 7.2.4 - 7.2.6 för varje enskild-fläck kontroll. Beroende på cytometern och mjukvara, kan det inte vara möjligt att ställa in samtliga styren som visas i figur 1 under förvärv (mer exakt gating utförs vid analysen, se avsnitt 8).
  3. Förvärva prover som för enkel-färgade prover (i steg 7,2), men i "Kanaler" låda, välja alla kanaler som krävs, inklusive brightkanalen.
    1. Före inspelning uppgifter, ta för att bekräfta att kanalen intensiteten är lämplig för identifiering av de önskade cellpopulationer. Om inte, justera laserinställningar och re-record enkelfläck kontroller med användning av de nya inställningarna, såsom beskrivs i steg 7,2.
    2. För varjeprov förvärva flera tiotusentals händelser.
      OBS: Under de flesta betingelser, cell-cell-kontakt händelser är en liten minoritet av det totala cellantalet (de flesta är enskilda celler). I allmänhet, är det önskvärt att ha minst 100 händelser i den slutliga membrankontakt grind.

8. Analysera Data

  1. Analysera data som förvärvats på bild flödescytometer använda analytisk programvara gratis från tillverkarens webbplats (måste ett användarkonto skapas, se Table of Materials).

Figur 1
Figur 1. Gating strategi för att identifiera alloreaktiva Immun synapser. A. fokus händelser gated från alla händelser genom att granska cellbilder baserade på kvadratiska medelvärdet av förändringstakten av bildintensiteten profilen (Gradient RMS) med hjälp av ljusfält channel (kanal 4, Ch04), såsom beskrivs i texten. B. Bland i-fokus händelser, är dubletter särskiljas från enstaka celler genom att plotta sidförhållandet versus område för brightkanalen. Enstaka celler är grupperade nära sidförhållandet hos en och har ett mindre område, medan dubletter är nära 0,5 och har en större yta. C. Fluorescensintensitet av APC (i detta fall, en dendritisk cell [DC] markör, CD11c) plottas sedan mot fluorescensintensiteten för T-cellmarkör (i detta fall, CD90.2), och dubbel positiva händelser grindas. Gränser i porten kan förfinas genom att granska bilder av händelser nära gränsen. D. T-APC dubletter därefter förfinas så att de innehåller endast en APC genom att plotta sidförhållandet versus arean av APC markör (CD11c, CH02). E. Dessa enkel-APC dubletter därefter förfinas så att de innehåller endast en T-cell genom att plotta sidförhållandet kontra områdetav T-cellmarkör (CD90.2, Ch06). F. Slutligen händelser som innehåller endast två kärnor väljs genom att plotta ett histogram av fläcken räkna på den nukleära fläckkanalen (7-AAD, CH05) och grind händelser som innehåller endast 2 7-AAD-positiva fläckar (dvs kärnor). Händelserna i denna grind analyseras för membrankontakt och synaps bildning, såsom beskrivs i figur 2. Data analyserades i ett blint sätt med avseende på behandlingstilldelning och är från en tidigare publicerad experiment 23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

OBS: Gating strategi beskrivs i detta avsnitt och avbildas i figur 1. Analys av avbildnings flödescytometri data skall utföras på ett blint sätt med avseende på behandlingstilldelningen. Även om vi tror att immun synapser och icke-synaptic kontakter är i allmänhet lätt särskiljas (se nedan och fig 2 och 3), bör bländande minimera förspänning härrör från subjektivitet inneboende i bildanalys.

  1. Generera en kompensationsmatris genom att ladda de enkelfläckstyr datafiler till guiden ersättning. Efter lastning de enkels färgade filer väljer de fluorescerande kanalerna som används i experimentet.
    OBS: Programmet genererar automatiskt en kompensation matris, men detta bör manuellt valideras för att säkerställa att rätt positiva befolknings valdes.
    1. Dubbelklicka på ett värde i matrisen och till grafen till analysområdet. Skapa en ny port vid behov utesluta döda celler / dubbletter / falska positiva; denna nya raffinerade positiva populationen kan väljas i matrislådan i rullgardinsmenyn för varje kanal.
    2. Upprepa detta för varje kanal. Klicka på "Finish" för att spara compensation-matris (.ctm fil).
  2. Erhålla en fil dataanalys (.daf) från den råa fil (.rif) genom att ladda .rif filen till analysmjukvara och tillämpa kompensationsmatrisen.
  3. När data laddas, utföra slussning för att identifiera T-cell-APC kontakthändelser.
    OBS: En typisk grind strategi innebär att identifiera i-fokus händelser, välja dubletter baserat på storlekskriterierna (området kontra sidförhållande av händelsen), och val av T-cell-APC dubletter som händelser som är dubbelpositiva för T-cellen och APC markörer (Figur 1A-C).
    OBS: Aspektförhållandet är förhållandet mellan bredden av en händelse till dess höjd, som tillåter diskriminering av enskilda celler (förhållande nära 1) från dubletter (förhållande nära 0,5).
  4. Identifiera i-fokus händelser genom att plotta kvadratiska medelvärdet av förändringshastigheten hos bildintensitetsprofilen (gradient RMS) i brightkanalen (Figur 1A). Klicka på the gradient RMS histogram för att visa cell händelser i enskilda lådor och sedan placera en grind exklusive out-of-focus händelser.
  5. Plotta området kontra förhållandet aspekten av brightkanalen och rita en grind som identifierar dubbletter baserat på händelse form och storlek (Figur 1B). Granskning av bilder av händelser innanför och utanför gränsen till denna port kan hjälpa analytikern att förfina gate storlek och placering. Då, konstruera en kurva över dessa doublet händelser i vilken intensiteten av cellmarkören T visas på ena axeln och intensiteten av APC markör visas på den andra. Rita en T-APC dublett grind innehållande händelser positiva för båda markörerna.
  6. Bland T-cell-APC doublet händelser väljer händelser som endast innehåller en T-cell och en APC.
    1. Göra detta genom att plotta sidförhållandet versus område för APC markör och genom gating på dubletter innehållande en enda APC (figur 1D). Plotta sidförhållandet versus område för T-cell-märketer och grind på dubletter innehållande en enda T-cell (Figur 1E).
      OBS: Ytterligare förfining kan uppnås genom att plotta ett histogram av fläcken count funktionen tillämpad på nukleär fläck fluorescens och grindning på händelser med endast två fläckar (figur 1F).
  7. I vissa fall kommer de två cellerna inom en dubblett inte vara i kontakt; att identifiera celler i kontakt med varandra, definierar objektmasker för APC och T-celler.
    1. Använd "Masker" alternativet i analysmenyn för att öppna Masker manager och definiera en ny mask. Skriva ett namn, såsom "T-cellobjektmask." Klicka på "Function" knappen och i dialogrutan, välj "Object".
    2. Välja den kanal i vilken den T-cellmarkör detekteras (t ex, Ch06). Klicka på "OK".
      OBS: "Object (M06, Ch06, Tight)" visas i Function box. Här standardobjektmask vanligen works bra men kan kräva optimering.
    3. Upprepa denna process för att skapa en APC-objekt mask i den lämpliga kanalen.
  8. Efter att ha identifierat APC och T-cell-masker, fastställa membrankontakt genom plottning T-cellmarkör fluorescensintensitet i APC objektmasken mot APC fluorescensintensiteten i T-cellobjektmasken. På denna kurva, rita en grind som omfattar endast celler i kontakt med varandra.
    OBS: Typiskt finns det ganska tydliga dubbelpositiva och dubbla negativa populationer (figur 2A). Gränsen mellan de dubbla positiva och dubbelnegativa populationer kan ställas in genom att granska bright bilder av celler i gränsområdet för att säkerställa att cellerna i kontakt inom porten och att cellerna inte är i kontakt är uteslutna.
  9. I detta skede manuellt granska falloidin FITC bilder av händelser inom denna port för att skilja mogna immun synapser från enkla cell-cellkontakt. USE "tag bilder" funktion för att markera dessa bilder.
    OBS: Den procentuella andelen märkta händelser (immun synapser) inuti denna grind kan användas som ett index för direkt alloreaktivitet i T-cellpopulationen som studeras.

Representative Results

Denna metod användes för att undersöka CD4 + T-cell alloreaktivitet hos möss utförda toleranta mot donatoralloantigener före heterotopisk hjärt allogen transplantation. CBA-möss (H-2 k) gavs ett toleransinducerande protokoll bestående av en donatorspecifik (B6, H-2 b) blodtransfusion kombineras med en icke-utarmande CD4-antikroppen en månad innan de får en B6 hjärttransplantation. Detta protokoll resulterar i långtids allograftöverlevnad som är beroende av Foxp3 + regulatoriska T-celler 36, 37. Sju dagar efter transplantation, ades mjält CD4 + T-celler som erhållits från toleranta och icke-toleranta mottagare av B6 allogena hjärttransplantat och saminkuberades med B6 benmärgshärledda DCs enligt detta protokoll. Figur 2 visar representativa data från detta experiment. Membrankontakt grind visas i figur 2A, med gröna hårkorset placeras på en synaptisk händelse (vänstra panelen 1) och på en icke-synaptisk händelse (höger panel). Figur 2B visar de bright och fluorescenskanalerna för denna händelse. Att minska förspänningen ades data analyseras av en observatör blind för behandlingstilldelning 23. Såsom visas i flera exempel i figur 3, såväl från icke-toleranta (Figur 3A-B) och toleranta (fig 3C-D) CBA mottagare av B6 hjärtan, synapser är lätt skiljas från icke-synaptiska kontakter genom närvaron av en tät FITC-positiva ås vid T-APC-gränssnittet. Dessa resultat visar att visuell detektering av immun synapser som gjorts av mottagande T-celler spår med graden av alloreaktivitet hos mottagaren.

figur 2
Figur 2. Identifiering av T-APC dubletter med MembraneKontakt och immun Synapse Formation. Händelser i den slutliga dublett grind (figur 1F) analyseras. A. T-cellmarkör fluorescens i APC objektmasken är avsatt mot APC markör fluorescens i DC objektmasken. Vissa doublet händelser har en APC och en T-cell utan cell-cell kontakt och visas i det nedre vänstra hörnet av tomten (bilderna visas inte). Ett membran kontakt grind kan därför upprättas som inkluderar endast dubletter i vilka T-celler och APC är i kontakt. Bilder av varje händelse i denna grind granskas med avseende på tecken av aktin cytoskelettala omlagring i falloidin-FITC-kanal och kan märkas med användning av analysprogram. Den vänstra panelen visar en immun synaps händelse (märkta 1 och indikeras med gröna hårkors), medan den högra panelen indikerar en membrankontakt händelse utan immun synaps bildning (märkt 2 och indikeras med gröna hårkors). Fastställandet av synaps bildning kräver manuell granskning av dessabilder, som visas i B. B. Den översta raden visar bright och fluorescens kanal bilder under en dublett med en immun synaps (motsvarar händelsen en i A); den undre raden visar en dubblett med membrankontakt men saknar synaps bildning (motsvarar händelsen 2 i A). Data analyserades i ett blint sätt med avseende på behandlingstilldelning och är från en tidigare publicerad experiment 23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 3
Figur 3. Exempel på T-APC Synapse Formation. CBA-möss erhöll hjärtallotransplantat från B6 donatorer efter antingen ingen förbehandling (AB) eller efter toleransinduktion med B6 helblod i skydd av en icke-utarmande anti-CD4-antikropp ( rong> CD). Efter 7 dagar, var mjält CD4 ^ T-celler testades med avseende på synaps bildning med B6 DCs. A. Tre exempel på icke-synaptiska dubletter med membrankontakt från en icke-toleransstimulerade djur. B. Tre exempel på immun synapser från en icke-toleransstimulerade djur. C. Tre exempel på icke-synaptiska dubletter med membran kontakt från en toleransstimulerade djur. D. Tre exempel på immun synapser från ett toleransstimulerade djur. Synaps bildning indikeras genom närvaron av en ljus, FITC-positiva ås vid T-APC-gränssnitt (Ch03). Data analyserades i ett blint sätt med avseende på behandlingstilldelning och är från en tidigare publicerad experiment 23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ays "> Antikropp / Färgämne fluorokrom kanalisera Koncentration CD11c eF450 CH02 5 | j, g / ml, titrera empiriskt CD90.2 APC Ch06 5 | j, g / ml, titrera empiriskt phalloidin FITC Ch03 0,05-0,5 | ig / ml 7-AAD - CH05 25 | ig / ml

Tabell 1. Antikroppar och färgämnen som används i denna studie. Fluorokromkonjugerade antikroppar, färgämnen, leverantörer och rekommenderade koncentrationerna presenteras i tabellen. Avbildnings flödescytometer kanal som användes för att detektera varje fluorokrom visas också i tabellen.

Discussion

Imaging flödescytometri har använts för att demonstrera immun synaps bildning mellan monoklonala T-celler och APC eller i närvaro av superantigener 24, 25, 26, 27, 28. Denna metod drar fördel av det faktum att efter en produktiv T-cell-APC-kontakt, omordnar T-cellen dess aktincytoskelettet, polarisera den mot kontaktstället 21. Denna omlagring inträffar inte utan TCR-signalering, och det är därför en tidig korrelat av T-cellaktivering 19, 20, 21. Den metod som presenteras här anpassar detta tillvägagångssätt för mätning av alloreaktiva T-cellfrekvens i polyklonala T-cellpopulationer. Som sådan kan det i framtiden att ligga till grund för utvecklingen av analyser för givar reactivi ty vid klinisk transplantation.

Även direkta jämförelser har ännu inte gjorts, verkar detektion av alloreaktiva immun synapser ha överlägsen prognosförmåga än den konventionella MLR. Till exempel, har tidigare arbete visat att, i det toleransinducerande protokoll som beskrivs ovan, resultaten av en MLR misslyckas med att på ett tillförlitligt sätt korrelerar med transplantat utfall 2.

Ett antal analyser har utvecklats för drifts tolerant tillstånd hos människor 9, 10, 11, även om dessa inte mäter effektor cellfunktion som svar på alloantigen. I kontrast, IFNy ELISPOT-analyser 8 åtgärd effektor-T-cellfunktion, men kan inte fånga hela spektrumet av cytokinutsöndring som kan vara relevanta för akut och kronisk allograftavstötning, såsom IL-17 38,> 39. Den begränsande spädningsanalys 4, vilket är arbetskrävande, och det trans vivo-analys 6, vilket kräver möss, har betydande praktiska begränsningar som skulle hindra deras tillämpning i en klinisk miljö. Senaste förbättringarna på analys av prolifererande celler med användning av TCR-sekvensanalys av T-celler som svarade i MLR kan vara av värde, men liksom analysen presenteras här, kommer att kräva ytterligare validering i kliniska studier 18, 40.

Vidareutveckling av immun synapsen detektionsanalysen kommer att kräva att ett antal viktiga frågor besvaras. Först analysen som utvecklade mäter endast direkt alloreaktivitet. Den direkta vägen involverar presentationen av allogena MHC / peptidkomplex på givarhärledda APC. Den senare är i allmänhet elimineras snabbt efter transplantation, och vidare alloantigen presentation är carried ut genom mottagande APC presenter intakt donator MHC (halv direkt väg) eller bearbetade donator antigener på själv-MHC (indirekt väg). Den indirekta vägen är en viktig drivkraft för kronisk allograftavstötning 33, 41.

I princip bör det vara möjligt att detektera indirekta immun synapser användning av denna analys, men indirekt alloreaktiva T-celler har en mycket lägre frekvens än direkt 42, 43, vilket innebär att analys av ett större antal händelser kommer att krävas. Ett andra övervägande är att vi bara har testat denna analys med användning av CD4 + T-celler, medan CD8 + T-celler är också en viktig komponent i den antidonatorsvar. Återigen bör det vara möjligt att detektera CD8 + T-cell-APC-synapser som använder denna metod. En annan begränsning är att metoden kräver manuell granskning och analys av cellbilder i slut MembRane kontakt gate, och vi arbetar för närvarande på automatisering av detta steg.

Slutligen kräver metoden testning och utveckling i mänskliga försökspersoner, och preliminära studier med humana prover för närvarande genomförs. Ytterligare fenotypiska T-celldelmängdsanalys (dvs effektor, minne, reglerande, etc.) i kombination med detektionen av immun synapser i transplantatmottagare skulle representera ett kraftfullt tillvägagångssätt för att karakterisera alloreaktiva T-cellrepertoaren och kommer att vara en viktig fokus för framtida arbete.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

SCJ stöddes av en International Society for Heart and Lung Transplantation Research Fellowship och Royal College of Physicians och kirurger i Kanada Detweiler resa Fellowship.SM stöddes delvis av en International Society for Heart and Lung Transplantation Career Development Award (till SCJ). SS stöddes av National Institutes of Health Research Oxford Biomedical Research Centre.JH är mottagare av en njure Research UK Senior Non-Clinical gemenskap. Detta arbete har finansierats av följande bidrag till AB och KW: a Wellcome Trust Program Grant (082519Z07Z), en brittisk Heart Foundation Program Grant (PG / 10 / 62,28504) och EU: s ramprogram 7 (en studie, BioDRIM). Författarna vill tacka Michael Parsons och Flödescytometri Core Facility vid Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System, Toronto för att ge tillgång till och stöd med ImageStream Mark X instrument.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline Various Varies
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5 M solution Thermo Fisher Scientific AM9260G
Triton X-100 nonionic detergent Sigma-Aldrich X100
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution
Cell strainers, 70 μm pore size Fisher Scientific 08-771-2
Phalloidin-fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich P5282
7-aminoactinomycin D Thermo Fisher Scientific A1310 Reconstitute in DMSO
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2 eBioscience 17-0902
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11b eBioscience 48-0112 Pacific blue has been replaced by eFluor 450
Biotinylated anti-mouse CD3 eBioscience 13-0032
Biotinylated anti-mouse MHC class II eBioscience 13-5321
Biotinylated anti-mouse B220 eBioscience 13-0452
Biotinylated anti-mouse CD8 eBioscience 13-0081
Biotinylated anti-mouse CD19 eBioscience 13-0193
Anti-biotin microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MidiMACS magnetic cell separator MIltenyi Biotec 130-042-302
recombinant mouse GM-CSF Peprotech 315-03
recombinant human TGFβ1 Peprotech 100-21 Human TGFβ1 has activity on mouse cells
Amnis ImageStream X Mark II Amnis/EMD Millipore N/A Imaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/
IDEAS Software Amnis/EMD Millipore N/A Free download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Cell culture medium  Various Varies
Fetal bovine serum Various Varies
Cell culture plates Various Varies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cravedi, P., Heeger, P. S. Immunologic monitoring in transplantation revisited. Curr Opin Organ Transplant. 17, (1), 26-32 (2012).
  2. Pearson, T. C., et al. The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model. Transplantation. 55, (2), 361-367 (1993).
  3. Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity. Transplantation. 69, (8), 1549-1554 (2000).
  4. Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation. Transplantation. 57, (5), 673-676 (1994).
  5. Roelen, D. L., et al. Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation. Clin Exp Immunol. 156, (1), 141-148 (2009).
  6. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J Clin Invest. 106, (1), 145-155 (2000).
  7. Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates. J Am Soc Nephrol. 17, (2), 564-572 (2006).
  8. Zitzner, J. R., Tambur, A. R. Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation. Cells. 1, (2), 100-110 (2012).
  9. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120, (6), 1836-1847 (2010).
  10. Brouard, S., et al. Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, (39), 15448-15453 (2007).
  11. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120, (6), 1848-1861 (2010).
  12. Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples. Nat Rev Nephrol. 12, (9), 534-548 (2016).
  13. Li, L., et al. Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection. PLoS One. 8, (12), e82153 (2013).
  14. Khatri, P., et al. A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation. J Exp Med. 210, (11), 2205-2221 (2013).
  15. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13, (11), 2865-2874 (2013).
  16. Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20, (1), 64-71 (2015).
  17. Miqueu, P., et al. Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients. Eur J Immunol. 40, (11), 3280-3290 (2010).
  18. Morris, H., et al. Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients. Sci Transl Med. 7, (272), 272ra210 (2015).
  19. Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, (8), 3909-3913 (1997).
  20. Goldsmith, M. A., Weiss, A. Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation. Science. 240, (4855), 1029-1031 (1988).
  21. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, (5425), 221-227 (1999).
  22. Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296, (5574), 1873-1876 (2002).
  23. Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection. Am J Transplant. 16, (5), 1394-1407 (2016).
  24. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 347, (1-2), 79-86 (2009).
  25. Burbach, B. J., et al. Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP. J Immunol. 181, (7), 4840-4851 (2008).
  26. Markey, K. A., et al. Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen. J Immunol. 192, (11), 5426-5433 (2014).
  27. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, (2), 351-363 (2012).
  28. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. (2015).
  29. Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex. J Exp Med. 141, (3), 681-696 (1975).
  30. Macedo, C., et al. Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response. Am J Transplant. 9, (9), 2057-2066 (2009).
  31. Noorchashm, H., et al. A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency. Transplantation. 67, (9), 1281-1284 (1999).
  32. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J Immunol. 166, (2), 973-981 (2001).
  33. Lee, R. S., et al. Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, (6), 3276-3281 (2001).
  34. Pickl, W. F., et al. Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes. J Immunol. 157, (9), 3850-3859 (1996).
  35. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, (6), 1693-1702 (1992).
  36. Francis, R. S., et al. Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells. Eur J Immunol. 41, (3), 726-738 (2011).
  37. Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61, (11), 1642-1647 (1996).
  38. Faust, S. M., et al. Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection. J Immunol. 183, (11), 7297-7306 (2009).
  39. Yuan, X., et al. A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy. J Exp Med. 205, (13), 3133-3144 (2008).
  40. Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture. PLoS One. 9, (11), e111943 (2014).
  41. Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis. Am J Transplant. 3, (6), 736-742 (2003).
  42. Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice. J Immunol. 162, (1), 352-358 (1999).
  43. Liu, Z., et al. Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity. J Exp Med. 177, (6), 1643-1650 (1993).
Mätning av T-cell alloreaktivitet Använda Imaging Flow Cytometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Juvet, S. C., Moshkelgosha, S., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (122), e55283, doi:10.3791/55283 (2017).More

Juvet, S. C., Moshkelgosha, S., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (122), e55283, doi:10.3791/55283 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter