Summary
Vi detalj en metod för att tillverka tredimensionella pappersbaserade mikrofluidanordningar för användning i utvecklingen av immunanalyser. Vårt förhållningssätt till sammansatta enheten är en typ av flerskikts, additiv tillverkning. Vi visar en sandwich immun att tillhandahålla representativa resultat för dessa typer av pappersbaserade enheter.
Abstract
Papper vekar vätskor självständigt på grund av kapillärkraften. Genom mönstring papper med hydrofoba barriärer kan transporten av vätskor styras och riktas inom ett skikt av papper. Dessutom stapla flera skikt av mönstrat papper skapar sofistikerade tredimensionella mikroflödes nätverk som kan stödja utvecklingen av analytiska och bioanalytiska analyserna. Pappersbaserade mikrofluidikanordningar är billiga, bärbara, lätta att använda, och kräver ingen extern utrustning för att fungera. Som ett resultat håller de mycket lovande som en plattform för point-of-care diagnostik. För att kunna utvärdera användbarheten och analytiska prestanda pappersbaserade enheter måste lämpliga metoder utvecklas för att säkerställa deras tillverkning är reproducerbar och på en skala som är lämplig för laboratoriemiljö. I detta manuskript, till ett förfarande fabricera en allmän anordning arkitektur som kan användas för pappersbaserade immunanalyser beskrivs. Vi använder en form av additiv tillverkar byg (multi-layer laminering) för att framställa anordningar som innefattar flera skikt av mönstrat papper och mönstrat lim. Förutom att påvisa en korrekt användning av dessa tredimensionella pappersbaserade mikroflödessystem enheter med en immunanalys för humant koriongonadotropin (hCG) är fel i tillverkningsprocessen som kan resultera i enhets misslyckanden diskuteras. Vi förväntar oss att detta sätt att tillverka pappersbaserade enheter kommer att finna bred användbarhet i utvecklingen av analytiska applikationer som utformats speciellt för inställningar begränsad resurs.
Introduction
Papper är allmänt tillgänglig i en rad olika formuleringar eller kvaliteter, kan funktionaliseras för att ställa sina egenskaper, och kan transportera vätskor självständigt genom kapillärverkan eller uppsugning. Om papperet är mönstrad med en hydrofob substans (t.ex. fotoresist en eller vax 2), uppsugning av vätskor kan styras rums inom ett skikt av papper. Till exempel kan en pålagd vattenhaltigt prov riktas in i ett antal olika zoner för att reagera med kemiska och biokemiska reagenser lagrade i papperet. Dessa pappersbaserade mikroflödessystem enheter har visat sig vara en användbar plattform för utveckling av bärbara och billiga analytiska analyser 3, 4, 5, 6, 7. Tillämpningar av pappersbaserade mikroflödessystem enheter inkluderar point-of-care diagnostikef "> 8, övervakning av miljöföroreningar 9, upptäckt av förfalskade läkemedel 10, och delokaliserad hälso- och sjukvård (eller" telemedicin ") i begränsad resurs inställningar 11.
Flera lager av mönstrat papper kan sättas samman till en integrerad enhet där hydrofila zoner från grannskikten (dvs över eller under) ansluter för att bilda kontinuerliga fluid nätverk vars inlopp och utlopp kan vara kopplade eller vänster oberoende. 12 Varje skikt kan innefatta ett unikt mönster, som möjliggör den rumsliga separation av reagens och multipla analyser som skall utföras på en enda anordning. Den resulterande tredimensionella mikroflödessystem enhet är inte bara kan uppsugning vätskor för att möjliggöra analytiska analyser (t.ex. leverfunktionstester 13 och elektrokemisk detektering av små molekyler 14), men det kan också support ett antal sofistikerade funktioner (t.ex. ventilerna 15 och enkla maskiner 16) som är gemensamma för de traditionella mikroflödes metoder. Viktigt, eftersom papper transporterar vätskor genom kapillärverkan, dessa enheter kan drivas med minimal ansträngning från användaren.
Eftersom reagens kan lagras i den tredimensionella strukturen för en pappersbaserad enhet, kan komplexa protokoll reduceras till en enda tillsats av vattenhaltigt prov till en enhet. Nyligen införde vi en generell tredimensionell enhet arkitektur som kan användas för att utveckla pappersbaserade immun använder vax-tryckteknik för att skapa mönstrade skikt. 17, 18 Dessa studier fokuserade på hur aspekter i samband med utformningen av enhets antal staplade lager används, sammansättningen av lagren, och mönstret av den tredimensionella mikroflödesnätverks kontrollerade totalt perprestanda av immunanalysen. I slutändan kunde vi använda dessa konstruktionsregler för att underlätta en snabb utveckling av en multiplex immun 19. I detta manuskript, en tidigare utvecklat immun för humant koriongonadotropin (hCG, graviditetshormon) är 17 som ett exempel för att illustrera de strategier som vi har utvecklat för montering och tillverkning av tredimensionella pappersbaserade immun. Följaktligen fokuserar vi på montering och drift av en anordning i stället för utveckling av en analys.
I en sandwich-immunanalys, vilket är det format som används för att detektera hCG, en infångningsantikropp som är specifik för en subenhet av hormonet beläggs på ett fast substrat, som därefter blockeras för att begränsa icke-specifik adsorption av ett prov eller efter en efterföljande reagens. Detta substrat är oftast en polystyren-mikrobrunnsplatta (t.ex. för en enzymkopplad immunabsorberande analys eller ELISA). Provet är sedansattes till en brunn och fick inkubera under en tidsperiod. Efter noggrann tvättning, är en antikropp specifik för den andra subenheten av hCG sattes och fick inkubera. Denna detekteringsantikroppen kan konjugeras till en kolloidal partikel, ett enzym, eller fluorofor i syfte att producera en mätbar signal. Brunnen åter tvättas före tolkningen av resultaten av en analys (t.ex., med användning av en plattläsare). Medan kommersiella kit förlita sig på denna tidsödande flerstegsprocess, kan alla dessa steg utföras snabbt i pappersbaserade mikroflödessystem enheter med minimal inblandning av användaren.
Den anordning som används för hCG immun består av sex aktiva skikt, som är, från topp till botten, som används för provtillsats, konjugat lagring, inkubation, fånga, tvätt, och blot (Figur 1). Provet Dessutom lagret består av kvalitativt filterpapper. Den underlättar införandet av ett vätskeprov och skyddar reagenserna i konjugatet layer från föroreningar från omgivningen eller oavsiktlig beröring av användaren. Konjugatet skiktet (kvalitativt filterpapper) håller färgproducerande reagens (t.ex. kolloidalt guld-märkt antikropp) för immunanalys. Inkubationen skiktet (kvalitativt filtrerpapper) tillåter provet att resa sig i sidled inom planet av papperet för att främja bindning av analyten med reagens innan den når nästa lager, infångningsskiktet. Infångningsskiktet (nylonmembran) innehåller ligander specifika för analyten adsorberas till materialet. Efter analysen är slutförd, är detta skikt avslöjade att möjliggöra visualisering av det färdiga immunokomplex. Tvättskiktet (kvalitativt filterpapper) drar överflödig vätska inklusive gratis konjugerade reagens bort från ansiktet av infångningsskiktet i blot skiktet (tjock kromatografi papper). Den sex-skiktet enheten hålls samman av fem skikt av mönstrat, dubbelsidig självhäftande: fyra skikt av permanent självhäftande upprätthålla integriteten i den monblödde enhet och ett skikt av borttagbart lim underlättar skalar av enheten för att inspektera resultatet av immun på infångningsskiktet.
Vid tillämpningen av detta manuskript, använder vi bara negativa och positiva kontrollprover av hCG (0 mIU / ml och 81 mIU / ml, respektive) för att ge representativa resultat av ett pappersbaserat immun, som tillåter en särskild diskussion om förhållandet mellan tillverkningsmetoder och prestandan hos en enhet. Förutom att visa hur man tillverkar enheter framgångsrikt markerar vi flera tillverkningsfel som kan leda till fel på en enhet eller reproducerbara analysresultat. Protokollet och diskussion som beskrivs i detta manuskript ger forskarna värdefull insikt i hur pappersbaserade immun är utformade och tillverkade. Medan vi fokuserar vår demonstration på immun, räknar vi med att de riktlinjer som presenteras häri kommer att vara i stort sett användbar för tillverkning av trednella pappersbaserade mikrofluidikanordningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av pappersbaserade mikroflödessystem enhet Lager
- Förbered mönster för lager av papper, nylon, och lim med hjälp av en grafisk design program. 6 Varje skikt kan ha ett annat mönster.
OBS: Mönstret kan innefatta inriktnings hål som inte krävs för en fungerande pappersbaserad immun, men hjälpa till med reproducerbar tillverkning av tredimensionella enheter. Placering av dessa hål kommer att skilja sig om enheter monteras individuellt, i remsor eller som hela blad. Den programvara som används för att utforma mönster kan variera beroende på valet av mönsterteknik (t.ex. fotolitografi, vax utskrift eller skärning). 6 - Spraya arbetsområdet med en lösning av 70% (volym / volym) etanol och vatten. Torka av arbetsområdet med en ren pappershandduk.
2. Beredning av pappersskikt: provtillsats, konjugat Förvaring, inkubation och tvätta lager
- Förbered lager av kvalitativ filterpapper med hjälp av en stor bordspapperskniv. Skär ett lager papper i en standardpappersstorlek för att underlätta mönstring med hjälp av en solid ink (vax) skrivare. Till exempel kan en enda 460 x 570 mm 2 ark göra 4 ark US Letter papper (8,5 x 11 inches 2). Hantera papper med rena handskar hela tiden för att minimera kontaminering.
- Ladda ett snitt ark kromatografi papper i skrivaren facket. Skriv tidigare utformade skikt (se figur 1).
OBS: Ett mönster kan skrivas ut direkt på detta blad med hjälp av automatisk matning. Endast ett pappersark ska skrivas ut i taget för att undvika pappersstopp. För alla lager, använd "Enhanced" utskriftsinställningar.
3. Framställning av nylonmembran lager: Capture Layer
- Skär lager rulle av nylonmembran till ark (7,5 x 10 tum 2) med användning av en bordsskiva pappersskäraren. Ta stor omsorg vid hantering av nylonmembran för att behålla sin integritet och skydda mot rippning. Förvara oanvänt material i en torkapparat skåp, som nylonmembran är fuktkänsliga.
OBS: Skär skivor är smalare än US Letter papper. Eftersom nylonmembran är tunna och sköra, kan de inte bearbetas av skrivaren direkt och behöver stöd. Detaljer diskuteras nedan. - Med hjälp av en vax skriva ut en infångningsskikt mönster på en bit papper och tejpa fast den till en ljuslåda för att fungera som en guide för placering av nylonmembranet. Ljuslådan bistår inriktningen av flera skikt.
- Placera ett tomt papper på den tidigare tryckta ark kopieringspapper. Tejpa blankt papper i ljuslåda, men inte band de två arken.
- Placera ett snitt ark av nylonmembran på ren bit papper. Se till att membranet täcker det tryckta området i det undre skiktet på kopieringspapperet. Tejpa alla fyra sidor av nylonmembranet till nollanav kopieringspapper.
OBS: Se till att nylonmembranet är platt och slät, så att det inte finns några problem med utskrift (t.ex. pappersstopp eller ojämn utskrift av vax). Vax kan tryckas på tejpen där nylonmembranet är fäst vid den kopieringspapper. Om detta inträffar bör områden där nylon ofullständigt mönstrade på grund av bandtäckning kasseras. För framtida preparat kan större stycken av nylonmembran användas för att undvika detta tryckfel. - Ladda ett ark av nylonmembran (med stöd av kopieringspapper fästs på den) i det manuella inmatnings skrivaren facket. Skriva ut endast en ark av nylonmembran i taget.
OBS: Det finns inga förberedande stegen som krävs för att blot skiktet, eftersom det inte är mönstrad.
4. Skapa Hydrofoba hinder i det tryckta skiktet
- Tejp de tryckta skikt på en akryl ram för jämn uppvärmning över och under lagret när den placeras i en gravitations konvektionsugn. Håll nylonmembranet tejpade tillstödarket på kopieringspapperet förrän efter vaxet smälts och hydrofoba barriärer bildas.
OBS: akryl ram är en skräddarsydd, laserskuren bit av 1/2 ".. Tjock akrylplast Två ramstorlekar beroende på antalet enheter som tillverkas användes yttre gränsen av mindre ram mäter 11 5/8" x 2 3/4 ", och det inre hålet på ramen mäter 10 3/8" x 1 3/4 ". den yttre kanten av större ram mäter 11 5/8" x 8 7/8 ", och den inre hål av ramen mäter 10 1/4 "x 7 7/8". den öppna, inre utrymme möjliggör ännu smältning av vax genom hela tjockleken av papperet. - Placera lagren i ugn vid 150 ° C under 30 sekunder tills vaxet smälter in i papperets tjocklek. Kontrollera att vaxet har genomsyrat tjockleken på papperet genom att vända den upp och kontroll av brister i konstruktionen.
NOT: Forcerad luft ugnar eller värmeplattor kan också användas för att smälta fast vax bläck. smält gångereller temperaturer kan variera beroende på uppvärmningsmetod. - Ta bort papperet och nylonmembran från akryl ram. Dessutom, ta bort nylonmembran från stöd ark kopieringspapper.
5. Framställning av klisterskikten
- Mönster dubbelsidiga ark av självhäftande film med hjälp av en robot kniv plotter, med hjälp av design filer som tidigare framställts (steg 1,1). Skydda synligt klister yta med hjälp av ett ark av vax liner.
OBS: dubbelsidig självhäftande bör vara mönstrad med hål som tillåter provet att strömma genom skikten som en kontinuerlig fluidvägen. Vaxet liner kan lätt avlägsnas från bindemedlet, och tjänar till att skydda den från föroreningar och rivning under skärning. En laserskärare eller dö tryck kan också användas för att mönsterlager av adhesiva filmer.
6. stöd av Enhets lager med lim
- Spraya ljuslåda med en lösning av 70% (volym / volym) etanol och vatten. Torka med en ren pappers tOwel.
- Tejp ett mönstrat skikt av papper eller nylonmembran som måste backas upp med lim på ljuslåda med den tryckta sidan nedåt.
- Peel ena sidan av skyddspappret från den mönstrade papper lim och fäst den på skikt av papper eller nylonmembran. Använda ljuslåda för att säkerställa korrekt inriktning av mönstren. Tryck ihop. Placera delvis monterade anordningen i en skyddsremsan.
OBS: Skydds slip är en hopvikt laminefilmstomme som skyddar enheter från förorening eller skador genom att se till att de inte kommer i kontakt med lamineringsrullarna. - Passera det resulterande två-skiktsaggregatet genom ett automatiserat laminator för att fullständigt trycka limmet och pappers tillsammans, avlägsnande av eventuella luftfickor från adjoined skikten.
OBS: Luftfickor mellan skikten hos anordningen kan störa enhetens integritet och transporterande reproducerbarhet genom att orsaka läckor.
7. Behandling av konjugat LAyer med Reagens för Immun Före Device Assembly
- Tejp konjugat skikt på en akryl ramen så att den hydrofila zonen som skall behandlas är upphängd och inte är i kontakt med ramen.
- Tillsätt 2,5 | il av 100 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till den hydrofila zonen på konjugatet skiktet. Låter det torka vid rumstemperatur under 2 min och sedan vid 65 ° C under 5 min.
OBS: Denna volym är precis tillräckligt för att väta den zon av papperet. BSA-lösningen hjälper till att förhindra aggregering av kolloidala nanopartiklar under torkningsprocessen, vilket kommer att underlätta frigörandet av nanopartiklar när papperet och reagenser rehydratiseras av provet. - Tillsätt 5 pl av 5 OD kolloidalt guld nanopartiklar konjugerat till anti-β-hCG-antikropp, och upprepa torkprocessen.
OBS: Enheterna för koncentration av kolloidala guldnanopartiklar är ofta uttryckta som optisk densitet (OD) uppmätt av absorbance vid λ = 540 nm. Ingen behandling krävs för veken pad innan anordningsenheten i avsnitt 10.
8. Behandling av lateral kanal med Reagens för Immun Före Device Assembly
- Tejp lateral kanalskikt på en akryl ramen så att den hydrofila zonen som skall behandlas är upphängd och inte är i kontakt med ramen.
- Tillsätt 10 | il av blockeringsmedel (5 mg / ml fettfri mjölk och 0,1% (volym / volym) Tween 20 i 1 x PBS) för att behandla den laterala kanal. Upprepa samma torkningsprocessen (2 min vid rumstemperatur och därefter vid 65 ° C under 5 min) som konjugatet skiktet.
9. Behandling av Capture Layer med Reagens för Immun Före Device Assembly
- Tejp infångningsskikt på en akryl ramen så att den hydrofila zonen som skall behandlas är upphängd och inte är i kontakt med ramen.
- Behandla infångningsskiktet med 5 mikroliter av 1 mg / ml anti-α-hCG-antikropp och sedan göra det möjligt förtorkas provet vid rumstemperatur under 2 min följt av 8 min vid 65 ° C.
- Lägg 2 mikroliter av blockeringsmedel (5 mg / ml fettfri mjölk och 0,1% (volym / volym) Tween 20 i 1 x PBS). Upprepa torkningsprocessen för avskiljning skiktet.
OBS: Detta belopp är lämplig för att belägga papper utan att täppa igen porerna i nylonmembranet, vilket kan inträffa när för mycket blockerande medel används.
10. Montering av Tredimensionell Pappersbaserade Mikrofluidikanordningar
- Tejpa tvättskiktet till ljuslåda (tryckta sidan uppåt). Om inriktnings hål används, ta bort dem från efterföljande skikt med hjälp av en handhållen hål-stansverktyg.
- Ta bort skyddsfilmen på baksidan av infångningsskiktet för att exponera klistret. Rikta infångningsskiktet ovanför tvättskiktet med hjälp av inriktningshålen som en guide. Trycker samman de två skikten. Undvik att vidröra hydrofila zoner för att minimera kontaminering eller skada på enheten. Pincett kan användas för att hjälpa assembly.
- Ta bort skyddsfilmen på baksidan av inkubationen skiktet för att exponera klistret. Rikta inkubation skiktet ovanför infångningsskiktet och tryck ihop dem. Fortsätt att lägga till lager på detta sätt tills alla aktiva skikt är monterade.
- Placera delvis monterade anordningen i en skyddsremsan och stadigt fästa lagren ihop med en laminator.
- Ta bort skyddsfilmen på baksidan av tvättskiktet och anbringa blot skiktet till botten av anordningen. Upprepa lamineringssteg 10,4 för att fullborda monteringen av det tredimensionella pappersbaserade mikrofluidikanordning. Klipp önskat antal enheter från skivor eller remsor av fullt monterade enheter med sax.
OBS: Full ark enheter, remsor av enheter eller enskilda enheter kan framställas med hjälp av ett liknande tillvägagångssätt.
11. Utföra en pappersbaserad immun
- Tillsätt 20 pl av ett prov till den hydrofila zonen ovanpå enheten (dvs, tHan provskiktet).
- Vänta på att provet att sugas helt in i anordningen, tillsätt sedan 15 ^ il tvättbuffert (0,05% volym / volym Tween 20 i 1x fosfatbuffrad saltlösning). Efter den första alikvot av tvättbuffert har det hur helt in i anordningen, lägga till en andra 15 | il alikvot av tvättbuffert.
OBS: Tvättbufferten har helt onda in i anordningen när vätskedroppen har försvunnit, som inte visar någon menisken på ytan av papperet. Analysen är klar när den andra alikvot av tvättbuffert har helt kommit in i anordningen. - Att avslöja resultaten av analysen, skala bort de tre översta skikten av enheten med hjälp av en pincett för att exponera infångningsskiktet.
- Tolka resultaten av analysen kvalitativt genom att observera närvaron eller frånvaron av färg. Alternativt bild avläsningsskiktet med hjälp av en bordsskanner och använda bildbehandlingsprogram eller algoritmer för att kvantifiera resultat och karakterisera fördelningarna av intensitet inom endetektionszonen. 20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erhålla reproducerbara analys föreställningar tredimensionella pappersbaserade mikroflödessystem enheter förlitar sig på en tillverkningsmetod som säkerställer överensstämmelse mellan enheter. Mot detta mål, har vi identifierat ett antal tillverkningsprocesser och material överväganden och diskutera dem här i samband med att visa en pappersbaserad immunanalys. Vi använder ett vax tryckmetod för att bilda hydrofoba barriärer inom pappersbaserade mikrofluidikanordningar (Figur 2A). 2 Den här metoden är idealiskt eftersom det bygger bara på allmänt tillgängliga kontorsutrustning, kräver minimalt procedursteg för att slutföra, och inte kräver användning av kemikalier (t.ex. fotoresister) som kan störa proteinadsorption eller förändra vätbarheten av pappersfibrer. Vidare producerar vax utskrift fluid vägar med reproducerbara dimensioner, vilket är avgörande för analyser med repeterbara prestanda och varaktighet times. Efter de hydrofoba barriärerna är bildade, är limark appliceras på skikten för att underlätta montering av tredimensionella enheter (Figur 2B). Eventuella reagens som erfordras för immunanalysen kan appliceras efter den adhesiva filmen sättes till baksidan av ett skikt (figur 2C). Detta förfarande är användbart för tillverkningsprocesser i en akademisk laboratorium eftersom många enheter kan framställas parallellt. Monteringsprocessen för en immunoanalys anordning är fullbordad efter det att alla skikten hos anordningen är staplade och laminerade tillsammans (figur 2D). Vi lägger till provet för att påbörja analysen. I detta exempel använder vi en urinkontroll inställd för graviditetstest, som innehåller negativa och positiva prover av hCG i buffert, som prover för att visa driften av våra enheter och reproducerbarhet analyser utförs med hjälp av dem. Två alikvoter av tvättbuffert tillsätts sedan i tur och ordning. När det slutliga alikvot av tvättbuffert har helt kommit in i enheten,analysen anses komplett. De tre skikten är då skalas bort för att avslöja den infångningsskiktet (figur 3A). Detta steg irreversibelt skadar enheten se till att det inte kan användas igen. Färdigställandet av en pappersbaserad immunresulterar i en kvalitativ färg avläsning som kan tyda på en negativ eller positiv utgång vid visuell inspektion. Objektivitet dessa resultat framgår i okorrigerade bilder som förvärvats med hjälp av en flatbäddsskanner (Figur 3B).
Misslyckade försök kan ofta lyfta fram vissa procedursteg vars betydelse kan vara annorlunda omärkligt när analysen av ett experiment fokuserar på framgångsrika resultat. Vi visar tre fel i tillverkning och montering av tredimensionella pappersbaserade mikroflödessystem enheter som resulterar i fel i immun: (i) Ibland, enhets misslyckanden är inte uppenbara förrän efter en analys är klar. Till exempel, en misalignment mellan skikt som innefattar inkubationen kanalen och infångningszonen kan orsaka utveckling av ett oregelbundet mönster i den positiva signalen, vilket kan resultera i en felaktig tolkning av den kvalitativa signalen av en användare (Figur 4A). (Ii) Om vaxet inte är tryckt i en tillräcklig mängd eller ej att smälta helt genom hela tjockleken på papperet, då integriteten hos de resulterande hydrofoba hinder kan äventyras. Ofullständig bildning av dessa hinder kommer att orsaka en förlust av kontroll över uppsugning och leda till läckage i enheten. Till exempel, istället för att begränsa flödet till en kanal inom ett skikt, kommer ett semipermeabelt vaxbarriär tillåta fluid att sugas på andra ställen i papperets plan. Utan definierade kanaler, är det osannolikt att nå fånga eller tvättskikt provet. Användaren kommer att uppfatta denna typ av fel som en kraftigt förkortad analys varaktighet. Vi visar här enheten fel genom att tillämpa en lösning av röd karamellfärg till en layer vars vaxmodell tilläts inte smälta för hela 30 sekunder (Figur 4B). En immunanalys med användning sådant skikt var "färdig" i sex minuter, vilket är klart annorlunda än den förväntade varaktigheten av 15 min. (Iii) Analyser som tar längre tid än väntat att slutföra kan tyda på ett fel i tillverkningen av en enhet. Till exempel, felaktigt skära lim eller ockluderade porer på grund av tillämpningen av en överdriven mängd reagens (t.ex. blockeringsmedel eller kolloidalt guld) kan förbjuda ett prov eller tvättbuffert från att komma in i enheten (Figur 4C).
Sammantaget är vår tillverkningsprotokoll användbar för att tillverka ett stort antal pappersbaserade mikroflödessystem enheter parallellt på en skala som är användbar för en akademisk laboratorium. Vi visar utförandet av hCG pappersbaserade immunställdes med användning av denna metod genom att utföra 70 analyser parallellt: 35 negativa replikat och 35 positiva replicates. Vid tillämpningen av denna demonstration utarbetade vi en uppsättning av skikt med utformningen av vår enhet, anbringat lager av papper med lim, och sedan skära arken i rader av enheter. Varje ark skars till 7 rader, som innehöll tio enheter. Detta underlättade arrangemanget av skikt på de mindre akryl ramar där skikten är tejpade och sedan behandlas med reagens som behövs för att utföra analyserna. Denna metod för enhet framställning föreslås i en anteckning i protokollet. Efter behandlingen av skikt konstruerades anordningen monteras i remsor av tio och lamineras sedan. Efter den slutliga anordningen tillverkningssteg genomfördes, anordningarna förblev i remsorna av tio och prov sattes till varje enhet. Vi observerade en 0% felfrekvens för enheter tillverkas med hjälp av våra protokoll. Vi använde en öppen källkod bildbehandlingsprogram 20 för att kvantifiera resultaten av dessa analyser. Även om ett antal metoder finns tillgängliga för att analysera intensitetsutdelningsjon i runda fläckar (t.ex. radiella eller linjära distributioner) 21 mäter vi medelintensiteten från den gröna kanalen av en RGB-bild av enheten med hjälp av hela detekterings plats som ett område av intresse. 17, 18, 19 Vi normalisera sedan mätningarna av både positiva och negativa analyser genom att subtrahera rå negativa data (Figur 3B). Vi bestämde variationskoefficienten för varje datauppsättning för att vara 1% för analyser utfördes med användning av negativa prov och 3% för analyser utfördes med användning av positiva prover.
Figur 1: Schematisk bild av tredimensionella pappersbaserad anordning. Illustrationen visar de hydrofoba och hydrofila regioner som definierar fluidvägen i anordningen, liksom pattleras lager av permanent och avtagbart lim som håller ihop lagren. Varje skikt är märkt av funktionen därav i analysen. Den röda, blå eller gröna kontur på varje lager indikerar det material som används för att tillverka den specifika skikt (red: kromatografi papper, blå: nylonmembran, grön: tjock kromatografi papper). Dimensioner ges för varje zon i anordningen i mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Förfarande som används för att tillverka immun från tredimensionella pappersbaserade mikroflödessystem enheter. (A) Bilder av fram- och baksidan av ett ark av kromatografi papper mönstrade med hjälp av vax utskrift före och efter uppvärmning. (B) Ett ark av kromatografipapperbackas upp med en film av mönstrat lim. (C) Behandlingar anbringas på de hydrofila zoner av en remsa av mönstrad nylonmembran. (D) Montering av remsor av en flerskiktsanordning med hjälp av en ljuslåda och inriktningshål som en guide. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tolka resultatet av en pappersbaserad immunanalys. (A) De översta tre skikt av det pappersbaserade enheten skalas tillbaka för att exponera infångningsskiktet och tolka resultaten av analysen. (B) Grafisk representation av hur ett pappersbaserat immun för hCG. Resultaten som visas är medeltal av 70 replikat utförs samtidigt, där 35 replikat vardera används for positiva och negativa prov av hCG. Felstaplar representerar standardavvikelsen för datauppsättningen. Okorrigerade, representativa bilder som skildrar positiv (röd färg) och negativa (vit färg) resultat från en hCG immun visas ovanför respektive uppgifter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Exempel på tillverkningsfel. (A) På grund av snedställning av den laterala kanalen ovanför infångningsskiktet är positiv signal koncentrerad till ett litet område i avläsningszonen. En "våt" cirkulärt område (streckad kontur) kan observeras till höger om utläsningen zonen till följd av kontakt mellan den felinriktade lateral kanal med infångningsskiktet (vänster). Bilden av en positiv avläsning påinfångningsskikt av en korrekt inriktad anordning (höger). (B) Ofullständig smältning av vax genom hela tjockleken hos ett skikt kan leda till läckage i anordningen. Karamellfärg har lagts till lösningen för att hjälpa till med visualisering av provet i skikt med ofullständiga eller helt formade hydrofoba barriärer. (C) Felaktigt skära limmet kan blockera fluidic nätverket mellan skikt av papper, som stoppar flödet av ett prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Tillverkning tredimensionella pappersbaserade mikroflödessystem enheter. Den schematiska visar montering och laminering av flera skikt av mönstrat papper i förda tredimensionella anordningar. I detta exempel, 70 enheter cen göras samtidigt. Skikten av adhesiva och inriktningshål har tagits bort från den schematiska i förenklingssyfte. Efter montering, kan enskilda enheter tas bort och användas i analyser. De röda, blå och gröna konturer på varje skikt indikerar det material som används för att tillverka den specifika skikt (red: kromatografi papper, blå: nylonmembran, grön: tjock kromatografi papper). Scale bar = 25 mm med undantag av den separata enheten (höger), som har dimensionerna 12 x 28 mm 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifiera en reproducerbar tillverkningsstrategi är en viktig del av analysutveckling. 22 Vi använder en sekventiell, skikt-för-skikt tillvägagångssätt för tillverkning av tredimensionella pappersbaserade mikrofluidikanordningar. I motsats till de metoder som gäller fällbara eller origami tekniker för att producera flerskikts enheter från ett enda pappersark 23, erbjuder 24 additiv tillverkning en rad fördelar: (i) Flera material kan införlivas i en enda enhet arkitektur utan modifiering av metoder för tryckning, justering eller montering av lager. (Ii) Mönstrade limfilmer kan integreras i monteringsprocessen. Dessa filmer anbringa intilliggande skikt, och, baserat på styrkan hos den adhesiva, kan vara reversibel för att möjliggöra avdragning och utvärdering av interna skikt. Dessutom lim ger strukturell integritet till den tredimensionella enhet, vilket utesluter behovetför bindemedel 25 klipp eller bearbetade höljen. 23 (iii) Enskilda ark US Letter kromatografi papper rymmer en rad upprepningar, som i hög grad kan förbättra genomströmningen av laboratorieskala tillverkning (Figur 5). Detta är särskilt fördelaktigt när man utvärderar ett stort antal experimentella betingelser som kräver tekniska replikat. Genom detta tillvägagångssätt, kan 70 tredimensionella pappersbaserade anordningar framställas samtidigt. (iv) Liknande flerskiktslamine metoder används för stora volymer tillverkning av många kommersiella produkter inom hälso- och sjukvården (t.ex. sårvård dressingar och depotplåster), vilket följaktligen sänker produktions hinder för att översätta dessa tredimensionella pappersbaserade mikroflödessystem enheter.
Förutom att underlätta skalning och montering, är också kritisk för utformning av den tredimensionella fluidic nätverk valet av vidhäftningsmedel. En annonshesive filmen kan tjäna som en ytterligare barriär mellan skikt av papper, vilket kan göra det möjligt för maskering av hydrofila zoner på intilliggande skikt. I praktiken är det önskvärt att använda tunna skikt av bindemedel. Om limmet är för tjock (t.ex. många dubbelsidiga tejper), då gapet som bildas mellan lager av papper kommer att vara för stor för att underlätta uppsugning och måste fyllas med en hydrofil substans (t.ex., cellulosapulver) att återfå funktion. 12 Även om detta ytterligare steg ökar komplexiteten att tillverka och det ämne som används kan störa vissa analyser, dessa luckor blir en användbar funktion för produktion av kontrollerbara, fluidtryck ner ventiler. 15 Andra former av adhesiv har använts vid framställning av tredimensionella pappersbaserade mikrofluidikanordningar. Självhäftande sprayer erbjuder en enkel metod för att fästa skikten till varandra. 26 Med denna metod är det vidhäftande materialet appliceras jämnt på båda than hydrofoba och hydrofila områden av papperet. En fördel med denna metod är att det inte behövs ytterligare utrustning (t.ex. kniv plotter eller laserskärare) för att utforma mönstret för det adhesiva skiktet. Dock måste villkoren för en enhetlig tillämpning av limmet sprut bestämmas experimentellt för varje typ av material som används. Topografin av materialet kan påverka den bindemedelsmaterialet gränssnitt och längre spruttider kan behövas för grövre ytor. Dessutom kan sprutning lim på de hydrofila zoner av fluidic pathway resultera i försämrad uppsugning genom att förändra vätbarheten av papperet. Alternativt kan användningen av schabloner 27 eller screentryck 8 användas mönster lim direkt på lager av mönstrat papper.
Två viktiga överväganden för utveckling av tredimensionella pappersbaserade mikrofluidikanordningar är valet av material och utformning av den fluidic nätverk. (I) Vi väljer material och kombinationer av material baserade på uppsugningshastighet, våtstyrka, tjocklek, och proteinbindande förmåga. Uppsugningshastighet kan påverka varaktigheten av en analys och mängden tid reagenser måste reagera eller binda inom ett lager. Olika kvaliteter av papper kännetecknas av wicking avgifter baserade på, till exempel, vid behandling av pappret, dess porositet och dess tjocklek. Det är möjligt att använda flera skikt av papper för att öka den effektiva uppsugningshastighet av en anordning. 28 En god våtstyrka är önskvärt för applikationer som kräver hantering (t.ex. skalar en RIA) efter det att enheten har mättats med ett prov. Material som är för tjockt eller som inte kan passera genom kommersiella skrivare på grund av instabilitet kommer att kräva en alternativ metod för att framställa mönstrade kanaler (t.ex. fotolitografiska). Men däremot tjockare material är idealiska för blot skikt (eller sänkor) att dra fluider genom the enhet. Många kvaliteter av nylonmembran är tillgängliga kommersiellt, vilka kan skilja sig i sin förmåga att binda proteiner irreversibelt till infångningszonen. Materialbyten (t.ex. nitrocellulosa i stället för ett nylonmembran) kan också påverka bindningskapacitet, vilket kan påverka analysens känslighet. (ii) Användningen av symmetri i utformningen av fluidiska nätverken säkerställer att de unika kanaler mönstrade till tredimensionella enheter uppför sig identiskt (t.ex., fyllas samtidigt), som är kritisk för multiplexerade analyser. 19 Symmetri förenklar ytterligare layer design, bistår med lager justering vid montering fulla ark enheter och kan minimera avfallet. Modifieringar av anordningens utformning kan påverka utförandet av analysen. Till exempel, kommer att öka längden av den laterala kanalen i inkubationen skiktet påverkar varaktigheten av analysen, eftersom fluiden kommer att suga en proportionellt längre sträcka innan den når outlet. 17 I applikationer som förlitar sig på bindningen av en målbiomolekyl, kan en längre analystid vara fördelaktigt eftersom det kan öka den fraktion av bundna, märkta ämnen före immobilisering på infångningsskiktet.
Sammanfattningsvis har vi presenterat en metod för att tillverka tredimensionella pappersbaserade mikroflödes enheter som stöder utvecklingen av immun. Denna metod, som använder en typ av additiv tillverkning för att producera flerskikts enheter underlättar produktionen av enheter en skala som är lämplig för laboratorieforskning. Protokollet som beskrivs i detta manuskript är specifik för pappersbaserade immun enheter; räknar vi dock med de förfaranden för montering av dessa immun-vax utskrift, mönstring lim, anpassa lager, och laminering-kommer att vara lätt utdragbara för många tredimensionella pappersbaserade mikroflödessystem enhet arkitekturer. En förståelse av tillverkningsmetod kan ledatill utveckling av nya point-of-care analyser med ett brett spektrum av tillämpningar inom hälsovård, miljö och jordbruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Illustrator CC | Adobe | to design patterns for layers of paper and adhesive | |
| Xerox ColorQube 8580 printer | Amazon | B00R92C9DI | to print wax patterns onto layers of paper and Nylon |
| Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven | Fisher Scientific | 15-103-0509 | to melt wax into paper |
| Artograph LightTracer | Amazon | B000KNHRH6 | to assist with alignment of layers |
| Apache AL13P laminator | Amazon | B00AXHSZU2 | to laminate layers together |
| Graphtec CE6000 Cutting Plotter | Graphtec America | CE6000-40 | to pattern adhesive films |
| Swingline paper cutter | Amazon | B0006VNY4C | to cut paper or devices |
| Epson Perfection V500 photo scanner | Amazon | B000VG4AY0 | to scan images of readout layer |
| economy plier-action hole punch | McMaster-Carr | 3488A9 | to remove alignment holes |
| Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4 | Sigma Aldrich | WHA1004917 | |
| Fisherbrand chromatography paper (thick) | Fisher Scientific | 05-714-4 | to function as blot layer |
| Immunodyne ABC (0.45 µm pore size ) | Pall Corporation | NBCHI3R | to function as material for capture layer |
| removable/permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF021621 | to facilitate peeling |
| permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF051521 | |
| wax liner | FLEXcon | FLEXMARK 80 D/F PFW LINER | to assist with patterning adhesive |
| acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | to fabricate frame |
| self-adhesive sheets | Fellowes | CRC52215 | to use as protective slip |
| absolute ethanol | VWR | 89125-172 | to sanitize work area |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 0332 | |
| Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls | Fisher Scientific | 22-071-066 | to use as positive and negative samples |
| anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1) | Arista Biologicals | CGBCG-0701 | to treat conjugate layer |
| goat anti-α-hCG antibody | Arista Biologicals | ABACG-0500 | to treat capture layer |
| 10X phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Oxoid skim milk powder | Thermo Scientific | OXLP0031B | |
| Tween 20 | AMRESCO | M147 |
References
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 8 (12), 2146-2150 (2008).
- Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 81 (16), 7091-7095 (2009).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. 46 (8), 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Diagnostics for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Chem. 82 (1), 2-10 (2010).
- Cate, D. M., Adkins, J. A., Mettakoonpitak, J., Henry, C. S. Recent developments in paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 87 (1), 19-41 (2015).
- Li, X., Ballerini, D. R., Shen, W. A perspective on paper-based microfluidics: Current status and future trends. Biomicrofluidics. 6, 011301 (2012).
- Lisowski, P., Zarzycki, P. K. Microfluidic paper-based analytical devices (µPADs) and micro total analysis systems (µTAS): Development, applications and future trends. Chromatographia. 76, 1201-1214 (2013).
- Pollock, N. R., et al. A paper-based multiplexed transaminase test for low-cost, point-of-care liver function testing. Sci. Transl. Med. 4 (152), 152ra129 (2012).
- Mentele, M. M., Cunningham, J., Koehler, K., Volckens, J., Henry, C. S. Microfluidic paper-based analytical device for particulate metals. Anal. Chem. 84 (10), 4474-4480 (2012).
- Weaver, A. A., et al. Paper analytical devices for fast field screening of beta lactam antibiotics and antituberculosis pharmaceuticals. Anal. Chem. 85 (13), 6453-6460 (2013).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Vella, S. J., et al. Measuring markers of liver function using a micro-patterned paper device designed for blood from a fingerprick. Anal Chem. 84 (6), 2883-2891 (2012).
- Nie, Z., Deiss, F., Liu, X., Akbulut, O., Whitesides, G. M. Integration of paper-based microfluidic devices with commercial electrochemical readers. Lab Chip. 10 (22), 3163-3169 (2010).
- Martinez, A. W., et al. Programmable diagnostic devices made from paper and tape. Lab Chip. 10 (19), 2499-2504 (2010).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper machine" for molecular diagnostics. Anal. Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Schonhorn, J. E., Fernandes, S. C., Rajaratnam, A., Deraney, R. N., Rolland, J. P., Mace, C. R. A device architecture for three-dimensional, patterned paper immunoassays. Lab Chip. 14 (24), 4653-4658 (2014).
- Fernandes, S. C., Logounov, G. S., Munro, J. B., Mace, C. R. Comparison of three indirect immunoassay formats on a common paper-based microfluidic device architecture. Anal. Methods. 8 (26), 5204-5211 (2016).
- Deraney, R. N., Mace, C. R., Rolland, J. P., Multiplexed Schonhorn, J. E. patterned-paper immunoassay for detection of malaria and dengue fever. Anal. Chem. 88 (12), 6161-6165 (2016).
- Abramoff, M., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Derda, R., et al. Multizone paper platform for 3D cell cultures. PLoS ONE. 6 (5), e18940 (2011).
- Mace, C. R., Deraney, R. N. Manufacturing prototypes for paper-based diagnostic devices. Microfluid. Nanofluidics. 16 (5), 801-809 (2014).
- Liu, H., Crooks, R. M. Three-dimensional paper microfluidic devices assembled using the principles of origami. J. Am. Chem. Soc. 133 (44), 17564-17566 (2011).
- Kalish, B., Tsutsui, H. Using Adhesive patterning to construct 3D paper microfluidic devices. J. Vis. Exp. (110), e53805 (2016).
- Scida, K., Cunningham, J. C., Renault, C., Richards, I., Crooks, R. M. Simple, sensitive, and quantitative electrochemical detection method for paper analytical devices. Anal. Chem. 86 (13), 6501-6507 (2014).
- Lewis, G. G., DiTucci, M. J., Baker, M. S., Phillips, S. T. High throughput method for prototyping three-dimensional, paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 12 (15), 2630-2633 (2012).
- Kalish, B., Tsutsui, H. Patterned adhesive enables construction of nonplanar three-dimensional paper microfluidic circuits. Lab Chip. 14 (22), 4354-4361 (2014).
- Camplisson, C. K., Schilling, K. M., Pedrotti, W. L., Stone, H. A., Martinez, A. W. Two-ply channels for faster wicking in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 15 (23), 4461-4466 (2015).
