Summary
Vi detalje en metode til at fremstille tredimensionale papirbaserede mikrofluidenheder til anvendelse i udviklingen af immunoassays. Vores tilgang til enhed forsamling er en type af flerlagede, additiv produktion. Vi demonstrerer en sandwich-immunassay til at give repræsentative resultater for disse typer af papir-baserede enheder.
Abstract
Papir væger væsker autonomt skyldes kapillarvirkning. Ved mønstring papir med hydrofobe barrierer, kan transporten af fluider blive kontrolleret og styret inden for et lag af papir. Desuden stabling af flere lag af mønstret papir skaber sofistikerede tredimensionelle mikrofluide netværk, der kan støtte udviklingen af analytiske og bioanalytiske analyser. Papirbaserede mikrofluidenheder er billig, bærbar, let at bruge, og kræver ingen ekstern udstyr kan fungere. Som et resultat, de holder meget lovende som en platform for point-of-care diagnostik. For at kunne vurdere anvendeligheden og analytisk ydeevne papir-baserede enheder, skal der udvikles egnede metoder for at sikre deres fremstilling er reproducerbar og på en skala, der er passende for laboratoriet indstillinger. I dette manuskript, en fremgangsmåde fabrikere en generel enhed arkitektur, der kan anvendes til papirbaserede immunoassays er beskrevet. Vi bruger en form for additiv manufacturing (flerlags laminering) at forberede enheder, der omfatter flere lag mønstret papir og mønstret klæbemiddel. Ud over at demonstrere den korrekte anvendelse af disse tredimensionelle papirbaserede mikrofluidenheder med en immunoassay for humant choriongonadotropin (hCG), er fejl i fremstillingsprocessen, der kan resultere i enhedens fiaskoer diskuteret. Vi forventer, at denne tilgang til fremstilling af papir-baserede enheder vil finde bred anvendelighed i udviklingen af analytiske applikationer designet specielt til indstillinger begrænset ressource.
Introduction
Papir er bredt tilgængelige i en række formuleringer eller kvaliteter, der kan funktionaliseres til at tune sine egenskaber, og kan transportere væsker autonomt ved kapillarvirkning eller fugtspredende. Hvis papiret er mønstret med en hydrofob substans (f.eks fotoresist 1 eller voks 2), det sugende af fluider kan styres rumligt inden et lag af papir. For eksempel kan en anvendt vandig prøve ledes ind i et antal forskellige zoner for at reagere med kemiske og biokemiske reagenser lagret i papiret. Disse papirbaserede mikrofluidenheder har vist sig at være en nyttig platform for udvikling af bærbare og billige analytiske assays 3, 4, 5, 6, 7. Anvendelser af papirbaserede mikrofluidenheder omfatter point-of-care diagnostikef "> 8, overvågning af miljøbelastende stoffer 9, afsløring af forfalskede lægemidler 10, og delokaliseret sundhedspleje (eller" telemedicin ") i begrænset ressource indstillinger 11.
Flere lag af mønstret papir kan samles til en integreret enhed, hvor hydrofile zoner fra tilstødende lag (dvs. over eller under) tilsluttes til at danne kontinuerte fluide netværk, hvis ind- og udgange kan kobles eller venstre uafhængig. 12 Hvert lag kan omfatte et unikt mønster, som muliggør den rumlige adskillelse af reagenser og multiple assays, der skal udføres på en enkelt enhed. Den resulterende tredimensionelle mikrofluidanordning er ikke kun i stand til fugtspredende væsker til at muliggøre analytiske analyser (f.eks leverfunktionstest 13 og elektrokemisk detektion af små molekyler 14), men det kan også suphavn en række avancerede funktioner (f.eks, ventiler 15 og enkle maskiner 16) er fælles for de traditionelle mikrofluide tilgange. Vigtigt er det, fordi papiret væger væsker ved kapillarvirkning, disse enheder kan betjenes med en minimal indsats fra brugeren.
Da reagenser kan opbevares inden den tredimensionale arkitektur af en papir-baseret enhed, kan komplekse protokoller reduceres til en enkelt tilsætning af vandig prøve til en enhed. Vi har for nylig indført et generelt tredimensionalt enhed arkitektur, der kan anvendes til udvikling af papirbaserede immunoassays under anvendelse af voks-trykketeknik til at skabe mønstrede lag. 17, 18 Disse undersøgelser fokuserede på, hvordan aspekter i forbindelse med udformningen af indretningen-antal stablede lag anvendes, sammensætning af lagene, og mønsteret af den tredimensionale mikrofluid net-kontrollerede samlede prformance af immunoassay. I sidste ende, var vi i stand til at bruge disse design regler for at fremme en hurtig udvikling af en multiplex immunoassay 19. I dette manuskript, en tidligere udviklet immunassay til human choriongonadotropin (hCG; graviditet hormon) er 17 anvendes som et eksempel for at illustrere de strategier, vi har udviklet til montering og fremstilling af tredimensionelle papirbaserede immunoassays. Følgelig vi fokuserer på montering og drift af en indretning snarere end udviklingen af et assay.
I et sandwich-immunassay, som er det format, der bruges til at påvise hCG, et indfangende antistof specifikt for en underenhed af hormonet overtrækkes på et fast substrat, som derefter blokeres at begrænse den ikke-specifikke adsorption af en prøve eller enhver efterfølgende reagens. Dette substrat er oftest en polystyren mikrobrønd-plade (fx til et enzymbundet immunosorbentassay eller ELISA). Prøven er dereftertilsat til en brønd og fik lov at inkubere i en tidsperiode. Efter grundig vaskning et antistof specifikt for den anden underenhed af hCG tilsat og fik lov til at inkubere. Denne påvisning antistof kan konjugeres til en kolloid partikel, enzym eller fluorofor for at frembringe et måleligt signal. Brønden vaskes igen før fortolkning af resultaterne af et assay (fx under anvendelse af en pladelæser). Mens kommercielle kit stole på denne tidskrævende flertrinsproces, kan alle disse trin udføres hurtigt i papirbaserede mikrofluidenheder med minimal indgriben til brugeren.
Den enhed, der bruges til hCG immunoassay omfatter seks aktive lag, som, fra top til bund, der anvendes til prøven kommer, konjugat opbevaring, inkubation, opsamling, vask, og blot (figur 1). Prøven tilsætning lag er lavet af groft filtrerpapir. Det letter indføring af en væskeprøve og beskytter reagenserne i konjugatet Layer fra forurening fra miljøet eller utilsigtet kontakt af brugeren. Konjugatet lag (groft filtrerpapir) holder farveproducerende reagens (f.eks kolloidt guld-mærket antistof) for immunoassay. Inkubationen lag (groft filtrerpapir) tillader prøven at rejse sideværts i planet af arket til fremme binding af analytten med reagenser, før de når det næste lag, indfangning lag. Indfangning lag (nylonmembran) indeholder ligander specifikke for analytten adsorberes på materialet. Efter assayet er udført, dette lag afsløret at muliggøre visualisering af den færdige immunkompleks. Vask lag (groft filtrerpapir) trækker overskydende væske, herunder gratis konjugerede reagenser væk fra ansigtet af capture lag ind blottet lag (tykt kromatografi papir). De seks-lag enhed holdes sammen af fem lag af mønstret, dobbeltsidet klæbende: fire lag permanent klæbemiddel bevare integriteten af monteblødte enhed og et lag af aftageligt klæbemiddel letter skrælning af indretningen til at inspicere resultatet af immunoassay om indfangning lag.
Med henblik på dette manuskript, vi bruger negative og positive kontrolprøver af hCG (0 mIU / ml og 81 mIU / mL) for at tilvejebringe repræsentative resultater af en papirbaseret immunassay, som tillader en dedikeret diskussion af forholdet mellem fabrikation metoder og udførelsen af en enhed. Ud over at demonstrere hvordan man fremstiller enheder med succes, fremhæver vi flere fabrikationsfejl, der kan føre til svigt af en enhed eller reproducerbare analyseresultater. Protokollen og diskussion beskrevet i dette manuskript vil give forskerne med værdifuld indsigt i, hvordan papirbaserede immunoassays er designet og fabrikeret. Mens vi fokuserer vores demonstration på immunoassays, forventer vi, at de retningslinjer, der præsenteres heri, vil være bredt anvendelig til fremstilling af tredimensionellsionelle papirbaserede mikrofluidenheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Papirbaserede mikrofluidapparat Lag
- Forbered mønstre for lag af papir, nylon, og klæbemidlet ved anvendelse af en grafisk design program. 6 Hvert lag kan have et andet mønster.
BEMÆRK: Mønsteret kan omfatte tilpasning huller, der ikke er nødvendige for en funktionel papirbaseret immunassay, men bistå med reproducerbar fremstilling af tredimensionelle enheder. Placering af disse huller vil variere, hvis enheder samles individuelt, strimler eller som fuldgyldige ark. Den software program, der bruges til at designe mønstre kan variere baseret på valg af mønster teknik (f.eks fotolitografi, voks trykning, eller skæring). 6 - Spray arbejdsområdet med en opløsning af 70% (v / v) ethanol og vand. Tør arbejdsområde med et rent stykke køkkenrulle.
2. Udarbejdelse af papir Lag: Sample Addition, konjugat Opbevaring, inkubation og vask Lag
- Forbered lag af groft filtrerpapir ved hjælp af en stor bordplade papir cutter. Skær en bestand ark papir i en standard papirformat at lette mønster ved hjælp af en solid ink (voks) printer. For eksempel kan en enkelt 460 x 570 mm 2 ark gøre 4 ark US Letter papir (8,5 x 11 inches 2). Håndter papir med rene handsker på alle tidspunkter for at minimere forurening.
- Læg et snit ark kromatografi papir i printeren bakken. Print tidligere designede lag (se figur 1).
BEMÆRK: Et mønster kan udskrives direkte på dette ark bruger den automatiske foder. Kun ét ark papir skal udskrives på et tidspunkt for at undgå papirstop. For alle lag, bruge "Enhanced" udskriftsindstillinger.
3. Udarbejdelse af Nylon membran lag Capture Layer
- Skær emnerullen af nylonmembran i ark (7,5 x 10 tommer 2) med en bordplade papir cutter. Vær meget forsigtig i håndteringen af nylonmembran til at bevare sin integritet og beskytte mod kopiering. Opbevar ubrugt materiale i en ekssikkator kabinet, som nylon membraner er fugt følsom.
BEMÆRK: Skær ark er smallere end US Letter papir. Fordi nylon membraner er tynde og skrøbelige, kan de ikke behandles af printeren direkte og kræver støtte. Detaljer er beskrevet nedenfor. - Ved hjælp af en voks printer, udskrive et capture lag mønster på et stykke papir og tape det til en lyskasse at tjene som et styr for positioneringen af nylonmembran. Den lyskasse hjælper tilpasningen af flere lag.
- Placer en ren ark kopipapir på det tidligere udskrevne ark kopipapir. Tape det rene ark papir til lyskassen, men ikke tape de to ark sammen.
- Placer et enkeltark af nylon-membran på rent stykke papir. Sørge for, at membranen dækker det trykte område af det nederste lag kopipapir. Tape alle fire sider af nylon-membran til buret rentkopipapir.
BEMÆRK: Sørg for, at nylon membran er flad og glat, så der er ingen problemer med udskrivning (f.eks papirstop eller ujævn udskrift af voks). Voks kan være trykt på båndet, hvor nylon membranen er fastgjort til kopipapir. Hvis dette sker, bør områder, hvor nylon er ufuldstændigt mønstrede grund tape dækning kasseres. For fremtidige præparater, kan større stykker nylon membran bruges til at undgå dette trykfejl. - Læg et ark af nylon membran (støttet af kopipapir fastgjort til det) i den manuelle foder printer bakke. Udskriv kun ét ark nylonmembran ad gangen.
BEMÆRK: Der er ingen forberedelse trin, der kræves for blot lag, da det ikke er mønstret.
4. Oprettelse Hydrofobe Barrierer i den trykte Layer
- Tape de trykte lag på en acryl ramme til selv opvarmning over og under laget, når de anbringes i en tyngdekraft konvektionsovn. Hold nylonmembran tapede tilstøtte ark kopipapir før efter voks smeltes og hydrofobe barrierer dannes.
BEMÆRK: akryl rammen er en custom-made, laserskåret stykke 1/2 ".. Tyk akryl plast To frame størrelser afhængig af antallet af enheder, der fremstilles blev brugt Den ydre kant af mindre ramme måler 11 5/8" x 2 3/4 ", og den indre hul af rammen måler 10 3/8" x 1 3/4 ". den ydre kant af den større ramme måler 11 5/8" x 8 7/8 ", og den indre hul af rammen måler 10 1/4 "x 7 7/8". det åbne, indre rum giver mulighed for selv smeltning af voks gennem hele tykkelsen af papiret. - Placer lagene i ovn ved 150 ° C i 30 sekunder, indtil voksen smelter ind i tykkelsen af papiret. Bekræft, at voksen har gennemsyret tykkelsen af papiret ved at dreje det over og kontrol for fejl i designet.
BEMÆRK: tvungen luftcirkulation ovne eller varmeplader kan også anvendes til at smelte den faste voks blæk. Smeltning gangeeller temperaturer kan variere afhængigt af opvarmningsmetode. - Fjern papiret, og nylonmembran fra akryl ramme. Også fjerne nylon membran fra støtte ark kopipapir.
5. Fremstilling af klæbelag
- Mønster dobbeltsidede ark klæbende film ved hjælp af en robot kniv plotter, ved hjælp af design filer tidligere fremstillede (trin 1.1). Beskyt ikke-tildækket klæbestof overfladen med en plade af voks liner.
BEMÆRK: dobbeltsidet klæbende bør mønstret med huller, der tillader prøven at flyde gennem lag som en kontinuerlig strømningsteknisk pathway. Voks Foringen let fjernes fra klæbemidlet, og tjener til at beskytte det mod kontamination og tåreflåd under skæring. En laserskærer eller dø tryk kan også anvendes til mønster lag af klæbende folier.
6. Sikkerhedskopiering af Device Layers med Adhesive
- Spray lyskassen med en opløsning af 70% (v / v) ethanol og vand. Tør med en ren papir tOwel.
- Tape en mønstret lag af papir eller nylon membran, der skal bakkes med klæbemiddel på lyskasse med den trykte side nedad.
- Peel ene side af beskyttende liner fra den mønstrede ark lim og fastgør den til lag af papir eller nylon membran. Brug lyskassen for at sikre korrekt tilpasning af mønstre. Tryk sammen. Placer delvis samlet enhed i en beskyttende slip.
BEMÆRK: Den beskyttende slip er et foldet stykke laminering opbakning film, der beskytter enheder fra forurening eller beskadigelse ved at sikre, at de ikke kontakte lamineringsmaskine rullerne. - Passere det resulterende to-lags montering gennem et automatisk laminator til helt trykke klæbemidlet og papir sammen, fjerne eventuelle luftlommer fra adjoined lag.
BEMÆRK: luftlommer mellem lagene af anordningen kan forstyrre enhedens integritet og fugtspredende reproducerbarhed ved at forårsage utætheder.
7. Behandling af konjugat LAyer med Reagenser til Immunoassays Før Device Assembly
- Tape konjugat lag på en acryl ramme, således at den hydrofile zone, der skal behandles, er suspenderet og ikke er i kontakt med rammen.
- Tilføj 2,5 pi 100 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) i 1x phosphatpufret saltvand (PBS) til den hydrofile zone på konjugatet lag. Lad det tørre ved stuetemperatur i 2 minutter og derefter ved 65 ° C i 5 minutter.
BEMÆRK: Denne volumen er lige nok til at fugte den zone af papiret. BSA-opløsningen hjælper til at forhindre aggregering af de kolloide nanopartikler under tørreprocessen, hvilket vil lette frigivelsen af nanopartiklerne når papiret og reagenser rehydreres ved prøven. - Tilsæt 5 pi 5 OD kolloidt guld nanopartikel konjugeret til anti-β-hCG-antistof, og gentag tørreprocessen.
BEMÆRK: Enhederne for koncentration af kolloide guld nanopartikler er ofte udtrykt som optisk densitet (OD) målt ved absorbance på λ = 540 nm. Ingen behandling er nødvendig for vægen pad før enheden forsamling i § 10.
8. Behandling af Lateral Channel med Reagens til Immunoassays Før Device Assembly
- Tape lateral kanal lag på en acryl ramme, således at den hydrofile zone, der skal behandles, er suspenderet og ikke er i kontakt med rammen.
- Tilsæt 10 pi blokerende middel (5 mg / ml fedtfri mælk og 0,1% (v / v) Tween 20 i 1 x PBS) til behandling af den laterale kanal. Gentag den samme tørringsproces (2 min ved stuetemperatur og derefter ved 65 ° C i 5 min) som konjugatet lag.
9. Behandling af Capture Layer med Reagenser til Immunoassays Før Device Assembly
- Tape capture lag på en acryl ramme, således at den hydrofile zone, der skal behandles, er suspenderet og ikke er i kontakt med rammen.
- Behandl capture lag med 5 pi 1 mg / ml anti-α-hCG-antistof ud, hvorefterprøve at tørre ved stuetemperatur i 2 minutter efterfulgt af 8 minutter ved 65 ° C.
- Tilsæt 2 pi blokerende middel (5 mg / ml fedtfri mælk og 0,1% (v / v) Tween 20 i 1 x PBS). Gentag tørringsprocessen for opsamling lag.
BEMÆRK: Dette beløb er hensigtsmæssigt at belægge papirerne uden at tilstoppe porerne i nylon membran, som kan ske, når alt bliver brugt meget blokerende middel.
10. Montering af Tre-dimensionel papir-baserede mikrofluidenheder
- Tape vask lag til lyskassen (trykte side opad). Hvis der anvendes alignment huller, fjerne dem fra efterfølgende lag ved hjælp af en håndholdt hulning værktøj.
- Fjern den beskyttende film på bagsiden af indfangning lag for at blotlægge klæbemidlet. Juster capture lag over vask lag ved hjælp af tilpasning huller som en guide. Trykke på de to lag sammen. Undgå at røre hydrofile zoner for at minimere forurening eller beskadigelse af enheden. Pincet kan anvendes til at hjælpe assembly.
- Fjern den beskyttende film på bagsiden af inkubationen lag for at blotlægge klæbemidlet. Juster inkubation lag over capture lag og tryk dem sammen. Fortsæt med at tilføje lag på denne måde, indtil alle aktive lag er samlet.
- Placer delvis samlet enhed i en beskyttende slip og fast anbringer lagene sammen ved hjælp af en lamineringsmaskine.
- Fjern den beskyttende film på bagsiden af vask lag og anbringer blot-lag til bunden af indretningen. Gentag lamineringstrin 10.4 at fuldende samlingen af den tredimensionale papirbaserede mikrofluidapparatet. Klip ønskede antal enheder fra strimler eller plader af fuldt monterede enheder ved hjælp saks.
BEMÆRK: Fuld ark enheder, strimler af enheder, eller enkelte enheder kan fremstilles ved hjælp af en lignende fremgangsmåde.
11. Udførelse af en papir-baseret immunassay
- Tilsæt 20 pi af en prøve til den hydrofile zone på toppen af indretningen (dvs. than prøve lag).
- Vente for prøven at væge helt ind i indretningen, hvorefter der tilsættes 15 pi vaskebuffer (0,05% vol / vol Tween 20 i 1x phosphatpufret saltvand). Efter den første portion af vaskebuffer har wicked helt ind i enheden, tilføje en anden 15 pi alikvot af vaskepuffer.
BEMÆRK: vaskebuffer har helt suget ind i enheden, når den flydende dråbe er forsvundet, viser ingen menisk på overfladen af papiret. Assayet er færdig, når den anden aliquot af vaskebuffer har fuldstændig ind i enheden. - At afsløre resultaterne af assayet, skalle de tre øverste lag af indretningen med en pincet for at blotlægge capture lag.
- Fortolke resultaterne af assayet kvalitativt ved at observere nærvær eller fravær af farve. Alternativt billede udlæsningen lag bruger en stationær scanner og brug billedbehandling software eller algoritmer til at kvantificere resultater og karakterisere fordelingerne af intensitet i etpåvisningszonen. 20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Indhentning reproducerbare assay forestillinger i tre-dimensionelle papirbaserede mikrofluidenheder er afhængig af en fremstillingsmetode, der sikrer sammenhæng mellem enheder. Mod dette mål, har vi identificeret en række fremstillingsprocesser og materielle overvejelser, og diskutere dem her i forbindelse med at demonstrere en papirbaseret immunoassay. Vi bruger en voks trykmetode at danne hydrofobe barrierer på papirbaserede mikrofluidenheder (figur 2A). 2 Denne metode er ideel, fordi det bygger kun på almindeligt tilgængelige kontorudstyr, kræver minimal proceduremæssige skridt til at fuldføre, og ikke kræver brug af kemikalier (f.eks fotoresister), der kan interferere med proteinadsorption eller ændre befugtningsevne papirfibre. Endvidere voks udskrivning producerer fluide veje med reproducerbare dimensioner, hvilket er afgørende for analyser med gentagelige forestillinger og varighed times. Efter de hydrofobe barrierer dannes, er klæbende ark påføres lag for at lette samling af tredimensionelle enheder (figur 2B). Eventuelle reagenser nødvendige for immunoassay kan påføres efter klæbefolien tilsættes til bagsiden af et lag (figur 2C). Denne procedure er nyttig til fremstillingsprocesser i en akademisk laboratorium, fordi mange anordninger kan fremstilles parallelt. Samlingsprocessen for en immunoassay enhed er afsluttet efter alle lag af indretningen er stablet og lamineret sammen (figur 2D). Vi tilsætter prøve at starte assayet. I dette eksempel bruger vi en urin kontrol indstillet til graviditetstests, som indeholder negative og positive prøver af hCG i buffer, som prøver at demonstrere driften af vores enheder og reproducerbarheden af analyser udført med dem. To portioner af vaskepuffer tilsættes derefter sekventielt. Når den endelige prøve af vaskebuffer har fuldstændig ind i enheden, denassay betragtes som fuldstændig. De tre øverste lag derpå skrællet bort for at afsløre indfangning lag (figur 3A). Dette trin irreversibelt skader anordning, der sikrer, at den ikke kan anvendes igen. Færdiggørelsen af en papirbaseret immunoassay resulterer i en kvalitativ farve udlæsning, der kan indikere en negativ eller positiv effekt på visuel inspektion. Den objektivitet af disse resultater er tydelig i ukorrigerede billeder erhvervet ved hjælp af en flatbed scanner (figur 3B).
Mislykkede forsøg kan ofte fremhæve visse proceduremæssige skridt, hvis betydning kan være anderledes umærkelig, når analysen af et eksperiment er fokuseret på vellykkede resultater. Vi demonstrerer tre fejl i fremstilling og samling af tredimensionelle papirbaserede mikrofluidenheder, der resulterer i svigt i immunoassay: (i) Lejlighedsvis, enhedens fejl er ikke synlige før efter en analyse er afsluttet. For eksempel en misalignment mellem lag, der omfatter inkubering kanal og indfangningszone kan forårsage udvikling af et uregelmæssigt mønster i det positive signal, hvilket kan resultere i fejlagtig fortolkning af den kvalitative signal af en bruger (figur 4A). (Ii) Hvis voks ikke er trykt i en tilstrækkelig mængde eller ikke lov til at smelte helt gennem den fulde tykkelse af papiret, så integriteten af de resulterende hydrofobe barrierer kan være kompromitteret. Ufuldstændig dannelse af disse barrierer vil medføre et tab af kontrol over fugtspredende og føre til lækager i enheden. For eksempel, i stedet for at begrænse strømning til en kanal i et lag, vil en semipermeabel voks barriere tillader fluid at væge andetsteds i papirets plan. Uden definerede kanaler, prøven er usandsynligt at nå capture eller vaske lag. Brugeren vil opfatte denne form for fejl som en stærkt forkortet assay varighed tid. Vi demonstrerer denne enhed svigt ved at anvende en opløsning af rød frugtfarve til en layer hvis voks mønster blev ikke lov til at smelte for hele 30 sek (figur 4B). Et immunoassay under anvendelse af et sådant lag blev "afsluttet" i 6 min, hvilket er klart anderledes end den forventede varighed af 15 min. (Iii) Analyser, der tager længere tid end forventet at fuldføre kan indikere en fejl ved fremstillingen af en indretning. For eksempel forkert skåret selvklæbende eller okkluderede porer på grund af anvendelsen af en stor mængde af reagenser (f.eks blokerende midler eller kolloid guld) kunne forbyde en prøve eller vaskebuffer at trænge ind i apparatet (figur 4C).
Samlet set vores produktion protokol er nyttigt at fabrikere mange papirbaserede mikrofluidenheder parallelt på en skala, der er nyttigt for en akademisk laboratorium. Vi demonstrerer udførelsen af hCG papirbaserede immunoassay fremstillet ved anvendelse af denne metode ved at udføre 70 analyser parallelt: 35 negative gentagelser og 35 positive replicates. Ved anvendelsen af denne demonstration, vi udarbejdet et sæt af lag med design af vores enhed, anbringes de lag af papir med lim, og derefter skæres arkene i rækker af enheder. Hvert ark blev skåret i 7 rækker, som indeholdt ti enheder. Dette lettede arrangementet af lag på de mindre akryl rammer, hvor lagene er tapede og derefter behandlet med reagenser, der er nødvendige for at udføre assayene. Denne fremstillingsmetode enhed er foreslået i en note i protokollen. Efter behandling af lag, blev indretningerne samlet i strimler af ti og derefter lamineret. Efter den sidste enhed fabrikationstrin blev afsluttet, indretningerne forblev i strimlerne af ti og prøven blev tilsat til hver enhed. Vi observerede en 0% fejlrate for enheder fremstillet ved hjælp af vores protokol. Vi brugte en open source billedbehandling software 20 at kvantificere resultaterne af disse analyser. Mens en række metoder til at analysere intensiteten fordelingsnøgleion i cirkulære pletter (f.eks radial eller lineære fordelinger) 21 vi måler den gennemsnitlige intensitet fra den grønne kanal af et RGB-billede af enheden ved hjælp af hele afsløring stedet som et område af interesse. 17, 18, 19 Vi derefter normalisere målingerne af både positive og negative assays ved at fratrække de rå negative data (figur 3B). Vi bestemt variationskoefficienten for hvert datasæt til at være 1% for analyser udført med negative prøver og 3% for analyser udført ved hjælp af positive prøver.
Figur 1: Skematisk af tre-dimensionelle papir-baseret enhed. Denne illustration viser de hydrofobe og hydrofile områder, der definerer strømningstekniske pathway i anordningen, samt pattregeres lag af permanent og aftagelig lim, der holder lagene sammen. Hvert lag er mærket af den funktion den udfører i assayet. Det røde, blå eller grønne kontur på hvert lag angiver det anvendte materiale til at fremstille den specifikke lag (rød: kromatografi papir, blå: nylonmembran, grøn: tykt kromatografi papir). Dimensionerne er anført for hver zone i indretningen i mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Procedure brugt til at fremstille immunassays fra tredimensionale papirbaserede mikrofluidenheder. (A) Billeder af forsiden og bagsiden af et ark kromatografi papir mønstret ved anvendelse voks trykning før og efter opvarmning. (B) Et ark af kromatografi papirstøttet med en film af mønstret klæbemiddel. (C) Behandling påføres de hydrofile zoner af en strimmel af mønstret nylonmembran. (D) Montering af strimler af en flerlaget anordning ved hjælp af en lyskasse og tilpasning huller som en vejledning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: fortolkning af resultater af en papirbaseret immunoassay. (A) De tre øverste lag af papir-baseret enhed skrælles tilbage for at blotlægge indfangning lag og fortolke resultaterne af assayet. (B) Grafisk fremstilling af udførelsen af en papir-baseret immunassay til hCG. Resultaterne afbildet er gennemsnittene af 70 gentagelser udføres samtidigt, hvor 35 replikater hver anvendes for positive og negative prøver af hCG. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af datasættet. Ukorrigerede, repræsentative billeder skildrer positive (rød farve) og negative (hvid farve) resultater fra en hCG immunoassay er vist ovenfor deres respektive data. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksempler på fabrikationsfejl. (A) Da fejljustering af den laterale kanal ovenfor indfangning lag, er det positive signal koncentreret i et lille område af udlæsning zone. En "våd" cirkulære område (stiplet omrids) kan observeres til højre for udlæsning zone som følge af kontakt mellem skævt laterale kanal med opsamling lag (venstre). Billede af en positiv udlæsning påindfangning lag af en korrekt afstemt indretning (højre). (B) Ufuldstændig smeltning af voks i hele tykkelsen af et lag kan føre til lækager i indretningen. Levnedsmiddelfarvestof er blevet føjet til opløsningen for at hjælpe med visualisering af prøven i lag med ufuldstændige eller fuldt dannede hydrofobe barrierer. (C) Forkert skåret klæbemiddel kan blokere fluidik netværk mellem lag af papir, som stopper strømningen af en prøve. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Produktion tredimensionale papirbaserede mikrofluidenheder. Den skematiske afbilder montering og laminering af flere lag mønstret papir i afsluttede tredimensionale enheder. I dette eksempel 70 enheder cen ske samtidigt. Lagene af klæbende og tilpasning huller er blevet fjernet fra den skematiske for forenklingens skyld. Efter samling kan individuelle anordninger fjernes og anvendes i assays. De røde, blå og grønne linjer på hvert lag angiver det materiale, der anvendes til at fremstille den specifikke lag (rød: kromatografi papir, blå: nylon membran, grøn: tykt kromatografi papir). Scale bar = 25 mm med undtagelse af den separate enhed (højre), som har dimensioner på 12 x 28 mm 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifikation af en reproducerbar produktionsstrategi er et væsentligt element i analysen udvikling. 22 Vi bruger en sekventiel, lag-på-lag tilgang til at fremstille tredimensionale papirbaserede mikrofluidenheder. I modsætning til de fremgangsmåder, der anvender foldning eller origami til frembringelse flerlagede enheder fra et enkelt ark papir 23, 24 additiv fremstilling giver en række fordele: (i) flere materialer kan inkorporeres i en enkelt indretning arkitektur uden ændringer fremgangsmåder til trykning, tilpasning, eller samling af lag. (Ii) Mønstrede klæbende film kan integreres i samleprocessen. Disse film anbringer tilstødende lag, og, baseret på styrken af klæbemidlet, kan være reversibel for at muliggøre skrælning og evaluering af interne lag. Desuden klæbemidler tilvejebringelse af strukturel integritet til det tredimensionale anordning, der udelukker behovetfor bindemiddel 25 klip eller bearbejdede kabinetter. 23 (iii) Individuelle ark US Letter kromatografi papir kan rumme en bred vifte af replikater, hvilket i høj grad kan forbedre gennemløb af laboratorie-skala produktion (figur 5). Dette er især en fordel, når de evaluerer en lang række eksperimentelle betingelser, der kræver tekniske replikater. Ved denne fremgangsmåde kan 70 tredimensionelle papirbaserede indretninger fremstilles samtidigt. (iv) anvendes Tilsvarende flerlaget Laminater tilgange til højvolumen fremstilling af talrige kommercielle produkter i sundhedssektoren (f.eks sårpleje forbindinger og transdermale plastre), hvilket følgelig sænker produktionen barriere for at omsætte disse tredimensionale papirbaserede mikrofluidenheder.
Ud over at lette afskalning og samling, valget af klæbemiddel er også kritisk til design af den tredimensionale strømningsteknisk netværk. En annonceklæberkobling film kan tjene som en yderligere barriere mellem lag af papir, som kan aktivere maskering af hydrofile zoner på tilstødende lag. I praksis er anvendelsen af tynde lag af klæbemiddel er ønskelig. Hvis limen er for tyk (f.eks mange dobbeltsidet bånd), så mellemrummet dannet mellem lag af papir vil være for store til at lette vægevirkning og skal udfyldes med et hydrofilt stof (f.eks, cellulosepulver) at genvinde funktion. 12 Mens dette yderligere skridt tilføjer kompleksitet til at fremstille og det stof, der anvendes kan forstyrre nogle analyser, disse huller bliver en nyttig funktion til produktion af styrbare, fluide push-down ventiler. 15 Andre former for klæbemiddel er blevet anvendt til fremstilling af tredimensionale papirbaserede mikrofluidenheder. Klæbende sprays tilbyde en simpel metode til at påføre lag til hinanden. 26. Ved anvendelse af denne metode, er det klæbende materiale påføres ensartet på både than hydrofobe og hydrofile område på papiret. En fordel ved denne metode er, at ekstra udstyr (fx kniv plotter eller laserskærer) ikke er nødvendig for at udforme mønstret for klæbelaget. Dog skal betingelserne for en ensartet anvendelse af den klæbende spray bestemmes eksperimentelt for hver type materiale, der anvendes. Topografien af materialet kan påvirke selvklæbende materiale interface og kan være behov for længere spray tider for grovere overflader. Derudover kan sprøjtning klæbemiddel på de hydrofile zoner af strømningsteknisk pathway resulterer i hæmmet vægevirkning ved ændring befugteligheden af papiret. Alternativt kan brugen af stencils 27 eller serigrafi 8 anvendes til mønster klæbemiddel direkte på lag af mønstret papir.
To vigtige overvejelser i forbindelse med udviklingen af tredimensionelle papirbaserede mikrofluidenheder er valget af materialer og udformningen af bomuld, lidic netværk. (I) Vi udvælger materialer og kombinationer af materialer baseret på vægevirkningshastighed, vådstyrke, tykkelse, og protein-bindingskapacitet. Vægevirkningshastighed kan påvirke varigheden af et assay, og mængden af tid reagenser reagere eller binde i et lag. Forskellige kvaliteter af papir er karakteriseret ved vægevirkning satser baseret på for eksempel behandling af papiret, dets porøsitet, og dens tykkelse. Det er muligt at anvende flere lag papir for at øge den effektive vægevirkningshastighed af en indretning. 28 En god våd styrke er ønskelig til applikationer, der kræver håndtering (f.eks peeling et immunoassay), efter at enheden er blevet mættet med en prøve. Materialer, der er for tykt eller som ikke kan føres gennem kommerciel printer på grund af skrøbelighed vil kræve en alternativ metode til at producere mønstrede kanaler (f.eks fotolitografiske). Men i modsætning, tykkere materialer er ideelle til blot-lag (eller dræn) at høste fluider gennem the enhed. Mange kvaliteter af nylonmembraner er kommercielt tilgængelige, som kan afvige i deres evne til at binde proteiner irreversibelt til indfangningszonen. Materialesubstitutioner (f.eks nitrocellulose stedet for en nylonmembran) kan også påvirke bindingskapacitet, som kan påvirke analysens følsomhed. (ii) Anvendelsen af symmetri i designet af strømningstekniske netværk sikrer, at de unikke kanaler mønstrede til tredimensionelle enheder opføre sig ens (f.eks fyldt samtidigt), som er afgørende for multiplex assays. 19 Symmetry forenkler yderligere lag design, hjælper med lag tilpasning ved montering fulde ark enheder, og kan minimere spild. Modifikationer af enheden design kan påvirke analysens ydeevne. For eksempel vil forøgelse af længden af den laterale kanal i inkubationen lag indflydelse på varigheden af assayet, fordi væsken vil opsuge en forholdsmæssigt længere afstand, før de når outlet. 17 I applikationer der er baseret på binding af et target biomolekyle kan en længere assaytid være fordelagtig, fordi den kan øge den del af bundne, mærkede arter før immobilisering om indfangning lag.
Som konklusion har vi præsenteret en metode til fremstilling af tredimensionelle papirbaserede mikrofluidenheder, som støtter udviklingen af immunoassays. Denne fremgangsmåde, som anvender en type additiv fremstilling til at producere flerlags anordninger letter produktionen af enheder på en skala, der er egnet til laboratorieundersøgelser. Den i dette manuskript protokol er specifik for papirbaserede immunoassay-enheder; dog forventer vi de procedurer, der vedrører montering af disse immunoassays-voks trykning, mønstring klæbemiddel, justering lag, og laminering-vil være let udvides til en lang række tredimensionelle papirbaserede mikrovæskeanordning arkitekturer. En forståelse af fabrikation metode kan føretil udviklingen af nye point-of-care analyser med en bred vifte af applikationer inden for sundhedspleje, miljø og landbrug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Illustrator CC | Adobe | to design patterns for layers of paper and adhesive | |
| Xerox ColorQube 8580 printer | Amazon | B00R92C9DI | to print wax patterns onto layers of paper and Nylon |
| Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven | Fisher Scientific | 15-103-0509 | to melt wax into paper |
| Artograph LightTracer | Amazon | B000KNHRH6 | to assist with alignment of layers |
| Apache AL13P laminator | Amazon | B00AXHSZU2 | to laminate layers together |
| Graphtec CE6000 Cutting Plotter | Graphtec America | CE6000-40 | to pattern adhesive films |
| Swingline paper cutter | Amazon | B0006VNY4C | to cut paper or devices |
| Epson Perfection V500 photo scanner | Amazon | B000VG4AY0 | to scan images of readout layer |
| economy plier-action hole punch | McMaster-Carr | 3488A9 | to remove alignment holes |
| Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4 | Sigma Aldrich | WHA1004917 | |
| Fisherbrand chromatography paper (thick) | Fisher Scientific | 05-714-4 | to function as blot layer |
| Immunodyne ABC (0.45 µm pore size ) | Pall Corporation | NBCHI3R | to function as material for capture layer |
| removable/permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF021621 | to facilitate peeling |
| permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF051521 | |
| wax liner | FLEXcon | FLEXMARK 80 D/F PFW LINER | to assist with patterning adhesive |
| acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | to fabricate frame |
| self-adhesive sheets | Fellowes | CRC52215 | to use as protective slip |
| absolute ethanol | VWR | 89125-172 | to sanitize work area |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 0332 | |
| Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls | Fisher Scientific | 22-071-066 | to use as positive and negative samples |
| anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1) | Arista Biologicals | CGBCG-0701 | to treat conjugate layer |
| goat anti-α-hCG antibody | Arista Biologicals | ABACG-0500 | to treat capture layer |
| 10X phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Oxoid skim milk powder | Thermo Scientific | OXLP0031B | |
| Tween 20 | AMRESCO | M147 |
References
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 8 (12), 2146-2150 (2008).
- Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 81 (16), 7091-7095 (2009).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. 46 (8), 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Diagnostics for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Chem. 82 (1), 2-10 (2010).
- Cate, D. M., Adkins, J. A., Mettakoonpitak, J., Henry, C. S. Recent developments in paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 87 (1), 19-41 (2015).
- Li, X., Ballerini, D. R., Shen, W. A perspective on paper-based microfluidics: Current status and future trends. Biomicrofluidics. 6, 011301 (2012).
- Lisowski, P., Zarzycki, P. K. Microfluidic paper-based analytical devices (µPADs) and micro total analysis systems (µTAS): Development, applications and future trends. Chromatographia. 76, 1201-1214 (2013).
- Pollock, N. R., et al. A paper-based multiplexed transaminase test for low-cost, point-of-care liver function testing. Sci. Transl. Med. 4 (152), 152ra129 (2012).
- Mentele, M. M., Cunningham, J., Koehler, K., Volckens, J., Henry, C. S. Microfluidic paper-based analytical device for particulate metals. Anal. Chem. 84 (10), 4474-4480 (2012).
- Weaver, A. A., et al. Paper analytical devices for fast field screening of beta lactam antibiotics and antituberculosis pharmaceuticals. Anal. Chem. 85 (13), 6453-6460 (2013).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Vella, S. J., et al. Measuring markers of liver function using a micro-patterned paper device designed for blood from a fingerprick. Anal Chem. 84 (6), 2883-2891 (2012).
- Nie, Z., Deiss, F., Liu, X., Akbulut, O., Whitesides, G. M. Integration of paper-based microfluidic devices with commercial electrochemical readers. Lab Chip. 10 (22), 3163-3169 (2010).
- Martinez, A. W., et al. Programmable diagnostic devices made from paper and tape. Lab Chip. 10 (19), 2499-2504 (2010).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper machine" for molecular diagnostics. Anal. Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Schonhorn, J. E., Fernandes, S. C., Rajaratnam, A., Deraney, R. N., Rolland, J. P., Mace, C. R. A device architecture for three-dimensional, patterned paper immunoassays. Lab Chip. 14 (24), 4653-4658 (2014).
- Fernandes, S. C., Logounov, G. S., Munro, J. B., Mace, C. R. Comparison of three indirect immunoassay formats on a common paper-based microfluidic device architecture. Anal. Methods. 8 (26), 5204-5211 (2016).
- Deraney, R. N., Mace, C. R., Rolland, J. P., Multiplexed Schonhorn, J. E. patterned-paper immunoassay for detection of malaria and dengue fever. Anal. Chem. 88 (12), 6161-6165 (2016).
- Abramoff, M., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Derda, R., et al. Multizone paper platform for 3D cell cultures. PLoS ONE. 6 (5), e18940 (2011).
- Mace, C. R., Deraney, R. N. Manufacturing prototypes for paper-based diagnostic devices. Microfluid. Nanofluidics. 16 (5), 801-809 (2014).
- Liu, H., Crooks, R. M. Three-dimensional paper microfluidic devices assembled using the principles of origami. J. Am. Chem. Soc. 133 (44), 17564-17566 (2011).
- Kalish, B., Tsutsui, H. Using Adhesive patterning to construct 3D paper microfluidic devices. J. Vis. Exp. (110), e53805 (2016).
- Scida, K., Cunningham, J. C., Renault, C., Richards, I., Crooks, R. M. Simple, sensitive, and quantitative electrochemical detection method for paper analytical devices. Anal. Chem. 86 (13), 6501-6507 (2014).
- Lewis, G. G., DiTucci, M. J., Baker, M. S., Phillips, S. T. High throughput method for prototyping three-dimensional, paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 12 (15), 2630-2633 (2012).
- Kalish, B., Tsutsui, H. Patterned adhesive enables construction of nonplanar three-dimensional paper microfluidic circuits. Lab Chip. 14 (22), 4354-4361 (2014).
- Camplisson, C. K., Schilling, K. M., Pedrotti, W. L., Stone, H. A., Martinez, A. W. Two-ply channels for faster wicking in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 15 (23), 4461-4466 (2015).
