Summary
Vi detalj en metode for å fremstille tredimensjonale papirbaserte microfluidic anordninger for bruk i utvikling av immunoanalyser. Vår tilnærming til enheten montering er en type flerlags, additiv produksjon. Vi viser en sandwich immunoassay å gi representative resultater for disse typer papirbaserte enheter.
Abstract
Papir transporterer væsker autonomt på grunn av kapillær virkning. Ved mønstring av papir med hydrofobe barrierer, kan transporten av fluider styres og rettes innenfor et lag av papir. Videre stable flere lag med mønstret papir skaper sofistikerte tredimensjonale microfluidic nettverk som kan støtte utvikling av analytiske og bioanalytical analyser. Papirbaserte microfluidic enheter er billig, bærbar, lett å bruke, og krever ingen ekstern utstyr for å operere. Som et resultat, de holder store løftet som en plattform for point-of-care diagnostikk. For å kunne vurdere nytten og analytisk ytelse av papirbaserte enheter, må utvikles egnede metoder for å sikre deres produksjon er reproduserbar og på en skala som passer for laboratorium innstillinger. I dette manuskriptet, en fremgangsmåte fabrikkere en generell enhet arkitektur som kan brukes for papirbaserte immunoanalyser er beskrevet. Vi bruker en form for tilsetningsstoff manufacturing (multi-layer laminering) for å forberede enheter som omfatter flere lag med mønstret papir og mønstret lim. I tillegg til å demonstrere riktig bruk av disse tredimensjonale papirbaserte microfluidic enheter med en immunanalyse for humant choriongonadotropin (hCG), er feil i produksjonsprosessen som kan resultere i enhetsfeil diskutert. Vi forventer at denne tilnærmingen til produksjon papirbaserte enheter vil finne bred nytte i utviklingen av analytiske applikasjoner utviklet spesielt for begrenset ressursinnstillinger.
Introduction
Papir er allment tilgjengelig i en rekke formuleringer eller karakterer, kan funksjon å stille sine egenskaper, og kan transportere væsker autonomt ved kapillær handling eller fukttransporterende. Hvis papiret er mønstret med en hydrofob substans (f.eks fotoresist en eller voks 2), veke av fluider kan kontrolleres romlig innenfor et lag av papir. For eksempel kan en anvendt vandig prøve ledes inn i et antall forskjellige soner for å reagere med kjemiske og biokjemiske reagenser lagret i papiret. Disse papirbaserte microfluidic enheter har vist seg å være en nyttig plattform for utvikling av bærbare og billig analytiske analyser 3, 4, 5, 6, 7. Anvendelser av papirbaserte microfluidic enheter inkluderer point-of-care diagnostikkef "> 8, overvåking av miljøgifter 9, påvisning av falske legemidler 10, og delocalized helsetjenester (eller" telemedisin ") i begrenset ressurs innstillinger 11.
Flere lag med mønstrede papir kan settes sammen til en integrert enhet hvor hydrofile soner fra nabolagene (dvs. over eller under) koble til å danne sammenhengende fluidic nettverk som innløp og utløp kan kobles eller venstre uavhengige. 12 Hvert lag kan omfatte et unikt mønster, som muliggjør den romlige separasjon av reagenser og multiple analyser som skal utføres på en enkelt enhet. Det resulterende tre-dimensjonale mikrofluid anordning er ikke bare i stand til fukttransporterende væske for å muliggjøre analytiske analyser (for eksempel leverfunksjonstester 13 og elektrokjemisk påvisning av små molekyler 14), men det kan også support en rekke avanserte funksjoner (for eksempel ventiler 15 og enkle maskiner 16) som er felles for tradisjonelle microfluidic tilnærminger. Viktigere, fordi papir veker væsker ved kapillær virkning, disse enhetene kan drives med minimal innsats fra brukeren.
Siden reagenser kan lagres i løpet av den tredimensjonale arkitektur av et papirbasert enhet, kan komplekse protokoller bli redusert til en enkel tilsetning av vandig prøve til en enhet. Nylig introduserte vi et generelt tre-dimensjonal anordning arkitektur som kan brukes for utvikling av papirbaserte immunoanalyser ved å bruke voks-trykketeknikk for å lage mønstret lag. 17, 18. Disse studiene fokusert på hvordan aspekter relatert til utformingen av den enhets antall av stablede sjikt anvendes, sammensetningen av lagene, og mønsteret av de tre-dimensjonale mikrofluidnettverkskontrollert den generelle perprestasjons av immunoassay. Til syvende og sist, var vi i stand til å bruke disse design regler for å lette den raske utviklingen av en multiplekset immunoassay 19. I dette manuskriptet, en tidligere utviklet immunanalyse for humant choriongonadotropin (hCG; graviditetshormonet) blir 17 brukt som et eksempel for å illustrere de strategier som vi har utviklet for montering og produksjon av tredimensjonale papirbaserte immunologiske analyser. Følgelig har vi fokus på montering og drift av en enhet i stedet for utvikling av en analyse.
I en sandwich-immunoanalyse, som er det format som brukes til bestemmelse av hCG, et fange-antistoff spesifikt for en underenhet av hormonet belegges på et fast substrat, som deretter blir sperret for å begrense den ikke-spesifikke adsorpsjon av en prøve eller en hvilken som helst etterfølgende reagens. Dette substrat er som oftest en polystyren-mikrobrønnplate (f.eks, for en enzym-bundet immunosorbent assay eller ELISA). Prøven blir derettertilsatt til en brønn og inkubert i en tidsperiode. Etter grundig vasking blir et antistoff som er spesifikt til den andre subenhet av hCG tilsatt og inkubert. Denne oppdagelse Antistoffet kan være konjugert til en kolloidal partikkel, enzym, eller fluorofor for å frembringe en målbar signal. Brønnen blir igjen vasket forut for tolkning av resultatene av en analyse (for eksempel ved anvendelse av en plateleser). Mens kommersielle kits stole på denne tidkrevende flertrinnsprosess, kan alle disse trinnene utføres raskt i papirbaserte microfluidic enheter med minimal intervensjon for brukeren.
Den enhet som brukes for hCG immunanalyse består av seks aktive lag, som er, fra topp til bunn, som brukes for prøve tillegg konjugat lagring, inkubasjon, fangst, vask, og blot (figur 1). Prøven tilsetning laget er fremstilt av kvalitativt filterpapir. Den muliggjør innføring av en væskeprøve og beskytter reagensene i konjugatet Layer mot forurensning fra miljøet eller tilfeldig kontakt med brukeren. Konjugatet lag (kvalitativt filterpapir) holder fargeproduserende reagens (for eksempel kolloidalt gull-merket antistoff) for immunoanalysen. Inkubasjonen lag (kvalitativt filterpapir) gjør det mulig for prøven å reise seg sideveis i planet av papiret for å fremme binding av analytten med reagenser før de når det neste laget, fangst lag. Fangst lag (nylonmembran) inneholder ligander som er spesifikke for analytten adsorbert til materialet. Etter at analysen er fullført, blir dette lag åpenbart for å muliggjøre visualisering av den ferdige immunkompleks. Vaske lag (kvalitative filter papir) trekker overflødig væske inkludert gratis konjugerte reagenser unna ansiktet til fange laget opp i blot lag (tykk kromatografi papir). Den seks lag enhet holdes sammen av fem lag mønstret, tosidige selvklebende: fire lag med permanent lim opprettholde integriteten til ASSEMblødde anordning og et lag av klebemiddel fjernbar letter peeling av anordningen for å kontrollere resultatene av den immunologiske måling på fangst lag.
For formålet med dette manuskriptet, bruker vi kun negative og positive kontrollprøver av hCG (0 mlU / ml og 81 mlU / ml, henholdsvis) for å tilveiebringe representative resultater av en papirbasert immunologisk analyse, som tillater en dedikert diskusjon av forholdet mellom fabrikasjon metoder og ytelsen til en enhet. I tillegg til å demonstrere hvordan å produsere enheter hell, merker vi flere fabrikasjonsfeil som kan føre til svikt i en enhet eller uforklarlige analyseresultatene. Protokollen og diskusjon beskrevet i dette manuskriptet vil gi forskere med verdifull innsikt i hvordan papirbaserte immunoassays er designet og fabrikkert. Mens vi fokusere vår demonstrasjon på immunanalyser, forventer vi at retningslinjene som presenteres her vil være bredt nyttig for produksjon av Tredimensjonasjonell papirbasert microfluidic enheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av papirbaserte mikrofluidEnhets Layers
- Forbered mønstre for lag med papir, nylon, og lim ved hjelp av en grafisk design program. 6. Hvert lag kan ha et annet mønster.
MERK: Mønsteret kan omfatte innrettingshull som ikke er nødvendig for et funksjonelt papirbasert immunoassay, men hjelpe til med den reproduserbare fremstilling av tredimensjonale enheter. Plassering av disse hullene vil variere hvis enhetene er satt sammen individuelt, i strimler, eller som hele ark. Programmet brukes til å designe mønstre kan variere basert på valg av mønster teknikk (f.eks fotolitografi, voks utskrift, eller skjæring). 6 - Spray arbeidsområdet med en oppløsning av 70% (v / v) etanol og vann. Tørk av arbeidsområdet med et rent papirhåndkle.
2. Utarbeidelse av Paper Layers: Eksempel tillegg konjugert Lagring, inkubasjon og Wash Layers
- Forbered lag av kvalitative filter papir ved hjelp av en stor bord papir cutter. Skjær et lager ark inn i en standard papirstørrelse for å lette mønster ved hjelp av en solid blekk (voks) skriver. For eksempel kan en enkelt 460 x 570 mm 2 ark gjøre 4 ark med US Letter papir (8,5 x 11 inches 2). Hold papiret med rene hansker til alle tider for å redusere forurensning.
- Last et enkeltark av kromatografi papiret inn i skriveren skuffen. Skriv ut tidligere utformet lag (se figur 1).
MERK: Et mønster kan skrives direkte på dette arket bruker automatisk mating. Bare ett ark bør skrives om gangen for å unngå papirstopp. For alle lag, bruke "Enhanced" utskriftsinnstillinger.
3. Utarbeidelse av Nylon Membran lag: Capture Layer
- Skjær lager rull med nylonmembran til ark (7,5 x 10 tommer 2) med en tabletop papir cutter. Utvis stor forsiktighet ved håndtering av nylonmembran for å opprettholde sin integritet og beskytte mot revning. Ubrukt materiale i et tørkeskap, som nylonmembraner er fuktfølsomme.
MERK: Skjær ark er smalere enn US Letter papir. Fordi nylon membraner er tynn og skjør, kan de ikke behandles av skriveren direkte og trenger støtte. Detaljer er omtalt nedenfor. - Ved hjelp av en voksskriver, skrive ut en fangst lag mønster på et stykke kopipapir og tape den til en lyskasse for å tjene som en veiledning for plassering av nylon membran. Lyskasse hjelpemidler justeringen av flere lag.
- Plasser en ren kopipapir på det forrige utskriftskopipapir. Tape den rene ark til lyskasse, men ikke tape de to arkene sammen.
- Plasser et enkeltark av nylon membran på ren stykke kopipapir. Kontroller at membran dekker trykte området på nederste laget av kopipapir. Tape alle fire sidene av nylon membranen til nullenav kopipapir.
MERK: Pass på at nylonmembran er flatt og glatt, slik at det er ingen problemer med å skrive ut (for eksempel papirstopp eller ujevn utskrift av voks). Voksen kan være trykt på båndet der nylonmembran er festet til kopipapiret. Hvis dette skjer, bør områder der nylon er ufullstendig mønstrede grunn tape dekning kastes. For fremtidige forberedelser, kan større deler av nylon membran brukes til å unngå denne utskriftsfeil. - Legg et ark av nylon membran (støttet av kopipapir festet til det) i den manuelle mate skriver magasinet. Skriv ut bare ett ark av nylon membran på en gang.
MERK: Det er ingen forberedelse trinn som kreves for blot lag, som det ikke er mønster.
4. Opprette Hydrofobe Barrierer i Trykte Layer
- Tape de trykte lag på en akryl ramme for jevn oppvarming over og under lag når det plasseres i en tyngdekraft konveksjonsovn. Hold nylonmembran tapet tilstøtte kopipapir før etter at voksen er smeltet og hydrofobe barrierene dannes.
MERK: akryl ramme er en skreddersydd, laserskåret stykke 1/2 ".. Tykk akrylplast To rammestørrelser avhengig av antall enheter som blir fabrikkert ble brukt Den ytre grensen av mindre ramme måler 11 5/8" x 2 3/4 ", og det indre hull av rammen måler 10 3/8" x 1 3/4 ". den ytre kant av den større ramme måler 11 5/8" x 8 7/8 ", og den indre hull i rammen måler 10 1/4 "x 7 7/8". den åpne, indre rom gjør det mulig for selv smelting av voks gjennom hele tykkelsen av papiret. - Plasser lagene i ovn ved 150 ° C i 30 sekunder til voksen smelter inn i tykkelsen på papiret. Bekrefte at voksen har trengt gjennom tykkelsen av papiret ved å slå den over og kontrollere for feil i design.
MERK: Forsert luftovner eller varmeplater kan også anvendes for å smelte fast voks blekk. smelte~~POS=TRUNC gangereller temperaturer kan variere avhengig av oppvarmingsmetoden. - Fjerne papiret og nylonmembran fra akryl rammen. Også fjerne nylonmembran fra støtte kopipapir.
5. Utarbeidelse av Selvklebende Layers
- Mønster dobbeltsidige ark med selvklebende filmer ved hjelp av en robot kniv plotter, ved hjelp av design-filer tidligere utarbeidet (trinn 1.1). Beskytt eksponert lim overflaten med et ark med voks liner.
MERK: tosidige selvklebende bør mønstret med hull som gjør prøven til å flyte gjennom lag som en kontinuerlig fluidic sti. Voksen liner kan lett fjernes fra limet, og tjener til å beskytte den mot forurensning og rive under skjæring. En laser kutter eller dø Pressen kan også anvendes for å mønster lag av klebefilmer.
6. Sikkerhets av enhets lag med lim
- Spray lyskasse med en oppløsning av 70% (v / v) etanol og vann. Tørk av med en ren papir tOwel.
- Tape et mønstret lag av papir eller nylon membran som må sikkerhets med lim på lyskasse med utskriftssiden ned.
- Skrelle den ene siden av beskyttelsesforing fra det mønstrede ark av klebemiddel og feste det til det lag av papir eller nylonmembran. Bruk lyset boksen for å sikre riktig justering av mønstre. Trykk sammen. Plasser delvis montert enheten til en beskyttende slip.
MERK: Den beskyttende slip er en foldet stykke laminefilmen som beskytter enheter fra forurensning eller skade ved å sikre at de ikke kontakt med lamineringsrullene. - Før resulterende to-lags montering gjennom en automatisert laminator å fullstendig trykke limet og papir sammen, fjerne eventuelle luftlommer fra adjoined lag.
MERK: Luftlommer mellom lagene i enheten kan forstyrre enheten integritet og fukttransporterende reproduserbarhet ved å forårsake lekkasjer.
7. Behandling av konjugert Layer med reagenser for immunologiske Før Device Assembly
- Tape-konjugat lag på en akryl ramme slik at den hydrofile sone som skal behandles er suspendert og ikke er i kontakt med rammen.
- Legg 2,5 ul av 100 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) til den hydrofile sone på den konjugerte laget. La det tørke i romtemperatur i 2 minutter og deretter ved 65 ° C i 5 min.
MERK: Dette volum er akkurat nok til å fukte den sone av arket. BSA løsning bidrar til å hindre aggregering av de kolloidale nanopartikler under tørkeprosessen, som vil lette frigjøringen av nanopartikler når papiret og reagenser er rehydratiseres av prøven. - Tilsett 5 ul av 5 OD kolloidalt gull nanopartikkel konjugert til anti-β-hCG antistoff, og gjenta tørkeprosessen.
MERK: Enhetene for konsentrasjon av kolloidale gull nanopartikler blir ofte uttrykt som optisk tetthet (OD) målt ved absorbance på λ = 540 nm. Ingen behandling er nødvendig for veken puten før enheten montering i § 10.
8. Behandling av Lateral Channel med Reagens for immunologiske Før Device Assembly
- Tape lateral kanal lag på en akryl ramme slik at den hydrofile sone som skal behandles er suspendert og ikke er i kontakt med rammen.
- Tilsett 10 mL av blokkerende middel (5 mg / ml ikke-fettmelk og 0,1% (v / v) Tween 20 i 1 x PBS) for å behandle den laterale kanal. Gjenta den samme tørkeprosess (2 min ved romtemperatur og deretter ved 65 ° C i 5 min) som den konjugat lag.
9. Behandling av Capture lag med reagenser for immunologiske Før Device Assembly
- Tape fange et lag på en akryl ramme slik at den hydrofile sone som skal behandles er suspendert og ikke er i kontakt med rammen.
- Behandle fangst lag med 5 ul av 1 mg / ml anti-α-hCG antistoff og deretter tillatePrøven for å tørke ved romtemperatur i 2 minutter, etterfulgt av 8 min ved 65 ° C.
- Tilsett 2 mL av blokkeringsmiddel (5 mg / ml ikke-fettmelk og 0,1% (v / v) Tween 20 i 1 x PBS). Gjenta tørkeprosessen for fangst lag.
MERK: Dette beløp er hensiktsmessig å belegge papirer uten okkludering i porene i nylonmembran, noe som kan skje når for mye blokkerende middel anvendes.
10. Montering av Tredimensjonal Papirbaserte microfluidic enheter
- Tape vaskelaget til lyskasse (utskriftssiden opp). Hvis justeringshullene blir brukt, fjerne dem fra senere lag ved hjelp av en håndholdt hulling verktøyet.
- Fjern det beskyttende film på baksiden av fangst sjikt for å eksponere klebemidlet. Juster fangst lag over vaske laget ved hjelp av justeringshullene som en guide. Trykk på de to lagene sammen. Unngå å berøre hydrofile soner for å redusere forurensning eller skade på enheten. Pinsett kan brukes til å hjelpe assembly.
- Fjern det beskyttende film på baksiden av inkubasjon sjikt for å eksponere klebemidlet. Juster inkubasjon lag over fangst lag og trykk dem sammen. Fortsett å legge lag på denne måten til alle aktive lag er montert.
- Plasser delvis montert enheten til en beskyttende slip og godt feste lagene sammen ved hjelp av en lamineringsmaskin.
- Fjern det beskyttende film på baksiden av vaskesjiktet og påføre blot sjiktet til bunnen av enheten. Gjenta lamineringstrinn 10.4 for å fullføre sammenstillingen av de tre-dimensjonale papir-baserte mikrofluid enhet. Cut ønsket antall enheter fra strimler eller ark med fullt monterte enheter ved hjelp av saks.
MERK: Full ark med enheter, strimler av enheter eller enkeltheter kan fremstilles ved hjelp av en lignende tilnærming.
11. Utføre en papirbasert Immunoassay
- Tilsett 20 ul av en prøve til den hydrofile sone på toppen av enheten (dvs. than smake lag).
- Vent til prøven til veke helt inn i enheten, og deretter legge 15 ul vaskebuffer (0,05% v / v Tween 20 i 1x fosfatbufret saltvann). Etter den første delmengde av vaskebuffer er helt onde inn i enheten, legge til en annen 15 mL delmengde av vaskebuffer.
MERK: Vaskebufferen har fullstendig ond inn i enheten når den flytende dråpen har forsvunnet, og viser ingen menisk på overflaten av papiret. Analysen er fullført når den andre alikvot av vaskebuffer er helt inn i apparatet. - For å avsløre resultatene av analysen, skrelle bort de tre beste lagene i enheten ved hjelp av pinsett for å avsløre fangstlaget.
- Tolke resultatene av analysen kvalitativt ved å observere nærvær eller fravær av farge. Alternativt bilde avlesning lag bruker en stasjonær skanner og bruk bildebehandlingsprogramvare eller algoritmer for å kvantifisere resultater og karakterfordelingene av intensitet i løpet av endeteksjonssone. 20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innhenting reproduserbare analyse forestillinger i tredimensjonale papirbaserte microfluidic enheter er avhengig av en fabrikasjon metode som sikrer konsistens mellom enhetene. Mot dette målet, har vi identifisert en rekke produksjonsprosesser og materialhensyn, og diskutere dem her i sammenheng med å demonstrere en papirbasert immunologisk analyse. Vi bruker en voks utskrift metode for å danne hydrofobe barrierer i papirbaserte microfluidic enheter (Figur 2A). 2 Denne metoden er ideell fordi den er avhengig bare på allment tilgjengelige kontorutstyr, krever minimalt med prosessuelle skritt for å fullføre, og krever ikke bruk av kjemikalier (f.eks photoresists) som kan forstyrre protein adsorpsjon eller endrer fukting av papirfibre. Videre produserer voks utskrift fluidic trasé med reproduserbare dimensjoner, noe som er avgjørende for analyser med repeterbare forestillinger og varighet times. Etter at de hydrofobe barrierene dannes, er selvklebende ark påført lag for å lette monteringen av tredimensjonale enheter (figur 2B). Eventuelle reagenser som er nødvendige for immunologisk analyse kan påføres etter at klebefilmen blir tilsatt til baksiden av et lag (figur 2C). Denne fremgangsmåten er nyttig for fabrikasjon prosesser i en akademisk laboratorium fordi mange enheter kan være forberedt parallelt. Monteringsprosessen for en immunoanalyse enhet er avsluttet etter at alle lagene i anordningen er stablet og lamineres sammen (figur 2D). Vi legger prøve å starte analysen. I dette eksempelet bruker vi en urin kontroll satt for graviditetstester, som inneholder negative og positive prøver av hCG i buffer, som eksempler for å demonstrere driften av våre enheter og reproduserbarheten av analyser utført ved anvendelse av dem. To porsjoner av vaskebuffer blir deretter tilsatt sekvensielt. Når den endelige alikvot av vaskebuffer er helt inn i apparatet, ianalysen regnes som fullført. De øverste tre lagene blir deretter skrellet bort for å avdekke fangst laget (figur 3A). Dette trinnet irreversibelt skader enheten slik at den ikke kan brukes igjen. Gjennomføringen av et papirbasert immunologiske resulterer i en kvalitativ farge avlesning som kan indikere en negativ eller positiv effekt ved visuell inspeksjon. Objektivitet av disse resultatene er tydelig i korrigerte bilder ervervet ved hjelp av en planskanner (figur 3B).
Mislykkede forsøk kan ofte fremheve visse prosessuelle skritt hvis betydning kan være ellers umerkelig når analysen av et eksperiment er fokusert på vellykkede resultater. Vi viser tre feil i produksjon og montering av tredimensjonale papirbaserte microfluidic enheter som medfører svikt i immunanalyse: (i) Av og til, enhets feil er ikke klart før etter en analyse er ferdig. For eksempel, en misalignment mellom lag som omfatter inkubering kanal og oppfangingssone kan føre til utvikling av et uregelmessig mønster i det positive signal, noe som kan resultere i feiltolkning av den kvalitative signal av en bruker (figur 4A). (Ii) Hvis voksen ikke er trykt i en tilstrekkelig mengde eller ikke tillatt å smelte helt gjennom hele tykkelsen av papiret, og integriteten av de resulterende hydrofobe barrierene kan være kompromittert. Ufullstendig dannelsen av disse barrierene vil føre til tap av kontroll over fukttransporterende og føre til lekkasjer innenfor enheten. For eksempel, i stedet for å avgrense strømnings til en kanal innenfor et lag, vil en semipermeabel barriere voks tillate fluid til veken andre steder i papirplanet. Uten definerte kanaler, er usannsynlig å nå de fange eller vaske lag prøven. Brukeren vil oppfatte denne type feil som en sterkt forkortet analysen varighet. Vi viser denne enheten svikt ved å bruke en løsning av rød konditorfarge til a layer som voks mønsteret ble ikke lov til å smelte for hele 30 sek (figur 4B). En immunanalyse ved bruk av et slikt lag er "avsluttet" i 6 min, noe som er klart forskjellig fra den forventede varighet av 15 min. (Iii) Analyser som tar lengre tid enn forventet å fullføre kan tyde på en feil i fremstillingen av en enhet. For eksempel feilaktig kuttet lim eller okkluderte porene på grunn av bruk av en overdreven mengde reagenser (f.eks blokkere eller kolloidalt gull) kunne forby en prøve eller vaskebuffer kommer inn i enheten (Figur 4C).
Samlet sett er vår produksjon protokollen nyttig å dikte mange papirbaserte microfluidic enheter i parallell på en skala som er nyttig for en akademisk laboratorium. Vi viser resultatene av hCG papirbaserte immunologisk analyse fremstilt ved hjelp av denne fremgangsmåten ved å utføre 70 analyser i parallell: 35 negative replikater og 35 positiv replicates. Ved anvendelsen av denne demonstrasjonen, utarbeidet vi et sett av lag med design av vår enhet, festet lagene av papir med lim, og deretter kutte arkene inn rader av enheter. Hvert ark ble kuttet opp i 7 rader, som inneholdt ti enheter. Dette mulig anordningen av lagene på de mindre akryl rammer hvor lagene er tapet og deretter behandlet med reagenser som trengs for å utføre analysene. Denne metoden for enheten forberedelse er foreslått i et notat i protokollen. Etter behandling av sjiktene, ble enhetene montert i strimler av ti og deretter laminert. Etter den siste enheten fremstillingstrinn ble avsluttet, forble enhetene i strimler av ti og prøve ble tilsatt til hver enhet. Vi observerte en 0% failure rate for enheter fabrikkert ved hjelp av vår protokoll. Vi brukte en åpen kildekode bildebehandlingsprogramvare 20 å kvantifisere resultatene av disse analysene. Mens en rekke metoder er tilgjengelige for å analysere intensiteten industrion i sirkulære flekker (f.eks radial eller lineære distribusjoner) 21 måler vi mener intensiteten fra den grønne kanalen av et RGB-bilde av enheten du bruker hele påvisning sted som en region av interesse. 17, 18, 19 Vi deretter normalisere målinger av både positive og negative analyser ved å subtrahere den rå negative data (figur 3B). Vi har fastslått at variasjonskoeffisienten for hvert datasett til å være 1% for analyser utført ved anvendelse av negative prøver og 3% for analyser utført ved anvendelse av positive prøver.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av tre-dimensjonale papir-basert enhet. Denne illustrasjonen viser de hydrofobe og hydrofile regioner som definerer fluidveien inne i anordningen, så vel som den patterned lag av faste og flyttbare limet som holder lagene sammen. Hvert lag er merket ved funksjonen den utfører i analysen. Den røde, blå eller grønn disposisjon på hvert lag indikerer materialet som brukes til å dikte det bestemt lag (red: kromatografi papir, blå: nylon membran, grønn: tykk kromatografi papir). Dimensjoner er gitt for hver sone i anordningen i mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Fremgangsmåte for å fremstille immunoassays fra tredimensjonale papirbaserte microfluidic enheter. (A) Bilder av forsiden og baksiden av et ark av kromatografi papir mønster ved hjelp av voks utskrift før og etter oppvarming. (B) Et ark av papir kromatografistøttet med en film av mønstret lim. (C) Behandlinger tilført de hydrofile soner av en strimmel av mønstret nylonmembran. (D) Montering av strimler av et flerlags-enhet ved hjelp av en lyskasse og justeringshullene som en veiledning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Tolking resultatene av et papirbasert immunologisk analyse. (A) De tre øverste lag av papir-basert enhet skrelles tilbake for å eksponere fangst lag og tolke resultatene av analysen. (B) Grafisk fremstilling av resultatene av en papirbasert immunologisk analyse for hCG. Resultatene er avbildet er gjennomsnitt av 70 replikater utføres samtidig hvor 35 gjentak brukes for positive og negative prøver av hCG. Feilstolpene representerer standardavviket av datasettet. Korrigert, representative bilder som viser positive (rød farge) og negative (hvite) resultater fra en hCG immunoassay er vist ovenfor sine respektive data. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Eksempler på produksjonsfeil. (A) På grunn av forskyvning av den laterale kanal over fangst lag, blir det positive signal konsentrert i et lite område i avlesningssonen. En "våt" sirkelformet område (stiplet omriss) kan observeres til høyre i avlesningssonen som følge av kontakt mellom forskjøvet sidekanal med fangst lag (til venstre). Bilde av en positiv avlesning påfangst lag av en korrekt innrettet anordning (til høyre). (B) Ufullstendig smelting av voks gjennom hele tykkelsen av et lag som kan føre til lekkasje i apparatet. Konditorfarge er blitt tilsatt til løsningen for å hjelpe til med visualisering av prøven lagvis med ufullstendig eller helt dannede hydrofobe barrierer. (C) som ikke er kuttet klebemiddel kan blokkere fluid nettverket mellom lag av papir, som stopper strømmen av en prøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Produksjon av tredimensjonale papirbaserte microfluidic enheter. Den skjematisk viser sammenstillingen og laminering av flere lag av mønsterpapiret inn i ferdigstilte tredimensjonale enheter. I dette eksemplet er 70 enheter cen skje samtidig. Lagene av klebe og innrettingshullene har blitt fjernet fra den skjematiske for forenklingsformål. Etter monteringen, kan de enkelte anordninger bli fjernet og anvendt i analysene. De røde, blå og grønn strek på hvert lag indikerer materialet som brukes til å dikte det bestemt lag (red: kromatografi papir, blå: nylon membran, grønn: tykk kromatografi papir). Den Målestokk = 25 mm bortsett fra den separate anordningen (til høyre), som har dimensjoner på 12 x 28 mm 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifisere en reproduserbar produksjon strategi er en viktig del av analysen utvikling. 22 Vi bruker en sekvensiell, lag-for-lag metode for å fremstille tredimensjonale papirbaserte microfluidic enheter. I motsetning til de fremgangsmåter som gjelder folding eller origami teknikker for å produsere flerlags enheter fra et enkelt ark av papir 23, og har 24 additiv produksjons en rekke fordeler: (i) flere materialer kan inkorporeres i en enkelt enhet arkitektur uten modifikasjon til fremgangsmåter for utskrift, justering eller montering av lagene. (Ii) Mønstrede klebefilmer kan være integrert i monteringsprosessen. Disse filmene feste tilstøtende lag, og, basert på styrken av klebemiddel, kan være reversibel for å muliggjøre avskalling og evaluering av indre lag. Videre lim gi strukturell integritet til den tredimensjonale enhet, som utelukker behovetfor bindemiddel 25 klipp eller maskinerte kabinetter. 23 (iii) Individuelle ark US Letter kromatografi papir rommer en rekke paralleller, som i stor grad kan forbedre gjennomstrømningen av laboratorieskala produksjon (Figur 5). Dette er spesielt gunstig når man skal vurdere en rekke eksperimentelle forhold som krever tekniske replikater. Med denne løsning kan 70 tredimensjonale papirbaserte enheter fremstilles samtidig. (iv) Ligner flerlags lamine tilnærminger brukes for høy-volum produksjon av en rekke kommersielle produkter i helsevesenet (for eksempel sårpleie dressinger og depotplaster), som dermed senker produksjonen barriere å oversette disse tredimensjonale papirbaserte microfluidic enheter.
I tillegg til det lettere å skrelle og montasje, er valget av klebemidlet er også kritisk for utforming av den tredimensjonale fluid nettverk. En annonsehesive film kan tjene som en ekstra barriere mellom lag av papir, noe som kan gjøre det mulig maskering av hydrofile soner på tilstøtende lag. I praksis er bruk av tynne lag av klebemiddel ønskelig. Hvis limet er for tykke (f.eks mange tosidige bånd), så gapet som dannes mellom lag av papir vil være for stor til å lette transporterende og må fylles med et hydrofilt stoff (f.eks, cellulosepulver) for å gjenvinne funksjon. 12 Selv om dette ekstra trinn tilfører kompleksitet å fremstille og den substans som benyttes kan forstyrre enkelte analyser, disse hullene blir en nyttig funksjon for fremstilling av styrbare, fluidtrykkventiler. 15 Andre former for klebemiddel er blitt anvendt ved fremstilling av tredimensjonale papirbaserte microfluidic enheter. Klebe spray tilbyr en enkel metode for å feste lag til hverandre. 26 Ved hjelp av denne metoden, er selvklebende materiale påføres jevnt på begge than hydrofobe og hydrofile område av papiret. En fordel med denne metoden er at ytterligere utstyr (for eksempel kniv plotter eller laserskjærer) ikke er nødvendig for å utforme et mønster av klebemiddellaget. Imidlertid må betingelsene for ensartet påføring av klebemidlet sprøyte bestemmes eksperimentelt for hver type materiale som brukes. Topografien av materialet kan påvirke limet-materialet grensesnitt og lengre spray ganger kan være nødvendig for grovere overflater. I tillegg kan sprøyting lim på de hydrofile soner av fluidveien resultere i svekket veke ved å endre fuktbarheten av papiret. Alternativt kan bruken av stensiler 27 eller silketrykk 8 brukes til å mønster klebemiddel direkte på lag av mønstret papir.
To viktige hensyn for utvikling av tredimensjonale papirbaserte microfluidic enheter er valg av materialer og design av fluiDIC nettverk. (I) Vi velger materialer og kombinasjoner av materialer basert på sugehastighet, våtstyrke, tykkelse, og protein-bindingskapasitet. Sugehastighet kan påvirke varigheten av et assay, og mengden av tid reagenser må reagere eller binde innenfor et lag. Forskjellige grader av papir er kjennetegnet ved vekesatser basert på, for eksempel, ved behandling av papiret, dens porøsitet, og dens tykkelse. Det er mulig å benytte flere lag av papir for å øke den effektive sugehastighet av en enhet. 28 En god våt styrke er ønskelig for programmer som krever håndtering (f.eks peeling en immunoassay) etter at enheten har blitt mettet med en prøve. Materialer som er for tykk eller som ikke kan føres gjennom trykkeriet på grunn av skjørhet vil kreve en alternativ metode for å produsere mønstrede kanaler (f.eks, fotolitografi). Men i motsetning, tykkere materialer er ideelle for blot lag (eller vasker) for å trekke fluider gjennom the-enheten. Mange kvaliteter av nylonmembraner er kommersielt tilgjengelige, noe som kan variere i deres evne til å binde proteiner irreversibelt til fangstsone. Material substitusjoner (f.eks, nitrocellulose i stedet for et nylonmembran) kan også påvirke bindingskapasitet, noe som kan påvirke sensitiviteten til analysen. (ii) Anvendelsen av symmetri i utformingen av fluidic nettverk sikrer at de unike kanalene mønstrede til tredimensjonale enheter oppfører seg identisk (f.eks fylles samtidig), som er kritisk for multipleksede analyser. 19 Symmetry forenkler ytterligere lag design, bistår med lagjustering når du monterer hele ark med enheter, og kan redusere avfall. Modifikasjoner av anordningen design kan påvirke ytelsen til assayet. For eksempel vil økning av lengden av den laterale kanal i inkubasjonen lag påvirke varigheten av analysen, fordi fluidet vil veken en forholdsvis lengre strekning før de når outlet. 17 I applikasjoner som er avhengige av binding av en målbiomolekylet, kan en lengre analyse tid være en fordel fordi det kan øke brøkdel av bundne, merkede arter før immobilisering på fangst lag.
Avslutningsvis har vi presentert en metode for å dikte tredimensjonale papirbaserte microfluidic enheter som støtter utviklingen av immunanalyser. Denne fremgangsmåten, som bruker en type av additiv produksjon for å produsere flerlags enheter, muliggjør produksjon av anordninger ved en skala som er egnet for laboratorieundersøkelser. Protokollen er beskrevet i dette manuskriptet er spesifikk for papirbaserte immunologiske enheter; Men vi forventer prosedyrene knyttet til montering av disse immunoassays-voks utskrift, mønstring lim, samkjøre lag, og lamine-vil være lett utvides til en rekke tredimensjonale papirbaserte mikrofluidenhets arkitekturer. En forståelse av fabrikasjon metodikk kan føretil utvikling av nye point-of-care-analyser med et bredt spekter av applikasjoner i helsesektoren, miljø og landbruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Illustrator CC | Adobe | to design patterns for layers of paper and adhesive | |
| Xerox ColorQube 8580 printer | Amazon | B00R92C9DI | to print wax patterns onto layers of paper and Nylon |
| Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven | Fisher Scientific | 15-103-0509 | to melt wax into paper |
| Artograph LightTracer | Amazon | B000KNHRH6 | to assist with alignment of layers |
| Apache AL13P laminator | Amazon | B00AXHSZU2 | to laminate layers together |
| Graphtec CE6000 Cutting Plotter | Graphtec America | CE6000-40 | to pattern adhesive films |
| Swingline paper cutter | Amazon | B0006VNY4C | to cut paper or devices |
| Epson Perfection V500 photo scanner | Amazon | B000VG4AY0 | to scan images of readout layer |
| economy plier-action hole punch | McMaster-Carr | 3488A9 | to remove alignment holes |
| Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4 | Sigma Aldrich | WHA1004917 | |
| Fisherbrand chromatography paper (thick) | Fisher Scientific | 05-714-4 | to function as blot layer |
| Immunodyne ABC (0.45 µm pore size ) | Pall Corporation | NBCHI3R | to function as material for capture layer |
| removable/permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF021621 | to facilitate peeling |
| permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF051521 | |
| wax liner | FLEXcon | FLEXMARK 80 D/F PFW LINER | to assist with patterning adhesive |
| acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | to fabricate frame |
| self-adhesive sheets | Fellowes | CRC52215 | to use as protective slip |
| absolute ethanol | VWR | 89125-172 | to sanitize work area |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 0332 | |
| Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls | Fisher Scientific | 22-071-066 | to use as positive and negative samples |
| anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1) | Arista Biologicals | CGBCG-0701 | to treat conjugate layer |
| goat anti-α-hCG antibody | Arista Biologicals | ABACG-0500 | to treat capture layer |
| 10X phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Oxoid skim milk powder | Thermo Scientific | OXLP0031B | |
| Tween 20 | AMRESCO | M147 |
References
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 8 (12), 2146-2150 (2008).
- Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 81 (16), 7091-7095 (2009).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. 46 (8), 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Diagnostics for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Chem. 82 (1), 2-10 (2010).
- Cate, D. M., Adkins, J. A., Mettakoonpitak, J., Henry, C. S. Recent developments in paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 87 (1), 19-41 (2015).
- Li, X., Ballerini, D. R., Shen, W. A perspective on paper-based microfluidics: Current status and future trends. Biomicrofluidics. 6, 011301 (2012).
- Lisowski, P., Zarzycki, P. K. Microfluidic paper-based analytical devices (µPADs) and micro total analysis systems (µTAS): Development, applications and future trends. Chromatographia. 76, 1201-1214 (2013).
- Pollock, N. R., et al. A paper-based multiplexed transaminase test for low-cost, point-of-care liver function testing. Sci. Transl. Med. 4 (152), 152ra129 (2012).
- Mentele, M. M., Cunningham, J., Koehler, K., Volckens, J., Henry, C. S. Microfluidic paper-based analytical device for particulate metals. Anal. Chem. 84 (10), 4474-4480 (2012).
- Weaver, A. A., et al. Paper analytical devices for fast field screening of beta lactam antibiotics and antituberculosis pharmaceuticals. Anal. Chem. 85 (13), 6453-6460 (2013).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Vella, S. J., et al. Measuring markers of liver function using a micro-patterned paper device designed for blood from a fingerprick. Anal Chem. 84 (6), 2883-2891 (2012).
- Nie, Z., Deiss, F., Liu, X., Akbulut, O., Whitesides, G. M. Integration of paper-based microfluidic devices with commercial electrochemical readers. Lab Chip. 10 (22), 3163-3169 (2010).
- Martinez, A. W., et al. Programmable diagnostic devices made from paper and tape. Lab Chip. 10 (19), 2499-2504 (2010).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper machine" for molecular diagnostics. Anal. Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Schonhorn, J. E., Fernandes, S. C., Rajaratnam, A., Deraney, R. N., Rolland, J. P., Mace, C. R. A device architecture for three-dimensional, patterned paper immunoassays. Lab Chip. 14 (24), 4653-4658 (2014).
- Fernandes, S. C., Logounov, G. S., Munro, J. B., Mace, C. R. Comparison of three indirect immunoassay formats on a common paper-based microfluidic device architecture. Anal. Methods. 8 (26), 5204-5211 (2016).
- Deraney, R. N., Mace, C. R., Rolland, J. P., Multiplexed Schonhorn, J. E. patterned-paper immunoassay for detection of malaria and dengue fever. Anal. Chem. 88 (12), 6161-6165 (2016).
- Abramoff, M., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Derda, R., et al. Multizone paper platform for 3D cell cultures. PLoS ONE. 6 (5), e18940 (2011).
- Mace, C. R., Deraney, R. N. Manufacturing prototypes for paper-based diagnostic devices. Microfluid. Nanofluidics. 16 (5), 801-809 (2014).
- Liu, H., Crooks, R. M. Three-dimensional paper microfluidic devices assembled using the principles of origami. J. Am. Chem. Soc. 133 (44), 17564-17566 (2011).
- Kalish, B., Tsutsui, H. Using Adhesive patterning to construct 3D paper microfluidic devices. J. Vis. Exp. (110), e53805 (2016).
- Scida, K., Cunningham, J. C., Renault, C., Richards, I., Crooks, R. M. Simple, sensitive, and quantitative electrochemical detection method for paper analytical devices. Anal. Chem. 86 (13), 6501-6507 (2014).
- Lewis, G. G., DiTucci, M. J., Baker, M. S., Phillips, S. T. High throughput method for prototyping three-dimensional, paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 12 (15), 2630-2633 (2012).
- Kalish, B., Tsutsui, H. Patterned adhesive enables construction of nonplanar three-dimensional paper microfluidic circuits. Lab Chip. 14 (22), 4354-4361 (2014).
- Camplisson, C. K., Schilling, K. M., Pedrotti, W. L., Stone, H. A., Martinez, A. W. Two-ply channels for faster wicking in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 15 (23), 4461-4466 (2015).
