Summary
在啮齿类动物中局部膀胱出口梗阻的传统的建模是充满动物死亡率。来自各地的近端尿道和膀胱颈淋巴结清扫术一去神经损伤是主要关注的也是。我们制定并评估了安全可靠的中期，尿道梗阻模型，避免了传统模式的不足。
Abstract
部分膀胱出口阻塞（pBOO）患病率高，导致患者重大负担，医疗费用巨大。在pBOO中调查膀胱重塑的最常见的动物模型是在近端尿道部分阻塞的雌性啮齿动物。梗阻程度和动物死亡率的变异性是近端梗阻的主要问题。此外，围绕近端尿道和膀胱颈的解剖危及膀胱神经支配。
我们为pBOO开发了一种神经节省的中尿道梗阻（NeMO）模型，避免了传统模型的缺点。我们靠近耻骨联合的尿道，这消除了在这个区域的剖腹术和解剖的需要;另外，条纹尿道括约肌仍然保持不变。我们在女性Sprague-Dawley大鼠（12个障碍物，6只假动物）以及雌性C57 / bl6小鼠（20个阻塞物）中进行了NeMOS，18只深水动物）。两周后，我们评价膀胱功能，膀胱质量和体重。
我们有obstructed-或假手术雌性大鼠中没有死亡;作为传统的近端pBOO-方法所描述的，我们绑缝合线围绕近端尿道和暂时放置0.9毫米金属棒。 NEMO诱导膀胱质量增加85％后两周，平均残尿量为0.4mL中部分阻塞的大鼠，而只有0.03 mL，在假手术的动物。在小鼠中，我们测试了3种尺寸捆扎缝线当我们沿尿道放置插管。我们发现，使用27号插管导致超过50％的动物的死亡率;放置25号插管没有产生在膀胱质量增加所需的响应;利用26号插管产生具有最小的动物的死亡率（1/8），但在膀胱质量显著增加2倍良好的结果。
Introduction
部分膀胱出口梗阻（pBOO）具有高患病率，并可能导致严重的膀胱功能障碍1;频谱范围从先天畸形如后尿道瓣膜或尿道下裂，在获取的尿道狭窄良性前列腺增生。影响男性六十多年超过30％及以上2后者。大患者的负担，并与相关pBOO巨大的医疗费用担保的大量研究工作投入研究膀胱重塑响应增加流出阻力3。从2006年到2015年，超过220考研收录的论文进行了关于pBOO对膀胱的作用发表。
虽然pBOO动物模型已被设计在若干物种4，大鼠5，兔子6，猪7和谅解备忘录如E 8， 图9，但可以说是最常用的动物模型是经历近端尿道的局部阻塞的雌性大鼠;进入动物的腹部，膀胱外缝合，和解剖膀胱颈周围是不可避免的与这种传统的近端尿道梗阻技术。变异梗阻和动物死亡的程度仅仅是一些与此过程10，11相关联的关注;我们发现，在假手术的动物，围绕近端尿道切开导致，在膀胱颈12的神经纤维损失相关的生理变化。这一调查结果表明，这是最常用的pBOO动物模型，这涉及访问雌性啮齿动物的近端尿道，导致去神经损伤膀胱的相关结构和功能的改变，从而影响假和阻碍动物。因此，需要另一种方法避免去神经损伤。我们的实验室开发并评估了保留神经的中期尿道梗阻（NEMO）的方式，有效地促使膀胱预期梗阻相关的变化，如器官的质量和残余尿增多，而假手术的动物是来自非手术对照组动物没有区别。此外，横纹尿道括约肌仍保持不变，因为它位于靠近夹层的水平。此外，变异在膀胱质量梗阻引起的增加比在传统的近端尿道梗阻显著下和动物死亡率为零。
我们还成功地应用尼莫在雌性小鼠在阻碍动物低于10％的死亡率，而迄今为止描述的所有小鼠模型pBOO用约50％的死亡率相关。在研究小鼠膀胱重塑pBOO的上下文将与applicabil受益转基因修饰的全谱，两者均。
围绕在女性啮齿动物中尿道解剖不诱导在传统的近端梗阻模型中观察到的膀胱不希望的和混杂结构或功能的改变。然而，在中间尿道水平诱导部分阻塞仍引起膀胱肥大和增加的残余尿，从动物模型pBOO预期。重要的是，在小鼠进行尼莫在打开膀胱pBOO以重塑转基因方法，这在较大的啮齿动物几乎无法进行调查。
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Protocol
下面的实验方案经该机构的动物护理委员会。
1. NEMO雌性大鼠
- 制备
- 放置一个雌性Sprague-Dawley大鼠重约200克在3％异氟烷麻醉，称重动物，和剃以及使用碘手术擦洗消毒前耻骨区的3倍。
- 在加热垫上，磁带后肢和尾部向下和导尿与20号血管导管，其也被轻轻贴，以防止滑动膀胱。
- 解剖
- 使用手术刀从朝向尿道口的可触知的耻骨联合执行8mm的纵向皮肤切口。抬离皮肤两边便于以后伤口闭合。
- 解剖直截了当地通过用细剪刀纵向扩展来识别带支架尿道。将细自保持皮肤挂钩，以提高曝光尿道。
- 执行一些温和纵向使用弯剪背侧到尿道开发尿道和阴道之间的平面扩展。然后，通过直言尿道后面的4-0丝线缝合，并准备一个外科医生的结双拐。
- 部分尿道梗阻
- 除去血管导管，放置平行于尿道0.9毫米金属棒，然后拧紧围绕尿道和金属杆的结，从而使后者仍然其后容易滑出。
- 固定结用3更抛出使用温和张力移除所述杆之前。切缝合线端部约3姆·隆恩，或者4毫米如果梗阻后释放实验的一部分。
- 伤口闭合
- 近似使用可吸收缝线编织4-0埋单针在尿道旁腺。
- 用埋水平褥式缝合使用相同的吸收SUT关闭皮肤URE。注意：尽管它可能看起来非常规使用的可吸收缝合线的皮肤穿透针，我们没有遇到的并发症，如伤口感染，并且能够避免拆线。
- 术后护理
- 注入丁丙诺啡0.1mg / kg的皮下放置在大鼠恢复笼之前。
- 提供一些软恢复饮食的头24个小时的单坐落老鼠。在此之后，再次房子的动物在同一对作为前道工序提供他们正在做的很好，属于同一个治疗组。
- 每天检查大鼠膀胱大小和总体幸福感;记录自己的体重至少每周一次。
2. NEMO雌性小鼠
- 制备
- 放置一个雌性C57BL / 6小鼠体重约为18 g，并且继续进行在步骤1.1.1为详细。
- 继续进行在步骤1.1.2详细的，除了使用24量规昂iocatheter。
- 解剖
- 使用手术刀进行6 mm纵向皮肤切口，从可触诊的耻骨联合朝向尿道口。
- 直截了当地用精细剪刀纵向扩张来识别支架置入的尿道。通过类似的钝性剥离来解除在尿道上腹部运行的神经 - 血管束。
- 使用弯曲的剪刀对尿道进行一些柔和的纵向展开，以在尿道和阴道之间形成平面。然后，直截了当地穿过尿道后面的5-0不可吸收的编织缝线，并准备外科医生结的双掷。
- 部分尿道梗阻
- 将血管导管与1 mL注射器连接，并将0.1 mL生理盐水注入膀胱。
- 将26号套管平行于尿道放置。轻轻收紧尿道和套管周围的结，同时拉回血管日。
- 固定结用3更抛出使用温和张力移除插管之前。
- 测试尿液出现在在对动物的膀胱温和的压力，尿道口;如果无法表达尿松开领带。否则，切缝合线端部约3姆·隆恩。
- 伤口闭合
- 使用5-0编织可吸收缝合线埋藏水平褥式缝合关闭皮肤。
- 术后护理
- 将小鼠放入在回收笼子之前注入0.1mg / kg的丁丙诺啡皮下注射。
- 提供一些软恢复饮食的头48个小时，以单一坐落鼠标。在此之后，再次房子动物同组的过程之前，只要它们做得很好，属于同一个治疗组。
注：小鼠在手术后可触及的膀胱胀得24小时处理被过度阻塞时不作废，并会在n内死亡EXT 1 - 2天，除非麻醉下带回了去除阻碍结扎。 - 每天检查小鼠膀胱大小和总体幸福感;记录自己的体重至少每周一次。
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Representative Results
在雌性大鼠神经保留中期尿道梗阻（NEMO）
死亡
我们超过40雌性大鼠进行了中期尿道梗阻，到目前为止，并没有死亡。
膀胱质量
平均相对膀胱质量（膀胱到身体质量比）在假手术动物中为0.33％2周过程之后，而阻塞大鼠具有0.60％的平均相对膀胱质量换算成85％的增加（p = 0.004 ; 图1）。
残余尿
假手术组几乎没有任何剩余尿，我们可以吸通过在器官收获的时间直接膀胱穿刺，在对比度中间尿道梗阻的动物具有的0.42毫升（P = 0.01; 图2）残尿的显著更大的平均量。
在雌性小鼠神经保留中期尿道梗阻（NEMO）
死亡
总体来看，18只雌性小鼠接受了假NEMO过程中，其中一人死亡。为了校准梗阻的必要程度，我们评估了3米不同直径的捆扎缝线时沿尿道放置插管（25号，26号，和27号）的。的5只小鼠中没有时，我们使用了25号插管沿尿道的占位符（ 图3）死亡。在另一方面，死亡率显著具有较小尺寸的占位符增加。 1/8或5/8的小鼠使用26号或27时死亡-Gauge插管，分别为（P = 0.039，Fisher精确检验）。
膀胱质量
NEMO在使用25号插管没有有效地增加膀胱到身体质量比雌性小鼠（ 图4）。使用26号套管的导致膀胱相对质量（p值= 0.04）的过2倍的增加。当我们采用了27号占位符相对于膀胱质量的增加超过60％2周（P = 0.004）后发生。
残余尿
大鼠相似，雌性小鼠倾向于在麻醉诱导排尿。当收获囊，我们用钳子闭塞膀胱颈并称重与尿液和引流尿后的膀胱，这允许在本残余尿的精确计算膀胱收获。 PBOO放置25号或沿尿道26号插管没有导致在2周内（ 图5）内的残尿的变化。值得注意的是，只有极少数的动物麻醉诱导，这是在对比的是，当引起几乎所有的空白大鼠中无效。在3只小鼠使用27号插管幸存NEMO，平均残尿量增加了3倍相比相应沙姆斯。然而，差异无统计学意义，最有可能是由于低电平。
图1. NEMO有效地诱导后2周增加膀胱质谱。 NEMO导致增加膀胱-体-质量-比例为2周（P = 0.004;§）内的85％。
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图 NEMO 2周后残余尿 2 显着增加。而假手术大鼠具有几乎没有残余的尿，可能是针吸气在膀胱收获时间，中间尿道梗阻的动物具有几乎0.4毫升残余尿的平均值（P = 0.013;§）。
图3. 增加死亡率与局部梗阻程度。一出18只小鼠的假NEMO程序后死亡。当使用25号插管沿尿道的占位符，所有5手术小鼠存活，而1/8或5/8的小鼠当使用26号或27号插管，分别为（P = 0.039，Fisher精确死测试）。
<强>图4 中，2周后在相对膀胱质谱有效增加NEMO结果中26号和27号的占位符。 NEMO在使用25号插管的雌性小鼠并没有导致在膀胱相对质量（§）一个显著增加;用一个唯一的26号插管时，在相对大规模膀胱过度增加2倍发生（p值= 0.04;†）;用27号占位符的障碍物导致相对膀胱质量增加的超过60％（P = 0.004;‡）。
图5. 维护膀胱NEMO排空后2周。使用25号或沿着NEMO过程期间尿道26号插管没有导致在2周内（§）后在残余尿的变化。在平均残余乌尔增加3倍的27号组中的INE体积相比沙姆斯没有达到统计学显着性（阻挡N = 3;†）。
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Discussion
动物死亡率在许多报告10，11，13 pBOO的传统模式在近端尿道的主要问题，在15％以上的。 NEMO出现时在雌性大鼠施加到具有最小的死亡率。在小鼠近端尿道梗阻在技术上更具挑战性比在大鼠，因而更容易出现并发症。使用26号套管作为我们中间尿道方式的占位符，我们只有最小的动物死亡。在这里我们使用26号插管18的只有2个小鼠过度阻碍施加NEMO在雌性小鼠正在进行的研究（数据未显示）。使用更小的占位符，如27号插管在阻塞的小鼠的死亡一半由于过梗阻尿潴留或膀胱破裂。因此，我们认为一26号占位符是雌性小鼠约18g合理口径。
增加膀胱质量 pBOO在人类疾病的标志之一。我们确定了NEMO在大鼠和小鼠有效地诱发膀胱质量显著上升仅2周后。在近端尿道中pBOO后膀胱质量平均增加是超过2周，并因此比我们NEMO 12后，观察到高得多后2.5倍。在器官质量这样的过度增加但是不能反映多数膀胱下阻塞性尿路病，其研究人员的目标施加pBOO时模式;在这方面，NEMO提供了一个创伤小，耐受性好pBOO模型较为温和的重塑响应比传统近pBOO更接近人体病理学。在近pBOO膀胱传越显着增加是最有可能涉及到去神经伤害周围的膀胱颈淋巴结清扫术的结果;然后去神经可能危及逼尿肌 - 括约肌串扰第二，即使在假手术动物中12使功能性出口梗阻。
残余尿也显著仅在2周后进行NEMO雌性大鼠增加。在另一方面小鼠中，仅使用27号插管作为占位符倾向于增加小鼠残尿的量。然而，当老鼠几乎所有的void当气体麻醉下放置，我们并没有在诱导时，只有极少数作废小鼠观察这一点。这种小鼠的非排尿行为可能掩盖残余尿量真实并需要另一个刺激诱发排尿在未来的研究。
同时使用0.9毫米杆沿在雌性大鼠尿道梗阻程度似乎是适当的，最小的动物死亡率组合与膀胱质量和残尿的明显增加，在雌性小鼠校准阻塞程度为NEMO是更具有挑战性的。一方面，使用25号套管并没有导致膀胱质量检测的增加，使用，另一方面，27号套管比经历pBOO小鼠的一半以上导致过度阻塞。只有26号插管具有在器官生长方面具有低动物死亡率沿一个合理的响应。
由于pBOO显然是男性比女性更普遍，使用雄性动物会模拟人类pBOO时是可取的。我们保留神经中期尿道梗阻（NEMO）技术显然不能满足接受动物的激素状态影响发起组织重塑的炎症反应的这个缺点。低可变性和小鼠NEMO的低死亡率动物，然而，会使膀胱的调查重塑服从的转基因方法，这是在大的啮齿类动物非常有限的全谱。
总之，对于NEMO雌性大鼠和雌性小鼠是容易做到的，具有低动物死亡率，并避免去神经损伤周围膀胱颈淋巴结清扫术导致膀胱。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female rat | Charles-River Canada | Sprague Dawley Rat (Crl:SD); Strain Code: 400 | about 200 g |
| Isoflorane vaporizer | Benson medical industries inc. | TEC III Isoflurane; product code: 53-T3ISO | |
| Isoflorane | Fresenius Kabi Animal Health | Isoflorane; product code CP0406V2 | 250 mL bottle |
| Disposable scalpel | Ted Pella, Inc. | #15 Sterile, Stainless Steel Scalpels; catalogue number 549-9-15S | |
| Microscopy forceps | Ted Pella, Inc. | Aesculap Microscopy Forceps, Finepoint, 115mm; product number 5443 | |
| Adson forceps | Ted Pella, Inc. | Aesculap Adson Dissection Forceps, Curved, 120mm; product number 5002-9 | |
| Curved surgical scissors | Ted Pella, Inc. | Surgical Scissors, Curved, S/S, 105mm; catalogue number 1376 | |
| 0.9 mm inox metal rod | goodfellow.com | Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65 | |
| Skin hooks - self made from inox steel | goodfellow.com | Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65 | |
| 4-0 Silk suture | esutures.com | 4-0 Sofsilk black 98" strand; product number LS640 | |
| 5-0 Vicry suture | esutures.com | 5-0 Vicryl undyed 27" RB-1 taper; product number J213H | |
| Needle holder | Medsupplier.com | Integra Miltex Carb-N-Sert Baumgartner Needle Holder - 5 1/2"; product code SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC |
|
| Temgesic (Buprenorphine) | first veterinary supply | Buprenex 0.3MG/ml inj amps; item #075701 | |
| 1 mL syringe with 27 G needle | Fisher Scientific | BD Tuberculin Syringe, BD 309623 | |
| 20 G Angiocath | Fisher Scientific | Andwin Scientific ANGIOCATH 20 GA; Catalog No. NC9561906 | |
| Recovery diet | clearh2o | DietGel 31M; 72-08-5022 | |
| C57Bl/6 female mice | Charles-River Canada | C57BL/6 Mouse (C57BL/6NCrI); Strain Code: 027 | about 18 g |
| 24 G angiocath | Fisher Scientific | Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc. IV CATH ANGIOCATH 24GX3/4IN; Catalog No. NC9814340 | |
| 5-0 Ethibond | esutures.com | 5-0 Ethibond green 30" RB-1 taper; product number X550H | |
| 26 G syringe needle | Sigma-Aldrich | BD Precisionglide syringe needle, Gauge 26; z192392 | |
| Normal Saline | Baxter | 0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 100 mL MINI-BAG; product code 2B0043 |
References
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