Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מדידת כונן מזווג סירוס ועיקור במאלה Published: February 15, 2017 doi: 10.3791/55291
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 3
1F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, 2Harvard NeuroDiscovery Center, Harvard Medical School, 3Department of Neurobiology, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מתאר assay התנהגותיים המשתמש כונן הזדווגות זכר תסיסנית melanogaste r ללמוד מוטיבציה. באמצעות שיטה זו, חוקרים יכולים לנצל טכניקות neurogenetic זבוב מתקדם לחשוף את המנגנונים הגנטיים, מולקולריים והמכשירים סלולריים העומדים בבסיס המוטיבציה הזו.

Abstract

למרות עשרות שנים של חקירה, הבסיסים העצביים ומולקולריים של מדינות מוטיבציה להישאר מסתוריים. פתחנו לאחרונה רומן, הרדוקציונית, ומערכת מדרגים לחקירה מעמיקה של מוטיבציה באמצעות כונן ההזדווגות של תסיסנית זכר (דרוזופילה), והשיטות אשר נפרטו כאן. הפרדיגמה התנהגותי מרכזי על המציאה כי זכר כונן הזדווגות פוחת לצד פוריות במשך הזדווגויות חזרו ומשחזר מעל ~ 3 ד. במערכת זו, את כלי neurogenetic העצמה זמינים לטוס להתכנס עם הנגישות הגנטיות תרשים חיווט משוער זמין עבור התנהגות מינית. התכנסות זו מאפשרת בידוד מהיר וחקירה של אוכלוסיות נוירונים קטנות עם פונקציות מוטיבציה ספציפיות. כאן נפרט את עיצוב וביצוע של assay שובע המשמש למדידת ולשנות מוטיבציה חיזור לטוס זכר. שימוש זהassay, אנחנו גם מדגימים כי כונן הזדווגות גברי נמוך ניתן להתגבר על ידי גירוי נוירונים דופאמינרגיים. את assay השובע הוא פשוט, זול, ויציב להשפעות של רקע גנטי. אנו מצפים assay שובע לייצר תובנות חדשות רבות לתוך הנוירוביולוגיה של מדינות מוטיבציה.

Introduction

עבודה תסיסנית סיפקה תובנה עמוקה וחלוציות לתוך תופעות ביולוגיות רבות, כולל אופי של הגן 1, עקרונות ההתפתחות העוברית 2, מקצבי היממה 3, וכן פיתוח חיווט של מערכת העצבים 4, 5, 6. מוטיבציה נשארת הרבה פחות הבינה היטב מאשר התופעות הללו, אולי בגלל המגבלות על המערכות כי נחקרו עד כה. מוטיבציה ב לטוס נלמדת בעיקר בהקשר של רעב, אשר מציב בפנינו אתגרים רבים בשל צריכת המזון שלהם הקטנה vanishingly לכל התקף האכלת שלד חיצוני אשר מונע סימנים גלויים של בתצהיר שומן. כתוצאה מכך, יש צורך להרחיב את המערכות בשימוש ללמוד מוטיבציה לטוס.

אנו מתארים מסגרת התנהגותית לחקר כונן הזדווגותתסיסנית. מערכת זו מנצלת את הכלים neurogenetic ב לעוף כמו גם את הנגישות 7, 8, 9, 10, 11, 12 ואת connectome המשוערת של המעגלים שלה דימורפית מינית 8, 13. בנוסף, חלק גדול מן המולדת 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ו למדו 22, 23, 24 חיזור שליטת מעגלים חושי-מוטוריים כבר הסתדר בפירוט, מתן הזדמנות נדירהכדי לאתר את צומת המעגל המדויקת שעליו מוטיבציה פגע. אנחנו דיווחנו לאחרונה כי, בשינה לטוס, כמו אצל בני אדם, רמות הדופמין ממלאות תפקיד מרכזי כונן הזדווגות 25, 26, 27. רכשנו גישה גנטית המייצר דופמין הרלוונטית וקבלת נוירונים לטוס, הקלה ברמת מעגל המולקולרית והמפורטת מנתח של תופעת משומר זו באמצעות המבחנים המתואר כאן 25.

נוסיף מבחני התנהגות באל et ג'אנג. 25 זירה התנהגותי שטוח חדש המאפשרת ניקוד וידאו, אשר אנו מכנים assay שובע 2 ממדים (2-D), שיפור חשוב על פני שיטות קודמות. כתוצאה מכך, assay החדש הוא יותר מדרגים לכימות, ולכן מתאים יותר מסך גנטי של גנים ונוירונים מעורבים מוטיבציה. אנו משתמשים assay החדש הזה, יחד עם מבחני חיזור neurogeמניפולציות גנטיות, כדי להדגים כיצד למדוד לשנות כונן הזדווגות לטוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מתאר את ההכנה (סעיפים 1 - 3), ביצוע (סעיף 4), וניתוח (סעיף 4) של מבחני שובע 2-D. לאחר מכן, באמצעות גירוי דופאמין כדוגמה, סעיף 5 מראה כיצד לשלב גירוי thermogenetic עם מבחני שובע 2-D כדי לגרום היפרסקסואליות. סעיף 6 מתאר 3 דרכים כדי לאמת את התוצאות של מבחני שובע 2-D. לבסוף, סעיף 7 מראה כיצד למדוד את ההתאוששות של כונן הזדווגות זבובים זכרים.

1. בודה 8- ו -32 קאמרית Arenas ההתנהגות

הערה: כל התנהגותית מורכבת מכמה שכבות של יריעות פלסטיק בחיתוך ליזר מוחזקות ביחד על ידי ברגי hex ואגוזי אגודל בכל אחת מארבע הפינות (איור 1 א).

  1. לפברק שכבות של הזירה. לפברק כל שכבה באמצעות מכשיר חיתוך בלייזר לחתוך יריעות פלסטיק אקריליק על הצורה המתאימה (ראה איור 1B, 1C עבור מוצרים).
    הערה: institutio מחקר רביש ns חותך ליזר בחנויות מכונים או רווחי בוראם. אם המוסד יש גישה מכשיר חיתוך בלייזר, המשך בביצוע השלבים הבאים. אם לא, ולאחר מכן בצע את ההוראות המפורטות בשלב 1.2 במקום.
    1. עבור כל שכבה, פתח את דפוס עיצוב בתוכנה של חיתוך בלייזר.
      הערה: העיצובים ניתן למצוא קבצי PDF בשם כראוי (למשל, 8-הקאמרית ארנה - Layer 2 - Doors.pdf) ב ההשלמות 1. קובץ זה מכיל גם הסברים על סוג של פלסטיק לשמש (למשל, 1 / 8 אינץ '(כלומר 3.175 מ"מ) אקרילי שקוף). העובי המדויק של כל שכבה אינו קריטי. הדרישה העיקרית היא לאפשר 0.12 אינץ '(3 מ"מ) או יותר של שטח אנכי חינם בתאים.
    2. שנו את ההגדרות לייזר (כוח, מיקוד וכו ') עבור סוג ועובי פלסטיק לשמש. מניחים פלסטיק במיטה חותך לייזר ולהפעיל את חיתוך בלייזר.
      הערה: הגדרות אלה ישתנו בהתאם נרחב על cutte לייזרמודל r ואת עוצמת הלייזר שלה. מצא הגדרות מתאימות על סמך ניסיון העבר או על ידי ביצוע חתכי מבחן על פלסטיק גרוטאות. תחריטי המשושה העמוקים כלולים בעיצוב להפסקה ראשי בורג hex. תכונה זו מאפשרת הידוק ביד אחת של אגוזי האגודל מאפשרת הזירות לנוח שטוחות על הספסל (ללא בולטות ראשי ברגים). עם זאת, מה שהופך תחריטים עמוק הוא לעתים קרובות קשה להשיג, ונדרש זמן רב, באמצעות מכשיר חיתוך בלייזר. שלב זה הוא אופציונלי וניתן דילג מבלי להשפיע על תוצאות התנהגותיות.
    3. כשמנסרים משקוף הדלת (שכבת 2, איור 1 א), גם להשתמש בהגדרות ליזר מתאימות לחריטת המספרים הקאמריים הכלולים העיצוב (כמו באיור 1B, 1C).
  2. הזמנה עם מפברק חיתוך לייזר מקוון. העלה את כל קבצי עיצוב PDF עבור 8- ו / או בזירה 32 קאמרי לציין את סוג החומר (למשל, 1/8 אינץ '(כלומר 3.175 מ"מ) קליאהאקריליק r) בהתבסס על ההסברים הקבצים. התוצאות יופיעו כמו 1B דמויות (בזירה 8-קאמרית) 1C (בזירה 32 קאמרית).
  3. להרכיב זירות באמצעות ארבעה ברגים hex וארבעה אגוזי אגודל ליישר ולהחזיק יחד שכבות הפלסטיק (איור 1 א). הזירות תופענה כמו באיור 1D, 1E (8 קאמרי) ואיור 1F, 1G (32 קאמרי).
    הערה: חומת המזון (שכבת 4 באיור 1A) משמשת עבור מבחני שובע 2-D בלבד מושמט בזירות 32 קאמריות, אשר משמשות מבחני חיזור.

2. הכנת מזון עבור 2-D Assay שובע

הערה: מאחר assay שובע 2-D משתרע 4.5 שעות, לעוף מזון משמש בזירה לספק תזונה ומים. פרוטוקול זה משתמש, אבל אינו מוגבל, את אגר קמח התירס הקונבנציונלי לעוף מזון.

  1. חלקית להרכיב בזירת שובע 2-D (8 הקאמרית) עם שכבות 3 - 6(ראה איור 1 א למשימות שכבה) והדק אותה עם אגוזי אגודל ברגי hex.
  2. מניחים אוכל לטוס טרי לתוך בקבוק נקי, למיקרוגל. להוסיף מספיק מים כדי לכסות את המשטח התחתון של בקבוק (איור 2 א).
  3. מזון מיקרוגל גבוה עבור 30 - 45 s. בדוק התקדמות ומערבבים כל 15 שניות עד שהיא נמסה (תרשים 2B). זְהִירוּת! אוכל לטוס רותחים מעל בקלות.
  4. השתמש קצה פיפטה 1,000 μL קהה (איור 2 ג) להעביר לאט ~ 1 מ"ל נמס מזון לתוך תא (איור 2 ד).
  5. אפשר מזון resolidify ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ~ (2E איור) לפני הרכבת בזירה לחלוטין (איור 2F).
  6. השתמש בזירה השלימה לניסויים (ראו סעיף 4) או בחנות ב 4 ° C..
  7. אחסן את שאריות מזון ב 4 ° C ושימוש חוזר.

3. הכנת בתולה נקבות עבור מבחני התנהגות

הערה: מבחני שובע 2-D להשתמש במספרים גדולים של נקבות זבוב בתולה (~ 120 - 160 טוב זירת התנהגותי מלאה) שקשה אוסף בעזרת שיטות סטנדרטיות. סעיף זה מתאר גישה חלופית באמצעות transgene hs-HID על כרומוזום Y 28, אשר שימש בהצלחה מבחני החיזור 25, 29. המנייה המשמשת לייצור נקבות בתולה לבנות עיניים יש את w1118 גנוטיפ (X) / hs-HID (Y); + / +; + / + (מספר מניות Bloomington 24,638).

  1. Flip זבובים לתוך בקבוק חדש פעם 20 - 50% של גלמים יש eclosed (ראה איור 3 א למשל) ויש זכרים מספיק (5 - 10) כדי להפיץ את המניות.
  2. מחממים לזעזע את הבקבוק המקורי באמבט מים חמים 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי מספיק להפעיל hs-HID להרוג הזכרים (איור 3 ב). אחרי ההלם החום, רק נקבות eclose מבקבוקים אלה ולכן יישארו בתולה עדמבחנים.
    הערה: ודא שכל הצדדים של הבקבוק מחוממים באופן שווה (ראה איור 3 א עבור קו מים). להאריך מועד זה עד 2 שעות אם h 1 אינו מספיק כדי להרדים את כל הזכרים.
  3. לבודד נקבות שנאספו במשך לפחות 3 ד לפני ניסויים על מנת להבטיח כי הם ישנים מספיק כדי להיות פתוחים מינית 25, 29.
    הערה: Y-כרומוזום-פחות זכרים עולים מדי פעם ממלאי זה. יש זכרים אלה עיניים לבנות אינם מושפעים על ידי ההלם החום כי הם אינם מכילים את גן hs-HID. הם לא יכולים לייצר זרע ולכן לא ניתן להקטין פתיחות אצל נקבות 30, 31.

במה 4. וניקוד 2-D שובע מבחנים

הערה: חשוב לשלוט לגיל הזכר עף כשינויי כונן הזדווגות עם גיל. פרוטוקול זה משתמש זכרים כי הם 3 - 4 ד בן 25

  1. הגדר את החממה עד לטמפרטורה הרצויה (למשל, 23 ° C עבור סטנדרטי, ניסויי RT) ולחות (> 30%). עבור חממות ללא בקרת לחות, עוזב כוס מים בחממה מספיקה.
  2. מניחים בזירה assay שובע 2-D בחממה במשך ~ 30 דקות כדי לאזן את הטמפרטורה כדי למנוע התעבות בתאי במהלך הניסוי. הדלתות מסתובבות צריכות להיות במצב הפתוח.
  3. השתמש aspirator לטוס 32 כדי לשאוב 15 - 20 נקבות בתולה לתוך כל תא של הזירה (איור 4).
    הערה: חשוב כי נשים וגברים אינם מורדם באותו יום כמו assay. מניסיוננו, דבר עלול להשפיע פתיחות נשיות התנהגות חיזור גברית.
  4. לשאוב 1 זכר לתוך כל תא.
  5. מניח את הזירה הטעונה בחממה תחת מצלמת צרכן רגילה (איור 5) וקולנוע 4.5 שעות.
  6. ציון קטעי וידאו על ידי ציון כאשר כל זכר לטוס מתחיל ומסתיים כל (הזדווגות כלומר) הזדווגות. צעד זה עשוי להימשך זמן רב בהתחלה. בעזרת תרגול, אפשר להבקיע את הסרטונים במהירות 5x ומעלה.
    הערה: מאז זבובים מזדווגים במשך ~ 20 דקות ב ~ 23 ° C (משך זמן קצר יותר בטמפרטורות גבוהות) 29, אחד יכול לרחף באמצעות 15 הדקות הראשונות של כל הזדווגות.
  7. לאחר הכניסה לאתר, בכל עת ההזדווגות, סכם את מספר הזדווגויות לכל זבוב (ראה תוצאות נציג).
  8. השתמש בקוד הניתן ליצור ethogram. ראה השלמות 2 עבור הקוד, הוראות, ונתונים למשל.
  9. השתמש CO 2 או טמפרטורה קרה כדי להרדים את הזבובים לפני הוצאתם.

5. שימוש מניפולציה Thermogenetic להיפוך שובע ב 2-D שובע מבחני

הערה: בדיקות פרוטוקול זה אם גירוי thermogenetic של אוכלוסייה עצבית מוגדרת יכול להתגבר שובע. FLI ניסיוניes לבטא את ערוץ קטיון רגיש-חום TrpA1 ב אוכלוסיות מוגדרות של נוירונים (כטב"מ-TrpA1). השלבים שלהלן חלים על הגירוי של נוירונים דופאמינרגיים (TH-Gal4), אשר הוכחו לקדם כונן הזדווגות 25. צעדים אלה יכולים לשמש בשילוב עם נהגים עצביים אחרים לגלות אוכלוסיות אחרות המקדמות כונן הזדווגות.

  1. כדי thermogenetically לגרום התנהגויות הזדווגות זבובים שבע, להעלות את הטמפרטורה בחממה (למשל, מ -23 ° C עד 28.5 ° C) לאחר השלמת ניסוי שובע 4.5 h 2-D מלא.
  2. לאחר בחממה מגיע לטמפרטורה הרצויה, להמשיך גירוי חום את התוצאה ל הזדווגויות (כלומר. הזדווגויות) של הזכרים עבור H 1 (ראה תוצאות נציג).
    הערה: הטמפרטורה והאורך של גירוי עשויה להשתנות תלויה גנוטיפ ולכן יש צורך לפתור את התנאים האופטימליים המונעים גירוי יתר של נוירונים ועדיין לייצר Robuפנוטיפ st.

6. שימוש חיזור לבין תנועה כדי לאמת שובע

הערה: סעיף זה מתאר 3 שיטות אופציונליות שיכול לשמש כדי לאמת את התוצאות של מבחני שובע 2-D. הם אינם נדרשים עבור כל assay.

  1. השתמש מבחני חיזור לאמת שובע.
    1. לשאוב זכר אחד ונקבת בתולה אחת לתוך כל אחד 32 התאים בתוך זירת חיזור.
    2. לצלם את הזבובים עבור ~ 20 דקות באמצעות מצלמת צרכן רגילה.
    3. ציון מדד החיזור (CI) לכמת חיזור 25; זה הוא שבריר הזמן המושקע ביצוע התנהגות חיזור (שירה, הבאים, וכו '.) והזדווגות (הזדווגות כלומר) מעל חלון 5 דקות. חלון זה מתחיל מן המופע הראשון של התנהגות חיזור. אם זבוב זכר אינו מתחיל חיזור ב -15 הדקות הראשונות, CI שלה הוא 0. זבובים הנאיביים WT צריכים להראות CI גדולים מ 0.9, ואילו זבוב שבעה במלואה צריך ב CIelow 0.2. אמצעי חיזור אחרים יכולים אף הוא להיחשב 23, 33.
  2. חיזור ניקוד מבחני שובע 2-D
    1. ציון משך הזמן כי זבוב זכר מבלה חיזור, על פני פרק זמן של assay שובע 2-D (למשל, h הראשון). חיזור מוגדר זכר ביצוע כל שלב של הטכס (שירה, הבא, וכו '). בניגוד בסעיף 6.1.3, שלב זה אינו כולל זמן זכר מבלה הזדווגות.
    2. מחלקים את הזמן החיזור לעיל על ידי סך כל הזמן שהזכר לא ההזדווגות (כלומר לא מזדווגים) באותה תקופה. לדוגמה, אם גבר לטוס המשפט במשך 15 דקות ובני זוג במשך 20 דקות על h הראשון, היחס הוא 15 דקות / (60 דק '- 20 דק') = 0.375. היחס מוצג "הפרקציה של nonmating זמן החיזור" ב נציג תוצאות.
  3. שימוש assay תנועה להעריך תשישות
    1. חלקית להרכיב את 32בזירה קאמרית עם כל החלקים אבל גיליון הניגוד.
    2. לשאוב אחד זבוב זכר (לא נקבות זבוב) לתוך כל אחד 32 התאים בתוך זירת חיזור.
    3. לצלם את הזבובים עבור ~ 10 דקות באמצעות מצלמת צרכן רגילה.
    4. עקוב אחר הזבובים עם תוסף MTrack2 ב ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).

7. שחזור מזווג כונן לאחר 2-D שובע Assay

  1. בצע assay שובע 2-D כפי שתואר בסעיף 4, אבל לשאוב הזכר עף החוצה בסוף assay.
  2. לבודד את זבובים זכרים ב 23 ° C עבור המספר הרצוי של ימים.
  3. בצע assay שובע 2-D עם הזכרים התאושש וציון הזדווגויות שלהם (הזדווגויות כלומר) רק 1 h (ראה תוצאות נציג).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לאפיין כונן ההזדווגות תסיסנית, 3 ימים בת, WT זכרים קנטון-S נבדקו ב assay שובע 2-D. במהלך assay (4.5 שעות), זכרים להזדווג ממוצע של 4.8 ± 0.3 (ממוצע ± סטיית התקן של הממוצע, SEM) פעמים. הזדווגויות ליזום בעיקר 2 h (78%) (איור 6 א, 6 ב) ולהיות הראשון פחות תכופים כמו assay מתקדם (איור 6 א, 6 ב). ירידה זו אינה נובעת מחוסר שותפים ההזדווגות (74% נשים להישאר בךזוג ברחבי assay) או עייפות פיזית (איור 6F). במקום זאת, השפעה זו מוסברת ככל הנראה על ידי ירידה החיזור של הזכר במהלך assay, מ 42.6 ± 8.0% (ממוצע ± SEM) (1 st ח) ל -2.0 ± 0.7% (ממוצע ± SEM) (השעה האחרונה) של זמן nonmating (איור 6 ג). ירידה זו בחיזור באה לידי ביטוי גם כאשר הזכרים נבחנים מבחני חיזור עם נקבות חדשות (6D איור, 6E) (איור 6G, 6 שעות). תוצאות אלו מראות כי בהתנהלותה נשמר בכונן הזדווגות זבובים זכר יכול להיות שבע ב assay שובע 2-D ויכול לשחזר לאורך זמן.

את assay השובע 2-D יכול גם בקלות להיות משולב עם מניפולציות עצביות תסיסנית. אנחנו דיווחנו לאחרונה כי גירוי thermogenetic של נוירונים דופאמינרגיים הופך כונן הזדווגות זכר שובע טס 25. באמצעות מבחני שובע 2-D, אנו מוצאים כי גירוי דופאמין (TH> TrpA1, 28.5 מעלות צלזיוס) בסוף של assay השובע מוגבר הוא החיזור (איור 7 א, 7C, אדום) ואת ההזדווגות (איור 7 א, 7 ב, אדום). תופעות ההיפוך לא נצפו עם גנוטיפים בקרת הורים (איור 7 א - 7C, שחורים ואפורים). כל התוצאות האלה עולות בקנה אחד עם מחקר שנערך לאחרונה25 ולהציע כי assay שובע 2-D, יחד עם מבחני העזר (חיזור תנועה), שניתן להשתמש בם כדי לנתח רכיבים מולקולריים עצביים של כונן הזדווגות.

איור 1
איור 1. תכנון והרכבת ההתנהגות ארנס. זירת 8 קאמרית (המשמשת מבחני שובע 2-D) מורכבת מ -6 שכבות מוחזקות ביחד על ידי אגוזי אגודל ברגי hex (א). זירת 32 קאמרית (המשמשת מבחני חיזור) מיוצרת באופן דומה, אך ללא קיר המזון (שכבה 4). החלקים בזירה נחתכים החוצה עם מכשיר חיתוך בליזר ואת השכבות ממוספרות כמו (B) עבור 8-קאמרי (C) במשך 32 קאמרי. זירות 8 הקאמריות התאספו מוצגות (ד) (תצוגה מקדימה) ו- (ה) (מבט מצד עם שכבות ממוספרות). זירות 32 הקאמריות התאספו התאספו באופן דומה (F, G), אבל 4 Layer (קיר מזון) מושמט (G) מאז לא אוכל לטוס הוא בזירה עבור מבחני חיזור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. הכנת 2-D שובע מבחנים עם מזון. מזון תסיסנית תקן מושם בתוך צנצנת למיקרוגל עם מים (א). האוכל הוא במיקרוגל עד שהיא נמסה (B). טיפ פיפטה קהה (C, חץ) משמש להעברת מזון לתאי של התנהגותית בהרכבה חלקית (D). האוכל הוא מחדש הגדילו ב 4 ° C (E) לפני התנהגותית מורכבת לחלוטין (F)."Target =" pg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: יצירת הבתולה נקבות מן w1118 (X) / hs-HID (Y) במלאי. טוסו בקבוקי צריך להיות חום בהלם כאשר 50 - 80% של הגלמים הם uneclosed כפי שצוינו על ידי העמימות שלהם (א). התמונה מראה הבלעת דגימות של uneclosed (למעלה) eclosed (למטה) גלמים (א). בקבוקים נשקלים למטה שקוע 37 מעלות באמבט מים חמים צלזיוס במשך שעה 1 עם מפלס מים מעל התחתון של פקקי הבקבוק כדי להבטיח אפילו חימום (B). ראה החץ השחור ב (א) עבור קו המים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"איור איור 4: טוען זבובים לתוך התנהגותית. לשאוב בעדינות וחזקה 15 - 20 נקבות ב aspirator (א). קצה פיפטה משמש כדי לפתוח את הדלת מסתובבת (B), והזבובים שוחררו בעדינות לתוך התא (C). השתמש aspirator לסגור את הדלת מסתובבת (D). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: ביצוע ורישום Assay שובע 2-D. (א) מצלמת צריכה סטנדרטית (א) משמשת כדי להקליט את assay באינקובטור מוגדר לטמפרטורה הרצויה. החממה מכילה בקבוק מים (ב) וגלאי לחות (ג) כדי להבטיח אתרמת לחות מתאימה (> 30%). את assay השובע 2-D המוכן מצולם תחת מצלמת הווידאו (B). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: שובע ושחזור של Fy המזווג Drive. ב assay שובע 2-D, זבובים זכרים להזדווג לעיתים קרובות במהלך 2 השעות הראשונות של assay (A, B), אך להקטין החיזור שלהם (C) הזדווגויות (B) כמו assay מתקדם. הירידה המתקדמת בהתנהגות חיזור נשמרה כאשר זכרים מועברים assay חיזור עם נקבות חדשות לאחר השלים assay שובע 2-D של 0 h, או 1 h, או 4.5 שעות (D, E). חיצים אדומים מצביעים על זכרים מפגינים התנהגויות חיזור והזדווגות, בעוד ar תפוזשורות להצביע על-הזדווגות עישון, זבובים הלא חיזור (A, D). ירידת התנהגויות מיניות אינה תוצאה של תשישות פיזית, כמו גברים מראים רמות מקבילות של פעילות של תנועה לפני ואחרי assay השובע 2-D (F). זכרים בהדרגה לשחזר ההזדווגות שלהם (G) וחיזור (H) רמות מעל 3 ד של במנותק מן הנקבות. בנתון זה, *** p <0.001, ** p <0.01, NS לא משמעותי עבור מבחן t (C, F) ANOVA חד כיווני עם Tukey שלאחר הבדיקה (E, G, H). N = 15 - 16 עבור כל תנאי עבור כל הניסויים. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7: Thermogenetic שובע היפוך זכר זבובים. כמו assay שובע 2-D רגיל, הזכרים מציגים ירידה הזדווגויות במהלך הניסוי, אך גירוי thermogenetic של נוירונים דופאמינרגיים (TH> TrpA1, אדום), אבל לא גנוטיפים הורית שליטה (שחור ואפור), מחזירת הזדווגות כונן בזכרים שבע (א). אין הזדווגויות הם מובקעים כאשר ציר ה- X הוא שבור ב (א). ההיפוך הזה של כונן הזדווגות ניתן לכמת או באמצעות מספרי הזדווגות (B) או חיזור (C). מספרי ציר ה- X (ב) ו- (ג) מתייחסים זמן ב (א). צבע רקע כתום מצביע גירוי thermogenetic (A - C). בנתון זה, *** p <0.001, NS לא משמעותי עבור אינטראקציות בין גנוטיפ וטמפרטורה ANOVA דו סטרי עם Bonferroni שלאחר הבדיקה (B, C). N = 8 עבור כל גנוטיפ (B, C). ברי שגיאה מייצגים SEM..jove.com / קבצים / ftp_upload / 55,291 / 55291fig7large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

משלימה חומר 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה חומר 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מדינות מוטיבציה יכול להיות שבע, מתוחזק, והחלים 34. אנו מציגים assay שובע 2-D כי במהירות וחסונה ובוחן את כל ההיבטים הללו של הזדווגות כונן הבזק. assay זה פותח את האפשרות של שימוש מניפולציות גנטיות זבוב מתקדמים ללמוד המרכיבים המולקולריים מעגל של התנהגות מוטיבציה.

את assay השובע מסתמך על היכולת של הזכר לחזר בהצלחה ולהזדווג, וכדי לסיים הזדווגויות בזמן המתאים. למרות משפט זבובי hyposexual פחות, זבובים נמוך חיזור אינם בהכרח hyposexual; הם עשויים, למשל, יש קושי לזהות או מעקב הנקבות 35. מסיבה זו, assay השובע הוא מתאים ביותר עבור היפרסקסואליות בדיקות, פנוטיפ כי לא ניתן לצפות באופן מהימן ב assay חיזור סטנדרטי מפני שזכרי wild-type נאיביים להראות מדדי חיזור מתקרבים 1. היפרסקסואליות ב sh assay השובעולד להיחשב ביחס לגיל הזכר-פי ניסיוננו, גברים מבוגרים נוטים להזדווג מעט בתדירות גבוהה יותר מאשר גברים בגילאי 3 ימים משמש כאן.

השתמשנו גירוי thermogenetic של נוירונים דופאמינרגיים כדי להדגים את המניפולציות neurogenetic שניתן להשתמש במערכת זו כדי לחקור את הרכיבים הבסיסיים המוטיבציה. בנוסף, החוקרים יכולים גם להשתמש גירוי thermogenetic לאורך assay שובע 2-D ולחפש זכרים נימפומנית כי הם איטיים כדי להגיע שובע. כמובן, מבחני שובע יכולים גם להיות משולבים עם כלי השתקת נוירונים 36, 37, 38 optogenetics, מוטציות גנטיות 39, 40, 41, RNAi מציאת 28, 42, 43, 44, וכו '

את assay השובע הוא זול להרחבה. בזירה כל יכול להיות מיוצר עבור ~ 10 שווה 'דולר ארה"ב של חומרים (בתוספת עלויות חיתוך לייזר, אם בכלל) ואת תופסת פחות מקום מאשר ספר בכריכה רכה. הבקיע את קטעי הווידאו הוא גם משימה פשוטה יחסית. נסיין מיומן יכול להבקיע וידאו 4.5 שעות עם 8 זכר זבובים ~ 1.5 שעות. להקרנת תפוקה גבוהה יותר, אחד יכול להבקיע רק 2 h האחרון, כאשר זבובים נורמלים להראות רמות נמוכות מאוד של כונן הזדווגות. לחלופין, אפשר לזהות לבדוק את המבחנים כל 30 דקות ', כמו זה יהיה ללכוד את רוב ההזדווגויות ~ 20 דקות ארוכות.

אנו מקווים מערכת זו תותאם נרחבת ותתרום את הופעתה של תסיסנית כמערכת רבה עצמה עבור לחשיפת סודות מוטיבציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K12 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/8 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K42 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
3/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8560K219 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/32 inch black delrin McMaster-Carr 8575K132 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
Hex screws, 1 inch long (50x) McMaster-Carr 92314A115  Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas.
Thumb nuts (25x) McMaster-Carr 92741A100 Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr).
Camcorder Canon Vixia HF R700 Can be replaced by any consumer comcorder.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sturtevant, A. H., Bridges, C. B., Morgan, T. H. The spatial relations of genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 5 (5), 168-173 (1919).
  2. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (1985).
  3. Hall, J. C. Systems Approaches to Biological Rhythms in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 61-185 (2005).
  4. Luo, L. Rho GTPases in neuronal morphogenesis. Nature reviews. Neuroscience. 1 (3), 173-180 (2000).
  5. Schmucker, D., Clemens, J. C., et al. Drosophila Dscam Is an Axon Guidance Receptor Exhibiting Extraordinary Molecular Diversity. Cell. 101 (6), 671-684 (2000).
  6. Jan, Y. N., Jan, L. Y. HLH proteins, fly neurogenesis, and vertebrate myogenesis. Cell. 75 (5), 827-830 (1993).
  7. Stockinger, P., Kvitsiani, D., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121 (5), 795-807 (2005).
  8. Yu, J. Y., Kanai, M. I., Demir, E., Jefferis, G. S. X. E., Dickson, B. J. Cellular Organization of the Neural Circuit that Drives Drosophila Courtship Behavior. Current biology. 20 (18), 1602-1614 (2010).
  9. Zhou, C., Pan, Y., Robinett, C. C., Meissner, G. W., Baker, B. S. Central Brain Neurons Expressing doublesex Regulate Female Receptivity in Drosophila. Neuron. 83 (1), 149-163 (2014).
  10. Rideout, E. J., Dornan, A. J., Neville, M. C., Eadie, S., Goodwin, S. F. Control of sexual differentiation and behavior by the doublesex gene in Drosophila melanogaster. Nature neuroscience. 13 (4), 458-466 (2010).
  11. Manoli, D. S., Foss, M., Villella, A., Taylor, B. J., Hall, J. C., Baker, B. S. Male-specific fruitless specifies the neural substrates of Drosophila courtship behaviour. Nature. 436 (7049), 395-400 (2005).
  12. Kimura, K. I., Ote, M., Tazawa, T., Yamamoto, D. Fruitless specifies sexually dimorphic neural circuitry in the Drosophila brain. Nature. 438 (7065), 229-233 (2005).
  13. Cachero, S., Ostrovsky, A. D., Yu, J. Y., Dickson, B. J., Jefferis, G. S. X. E. Sexual dimorphism in the fly brain. Current biology. 20 (18), 1589-1601 (2010).
  14. Clowney, E. J., Iguchi, S., Bussell, J. J., Scheer, E., Ruta, V. Multimodal Chemosensory Circuits Controlling Male Courtship in Drosophila. Neuron. 87 (5), 1036-1049 (2015).
  15. Kallman, B. R., Kim, H., Scott, K. Excitation and inhibition onto central courtship neurons biases Drosophila mate choice. eLife. 4, e11188 (2015).
  16. von Philipsborn, A. C., Liu, T., Yu, J. Y., Masser, C., Bidaye, S. S., Dickson, B. J. Neuronal control of Drosophila courtship song. Neuron. 69 (3), 509-522 (2011).
  17. Zhou, C., Franconville, R., Vaughan, A. G., Robinett, C. C., Jayaraman, V., Baker, B. S. Central neural circuitry mediating courtship song perception in male Drosophila. eLife. 4, e08477 (2015).
  18. Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila. Neuron. 69 (3), 498-508 (2011).
  19. Kohatsu, S., Yamamoto, D. Visually induced initiation of Drosophila innate courtship-like following pursuit is mediated by central excitatory state. Nature Communications. 6, 6457 (2015).
  20. Fan, P., Manoli, D. S., et al. Genetic and neural mechanisms that inhibit Drosophila from mating with other species. Cell. 154 (1), 89-102 (2013).
  21. Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
  22. Ejima, A., Smith, B. P. C., et al. Generalization of Courtship Learning in Drosophila Is Mediated by cis-Vaccenyl Acetate. Current Biology. 17, 599-605 (2007).
  23. Keleman, K., Vrontou, E., Krüttner, S., Yu, J. Y., Kurtovic-Kozaric, A., Dickson, B. J. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489 (7414), 145-149 (2012).
  24. Pan, Y., Baker, B. S. Genetic Identification and Separation of Innate and Experience-Dependent Courtship Behaviors in Drosophila. Cell. 156 (1-2), 236-248 (2014).
  25. Zhang, S. X., Rogulja, D., Crickmore, M. A. Dopaminergic Circuitry Underlying Mating Drive. Neuron. 91 (1), 168-181 (2016).
  26. Bowers, M. B., Van Woert, M., Davis, L. Sexual behavior during L-dopa treatment for Parkinsonism. The American journal of psychiatry. 127 (12), 1691-1693 (1971).
  27. Sacks, O. W. Awakenings. , Vintage Books. New York. (1999).
  28. Dietzl, G., Chen, D., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  29. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing dopaminergic and GABAergic neurons control the duration and persistence of copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
  30. Peng, J., Chen, S., Busser, S., Liu, H., Honegger, T., Kubli, E. Gradual Release of Sperm Bound Sex-Peptide Controls Female Postmating Behavior in Drosophila. Current biology. 15 (3), 207-213 (2005).
  31. Yapici, N., Kim, Y. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
  32. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36 (36), 1-5 (2010).
  33. Cook, R., Cook, A. The Attractiveness to males of female Drosophila melanogaster: effects of mating, age and diet. Animal behaviour. 23, 521-526 (1975).
  34. Toates, F. M. Motivational Systems (Problems in the Behavioural Sciences). , (1986).
  35. Hall, J. C. The mating of a fly. Science. 264 (5166), 1702-1714 (1994).
  36. Simpson, J. H. Mapping and manipulating neural circuits in the fly brain. Advances in genetics. 65 (9), 79-143 (2009).
  37. Venken, K. J. T., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic Manipulation of Genes and Cells in the Nervous System of the Fruit. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
  38. Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  39. Bellen, H. J., Levis, R. W., et al. The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes. Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).
  40. Spradling, A. C., Stern, D., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153 (1), 135-177 (1999).
  41. Parks, A. L., Cook, K. R., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36 (3), 288-292 (2004).
  42. Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nature reviews. Genetics. 6 (3), 179-193 (2005).
  43. Ni, J. Q., Liu, L. P., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  44. Ni, J. Q., Zhou, R., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature. 8 (5), 405-407 (2011).

Tags

Neuroscience גיליון 120 מוטיבציה הזדווגות הכונן, דופמין חיזור התנהגות
מדידת כונן מזווג סירוס ועיקור במאלה<em&gt; תסיסנית</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boutros, C. L., Miner, L. E., Mazor, … More

Boutros, C. L., Miner, L. E., Mazor, O., Zhang, S. X. Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (120), e55291, doi:10.3791/55291 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter