Summary
ここでは、ゼブラフィッシュの性分化とメンテナンスの調査を容易にするであろう幼虫のゼブラフィッシュの生殖腺組織を単離するためのプロトコルを提示します。
Abstract
野生のゼブラフィッシュは、ZZ / ZWセックス決意システムを有するが、飼いならされたゼブラフィッシュは、性染色体を失っています。彼らは、ゲノム全体に分布するいくつかの遺伝子は、まとめて、個々の魚の性同一性を決定多遺伝子性別決意システムを利用します。現在、生殖腺の発達の調節に関与する遺伝子とその仕組みは、とらえどころのないまま。通常、生殖腺組織を分離することは、セックスの発生過程を調べるための最初のステップです。ここでは、ゼブラフィッシュの幼虫DPF 17 DPF（日受精後）と25からの性腺組織を分離するための手順を提示します。単離された生殖腺組織は、その後、形態学および遺伝子発現プロファイリングによって調べることができます。
Introduction
野生のゼブラフィッシュ4染色体の主要な女性セックス行列は、1（ すなわち 、共通の実験室株）を紛失したり、飼いならされたゼブラフィッシュに変更されます。代わりに、彼らは、温度、低酸素症、食品の可用性と人口密度などの環境要因を伴う多遺伝子のセックス決意システムを持っています。ゼブラフィッシュのセックス開発の詳細なメカニズムは完全には理解されていません。プライマリ性別決意信号（単数または複数）/何であるか、そのようなゼブラフィッシュ性別決意が発生した場合のように基本的な質問は、であり、遺伝子は、生殖腺の変換の最初のステップは、3 2 に答えされずに残って調節います。
ゼブラフィッシュのセックス、開発の過程では、いくつかの重要な段階では認識されています。開発の初期段階では、4 HPF（時間後に受精）始原生殖細胞（始原生殖細胞）仕様を受け、から出発して生殖隆起に移動および増殖。 PGC番号と生殖細胞と体細胞間の相互の相互作用は、生殖腺の分化4のために重要です。 13 DPF（日受精後）では、生殖腺は、未分化段階にあります。 17のDPFすることにより、生殖腺は、将来、女性と男性の両方における双方向性卵巣へと発展します。卵巣からの精巣にアポトーシス依存遷移は21〜25 DPFから始まり、数週間継続することができます。 35のDPFにより、生殖腺の性別が決定されており、性別特異的配偶子生産は両方の卵巣に進行中であると5精巣、6、7。
現在まで、多様な候補遺伝子とセックス決意のメカニズムが提案されています。プロテオミクスとトランスクリプトーム解析は、性的二型表現で多くの遺伝子を単離したこれらの遺伝子は、ゼブラフィッシュ8に性分化を研究するために利用されてきました9、10。例えば、幼生ゼブラフィッシュでは、cyp19a1a遺伝子は特になく、精巣11,12における卵巣において発現されます。また、AMH遺伝子が弱く卵胞顆粒膜細胞で発現するが、強く精巣のセルトリ細胞13れます。対照的に、Vasa遺伝子は、連続的に適切な性腺マーカー14、15作り、女性と男性の両方ゼブラフィッシュの生殖細胞において発現されます。
性腺遺伝子発現レベルを調べることは、特に双電位卵巣ステージ3,9に性別決意と分化の分子機構を理解することが重要です。しかし、幼虫のゼブラフィッシュおよび対応小さな生殖腺のサイズが小さいgonadaの単離を複雑さらなる分子分析のためにL組織。以前の研究では、operculaと肛門の気孔16との間の解剖全体のトランク域を使用しました。この準備は、生殖腺を含むが、複数の組織や器官から構成されています。あるいは、脈などの生殖腺特異的GFP発現を有するトランスジェニック動物：EGFPの蛍光活性化細胞選別（FACS）およびレーザー捕捉マイクロ切開17、18 を介して、性腺組織単離のために使用しました。しかし、彼らの広範なアプリケーションが限られています。ここでは、17 DPFと25 DPFの幼虫のゼブラフィッシュからの性腺組織を分離するための簡単な手順について説明します。我々は、他の器官に対する生殖腺の位置を示し、周囲の組織から形態学的に無傷の生殖腺を分離します。我々はさらに、（例えばヴァーサとcyp19a1aなどの生殖腺特異的遺伝子は高度に定量的PCRを介してトランク組織と比較して、単離された生殖腺で発現される表示します定量PCR）分析。本プロトコルは、それによって性腺組織19のその後の分子分析を可能にする、幼生ゼブラフィッシュから生殖腺特異的遺伝子の同定、単離、RNAの精製及び増幅を可能にします。
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Protocol
ゼブラフィッシュ実験は、復旦大学施設内動物管理使用委員会によって承認されました。ゼブラフィッシュは、標準的な手順20に従って上昇させて飼育しました。
1.準備
- 幼虫のゼブラフィッシュDPF 17 DPFと25を育成
- 交差前日午後遅く交差タンクに移し2のオスとメスの2大人のゼブラフィッシュ（、3〜6ヶ月、健康的な実験室アブ・ストレイン）。バリアで男性と女性を分離します。翌朝、タンクの水をリフレッシュし、それらが交尾できるようにするために障壁を取り除きます。受精後1〜2時間、100ミリメートルペトリ皿に卵を収集します。
- 初期の開発期間（4日間）の間に28.5°Cで40 mLの胚培地（EM）と100mmのプレートで約40胚を保ち、一日二回EMをリフレッシュ。 1 Lタンク（300 mLのシステム水40幼虫）に幼虫を移し、5 DPF後生ワムシ（全電源、一日二回）で供給。10 DPFの後にライブブラインシュリンプの代わりに、ワムシの食事を養います。 21 DPF 14に再循環水システムの中に魚を転送します。
- 17 DPF又は25 DPFまで再循環水システムにおける幼虫ゼブラフィッシュを上げます。明/暗サイクルを保証するシステムの水の14/10時間およびpH値は約7.2です。 17 DPF（5.5 6.8ミリメートル）の体長を測定し、25 DPF（8〜11 mm）の幼虫22。
- 解剖2％寒天プレートを準備します。
- 200mLの滅菌水に4gの寒天を加えます。それが透明になるまでマイクロ波オーブン中で混合物を加熱します。
- 次いで、直径60mmのペトリ皿（プレートのおよそ1/3量）にそれを注ぎ、約15分間、寒天溶液を冷却します。 4°Cで固化寒天プレートを保管してください。
2.プロトコール1：幼虫DPF 17及び25の生殖組織を分析
- 17 DPFの幼虫を麻酔するためにタンクに砕いた氷を追加します。転送30 mLの冷リンゲル液でペトリ皿冷却100mMの麻酔幼虫。完全に幼虫を麻酔するために、少なくとも15分間冷却リンゲル液中で培養した魚を保管してください。
- 小さなプラスチックのスプーンで予冷した寒天プレートに幼虫を転送します。 10 mLの全体の魚の体を水没リンゲル液を冷却し、そっとその側にそれを置きます。
- 25X実体顕微鏡の視野の下で以下の操作を行います。安定化のためのピンセットで魚のトランクをクランプします。ピンセットの別のペアと心に肛門から縦方向に腹部をリッピング。静かに内臓を露出するために、本体の片側に皮膚や筋肉を取り除きます。
- 慎重に浮き袋に腹器官の質量を削除します。浮き袋に添付生殖腺にダメージを与えることは避けてください。
- 浮き袋と前部本体との間の接続を遮断します。優しく全体の浮き袋と生殖腺組織を引き出します。
注：ほとんどの場合S、17 DPFの性腺組織は、上皮組織とprotonephridiumを取り巻く含まれています。それらは容易に分離されていないが、25℃で容易に分離することができるDPF。生殖腺は、肛門に接続されています。肛門で相互に接続され、左右の生殖腺との接合は、はっきりと見えるであろう。 - 慎重に浮き袋から生殖腺組織を分離し、周囲の脂肪組織をクリーンアップするためにピンセットを使用してください。
- 直ちに200μLのリンゲル液を含有する予冷1.5mLの遠心管に、単離された生殖腺組織を移します。すべての生殖腺組織が幼虫から分離されるまで、チューブを氷上に保管してください。
- 2.7 - 手順2.1に記載したように25 DPFの幼虫の生殖腺を解剖。
3.プロトコル2：孤立生殖腺組織の遺伝子発現を分析
- 幼虫性腺組織からトータルRNAを抽出します。
- 新しいRNaseフリー1に分離された生殖腺組織を転送します。5mLのチューブ及びリンゲル液を除去します。 100μLの溶解液を追加します。組織が完全に溶解するまでボルテックス。
- 製造業者の説明書に従って全RNA抽出手順を実行します。
- 私はバッファ10倍DNアーゼの1/10量とRNA溶液にDNアーゼIの1μLを加え、穏やかに混合。 37°Cで20分間インキュベートします。
- RNA溶液に1/10量のDNase不活性化試薬を追加します。 70°Cで10分間インキュベートします。分光光度計を用いて全RNAの濃度を測定します。 -20℃で保管してください。
- 第一鎖cDNA合成を行います
- 製造業者のプロトコルに従って第一鎖cDNA合成を実行するためにオリゴ（dT） - リンカープライマーを使用します。 20μLの総反応容量にRNAの1〜2μgのを追加。
- 45℃で90分間反応溶液をインキュベートします。 5分間70℃で加熱することによって反応を停止。
- cDNAに1μLのRNase Hを追加しますので、残留RNAを除去するためにlution。 〜13,000×gで10秒間静かに遠心混ぜます。 37°Cで20分間インキュベートします。 20μlのヌクレアーゼを含まない水を追加します。 -70℃で保管してください。
- 蛍光定量的PCRを行います
- 蛍光色素でサイクラーシステム上で定量PCRを行います。 30秒、15秒、15秒、95℃で35サイクル、TM-5°C、68°C以下のPCRサイクル条件を使用します。次のようにプライマー配列を使用する：AMH（FWD：GTGGATGGCAGCAGTACGAC; REV：GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG）、cyp19a1a（FWD：GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; REV：CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG）、nanos3（FWD：GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; REV：CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC）、 ヴァーサ （FWD：ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; REV：CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC）とβアクチン （FWD：AGTGCGACGTGGACATCCGTA; REV：GCACTTCCTGTGGACGATGGA）19。
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Representative Results
生殖腺の解剖は、アブ・ストレイン幼虫のゼブラフィッシュで行われました。 図1は、17 DPF、25 DPFにおける幼虫のゼブラフィッシュの典型的な性腺組織を示しています。まず、皮膚や腹部の片側の筋肉は内臓を露出するように切断されます。臓器の質量を除去した後、一緒に生殖腺を有する水泳膀胱トランクに残ります。生殖腺は、水泳膀胱（ 図1B 'の矢印）の腹側に取り付けました。 17のDPFでは、生殖腺は、双方向性卵巣段階にありました。単離された生殖腺は、左右の生殖腺を含有し（ 図1C）、半透明でした。ほとんどの場合、それは、上皮組織とprotonephridium（ 図1Cの矢印）に囲まれました。性腺DPF 25でしばしば脂肪組織（ 図1D）で包みました。この開発STで年齢は、大小いずれかの生殖腺を観察することができます。未熟卵巣は、二次卵母細胞の発達同じ大きさ、及び卵胞細胞が生殖腺体積（ 図1E）を増加させます。未成熟精巣ため幼虫卵巣（ 図1F）の変性およびアポトーシスの小です。
単離された生殖組織の分子特性を分析するために、我々は最初のAMH、cyp19a1a、nanos3及び脈 、qPCRによりゼブラフィッシュにおける4つの生殖腺マーカーの遺伝子発現レベルを調べました。総RNAは、RNA単離キットを使用して、幼虫性腺組織（N = 35）から抽出しました。加えて、我々は、17 DPFの幼虫の頭部と尾部を除去し、対照群としてRNAを抽出する（心臓および肛門細孔の構造との間）トランク組織を使用した（N = 15）。トランク組織は、皮膚、筋肉、骨（脊椎と肋骨）、膀胱、腎臓および生殖腺を泳ぐが含まれています。オリゴdT-Primed cDNAをqPCRのために使用されました。定量PCRの結果は、それぞれ約397、342、45および170倍、単離された生殖組織（ 図2）DPF 17にAMH、cyp19a1a、nanos3及び脈発現レベルの増加を示しました。
図17 DPF、25 DPFにおける幼生ゼブラフィッシュにおける典型的な生殖腺組織の1顕微鏡写真。 （A）25Xステレオ顕微鏡下で内臓を露出するために皮膚及び腹部の片側の筋肉をリッピング。 （B）臓器の質量を除去した後、水泳膀胱および生殖腺は、トランクに取り付けられたまま。 （B '）水泳膀胱および生殖腺の相対位置を示すために、パネルBにおける赤いボックスのビューを増幅しました。生殖腺は、矢印で示されています。 （C）は、ISO 17のDPFの生殖腺組織をた関連の。画像内の黒い組織（矢印）は、生殖腺に取り付け内皮組織及びprotonephridiumあります。 （DE）25 DPFでの脂肪組織の除去前後の大きな生殖腺。 （F）25 DPFにおける小さな性腺。スケールバー：200μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図17 DPFのトランクや孤立生殖腺でAMH、cyp19ala、nanos3と脈の2正規化された遺伝子発現レベル。使用される動物の数：対照群、n = 15。性腺基、N =対照群の35トランク組織ヘッドおよびテール構造をなしています。性腺基は、単離された性腺組織を指します。/files/ftp_upload/55294/55294fig2large.jpg」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ゼブラフィッシュは、強力なモデルとなっており、広範囲の開発と疾患関連研究に使用されています。例えば、脳、心臓、生殖腺、腎臓などのアダルトゼブラフィッシュにおける臓器の単離のための方法は、ウェル23、24、25を文書化されています。小型及び幼虫のゼブラフィッシュにおける生殖組織の動的再造形に、生殖腺組織の単離は困難な作業です。幼虫の生殖腺26を検査するためにEGFPベースの細胞選別とレーザーマイクロダイセクション：これまでの研究では、全体の解剖トランク組織またはトランスジェニック脈を使用します。栽培中の第4染色体の改変は、家畜ゼブラフィッシュにおける性別決意謎を行います。ここで説明する私たちの方法は、性決定メカを探索するために役立つことができ、さらに形態学的および分子検査のために、比較的きれいで、早期の生殖腺の製剤を提供することができますanisms。
開発の初期段階で、他の構造からの開発生殖腺を分離することは容易ではありません。私たちの方法は、解剖を実行する方法について説明します。正常にこのプロトコルを実行するには、いくつかの重要なステップに注意する必要があります。まず、幼虫のゼブラフィッシュの成長条件は、期待される結果を得るために重要です。幼生ゼブラフィッシュの生殖腺の発達は非常に動的なプロセスです。性腺組織の大きさおよび外観は、動物27の開発段階によって決定されます。標準化された状態で、ゼブラフィッシュの異なるバッチを維持することが重要です。幼虫の成長に影響を与え得る要因は人口密度、明暗サイクルの持続時間、食品の可用性と給餌スケジュールを含みます。仔魚の標準長さの測定は、動物22の成長状態を決定するためのガイドとして使用することができます。成功した生殖腺組織isolatための第二の重要な要因イオンは、相対位置及び生殖腺と周囲組織との間の形態学的差異を十分に理解あります。生殖腺が浮き袋の腹側に位置しているので、最初に浮き袋と一緒に生殖腺を分離することが便利です。加えて、生殖腺の遠位端はしっかり腸の遠位端に取り付けられています。だから、1は、先端に生殖腺から腸を削除する際に注意する必要があります。その後の遺伝子発現解析のために、あらかじめ冷却メディアと寒天プレートを使用し、かつ迅速に全体の手順を実行することが不可欠です。
同様の方法は、正常ルフ・ケッティングらによって利用されてきました。 28。彼らは、3週齢の幼虫にpiRNAsの機能とPIWI経路を調査するための生殖腺分離法を適用しました。ここでは、develoの分子同定と遺伝子発現プロファイルを探求し、早ければ17 DPFとしてゼブラフィッシュ幼生からの性腺組織を解剖しましたpingのゼブラフィッシュ生殖腺。以前に単離された生殖腺組織の将来の分子分析は、ゼブラフィッシュでセックス開発の根底にあるメカニズムを解明するためにトランスクリプトーム、methylome及びヒストンアセチル化パターンを決定するために実行されてもよいです。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、魚のケアのためのCチャンに感謝します。この作品は、中国の国家自然科学基金（GPへ31171074、31371099と31571067）によって及び浦江タレントプロジェクト（GPへ09PJ1401900）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture dish 100 mm | Corning | 430167 | For embryo incubation |
| 20x EM | For a 1 L needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl·2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4·7H2O. | ||
| 1x EM | Dilute 20x EM in distilled water | ||
| AGAROSE G-10 | Gene | 121985 | For preparing the 2% agar plates |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | For RNA isolation |
| Meter glass | Shen Bo | 250 ml | For preparing the 2% agar plates |
| Microwave Oven | Midea | M1-211A | For heating the AGAR |
| Tweezer DUMONT#5INOX | World Precision Instrument | 500341 | For dissection |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ168 | For dissection |
| Pure water equipment | Millipore | ||
| Ringer’s solution | For a 1 L needed: Add 6.78 g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container. | ||
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Metal bath | QiLinbeier | Model GL-150 | |
| Microscope | Leica | M205 FA | For photomicrograph |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micro Scale RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | For RNA isolation from gonad tissues |
| Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | For DNA digestion in the RNA solution |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | #K1631 | For first-strand cDNA synthesis |
| Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | For digesting the residual RNA in the cDNA solution. |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | This product is a Taq DNA polymerase-based 2x master mix for real-time PCR and applicable for intercalation assay with SYBR Green I. |
| Spectrophotometer | Ne Drop | OD-2000+ | Measuring the concentration of the total RNA |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Hamburg | gene expression profiling |
References
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