Summary
在这里我们提出 的方法，以农药污染的食物输送到两个单独的蜜蜂和蜂箱菌落。过程评估由基本幼虫饮食的体内喂养和也对蜂窝菌落的天然条件对个体蜜蜂的农药效果。
Introduction
农药在环境中的存在是最严重的问题之一是影响一个蜜蜂1，2，3的使用寿命。一些研究表明农药残留量的蜂蜜蜂群和蜜蜂产品的共同存在。在台湾，农药的平均应用为11-12公斤/公顷，每年（2005至13年）。农药在台湾使用量是比欧盟国家的高，以及拉丁美洲国家的4，5。换句话说，在养蜂环境正在遭受严重的农药压力，特别是在台湾，可能在其他国家。
在西方蜜蜂是农业系统6的主要传粉昆虫之一，它也产生有价值的产品，如蜂蜜。然而，蜜蜂是博览会ED各种杀虫剂和这些农药能觅食上采集花蜜和花粉7,8时已喷洒杀虫剂花后带回蜂箱。他们还可以通过自己的目的来控制荨麻疹9，10，11内的虫害问题养蜂人暴露于杀虫剂。由于蜜蜂幼虫被护士蜜蜂为他们的发展，幼虫，无人机喂，甚至女王可能会接触到这些农药污染的花蜜和花粉12。需要解决的13多种农药对蜜蜂的毒性。
许多已作出努力，以评估环境农药残留的问题。杨等人。测试的蜜蜂幼虫在发展中的神经毒性杀虫剂吡虫啉的影响蜂箱和报道，吡虫啉亚致死剂量导致成年蜂14的嗅觉关联行为。此外，Urlacher 等。检查的有机磷农药，毒死蜱，对蜜蜂工人的学习表现在实验室条件下15的亚致死效应。在我们以前的研究中，我们评估的昆虫生长调节剂（IGR）的影响，吡丙醚（PPN），幼虫蜜蜂16。
在本文中，我们提出，以评估对蜜蜂的发展化学影响的方法。进行了描述并应用于任何个别蜜蜂或菌落蜜蜂馈送方法。起初，我们在殖民地幼虫上测试了不同浓度的农药污染的基本幼虫饲料（BLD），以评估在体内个别蜜蜂农药的影响。我们接着来模拟自然康迪特通过使用蜂箱内农药污染的糖浆中的农药的离子。在该方法中，PPN，它被广泛用于对抗有害昆虫17和有害蜜蜂幼虫和蛹16，18，19的发展，将表示该领域的农药的负面影响的指标。
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Protocol
1.准备
- 使1升50％的糖浆。溶解1公斤蔗糖在1L的DDH 2 O.
- 准备在BLD吡丙醚（PPN）的解决方案。使1.1升的10,000ppm的PPN原液，并稀释于无菌的DDH 2 O储存于4℃1 L 100毫升PPN溶液。
- 稀释在BLD的PPN原液至0.1，1，10和100mg / kg的（PPM）最终浓度为下述实验。
- 让PPN糖浆（为殖民地的水平）。稀释PPN股票的50％糖浆10和100ppm的最终浓度为以下实验。
- 蜜蜂饲养。
注：在这里，实验地点是国立宜兰大学（NIU）养蜂场，艺兰市台; （GPS坐标：N24.747278，E121.746200）。- 检查蜜蜂（ 意大利蜜蜂 L.）菌落每周食物量并在必要时（蜂蜜存储区是空的）用1升50％的糖浆进料。定义一个健康集落在每个集落，用大号产卵通常蜜蜂梳子的9个帧。
- 制备100毫升基本幼虫饮食（BLD）的。溶解6％D-葡萄糖，6％果糖，和1％的酵母提取物在无菌蒸馏水去离子水（DDH 2 O）和补充有50％蜂王浆。储存在4°C，但不超过3天。
注意：预温热至35℃实验前并在3天内使用。
2. 体内送入方法
注意： 体内喂养方法已经从汉利等改性。 20
- 蜜蜂幼虫的选择和标签。
- 插入一个大号排阻到健康群体的9个帧分割成4个帧和5帧，同时限制王后到4帧区间。留在4帧部分的至少一个空帧产卵。
- 蜂王产卵1天后，检查蛋的外观的帧并保持蜂箱72个小时（ 第 4天）内的鸡蛋直到1天老幼虫孵化。采用包含1日龄工人幼虫（24小时内画影线）出用手从测试配置单元中的帧中的一个和从与蜂刷框架拆除蜜蜂工人。
- 覆盖有透明的滑动件（尺寸=长×宽×厚=29.7毫米×21毫米×0.1毫米）所述框架和钉对帧与图钉（ 图1A）的边缘上的透明幻灯片。
- 对于每个处理，随机选择50一天的老幼虫（ 第 4天），并通过使用在透明滑动永久记号笔标记每个育雏细胞（ 图1A和1B）。
注意：通过使用永久记号笔，以避免不同的处理之间的混乱写帧和透明幻灯片上每个处理的信息，以及。除去标记的幻灯片，并保持用于体内</ em>的进料和观察。
- 体内喂养。
- 不同浓度的PPN-BLD（0.1，1，10和100ppm）的每个标记的育雏细胞，通过移液在1天，2和3加以分别为10μL，10μL和20μL，根据的吸气量幼虫龄。 BLD（无PPN）相同量添加到对照组。由此，PPN-BLD的每个标记的细胞育雏总剂量累积到4，40，400，和4000微克。
注意：通过标记透明载玻片识别标记的育雏细胞和喂食后除去标记透明幻灯片。使用新鲜BLD供给由工蜂防止育雏细胞的清洗。 - 返回PPN处理帧到初始菌落作进一步的观察。
注：每个处理有四个殖民地4个生物重复。
- 不同浓度的PPN-BLD（0.1，1，10和100ppm）的每个标记的育雏细胞，通过移液在1天，2和3加以分别为10μL，10μL和20μL，根据的吸气量幼虫龄。 BLD（无PPN）相同量添加到对照组。由此，PPN-BLD的每个标记的细胞育雏总剂量累积到4，40，400，和4000微克。
- 7天处理的幼虫观察。
- 观察日ËPPN处理幼虫，标记的透明滑动返回到帧以记录死亡率和封盖率标记的育雏细胞。
- 13天治疗蛹羽化和利率的观察。
- 删除封顶育雏细胞的蜂蜡。
- 把软尖镊子进入育雏细胞和夹紧蛹非常轻微地再取出来蛹轻轻。
- 与实验室组织的双层下方各孔转移到蛹24孔组织培养板中。记录蛹转移过程中的损伤和死亡。
- 保持在培养箱中在24孔组织培养板在34℃和70％相对湿度，直至出现（ 约 8天）。
- 观察并记录蛹和出现的蜜蜂。
- 统计
- 计算所记录的数据并呈现为平均值±SD
- 分析由SA使用方差分析（ANOVA）分析数据S和用最少的差异显著（LSD）检验，以分析不同处理两种手段的区别。定义为P值<0.05具有统计学显著。不同的字母在表的同一列显示，通过统计分析显著的效果。
3. PPN的毒性在殖民地水平蜂箱
- 成立蜜蜂群体。
- 插入一个大号排除器垂直于健康的群体的9个帧分割成4个帧（A部分）和5帧（B部分），同时限制王后到4帧区间。在用于产卵的4帧部分保留至少一个空帧。
注：换个女王逃生的女皇部分的顶部，以防止女王从零部件之间移动。 - 女王铺设1天的鸡蛋后，检查帧鸡蛋的外观。用手取含有鸡蛋从部分A进行适当的帧并取出蜜蜂工人从与蜂刷帧。
- 盖上透明滑动框架和钉透明幻灯片与图钉框架的边缘。
- 随机地选择含有鸡蛋100个育雏细胞，并通过使用在透明幻灯片永久性记号笔标记每个育雏细胞。分配这些100个育雏细胞作为组1.收件使用永久标记，以避免不同的处理之间的混淆的帧和透明幻灯片上每个处理的信息。
- 返回标记的帧部分用于3天，然后王后转移到B部分产卵。
- 1天后，检查部分B的帧中，选择一个合适的帧和标签如步骤3.1.4所述的含有鸡蛋100个育雏细胞。分配这些100个育雏细胞作为第2组。
- 返回标记的帧到B部分3天，然后转移王后A部分产卵。
- 反复A部分和B部分之间的女王交换6次以上和数值分配团，分别（ 图2）。应该有共9组。
- 插入一个大号排除器垂直于健康的群体的9个帧分割成4个帧（A部分）和5帧（B部分），同时限制王后到4帧区间。在用于产卵的4帧部分保留至少一个空帧。
- ŤREAT蜂蜜蜂群与在第13天PPN糖浆（ 图2）。
- 加入1升含有在塑料蜂料箱10或100ppm（宽×长×高= 20厘米×30厘米×3.5厘米）的50％PPN糖浆和把盒子上在实验菌落的帧的顶部。
注：第1组没有13天内收到的PPN为育雏细胞已被查封。 - 饲料对照组如步骤2.2中所述的1L 50％糖浆（无PPN）。
- 加入1升含有在塑料蜂料箱10或100ppm（宽×长×高= 20厘米×30厘米×3.5厘米）的50％PPN糖浆和把盒子上在实验菌落的帧的顶部。
- 共1日龄幼体和记录作为每一组在第5天（ 图2）100个标记的育雏细胞的蛋孵化率。蜜蜂卵一般需要3天才能孵化成0天幼虫;因此，检查和标签100个鸡蛋含有育雏细胞在第1天，并在第5天计数1天老幼虫的数目对于每个组，以获得孵化率百分比。
- C指望。2-15封端的育雏细胞和记录作为每一组第11天（ 图2）100个标记的育雏细胞的幼虫封盖率。 6〜7日龄幼虫窝细胞会通过蜜蜂工人蜜蜂蜡幼虫化蛹为上限。
- 观察蛹成熟和记录标记100个育雏细胞的羽化率对于每个组17天（ 图2）。
- 删除封顶育雏细胞的蜂蜡，并采取了蛹轻轻用软尖镊子。转移蛹于24孔组织培养板用实验室组织的双层之下每个孔中。
- 保持在培养箱中在24孔组织培养板在34℃和70％RH，直到出现。
- 观察并记录蛹和出现蜜蜂对于每个组，直到第9组（49实验天）。
注：每个处理有四个生物重复。
- 统计
- 计算所记录的数据并呈现为平均±标准差。
- 分析对治疗之间的显著差异（ 例如为0ppm / 10 ppm时，为10 ppm / 100ppm的和为0ppm / 100ppm的）每个组中通过使用学生双尾t检验。定义如果P值<0.05为有统计学显著。
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Representative Results
为蜜蜂现场测试中，大号仅限于4帧部分用于产卵。此步骤可能会增加育雏密度在一帧和促进随后的观测。每个处理标记，和蜜蜂的发展显然通过透明幻灯片观察。 在 PPN-BLD的体内料到在蜂箱蜜蜂幼虫进行精确评估PPN对蜜蜂的殖民地发展的影响。使用体内供给方法促进了在蜂箱的化学处理的影响的观察。
对于PPN-BLD的每个剂量，共50个育雏细胞被标记和处理。加入PPN-BLD后，经治疗帧被返回到原来的菌落自然条件下的观察。 PPN-BLD对幼虫期蜜蜂的负面影响是容易OBSERVED。观察到的剂量依赖性作用。 表1呈现蜜蜂，在幼虫期死亡在两个较高剂量10和100ppm的数量。如表1所示，在两个剂量（0.1和1ppm），所述封盖率，日内出现和羽化率分别为不是从0（BLD食品加）显著不同或不喂食物的控制，只用的显著更高百分比蜜蜂与1ppm的变形的翅膀。在低浓度的PPN观察蛹黑化。此外，成人蜜蜂的比例出现了变形翼与较高剂量的PPN（ 表1）增加。
为了模拟蜜蜂菌落从环境PPN残余痛苦，PPN糖浆到整个蜂蜜蜂群的供给进行。治疗前，每一个集落是由两张排除器在第3天的间隔分为9个不同的时间组（ 网络连接古尔2）。因此，类似于那些在自然环境条件下，同时观察PPN对孵化，封盖和羽化率的影响。
将菌落在第13天（ 图2中由红色虚线表示）供给糖浆与10或100ppm PPN。从理论上说，组1是一个PPN - 自由控制，因为PPN-浆状物在第13天进料和在组1中的蜜蜂分别在蛹期和封端;在幼虫期蜜蜂开始在组2和3受到影响，并且将卵在基团4-9由于在PPN污染蜂箱的曝光时间变长（ 图2）的影响。
在这项试验中，我们给蜜蜂菌落PPN糖浆和观察发展当成人蜜蜂消耗的药水，想必饲喂蜂王和幼虫。这种假设被证实hatc兴，封盖和PPN治疗后观察到的羽化率和变形翅蜜蜂， 如图3A - 3D。所有参数在较高剂量（100ppm的）开始第3组显著不同，除了孵化率（ 图3A - 3D）。此外，PPN糖浆治疗后，许多蛹用黑色表皮，或不出现死亡。在100ppm的PPN治疗，封端的细胞被破坏，和受伤蛹从菌落（ 图3E）删除。
图1： 育雏细胞标记的示意图。 （A）1-日龄工人幼虫覆盖透明滑动纸和由永久性标记进行标记。 （B）标记为1天龄的幼虫工人育雏细胞;白色箭头表示1日龄内的工人幼虫。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 时间轴PPN时相对于9个实验组开始为。不同浓度的PPN在第13天（红色虚线）进料。将经处理的细胞集落分为A部分和B部分。女王交换从部分A到部分B和反之亦然用于产卵被示出。这已被复制许可爱思唯尔16。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图3： 前和喂养1千克PPN糖浆成测试蜂群后蜜蜂幼虫的开发。共9组在该实验中进行了调查：（A）孵化率; （B）封端率; （C）羽化率;和（D）畸形翼率。平均值±SD呈现;红色箭头表示，在此期间可以PPN开始作用于蜜蜂的时间。比对照（0 PPM）黑色星号显示出统计学意义。红色星号显示10至100ppm之间的统计学意义; （E）为100ppm PPN糖浆处理的蜂群表明未加帽的细胞，可能是变形蛹和黑色和变形蛹。这已被复制许可爱思唯尔16。 请点击此处查看该图的放大版本。
| PPN-BLD（PPM） | 幼虫号 | 幼虫发育 | ||
| 封顶率（％） | 羽化率（％） | 畸形的翅膀（％） | ||
| 100 | 140 | 0B | 0B | - |
| 10 | 139 | 22.2±33.2b | 0B | - |
| 1 | 140 | 72.3±17.9a | 67.7±17.6a | 7.7±5.7a |
| 0.1 | 136 | 78.3±17.5A | 75.4±22.8a | 1.4±2.8B |
| 0 | 138 | 78.9±5.4A | 78.9±5.4A | 0B |
| 不进纸 | 122 | 87.8±9.1a | 86.1±7.2A | 0.8±1.5B |
表1： 继续3天PPN对1日龄幼虫取食 的影响 。每个幼虫细胞中，从第1天到3分别添加BLD的10，10个20μL，。每个测定包含25-38幼虫菌落和4个集落进行了测试。平均值±SD呈现。不同的字母在同一列是通过最小二乘差异检验（P <0.05）显著不同ANOVA显示出显著作用之后。这已被复制许可爱思唯尔16。
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Discussion
王后限制产蛋方法和王后交换法是用于获得本协议内的现场测试设置蜜蜂基团的关键步骤。王后限制产蛋方法允许蜜蜂的生命周期的同步。因此，研究人员可以选择相同的年龄与不同剂量农药的治疗1日龄幼虫。对于女王交换法，王后被部分A（4帧）和B（5帧）以获得蜜蜂的不同发育阶段的现场测试，以评估农药和农药残留的影响之间进行交换。此外，大量的选择育雏细胞被记录在使用透明幻灯片标记现场测试。然而，鸡蛋在铺设偶尔导致育雏细胞不足以蜂王产卵。因此，需要为皇后交换法空帧的制备。另外，女王限制产蛋方法也可以用于对在蜂箱测试准备不同的蜜蜂群体。帧的入部分A 2帧和B部分7帧分离和女王的部分A（2帧）的布置可以限制2帧中由大号产的卵。
对于体内供给方法，PPN-BLD加入到每个育雏细胞。的蜜蜂比糖浆16,20表现出较高的接受BLD的。蜜蜂幼虫存活和生长的蜂王浆，糖，酵母提取物，和蒸馏水22，23组成的人工饲料。该BLD的葡萄糖和果糖成分并没有影响到幼虫的存活率在体外 21，因此，BLD将在蜂箱蜜蜂的增长更加稳定。值得注意的是，使用新鲜的BLD喂养也可以防止在工蜂幼虫排除幼虫饲养试验。此外，在饲养过程中，料温和首先需要避免1天岁的幼虫死亡。
在现场测试，化学在蜂箱偶尔引起幼虫排除由于护理蜜蜂的高嗅觉灵敏度污染BLD。糖组成显著影响平均幼虫成活率，蛹预幼体的重量，成人的重量，和卵巢管数量21。当浆状物用于递送的转基因花粉或阳性对照农药二嗪农，以蜜蜂幼虫，工人除去从含有添加或污染的食物21育雏细胞数幼虫。因此，所述糖组合物应该加以注意。增加1天老幼虫的数量或分散受试个体育雏小区站点也可以改善的问题。事实上，基于所述PPN-BLD处理过程的观察和戏剧性的剂量依赖性影响PPN-BLD蜜蜂上的发展，我们认为护士并没有消除人为添加到BLD育雏细胞。低浓度的蛹PPN原因黑化，这可能是由于增加的酚氧化酶活性，其调节黑化和化蛹24，25，26的。基于使用每个育雏细胞的人工饲养方法，PPN-BLD对蜜蜂的发展的巨大影响，可能是由于孵化的第一天PPN直接接触。
在喂养实验中使用的化学剂量可根据从蜂蜜的蜂箱收集新鲜的花粉样品中农药残留的调查数据进行设计。有各种各样的自然环境殖民地的农药污染的途径。化学污染物会被带回蜜蜂殖民地和幼虫摄取由于喂养MOT工蜂的离子，最终影响幼虫的发育。为了评估PPN的在蜂箱殖民地水平的影响，来代替花粉糖浆在这项研究中是最快最直接的方式饲养，以确保蜜蜂消耗的化学物质。此外，糖浆的条件可被定义的，而花粉的含量难以控制（ 例如 ，病原体或农药污染）。
下一个蜂蜜蜂群的蜜蜂现场条件，不同发育阶段（卵，幼虫，蛹和成虫蜜蜂）遭受同样的环境因素。在我们的实验装置，进行了模拟自然条件，以评估在动态环境中的化学物质对蜜蜂的发展阶段的影响。因此，PPN治疗（13天）后，我们就可以在第1组观察不受影响封盖率，受影响的封盖率在其他八组，及影响幼虫期S IN组2和3， 等。在这些条件下，细胞集落内的真实效果和化学整个菌落的扩散途径是清楚的。
与PPN糖浆处理蜜蜂菌落表现出加盖的细胞和从细胞集落除去蛹的失真。此外，在100ppm的PPN治疗中观察到的蛹广泛黑化。因此，PPN糖浆供给方法允许化学品对蜜蜂的生命周期在蜂箱的动态影响被观察到。在这项试验中，由工人和护理蜜蜂占据糖浆被推测送入蜂王和幼虫。为了确认，我们未来的研究将使用含有化学药水化学标记物（如食用染料），以进一步促进化学污染的蜂箱的动力学研究。
护士蜜蜂的食物源应来自觅食或在蜂窝和幼虫被馈送下颌和hypopharyng由护士蜜蜂21，25，26，27，28产生的EAL腺分泌物。当幼虫由护士蜜蜂馈送，由所述咽下腺在下颚骨产生的分泌物可以稀释PPN-糖浆。这种生物稀释效应更接近地类似于天然条件，但说明了不同的结果，以在体内供给方法。几种材料，包括其它杀虫剂，重金属和蜜蜂病原体可应用于此供给方法，用于评估和处理在蜜蜂种群的角色。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究是由格兰特105AS-13.2.3-BQ-B1从动物局动植物卫生检验检疫，农业委员会，行政院和格兰特103-2313-B-197-002-MY3从支持部科学技术部（MOST）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Honey bee box | SAN-YI Honey Factory | W1266 | Honeybees rearing |
| Queen excluder (between frames) | SAN-YI Honey Factory | I1575 | Queen limitation |
| Queen excluder (on top) | SAN-YI Honey Factory | I1566 | Queen limitation on top |
| Bee brush | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | W1414 | clean the bees on frame gently |
| Bee feeder | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | P0219 | feed sugar syrup to colony |
| Transparent slide | Wan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40) | 1139 | Mark the larval area on the frames (Material: Polyethylene Terephthalate, PET) (Size = Length*Width*thick = 29.7 mm * 21 mm * 0.1 mm) |
| 24 well tissu culture plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | TCP011024 | Rearing pupae from extraction |
| Autoclave | Tomin medical equipmenco., LTD. | TM-321 | Make sterilized distilled deionized water (ddH2O) |
| P20 pipetman | Gilson | F123600 | Add PPN into bee larval food pool |
| Incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-550RD | Rearing pupae from extraction |
| Kimwipes | COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD | KCS34155 | Rearing pupae from extraction |
| Royal jelly | National Ilan University (NIU) | NIU | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(-)-Fructose | Sigma | F0127 | Make basic larval diet (BLD) |
| Yeast extract | CONDA, pronadisa | 1702 | Make basic larval diet (BLD) |
| Sucrose | Taiwan sugar coporation | E01071010 | Make sugar syrup for bee food |
| Pyriproxyfen (11%) | LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD. | Registration No. 1937 | Insect growth regulator (IGR) used in the experiment |
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