Summary
Heri vi presentere en metode for å mate plantevernmidler forurenset mat til både en individuell honningbie og en bikube koloni. Fremgangsmåten evaluerer pesticid virkning på individuelle honningbier ved in vivo tilførsel av basisk larve diett og også på den naturlige tilstand av bikube koloni.
Introduction
Tilstedeværelsen av plantevernmidler i miljøet er en av de mest alvorlige problemer som påvirker livet til en honningbie en, to, tre. Flere studier har demonstrert den felles nærvær av preparatet rester i honningbie kolonier og bier. I Taiwan, gjennomsnittlig bruk av plantevernmidler var 11-12 kg / ha hvert år (2005-2013). Mengden av plantevernmidler som brukes i Taiwan er høyere enn EU-landene, og de latinamerikanske landene 4, 5. Med andre ord, er apicultural miljøet lider alvorlig plantevernmiddel stress, spesielt i Taiwan og muligens i andre land.
Honey Bee Apis mellifera er en av de store pollinatorer i jordbrukssystemer 6 og det gir også verdifulle produkter som honning. Men honningbier er exposed til ulike plantevernmidler og disse plantevernmidler kan bringes tilbake til bikuber etter beite på blomster som har blitt sprayet med plantevernmidler ved innsamling nektar og pollen 7, 8. De kan også bli utsatt for plantevernmidler av birøktere seg som mål å kontrollere skadedyr inne i elveblest 9, 10, 11. Fordi honningbie larvene blir matet av sykepleier bier for deres utvikling, larver, droner og til og med dronning kan bli eksponert for disse plantevernmiddel-forurenset nektar og pollen 12. Giftigheten av ulike plantevernmidler til honningbier må tas opp 13.
Mange forsøk har vært gjort for å vurdere spørsmål om miljøsprøytemiddelrester. Yang et al. testet påvirkning av nevrotoksiske insektmiddel imidakloprid på utvikling av honningbie larver ibikube og rapporterte at en sub-letal dose av imidakloprid resulterte i olfaktorisk assosiativ oppførsel av voksen bier 14. Også Urlacher et al. undersøkte subletale effekter av en organophosphate plantevernmiddel, chlorpyrifos, på en honningbie arbeidstaker læring ytelse under laboratorieforhold 15. I vår forrige undersøkelse, vurderte vi effekten av et insekt vekst regulator (IGR), pyriproksyfen (PPN), på larvehonningbier 16.
I denne artikkelen presenterer vi metoder for å vurdere de kjemiske virkninger på utviklingen av honningbier. Honningbie foringsmetoder er beskrevet og anvendt for å enten individuelle honningbier eller til en koloni. Til å begynne med ble det undersøkt forskjellige konsentrasjoner av pesticid-forurenset basislarve diett (F, L) på larver i koloniene for å evaluere virkningen av preparatet på individuelle honningbier in vivo. Vi fortsatte deretter å simulere den naturlige Conditioner av pesticidet ved anvendelse av plantevernmiddel-forurenset sirup i bikuber. I denne metoden, vil PPN, som er mye brukt mot skadeinsekter 17 og er skadelige for utvikling av honningbie larver og pupper 16, 18, 19, være en indikator for å representere den negative effekten av preparatet i felten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelser
- Lag 1 liter 50% sukker sirup. Oppløs 1 kg sukrose i 1 L DDH 2 O.
- Forbered Pyriproxyfen (PPN) oppløsning i Bld. Gjør 1,1 l av 10.000 ppm PPN stamløsning og fortynnet 100 ml PPN oppløsning i 1 liter sterilisert DDH 2 O. Oppbevar ved 4 ° C.
- Fortynn PPN lageroppløsning til sluttkonsentrasjoner på 0,1, 1, 10 og 100 mg / kg (ppm) i BLD for det følgende eksperiment.
- Gjør PPN-sirup (for kolonien nivå). Fortynn PPN lager til sluttkonsentrasjoner på 10 og 100 ppm i 50% sukkersirup for det følgende eksperiment.
- Honey bee oppdrett.
Merk: Her er den eksperimentelle sted National Ilan University (NIU) bigård, Yi-Lan by, Taiwan; (GPS-koordinater: N24.747278, E121.746200).- Kontroller honningbie (Apis mellifera L.) kolonier ukentlig for mat antall og mate med 1 liter 50% sukkersirup om nødvendig (honning lagringsområdet er tom). Definer en sunnkoloni som 9 rammer honningbie kammer i hver koloni med en dronning legge egg på vanlig måte.
- Forbered 100 ml basisk larve diett (F, L). Oppløs 6% D-glukose, 6% fruktose, og 1% gjærekstrakt i sterilisert destillert avionisert vann (DDH 2 O) og supplere med 50% Royal Jelly. Oppbevar ved 4 ° C, men ikke for mer enn 3 dager.
Merk: Forhånds varm til 35 ° C før forsøket og bruk innen 3 dager.
2. In vivo matemetode
Merk: In vivo foringsmetode har blitt forandret fra Hanley et al. 20
- Honey bee larver utvalg og merking.
- Sett en dronning forskyver for å dele 9 rammer av en frisk koloni i 4 karmer og rammer 5, og begrenser dronning til fire rammeseksjonen. La i det minste en tom ramme på fire rammeseksjonen for å legge egg.
- Etter dronningen legge egg for en dagKontroller rammene for utseendet av egg og holder eggene inne i bikuber i 72 timer (4 th dagen) inntil en dag gammel larvene klekkes. Ta en av de rammer som inneholder en-dag-gamle arbeideren larver (klekket i løpet av 24 timer) ut fra test strukturen for hånd og fjerne honningbie arbeidere fra rammen med en bie børste.
- Dekking av rammen med en gjennomsiktig glide (Size = lengde x bredde x tykk = 29,7 mm x 21 mm x 0,1 mm) og spikre den transparente lysbildet på kanten av rammer med tegnestifter (figur 1A).
- For hver behandling, tilfeldig velge 50 en dag gamle larver (4 th dag) og merke hvert avkom celle ved anvendelse av permanente tusj på det transparente sleiden (figur 1A og 1B).
Merk: Skriv informasjon om hver behandling på rammen og gjennomsiktig lysbilde samt ved hjelp av permanente merkepenner for å unngå forvirring mellom ulike behandlinger. Fjern de merkede lysbildene og holde for in vivo </ Em> foring og observasjon.
- In vivo foring.
- Legg forskjellige konsentrasjoner av PPN-BLD (0,1, 1, 10 og 100 ppm) til hver merket stamcellen ved pipettering på dag 1, 2 og 3 med 10 ul, 10 ul og 20 ul, henholdsvis, i henhold til inntaket mengden av larver alder. Legge den samme mengde av BLD (ingen PPN) til en kontrollgruppe. Derved vil den totale dosen av PPN-BLD i hver merket stamcellen akkumulerer til 4, 40, 400 og 4000 pg.
MERK: kjenne igjen de merkede cellene kull av de merkede transparente lysbildene og fjerne de merkede gjennomsiktige glir etter foring. Bruk frisk BLD for mating for å forhindre rengjøring av kull celler av arbeideren bier. - Returner PPN-behandlede rammer til de opprinnelige kolonier ytterligere observasjoner.
MERK: Hver behandling har fire biologiske repetisjoner i fire kolonier.
- Legg forskjellige konsentrasjoner av PPN-BLD (0,1, 1, 10 og 100 ppm) til hver merket stamcellen ved pipettering på dag 1, 2 og 3 med 10 ul, 10 ul og 20 ul, henholdsvis, i henhold til inntaket mengden av larver alder. Legge den samme mengde av BLD (ingen PPN) til en kontrollgruppe. Derved vil den totale dosen av PPN-BLD i hver merket stamcellen akkumulerer til 4, 40, 400 og 4000 pg.
- Observasjon av behandlet larver i dag syv.
- Å observere the PPN-behandlede larver, returnerer de merkede transparente glir til rammene for å registrere dødelighet og lokking av prisene på de merkede stamfisk cellene.
- Observasjon av behandlede puppe og eklosjonshormon priser på dag 13.
- Ta av bivoks for avkortet stamfisk celler.
- Sett myke tippet pinsett inn stamfisk celle og klemme puppe veldig lett og ta puppe forsiktig ut.
- Overfør puppe inn i 24-brønns vevskulturplater med en dobbelt-sjikt av laboratorie vev under hver brønn. Spill skaden og dødelighet under puppe overføring.
- Hold 24-brønns vevskulturplater i en inkubator ved 34 ° C og 70% relativ fuktighet inntil veksten (ca 8 dager).
- Observere og registrere puppe og dukket honningbier.
- Statistikk
- Beregn de registrerte data og til stede som et gjennomsnitt ± SD
- Analysere dataene ved hjelp av variansanalyse (ANOVA) av SAS og bruke den minst signifikante forskjell (LSD) test for å analysere forskjellene mellom to hjelp av forskjellige behandlinger. Definere statistisk signifikant som p-verdi <0,05. Ulike bokstaver i den samme kolonne i tabellen viser en betydelig virkning ved den statistiske analysen.
3. Giftig for PPN på kolonien nivå i Beehive
- Sett opp honningbie grupper.
- Sett en dronning forskyver vertikalt for å dele 9 rammer av en frisk koloni i 4 rammer (del A) og 5 rammer (del B), og begrenser dronning til fire rammeseksjonen. La i det minste en tom ramme i 4-rammeseksjonen for å legge egg.
Merk: Sagt på en annen dronning excluder den på toppen av dronningen del for å hindre dronningen fra å bevege seg mellom delene. - Etter dronningen legge egg for en dag, sjekk rammene for utseendet på egg. Ta de riktige rammene som inneholder egg ut fra del A for hånd og fjerne honningbie arbeiderefra rammen med en bie børste.
- Dekking av rammen med gjennomsiktig sklie og spikre gjennomsiktig sleiden til kanten av rammen med tegnestifter.
- Tilfeldig velge 100 kull celler som inneholder egg, og merke hver celle avkom ved å bruke permanent markør på det transparente lysbildet. Tildele disse 100 kull cellene som gruppe 1. Skriv informasjonen i hver av behandlings på rammen og gjennomsiktig plate ved å anvende permanent markør for å unngå forveksling mellom de forskjellige behandlingene.
- Returnere den merkede ramme til del A i 3 dager og deretter overføre den dronning til del B for å legge egg.
- Etter 1 dag, kontrollerer rammene av del B, velge en passende ramme, og merker 100 kull celler inneholdende egg som beskrevet i trinn 3.1.4. Tildele disse 100 kull cellene som gruppe 2.
- Returnere den merkede ramme til del B i 3 dager og deretter overføre dronning til del A for å legge egg.
- Gjenta dronning utveksling mellom del A og del B 6 flere ganger og tildele grupper numerisk,henholdsvis (figur 2). Det bør være totalt 9 grupper.
- Sett en dronning forskyver vertikalt for å dele 9 rammer av en frisk koloni i 4 rammer (del A) og 5 rammer (del B), og begrenser dronning til fire rammeseksjonen. La i det minste en tom ramme i 4-rammeseksjonen for å legge egg.
- T reat honningbie koloni med PPN sukker sirup på dag 13 (figur 2).
- Tilsett 1 L 50% PPN sukkersirup inneholdende 10 eller 100 ppm i et plast bie feeder box (B x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) og sette boksen på toppen av rammene i de eksperimentelle kolonier.
Merk: Gruppe 1 som ikke tar imot PPN på 13 dager som stamfisk cellene er blitt forseglet. - Strøm kontrollgruppen med 1 liter 50% sukkersirup (ingen PPN) som beskrevet i trinn 2.2.
- Tilsett 1 L 50% PPN sukkersirup inneholdende 10 eller 100 ppm i et plast bie feeder box (B x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) og sette boksen på toppen av rammene i de eksperimentelle kolonier.
- Telle 1 dag gamle larver og opptak av egget utklekkingsrate av 100 merkede kull celler for hver gruppe på dag 5 (figur 2). Honey Bee egg vanligvis tar 3 dager å klekkes til 0 dagen larver; Derfor, kontrollere og merke 100 egg-inneholdende kull celler på dag 1 og telle et antall av 1 dag gamle larver for hver gruppe på dag 5 for å oppnå den klekkingspro hastighet.
- Count avkortet kull celler og posten som larve capping hastighet på 100 merkede kull celler for hver gruppe på dag 11 (figur 2). 6 til 7 dager gammel larve stamfisk cellene vil bli avkortet med bivoks av honningbie arbeidere for larver forpuppes.
- Observere puppe modning og registrere eklosjonshormon hastighet på 100 merkede kull celler for hver gruppe på dag 17 (figur 2).
- Ta av bivoks for avkortet stamfisk celler og ta puppe ut med myke tippet pinsett forsiktig. Overfør puppe inn i en 24-brønns vevskulturplater med en dobbelt-sjikt av laboratorie vev under hver brønn.
- Hold 24-brønns vevskulturplater i en inkubator ved 34 ° C og 70% relativ fuktighet inntil veksten.
- Observere og registrere puppe og fremkom honningbier for hver gruppe til gruppe 9 (49 eksperimentelle dager).
Merk: Hver behandling har fire biologiske gjentas.
- Statistikk
- Beregn de registrerte data, og til stede som den midlere± SD.
- Analyser signifikante forskjeller mellom par av behandling (for eksempel 0 ppm / 10 ppm, 10 ppm / 100 ppm og 0 ppm / 100 ppm) i hver gruppe ved hjelp av Students tohalede t-test. Definer som statistisk signifikant hvis p-verdi <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For Honey Bee felttest ble en dronning begrenset til 4-rammeseksjon for å legge egg. Dette trinnet kan øke stam tetthet i en ramme og lette etterfølgende observasjoner. Hver behandling ble merket, og honningbier utvikling ble klart observert gjennom et gjennomsiktig lysbilde. In vivo tilførsel av PPN-BLD til honningbie larver i bikuben ble utført for å nøyaktig evaluere påvirkningen av PPN på utviklingen av honningbier i kolonien. Ved hjelp av in vivo forings metode lettes observasjon av virkningene av de kjemiske behandlinger på bikube.
For hver dose av PPN-BLD, ble totalt femti kull celler merket og behandles. Etter tilsetning av PPN-BLD ble de behandlede rammer tilbake til de opprinnelige kolonier for observasjon under naturlige forhold. De negative effektene av PPN-BLD på larvestadiet honningbier var lett observed. En doseringsavhengig effekt ble observert. Tabell 1 presenterer antallet av honningbier som døde ved larvestadiet ved de to høyere doser på 10 og 100 ppm. Som vist i tabell 1, i de to doser (0,1 og 1 ppm), monteringshodets priser, dager til oppkomst og eklosjonshormon ratene var ikke signifikant forskjellig fra 0 (F, L mat tilsatt) eller unfed kontroll, med bare en betydelig høyere prosentandel av bier med deformerte vinge ved 1 ppm. Melanization av pupper ble observert ved lave konsentrasjoner av PPN. Videre er andelen av voksne honningbier først med deformerte vinge økte med høyere doser av PPN (tabell 1).
For å simulere honningbie kolonier som lider av miljø PPN rest, mating av PPN sirup til hele honningbie koloni ble utført. Før behandling ble hver koloni oppdelt i 9 forskjellige tidsmessige grupper med 3 dagers intervaller ved to queen excluders (Figur 2). Derfor ble det observert virkningene av PPN på satsene for klekking, capping og eklosjonshormon samtidig under betingelser tilsvarende de i det naturlige miljø.
Koloniene ble matet sirup med 10 eller 100 ppm PPN ved dag 13 (antydet med den stiplede røde i figur 2). Teoretisk gruppe 1 var en PPN-fri kontroll fordi den PPN-sirup ble tilført på dag 13 og honningbier i gruppe 1 var i puppetrinnet og lukkes; honeybees i larvestadiet begynte å bli påvirket i grupper 2 og 3, og eggene vil bli påvirket i grupper 4-9 på grunn av den lengre eksponeringstid i PPN-forurensede bikuber (figur 2).
I denne studien matet vi honningbie kolonier med PPN sirup og observert utvikling når de voksne honningbier forbrukes sirup og antagelig lei dronningen og larver. Denne antagelse ble bekreftet av hatching, capping og eklosjonshormon frekvenser og deformerte vinger bier ble observert etter PPN behandlinger, slik som vist i figurene 3A - 3D. Alle parametre signifikant forskjellig ved den høyere dose (100 ppm) ved å starte med gruppe 3, med unntak av den utklekkingsrate (figur 3A - 3D). Videre etter PPN-sirup behandlinger, mange puppe døde med sorte neglebåndene eller ved å unnlate å dukke opp. I 100 ppm PPN behandling ble avkortet cellene ødelagt, og den skadde puppe ble fjernet fra kolonien (figur 3E).
Figur 1: Skjematisk av kull-celler merking. (A) en dag gamle arbeideren larver dekket av gjennomsiktige skyve papirer og ble merket av permanent markør. (B) merket 1 dagsgamle arbeideren larvekull celler; den hvite pilen indikerer en dag gamle arbeideren larve inne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Tidslinjen for når PPN startes i forhold til de 9 eksperimentelle grupper. Forskjellige konsentrasjoner av PPN ble matet på dag 13 (rød stiplet linje). Den behandlede koloni ble oppdelt i del A og del B. Queen-utveksling fra del A til del B og vice versa for å legge egg er vist. Dette er gjengitt med tillatelse fra Elsevier 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6 / 55296fig3.jpg"/>
Figur 3: Utvikling av honningbie larver før og etter foring 1 kg PPN sirup inn testede bee kolonier. Totalt ni grupper ble undersøkt i dette forsøk: (A) utklekkingsrate; (B) tildekking hastighet; (C) eklosjonshormon hastighet; og (D) misformet vinge hastighet. Gjennomsnitt ± SD er vist; Røde piler indikerer den tiden PPN kan begynne å handle på bier. Svarte asterisker viser statistisk signifikans sammenlignet med kontrollen (0 ppm). Rød stjerne viser statistisk signifikans mellom 10 og 100 ppm; (E) 100 ppm PPN sirup behandlet bikolonien viste uavdekkede celler, sannsynligvis deformeres puppe og svart og deformert puppe. Dette er gjengitt med tillatelse fra Elsevier 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| PPN-BLD (ppm) | Larver No. | larveutvikling | ||
| Avkortet rate (%) | Eklosjonshormon rate (%) | Feilformede vinger (%) | ||
| 100 | 140 | 0B | 0B | - |
| 10 | 139 | 22,2 ± 33.2b | 0B | - |
| 1 | 140 | 72,3 ± 17.9a | 67,7 ± 17.6a | 7.7 ± 5.7a |
| 0.1 | 136 | 78.3 ± 17.5a | 75,4 ± 22.8a | 1,4 ± 2.8b |
| 0 | 138 | 78,9 ± 5.4a | 78,9 ± 5.4a | 0B |
| Ikke-fôring | 122 | 87,8 ± 9.1a | 86,1 ± 7.2a | 0,8 ± 1.5b |
Tabell 1: Effekter av fortsatt 3 dager fôring av PPN på en dag gamle larver. Til hver larve-celle, ble 10, 10 og 20 ul av BLD tilsatt fra dag 1 til 3, henholdsvis. Hver analyse inneholdt 25 til 38 larver i en koloni og 4 kolonier ble testet. Gjennomsnitt ± SD er vist. Ulike bokstaver i den samme kolonne er signifikant forskjellige ved den minste kvadraters forskjellen test (P <0,05) etter ANOVA viste en signifikant effekt. Dette er gjengitt med tillatelse fra Elsevier 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Queen begrensede egg-leggende metode og dronning-utskiftingsmetode er kritiske trinn for å sette opp honningbie grupper for felttesting innen denne protokollen. Den Queen begrensede egg-leggende metode muliggjør synkronisering av livssyklusen til honningbier. Dermed kan forskerne velge en dag gamle larver på samme alder for behandling med forskjellige doser av plantevernmidler. For dronning-utskiftingsmetode ble dronning utvekslet mellom del A (4 rammer) og B (5 frames) for å oppnå forskjellige utviklingsstadier honningbie for felttesting for å evaluere virkningene av plantevernmidler og plantevernmidler. Dessuten ble et stort antall utvalgte kull cellene tatt opp i feltforsøk ved bruk av transparente lysbildene for etikettering. Men egg over-legging av og til resulterer i utilstrekkelig stamfisk celler for dronningen legge egg. Derfor er fremstillingen av tomme rammer som kreves for dronning-utskiftingsmetode. Alternativt kunne dronning-begrenset egg-leggende metode kan også benyttes for åfremstille forskjellige honningbie grupper for testing i bikuben. Separasjonen av rammene til 2 rammer i del A og 7 rammer i del B og plassering av dronning i del A (2 rammer) kan begrense eggene lagt av dronning innenfor 2 rammer.
For in vivo-matemetoden ble det PPN-BLD tilsatt til hvert avkom celle. Honningbier viste høyere aksept av BLD enn sirup 16, 20. Honey bee larver kan overleve og vokse på en kunstig diett bestående av kongelig gelé, sukker, gjærekstrakt, og destillert vann 22, 23. Glukose og fruktose sammensetning av BLD ikke påvirke overlevelsen av larvene in vitro 21, og derfor, BLD ville være mer stabil for honningbie vekst i bikuben. Spesielt, ved bruk av frisk BLD for mating kan også hindre arbeideren bier larve utelukkelse løpetlarveforingsforsøket. Videre under fôring prosessen, milde mating er i utgangspunktet nødvendig for å unngå døden av en dag gamle larver.
Ved felttester, kjemisk forurenset BLD i bikuben ganger forårsakes larve utelukkelse grunn av den høye følsomhet for olfaktoriske pleie bier. Sukkeret Sammensetningen påvirker i betydelig grad den gjennomsnittlige larve overlevelse, pre-pupal larver vekter, voksen vekter, og ovariole tall 21. Når sirupen ble brukt til å levere transgent pollen eller en positiv kontroll pesticid diazinon for honningbie larver, arbeiderne fjernet få larver fra kull celler som inneholder tilsatt eller forurenset mat 21. Således bør sukkersammensetningen noteres. Øke antall 1 dag gammel larver eller spre de testede enkelte stamfisk celle nettsteder kan også forbedre problemene. Faktisk er basert på den observasjon av PPN-BLD behandlingsprosesser og den dramatiske doseavhengige virkninger avPPN-BLD på utvikling av honningbier, antok vi at sykepleierne ikke fjerne kunstig lagt BLD til stamfisk celler. Lave konsentrasjoner av PPN årsak melanization av puppe, muligens på grunn av økt phenoloxidase aktivitet, som regulerer melanization og forpupping 24, 25, 26. Basert på bruken av en kunstig ernæring metode for hver stamcellen, kan de dramatiske virkninger av PPN-BLD om utvikling av honningbier være på grunn av direkte kontakt med PPN fra den første dagen av klekking.
De kjemiske doseringer benyttet i foringseksperimenter som kan være utformet basert på undersøkelsesdata for preparatet rester i friske pollenprøver tatt fra honning bikuber. Det finnes en rekke forskjellige ruter av plantevernmiddel forurensning av kolonier i det naturlige miljø. Kjemiske forurensninger kan bringes tilbake til de honningbie koloniene og svelges av larver på grunn av mating motion av arbeideren honningbier, til slutt påvirke utviklingen av larver. For å evaluere effekten av PPN på kolonien nivå i bikuben, ble sirup brukt i stedet for pollen for fôring i denne studien som den raskeste og mest direkte måten å sikre at honningbier forbrukes kjemisk. Videre kan tilstanden av sirupen skal defineres, mens innholdet av pollen er vanskelig å kontrollere (f.eks patogener eller plantevernmidler forurensning).
Under feltforhold, ulike utviklingsstadier (egg, larve, puppe og voksen bier) av honningbier i en honningbie koloni lide samme miljø faktor. I vår eksperimentelle oppsett, ble naturgitte forhold simulert for å vurdere virkningene av den kjemiske på utviklingsfasen av honningbier i et dynamisk miljø. Derfor, etter PPN behandling (13 dager), kan vi observere den upåvirkede lukkehastigheten i gruppe 1, den påvirkes capping hastigheten i de andre åtte grupper, og den påvirkes larvestadiets i gruppene 2 og 3, etc. Under disse betingelser, den sanne effekter i kolonien og hvor ruten til spredning av kjemikaliet til hele kolonien er klare.
Honningbie koloniene som ble behandlet med PPN sirup viste forvrengning av avkortet celler og fjerning av puppe fra kolonien. Videre ble omfattende melanization av pupper ble observert i 100 ppm PPN behandling. Dermed blir PPN-sirup mating metoden tillot den dynamiske innvirkning av kjemikalier på livssyklusen til honningbier i bikuben å bli observert. I denne studien ble det sirup tatt opp av arbeideren og sykepleie bier antagelig ført til dronningen og larver. For bekreftelse, vil fremtidige studier bruker kjemiske markører (slik som et spiselig fargestoff) i den kjemisk-holdig sirup for ytterligere å lette studiet av dynamikken i kjemisk forurenset bikuber.
Maten kilden til sykepleier bier bør komme fra nitter eller i bikuben og larver fôres kjeve og hypopharyngEAL kjertel sekreter som frembringes av sykepleier bier 21, 25, 26, 27, 28. Når larvene blir matet av sykepleier bier, kan sekreter produsert av hypopharyngeal kjertel i munndelene fortynne PPN-sirup. Dette biologisk fortynningseffekten mer ligner de naturlige betingelser, men forklarer de forskjellige resultatene til in vivo foringsmetoden. Flere materialer, deriblant andre pesticider, tungmetaller og honningbie patogener kunne anvendes på denne mating fremgangsmåte for evaluering og adressere roller i honningbie populasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Grant 105AS-13.2.3-BQ-B1 fra Bureau of Animal og plantehelse inspeksjon og karantene, Rådet for landbruk, konsern Yuan og Grant 103-2313-B-197-002-My3 fra departementet for naturvitenskap og teknologi (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Honey bee box | SAN-YI Honey Factory | W1266 | Honeybees rearing |
| Queen excluder (between frames) | SAN-YI Honey Factory | I1575 | Queen limitation |
| Queen excluder (on top) | SAN-YI Honey Factory | I1566 | Queen limitation on top |
| Bee brush | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | W1414 | clean the bees on frame gently |
| Bee feeder | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | P0219 | feed sugar syrup to colony |
| Transparent slide | Wan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40) | 1139 | Mark the larval area on the frames (Material: Polyethylene Terephthalate, PET) (Size = Length*Width*thick = 29.7 mm * 21 mm * 0.1 mm) |
| 24 well tissu culture plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | TCP011024 | Rearing pupae from extraction |
| Autoclave | Tomin medical equipmenco., LTD. | TM-321 | Make sterilized distilled deionized water (ddH2O) |
| P20 pipetman | Gilson | F123600 | Add PPN into bee larval food pool |
| Incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-550RD | Rearing pupae from extraction |
| Kimwipes | COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD | KCS34155 | Rearing pupae from extraction |
| Royal jelly | National Ilan University (NIU) | NIU | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(-)-Fructose | Sigma | F0127 | Make basic larval diet (BLD) |
| Yeast extract | CONDA, pronadisa | 1702 | Make basic larval diet (BLD) |
| Sucrose | Taiwan sugar coporation | E01071010 | Make sugar syrup for bee food |
| Pyriproxyfen (11%) | LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD. | Registration No. 1937 | Insect growth regulator (IGR) used in the experiment |
References
- Ruffi nengo, S. R., et al. Integrated pest management to control Varroa destructor and its implications to Apis mellifera colonies. Zootecnia Trop. 32 (2), 149-168 (2014).
- Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries, implications for honey bee health. PLoS One. 5, e9754 (2010).
- Lu, C. A., Chang, C. H., Tao, L., Chen, M. Distributions of neonicotinoid insecticides in the Commonwealth of Massachusetts, a temporal and spatial variation analysis for pollen and honey samples. Environ. Chem. 13, 4-11 (2016).
- Tsai, W. T. Analysis of coupling the pesticide use reduction with environmental policy for agricultural sustainability in Taiwan. Environ. & Pollut. 2, 59-65 (2013).
- Weng, Z. H. Pesticide market status and development trend (in Chinese). PRIDE. , https://pride.stpi.narl.org.tw/ (2016).
- Kevan, P. G. Pollinators as bioindicators of the state of the environment, species, activity and diversity. Agric. Ecosys. Environ. 74 (1-3), 373-393 (1999).
- Kevan, P. G. Forest application of the insecticide fenitrothion and its effect on wild bee pollinators (Hymenoptera: Apoidea) of lowbush blueberries (Vaccinium SPP.) in Southern New Brunswick, Canada. Biol. Conserv. 7, 301-309 (1975).
- Crane, E., Walker, P. The impact of pest management on bees and pollination. , IBRA. Cardiff, UK. (1983).
- Haouar, M., Decormis, L., Rey, J. Fluvalinate applied to flowering apple trees-contamination of honey-gathering bees and hive products. Agronomie. 10 (2), 133-137 (1990).
- Chauzat, M. P., et al. A survey of pesticide residues in pollen loads collected by honey bees in France. J. Econ. Entomol. 99 (2), 253-262 (2006).
- Bonzini, S., Tremolada, P., Bernardinelli, I., Colombo, M., Vighi, M. Predicting pesticide fate in the hive (part 1), experimentally determined τ-fluvalinate residues in bees, honey and wax. Apidologie. 42 (3), 378 (2011).
- Sanchez-Bayo, F., Goka, K. Pesticide residues and bees-a risk assessment. PLoS One. 9 (4), e94482 (2014).
- Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. Pesticides and honey bee toxicity-USA. Apidologie. 41, 312-331 (2010).
- Yang, E. C., Chang, H. C., Wu, W. Y., Chen, Y. W. Impaired olfactory associative behavior of honeybee workers due to contamination of imidacloprid in the larval stage. PLoS One. 7, e49472 (2012).
- Urlacher, E., et al. Measurements of chlorpyrifos levels in forager bees and comparison with levels that disrupt honey bee odor-mediated learning under laboratory conditions. J. Chem. Ecol. 42 (2), 127-138 (2016).
- Chen, Y. W., Wu, P. S., Yang, E. C., Nai, Y. S., Huang, Z. Y. The impact of pyriproxyfen on the development of honey bee (Apis mellifera L.) colony in field. J. Asia Pac. Entomol. 19 (3), 589-594 (2016).
- Dennehy, T. J., DrGain, B. A., Harpold, V. S., Brink, S. A., Nichols, R. L. Whitefly Resistance to Insecticides in Arizona: 2002 and 2003 Results. , San Antonio, TX, USA. http://ag.arizona.edu/crop/cotton/insects/wf/whiteflyresistance0204.pdf 1926-1938 (2004).
- Yang, E. C., Wu, P. S., Chang, H. C., Chen, Y. W. Effect of sub-lethal dosages of insecticides on honey bee behavior and physiology. Proceedings of international seminar on enhancement of functional biodiversity relevant to sustainable food production, ASPAC, Tsukuba, Japan, , http://www.niaes.affrc.go.jp/sinfo/sympo/h22/1109/paper_06.pdf (2010).
- Fourrier, J., et al. Larval exposure to the juvenile hormone analog pyriproxyfen disrupts acceptance of and social behavior performance in adult honey bees. PLoS One. 10, e0132985 (2015).
- Hanley, A. V., Huang, Z. Y., Pett, W. L. Effects of dietary transgenic Bt corn pollen on larvae of Apis mellifera and Galleria mellonella. J. Apicult.Res. 42 (4), 77-81 (2003).
- Kaftanoglu, O., Linksvayer, T. A., Page, R. E. Rearing honey bees, apis mellifera, in vitro 1, effects of sugar concentrations on survival and development. J. Insect Sci. 11 (96), 1-10 (2011).
- Vandenberg, J. D., Shimanuki, H. Technique for rearing worker honey bees in the laboratory. J. Apicult. Res. 26 (2), 90-97 (1987).
- Peng, Y. S. C., Mussen, E., Fong, A., Montague, M. A., Tyler, T. Effects of chlortetracycline on honey bee worker larvae reared in vitro. J. Invertebr.Pathol. 60 (2), 127-133 (1992).
- Bitondi, M. M., Mora, I. M., Simoes, Z. L., Figueiredo, V. L. The Apis mellifera pupal melanization program is affected by treatment with a juvenile hormone analogue. J. Insect Physiol. 44 (5-6), 499-507 (1998).
- Zufelato, M. S., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L., Hartfelder, K. The juvenile hormone analog pyriproxyfen affects ecdysteroid-dependent cuticle melanization and shifts the pupal ecdysteroid peak in the honey bee (Apis mellifera). Arthropod Struct. Dev. 29 (2), 111-119 (2000).
- Santos, A. E., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L. Hormone-dependent protein patterns in integument and cuticular pigmentation in Apis mellifera during pharate adult development. J. Insect Physiol. 47 (11), 1275-1282 (2001).
- Brouwers, E. V. M. Glucose/Fructose ratio in the food of honeybee larvae during caste differentiation. J. Apicult.Res. 23 (2), 94-101 (1984).
- Howe, S. R., Dimick, P. S., Benton, A. W. Composition of freshly harvested and commercial royal jelly. J. Apicult. Res. 24 (1), 52-61 (1985).
