Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Het evalueren van het effect van Environmental Chemicals over Honey Bee ontwikkeling van het individu naar Colony Level

Published: April 1, 2017 doi: 10.3791/55296
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

Introduction

De aanwezigheid van pesticiden in het milieu is een van de meest ernstige problemen die invloed heeft op de levensduur van een honingbij 1, 2, 3. Verschillende studies hebben de gemeenschappelijke aanwezigheid van residuen van bestrijdingsmiddelen in bijenkolonies en bijenproducten aangetoond. In Taiwan, het gemiddelde gebruik van pesticiden was 11-12 kg / ha per jaar (2005-2013). De hoeveelheid gebruikte pesticiden in Taiwan is hoger dan die van de EU-landen en de Latijns-Amerikaanse landen 4, 5. Met andere woorden, de bijenteelt milieu ernstige pesticide stress, vooral in Taiwan en mogelijk ook in andere landen.

De honingbij Apis mellifera is één van de belangrijkste bestuivers in landbouwsystemen 6 en het produceert ook waardevolle producten zoals honing. Echter, honingbijen zijn expoed aan verschillende pesticiden en deze bestrijdingsmiddelen kunnen terug naar bijenkorven na het foerageren op de bloemen die zijn bespoten met bestrijdingsmiddelen bij het verzamelen van nectar en stuifmeel 7, 8 worden gebracht. Ze kunnen ook worden blootgesteld aan pesticiden door de bijenhouders als doel plagen in de bijenkast 9, 10, 11 te regelen. Omdat honingbij larven worden gevoed door verpleegkundige bijen voor hun ontwikkeling, larven, drones en zelfs de koningin kan worden blootgesteld aan deze pesticide verontreinigde nectar en stuifmeel 12. De toxiciteit van verschillende bestrijdingsmiddelen honingbijen moet worden aangepakt 13.

Vele pogingen zijn gedaan om de problemen van milieu-residuen van bestrijdingsmiddelen te evalueren. Yang et al. testte de invloed van de neurotoxische insecticide imidacloprid op de ontwikkeling van de honingbij larven in debijenkorf en gemeld dat een sub-dodelijke dosis imidacloprid resulteerde in olfactorische associatief gedrag van de volwassen bijen 14. Ook Urlacher et al. onderzochten de sub-letale effecten van een organofosfaat pesticide, chloorpyrifos, op leerprestaties een honingbij werknemer onder laboratoriumomstandigheden 15. In onze vorige studie, evalueerden we de impact van een insect groei regulator (IGR), pyriproxyfen (PPN), op larvale honingbijen 16.

In deze paper presenteren we methoden voor de evaluatie van de chemische effecten op de ontwikkeling van de honingbijen. Honingbij voedermethoden werden beschreven en aangebracht op ofwel individuele bijen of een kolonie. In eerste instantie hebben we getest verschillende concentraties van pesticiden verontreinigde basic larvale dieet (BLD) op larven in de koloniën om de impact van het pesticide op de individuele honingbijen in vivo te evalueren. We gingen vervolgens over tot de natuurlijke condit simulerenionen van het pesticide met pesticide verontreinigde siroop in bijenkorven. Bij deze werkwijze wordt PPN, die wijd tegen plaaginsecten 17 en is schadelijk voor de ontwikkeling van honingbij larven en poppen 16, 18, 19, een indicator om het negatieve effect van het pesticide op het gebied vertegenwoordigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereidingen

  1. Maak 1 liter 50% suikerstroop. Los 1 kg sucrose in 1 L DDH 2 O.
  2. Bereid pyriproxyfen (PPN) oplossing in BLD. Voeg 1,1 l 10.000 ppm PPN voorraadoplossing en verdun 100 ml PPN-oplossing in 1 liter gesteriliseerde DDH 2 O. Bewaar bij 4 ° C.
  3. Verdun de PPN voorraadoplossing tot eindconcentraties van 0,1, 1, 10 en 100 mg / kg (ppm) in de BLD voor het volgende experiment.
  4. Maak PPN-siroop (voor de kolonie niveau). Verdun het PPN stock eindconcentraties van 10 en 100 ppm in 50% suikerstroop voor volgende experiment.
  5. Honey bee fokken.
    Opmerking: Hier, de experimentele locatie is de National Ilan University (NIU) bijenstal, Yi-Lan City, Taiwan; (GPS coördinaten: N24.747278, E121.746200).
    1. Controleer honingbij (Apis mellifera L.) kolonies wekelijks voedselkwantiteit en diervoeders met 1 liter 50% suikersiroop eventueel (honing opslaggebied leeg is). Definieer een gezondekolonie 9 beelden van honingbij kammen in elke kolonie een koningin eieren leggen normaal.
  6. Bereid 100 ml van de fundamentele larvale dieet (BLD). Ontbinding 6% D-glucose, fructose 6% en 1% gistextract in gesteriliseerd gedestilleerd gedeïoniseerd water (DDH 2 O) en aangevuld met 50% royal jelly. Bewaar bij 4 ° C, maar niet voor meer dan 3 dagen.
    Let op: Pre-warm tot 35 ° C voor het experiment en gebruik binnen 3 dagen.

2. In vivo voedingswijze

Notitie: In vivo voedingswijze aangepast is Hanley et al. 20

  1. Honingbij selectie en etikettering larven.
    1. Plaats een koningin excluder tot 9 frames van een gezonde kolonie te verdelen in 4 frames en 5 frames terwijl het beperken van de koningin om de 4 raamprofiel. Laat ten minste een leeg frame in het framedeel 4 voor het leggen van eieren.
    2. Na de koningin eieren leggen voor 1 dagControleer de frames voor het uiterlijk van de eieren en houden de eieren binnen de bijenkorven voor 72 uur (de 4e dag) tot 1 dag oude larven komen. Neem een ​​van de frames die 1 dag oud werksters (gearceerd binnen 24 h) uit de test korf met de hand en verwijder de honingbij werknemers uit het frame met een bee borstel.
    3. Bedek het frame met een transparante schuif (Size = lengte x breedte x dikte = 29,7 mm x 21 mm x 0,1 mm) en de plaat voor nagel aan de rand van frames met punaises (Figuur 1A).
    4. Voor elke behandeling, selecteert willekeurig 50 één dag oude larven (de 4e dag) en markeer elke broedcel met permanente stiften op de transparante schuif (Figuren 1A en 1B).
      Opmerking: Typ informatie van elke behandeling op het frame en de plaat voor en door permanente stiften de verwarring tussen verschillende behandelingen te vermijden. Verwijder de gemarkeerde dia's en bewaar ze voor de in vivo </ Em> voeding en observatie.
  2. In vivo voeden.
    1. Voeg verschillende concentraties van PPN-BLD (0,1, 1, 10 en 100 dpm) aan elke gemerkte broedcel door pipetteren op dag 1, 2 en 3 met 10 pl, 10 pl en 20 pl, respectievelijk volgens de inname hoeveelheid larven leeftijd. Voeg dezelfde hoeveelheid BLD (geen PPN) met een controlegroep. Waarbij de totale dosis van PPN-BLD in elk gemerkt broedcel accumuleert tot 4, 40, 400 en 4000 pg.
      OPMERKING: Herken de gelabelde broed door de gemarkeerde transparante dia's en verwijder de gemarkeerde transparante dia's na de voeding. Gebruik verse BLD voor het voederen van de reiniging van het broed te voorkomen door de werkbijen.
    2. Zet de PPN-behandelde frames naar de originele kolonies voor verdere observaties.
      OPMERKING: Elke behandeling heeft vier biologische herhalingen in vier kolonies.
  3. Observatie van de behandelde larven op dag 7.
    1. Om th observerene PPN-behandelde larven, de terugkeer van de gelabelde transparante dia's naar de frames om het sterftecijfer en het afdekken tarieven vast te leggen in de gelabelde broedcellen.
  4. Observatie van behandelde poppen en eclosion tarieven op dag 13.
    1. Verwijder de bijenwas van de afgetopte broedcellen.
    2. Zet de zachte getipt pincet in broedcel en klem de poppen zeer licht neem poppen voorzichtig naar buiten.
    3. Breng de poppen in 24-putjes weefselkweekplaten bij een dubbellaags laboratorium weefsels onder elk putje. Noteer de schade en sterfte tijdens pupal overdracht.
    4. Houd de 24-putjes weefselkweekplaten in een incubator bij 34 ° C en 70% relatieve vochtigheid tot opkomst (ongeveer 8 dagen).
    5. Observeren en de poppen en kwam honingbijen op te nemen.
  5. Statistieken
    1. Bereken de opgenomen data en aanwezig als gemiddelde ± SD
    2. Analyseer de gegevens met behulp van analyse van de variantie (ANOVA) van SAS en het minst significante verschil (LSD) test om de verschillen tussen twee gemiddelden van verschillende behandelingen te analyseren. Definieer statistisch significant als P-waarde <0,05. Verschillende letters in dezelfde kolom van de tabel vertoonde een significant effect op de statistische analyse.

3. De toxiciteit van PPN bij Colony niveau in Beehive

  1. Stel de honingbij groepen.
    1. Plaats een koningin uitsluitingsinrichting loodrecht op 9 beelden van een gezonde kolonie verdelen in frames 4 (deel A) en 5 beelden (deel B) terwijl het beperken van de koningin 4 framesectie. Laat ten minste een leeg frame in de 4-raamprofiel voor het leggen van eieren.
      Opmerking: Zet een andere koningin excluder de op de top van de koningin deel om te voorkomen dat de koningin beweegt tussen de onderdelen.
    2. Na de koningin eieren leggen voor 1 dag, controleer dan de kaders voor het verschijnen van eieren. Neem daarom de juiste frames waarin ei uit een deel A met de hand en verwijder de honingbij werknemersvan het frame met een bee borstel.
    3. Bedek het frame met plaat voor nagel en de plaat voor de rand van het frame met punaises.
    4. Willekeurig 100 broed waarin ei en markeer elke broedcel met permanente marker op de plaat voor. Wijs deze 100 broedcellen als Group 1. Schrijf de informatie van elke behandeling op het frame en transparante schuif met behulp van permanent marker aan de verwarring tussen de verschillende behandelingen te vermijden.
    5. Zet de gelabelde frame deel A voor 3 dagen en vervolgens over de koningin om een ​​deel B om eieren te leggen.
    6. Na 1 dag, controleer de frames van deel B, kies een geschikte frame en label 100 broed waarin ei zoals beschreven in stap 3.1.4. Wijs deze 100 broedcellen als groep 2.
    7. Zet de gelabelde frame deel B voor 3 dagen en vervolgens over de koningin, deel A, om eieren te leggen.
    8. Herhaal de koningin uitwisseling tussen deel A en deel B 6 keer en groepen numeriek toe te wijzen,(Figuur 2). Er moet in totaal 9 groepen.
  2. T reat honingbij kolonie PPN suikerstroop op dag 13 (Figuur 2).
    1. Voeg 1 liter 50% PPN suikersiroop met 10 of 100 ppm in een plastic bee voederdoos (B x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) en zet de doos op de frames in het experimentele kolonies.
      Let op: Groep 1 doet de PPN niet ontvangen in 13 dagen als de broed zijn verzegeld.
    2. Voer de controlegroep met 1 L 50% suikersiroop (geen PPN) zoals beschreven in stap 2.2.
  3. Aantal 1 dag oude larven en opnemen als het uitbroeden van 100 gelabelde broedcellen voor elke groep op dag 5 (Figuur 2). Honey bee eieren meestal 3 dagen om uit te komen in 0 dag larven; Daarom, controleer en label 100 eieren bevattende broed op dag 1 en tel het aantal 1 dag oude larven voor elke groep op dag 5 van het percentage uitkomen verkrijgen.
  4. Conteer de afgedekte broed en staat de larvale aftoppingspercentage 100 gemerkte broedcellen voor elke groep op dag 11 (Figuur 2). 6 tot 7 dagen oude larven broed zal worden afgesloten met bijenwas door honingbij werknemers voor larven pupating.
  5. Observeren poppen rijping en noteer verpopping van 100 gelabelde broedcellen voor elke groep op dag 17 (Figuur 2).
    1. Verwijder de bijenwas capped broed en neem poppen met zachte tip pincet voorzichtig. Breng de poppen in een 24-putjes weefselkweekplaten bij een dubbellaags laboratorium weefsels onder elk putje.
    2. Houd de 24-putjes weefselkweekplaten in een incubator bij 34 ° C en 70% RH tot opkomst.
    3. Observeren en de poppen te nemen en kwam honingbijen voor elke groep tot Groep 9 (49 experimentele dagen).
      Opmerking: Elke behandeling heeft vier biologische herhalingen.
  6. Statistieken
    1. Bereken de opgenomen data en de huidige als de gemiddelde± SD.
    2. Analyseer de grote verschillen tussen paren behandelingen (bijvoorbeeld 0 ppm / 10 ppm, 10 ppm / 100 ppm en 0 dpm / 100 ppm) in elke groep met behulp van de Student's tweezijdige t-test. Definiëren als statistisch significant als p-waarde <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Honey bee box SAN-YI Honey Factory W1266 Honeybees rearing
Queen excluder (between frames) SAN-YI Honey Factory I1575 Queen limitation 
Queen excluder (on top) SAN-YI Honey Factory I1566 Queen limitation on top 
Bee brush SAN-YI Honey Factory, Taiwan W1414 clean the bees on frame gently
Bee feeder SAN-YI Honey Factory, Taiwan P0219 feed sugar syrup to colony
Transparent slide Wan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40) 1139 Mark the larval area on the frames (Material: Polyethylene Terephthalate, PET) (Size = Length*Width*thick = 29.7 mm * 21 mm * 0.1 mm)
24 well tissu culture plate Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd TCP011024 Rearing pupae from extraction
Autoclave Tomin medical equipmenco., LTD. TM-321 Make sterilized distilled deionized water (ddH2O)
P20 pipetman Gilson F123600 Add PPN into bee larval food pool
Incubator  Yihder Co., Ltd. LE-550RD Rearing pupae from extraction
Kimwipes COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD KCS34155 Rearing pupae from extraction
Royal jelly National Ilan University (NIU) NIU Make basic larval diet (BLD)
D-(+)-Glucose Sigma G8270 Make basic larval diet (BLD)
D-(-)-Fructose Sigma F0127 Make basic larval diet (BLD)
Yeast extract CONDA, pronadisa 1702 Make basic larval diet (BLD)
Sucrose Taiwan sugar coporation E01071010 Make sugar syrup for bee food
Pyriproxyfen (11%) LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD. Registration No. 1937 Insect growth regulator (IGR) used in the experiment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ruffi nengo, S. R., et al. Integrated pest management to control Varroa destructor and its implications to Apis mellifera colonies. Zootecnia Trop. 32 (2), 149-168 (2014).
  2. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries, implications for honey bee health. PLoS One. 5, e9754 (2010).
  3. Lu, C. A., Chang, C. H., Tao, L., Chen, M. Distributions of neonicotinoid insecticides in the Commonwealth of Massachusetts, a temporal and spatial variation analysis for pollen and honey samples. Environ. Chem. 13, 4-11 (2016).
  4. Tsai, W. T. Analysis of coupling the pesticide use reduction with environmental policy for agricultural sustainability in Taiwan. Environ. & Pollut. 2, 59-65 (2013).
  5. Weng, Z. H. Pesticide market status and development trend (in Chinese). PRIDE. , https://pride.stpi.narl.org.tw/ (2016).
  6. Kevan, P. G. Pollinators as bioindicators of the state of the environment, species, activity and diversity. Agric. Ecosys. Environ. 74 (1-3), 373-393 (1999).
  7. Kevan, P. G. Forest application of the insecticide fenitrothion and its effect on wild bee pollinators (Hymenoptera: Apoidea) of lowbush blueberries (Vaccinium SPP.) in Southern New Brunswick, Canada. Biol. Conserv. 7, 301-309 (1975).
  8. Crane, E., Walker, P. The impact of pest management on bees and pollination. , IBRA. Cardiff, UK. (1983).
  9. Haouar, M., Decormis, L., Rey, J. Fluvalinate applied to flowering apple trees-contamination of honey-gathering bees and hive products. Agronomie. 10 (2), 133-137 (1990).
  10. Chauzat, M. P., et al. A survey of pesticide residues in pollen loads collected by honey bees in France. J. Econ. Entomol. 99 (2), 253-262 (2006).
  11. Bonzini, S., Tremolada, P., Bernardinelli, I., Colombo, M., Vighi, M. Predicting pesticide fate in the hive (part 1), experimentally determined τ-fluvalinate residues in bees, honey and wax. Apidologie. 42 (3), 378 (2011).
  12. Sanchez-Bayo, F., Goka, K. Pesticide residues and bees-a risk assessment. PLoS One. 9 (4), e94482 (2014).
  13. Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. Pesticides and honey bee toxicity-USA. Apidologie. 41, 312-331 (2010).
  14. Yang, E. C., Chang, H. C., Wu, W. Y., Chen, Y. W. Impaired olfactory associative behavior of honeybee workers due to contamination of imidacloprid in the larval stage. PLoS One. 7, e49472 (2012).
  15. Urlacher, E., et al. Measurements of chlorpyrifos levels in forager bees and comparison with levels that disrupt honey bee odor-mediated learning under laboratory conditions. J. Chem. Ecol. 42 (2), 127-138 (2016).
  16. Chen, Y. W., Wu, P. S., Yang, E. C., Nai, Y. S., Huang, Z. Y. The impact of pyriproxyfen on the development of honey bee (Apis mellifera L.) colony in field. J. Asia Pac. Entomol. 19 (3), 589-594 (2016).
  17. Dennehy, T. J., DrGain, B. A., Harpold, V. S., Brink, S. A., Nichols, R. L. Whitefly Resistance to Insecticides in Arizona: 2002 and 2003 Results. , San Antonio, TX, USA. http://ag.arizona.edu/crop/cotton/insects/wf/whiteflyresistance0204.pdf 1926-1938 (2004).
  18. Yang, E. C., Wu, P. S., Chang, H. C., Chen, Y. W. Effect of sub-lethal dosages of insecticides on honey bee behavior and physiology. Proceedings of international seminar on enhancement of functional biodiversity relevant to sustainable food production, ASPAC, Tsukuba, Japan, , http://www.niaes.affrc.go.jp/sinfo/sympo/h22/1109/paper_06.pdf (2010).
  19. Fourrier, J., et al. Larval exposure to the juvenile hormone analog pyriproxyfen disrupts acceptance of and social behavior performance in adult honey bees. PLoS One. 10, e0132985 (2015).
  20. Hanley, A. V., Huang, Z. Y., Pett, W. L. Effects of dietary transgenic Bt corn pollen on larvae of Apis mellifera and Galleria mellonella. J. Apicult.Res. 42 (4), 77-81 (2003).
  21. Kaftanoglu, O., Linksvayer, T. A., Page, R. E. Rearing honey bees, apis mellifera, in vitro 1, effects of sugar concentrations on survival and development. J. Insect Sci. 11 (96), 1-10 (2011).
  22. Vandenberg, J. D., Shimanuki, H. Technique for rearing worker honey bees in the laboratory. J. Apicult. Res. 26 (2), 90-97 (1987).
  23. Peng, Y. S. C., Mussen, E., Fong, A., Montague, M. A., Tyler, T. Effects of chlortetracycline on honey bee worker larvae reared in vitro. J. Invertebr.Pathol. 60 (2), 127-133 (1992).
  24. Bitondi, M. M., Mora, I. M., Simoes, Z. L., Figueiredo, V. L. The Apis mellifera pupal melanization program is affected by treatment with a juvenile hormone analogue. J. Insect Physiol. 44 (5-6), 499-507 (1998).
  25. Zufelato, M. S., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L., Hartfelder, K. The juvenile hormone analog pyriproxyfen affects ecdysteroid-dependent cuticle melanization and shifts the pupal ecdysteroid peak in the honey bee (Apis mellifera). Arthropod Struct. Dev. 29 (2), 111-119 (2000).
  26. Santos, A. E., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L. Hormone-dependent protein patterns in integument and cuticular pigmentation in Apis mellifera during pharate adult development. J. Insect Physiol. 47 (11), 1275-1282 (2001).
  27. Brouwers, E. V. M. Glucose/Fructose ratio in the food of honeybee larvae during caste differentiation. J. Apicult.Res. 23 (2), 94-101 (1984).
  28. Howe, S. R., Dimick, P. S., Benton, A. W. Composition of freshly harvested and commercial royal jelly. J. Apicult. Res. 24 (1), 52-61 (1985).
Het evalueren van het effect van Environmental Chemicals over Honey Bee ontwikkeling van het individu naar Colony Level
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ko, C. Y., Chen, Y. W., Nai, Y. S.… More

Ko, C. Y., Chen, Y. W., Nai, Y. S. Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level. J. Vis. Exp. (122), e55296, doi:10.3791/55296 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter