Summary
Nous présentons ici un procédé pour alimenter des aliments contaminés par les pesticides à la fois une abeille individuelle et une colonie ruche. La procédure évalue l'effet des pesticides sur les abeilles individuelles par l' alimentation in vivo de l' alimentation des larves de base et sur la condition naturelle de la colonie de ruche.
Introduction
La présence de pesticides dans l'environnement est l' un des problèmes les plus graves qui influe sur la vie d'une abeille 1, 2, 3. Plusieurs études ont démontré la présence commune des résidus de pesticides dans les colonies d'abeilles et les produits apicoles. A Taiwan, l'application moyenne des pesticides était 11-12 kg / ha chaque année (de 2005 à 2013). La quantité de pesticides utilisés à Taiwan est supérieure à celle des pays de l' UE, et les pays d' Amérique latine 4, 5. En d'autres termes, l'environnement apicole souffre de stress grave des pesticides, en particulier à Taiwan et peut-être dans d'autres pays.
L'abeille Apis mellifera est l' un des principaux insectes pollinisateurs dans les systèmes agricoles 6 et elle produit également des produits de valeur tels que le miel. Cependant, les abeilles sont Exposed à divers pesticides et ces pesticides peut être ramené à la recherche de nourriture après ruchers sur les fleurs qui ont été traitées avec des pesticides lors de la collecte nectar et de pollen 7, 8. Ils peuvent également être exposés aux pesticides par les apiculteurs eux - mêmes visant à contrôler les problèmes de ravageurs à l' intérieur des ruches 9, 10, 11. Parce que les larves d'abeilles sont alimentés par les abeilles nourrices pour leur développement, les larves, les drones et même la reine peut être exposé à ces nectars contaminées par les pesticides et le pollen 12. La toxicité des différents pesticides pour les abeilles doit être adressée 13.
De nombreux efforts ont été faits pour évaluer les problèmes de résidus de pesticides sur l'environnement. Yang et al. testé l'influence de l'insecticide imidaclopride neurotoxiques sur le développement des larves d'abeilles dans leruche et a rapporté qu'une dose sublétale de imidaclopride a donné lieu à un comportement associatif olfactif des abeilles adultes 14. En outre, Urlacher et al. a examiné les effets sublétaux d'un pesticide organophosphoré, chlorpyrifos, sur la performance de l' apprentissage d'un travailleur d'abeille de miel dans des conditions de laboratoire 15. Dans notre étude précédente, nous avons évalué l'impact d'un régulateur de croissance des insectes (IGR), pyriproxyfène (PPN), sur les abeilles larves 16.
Dans cet article, nous présentons les méthodes d'évaluation des impacts chimiques sur le développement des abeilles. méthodes d'alimentation des abeilles au miel ont été décrits et appliqués soit à abeilles domestiques individuels ou à une colonie. Dans un premier temps , nous avons testé différentes concentrations de l' alimentation des larves de base contaminées par des pesticides (BLD) sur les larves dans les colonies pour évaluer l'impact des pesticides sur les abeilles individuelles in vivo. Nous avons ensuite simuler le Condit natureldes ions du pesticide à l'aide de sirop contaminées par des pesticides à l'intérieur des ruches. Dans cette méthode, PPN, qui est largement utilisé contre les insectes nuisibles 17 et est nocif pour le développement des larves d'abeilles et pupes 16, 18, 19, sera un indicateur pour représenter l'effet négatif du pesticide sur le terrain.
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Protocol
1. Préparation
- Faire 1 L de 50% de sirop de sucre. Dissoudre 1 kg de saccharose dans 1 L ddH 2 O.
- Préparer la solution pyriproxyfène (PPN) dans BLD. Faire 1,1 L de 10 000 ppm solution PPN de stock et une solution diluée à 100 ml PPN dans 1 litre stérilisé ddH 2 O. Conserver à 4 ° C.
- Diluer la solution mère PPN à des concentrations finales de 0,1, 1, 10 et 100 mg / kg (ppm) dans le BLD pour l'expérience suivante.
- Faire PPN-sirop (pour le niveau de la colonie). Diluer le stock PPN à des concentrations finales de 10 et 100 ppm à 50% de sirop de sucre pour l'expérience suivante.
- Miel élevage des abeilles.
Note: Ici, l'emplacement expérimental est le rucher Université nationale Ilan (NIU), Ville Yi-Lan, Taiwan; (Coordonnées GPS: N24.747278, E121.746200).- Vérifiez abeille (Apis mellifera L.) colonies par semaine pour la quantité de nourriture et d' alimentation avec 1 litre 50% de sirop de sucre si nécessaire (la zone de stockage de miel est vide). Définir un environnement saincolonie 9 cadres de peignes d'abeilles dans chaque colonie avec une reine pondre des œufs normalement.
- Préparer 100 ml de l'alimentation des larves de base (BLD). Dissoudre 6% de D-glucose, 6% de fructose et 1% d' extrait de levure dans de l' eau désionisée distillée stérilisée (ddH 2 O) et de compléter avec 50% de la gelée royale. Conserver à 4 ° C mais pas pendant plus de 3 jours.
Note: Pré-chaud à 35 ° C avant l'expérience et l'utilisation dans les 3 jours.
2. méthode in vivo alimentation
Remarque: In vivo mode d'alimentation a été modifié depuis Hanley et al. 20
- Abeille de sélection de larves et d' étiquetage.
- Insérez un à reine pour diviser 9 cadres d'une colonie saine en 4 cadres et 5 cadres tout en limitant la reine à la section 4 du cadre. Laisser au moins une trame vide dans la section 4 de trame pour pondre des œufs.
- Après la reine pondre des œufs pour 1 jour, Vérifiez les cadres de l'apparition d'œufs et de garder les œufs à l' intérieur des ruches d' abeilles pendant 72 h (le 4 e jour) jusqu'au 1 jour ancienne éclosion des larves. Prenez l'un des cadres contenant vieux 1 jour larves d'ouvrières (éclos dans les 24 h) hors de la ruche d'essai à la main et enlever les travailleurs d'abeilles du cadre avec une brosse d'abeille.
- Couvrir le cadre avec une lame transparente (taille = longueur x largeur x épaisseur = 29,7 mm x 21 mm x 0,1 mm) et clouer la lame transparente sur le bord de trames avec des punaises (figure 1A).
- Pour chaque traitement, sélectionner de manière aléatoire 50 un jour, des larves âgées (4 ème jour) et marquer chaque cellule de couvain en utilisant des marqueurs permanents sur la lame transparente (figures 1A et 1B).
Note: Écrivez les informations de chaque traitement sur le cadre et lame transparente et en utilisant des marqueurs permanents pour éviter la confusion entre les différents traitements. Retirez les diapositives marquées et garder pour in vivo </ Em> l'alimentation et de l'observation.
- Dans l' alimentation vivo.
- Ajouter différentes concentrations de PPN-BLD (0,1, 1, 10 et 100 ppm) à chaque cellule de couvain marqué par pipetage au jour 1, 2 et 3 avec 10 pi, 10 pi et 20 pi, respectivement, en fonction de la quantité d'admission du âge larves. Ajouter la même quantité de BLD (pas PPN) à un groupe témoin. De ce fait, la dose totale de PPN-BLD dans chaque cellule de couvain marqué accumule à 4, 40, 400 et 4000 pg.
REMARQUE: reconnaître les cellules de couvain marquées par les lames transparentes marquées et retirer les lames transparentes marquées après le repas. Utilisation fraîche BLD d'alimentation pour empêcher le nettoyage des cellules de couvain par les abeilles ouvrières. - Remettre les cadres traités PPN aux colonies d'origine pour d'autres observations.
REMARQUE: Chaque traitement a quatre répétitions biologiques dans quatre colonies.
- Ajouter différentes concentrations de PPN-BLD (0,1, 1, 10 et 100 ppm) à chaque cellule de couvain marqué par pipetage au jour 1, 2 et 3 avec 10 pi, 10 pi et 20 pi, respectivement, en fonction de la quantité d'admission du âge larves. Ajouter la même quantité de BLD (pas PPN) à un groupe témoin. De ce fait, la dose totale de PPN-BLD dans chaque cellule de couvain marqué accumule à 4, 40, 400 et 4000 pg.
- Observation des larves traitées au jour 7.
- Pour observer ee larves PPN-traitées, retourner les diapositives transparentes marquées aux cadres pour enregistrer la mortalité et les taux de capsulage dans les cellules de couvain marquées.
- Observation des taux de pupes et Eclosion traités au jour 13.
- Retirer la cire d'abeille de couvain operculé.
- Mettez la pince à épiler douce déversée dans les cellules couvain et serrer les chrysalides très légèrement puis prendre pupes doucement.
- Transférer les pupes dans des plaques de culture tissulaire à 24 puits avec une double couche de tissus de laboratoire sous chaque puits. Notez les dommages et la mortalité pendant le transfert chrysalide.
- Maintenir l'humidité relative dans un incubateur à 34 ° C des plaques de culture tissulaire à 24 puits et de 70% jusqu'à l' émergence (environ 8 jours).
- Observer et enregistrer les chrysalides et les abeilles ont émergé.
- Statistiques
- Calculer les données enregistrées et présente en moyenne ± écart-type
- Analyser les données en utilisant une analyse de variance (Anova) par SAS et utiliser le moins significatif essai différence (LSD) pour analyser les différences entre les deux modes de traitements différents. Définir statistiquement significative comme valeur p <0,05. Des lettres différentes dans la même colonne du tableau montre un effet significatif par l'analyse statistique.
3. Toxicité des PPN à la Colonie Niveau en Ruche
- Mettre en place les groupes d'abeilles.
- Insérer une grille à reine verticalement pour diviser 9 trames d'une colonie saine en 4 trames (partie A) et de 5 images (partie B) tout en limitant la reine de la section 4 du cadre. Laisser au moins une trame vide dans la section 4-trame pour pondre des œufs.
Remarque: En d'autres à reine le au-dessus de la partie reine pour empêcher la reine de se déplacer entre les parties. - Après la reine pondre des œufs pour 1 jour, vérifiez les cadres de l'apparition des œufs. Prenez les cadres appropriés contenant des oeufs à partir de la partie A à la main et enlever les travailleurs d'abeillesà partir de la trame avec une brosse d'abeille.
- Couvrir le cadre avec lame transparente et clouer la lame transparente sur le bord du cadre avec des punaises.
- sélectionner de façon aléatoire 100 cellules de couvain contenant des oeufs et marquer chaque cellule de couvain en utilisant un marqueur permanent sur la lame transparente. Affecter ces 100 cellules de couvain comme groupe 1. écrire les informations de chaque traitement sur le châssis et lame transparente en utilisant un marqueur permanent pour éviter la confusion entre les différents traitements.
- Remettez le cadre marqué à la partie A pendant 3 jours, puis transférer la reine à la partie B pour pondre leurs œufs.
- Après 1 jour, vérifiez les cadres de la partie B, choisir un cadre approprié et l'étiquette 100 cellules de couvain contenant des oeufs comme décrit à l'étape 3.1.4. Affecter ces 100 cellules de couvain Groupe 2.
- Remettez le cadre marqué à la partie B pendant 3 jours, puis transférer la reine à la partie A à pondre des œufs.
- Répétez la reine échange entre la partie A et partie B 6 fois plus et assigner numériquement les groupes,respectivement (Figure 2). Il devrait y avoir au total 9 groupes.
- Insérer une grille à reine verticalement pour diviser 9 trames d'une colonie saine en 4 trames (partie A) et de 5 images (partie B) tout en limitant la reine de la section 4 du cadre. Laisser au moins une trame vide dans la section 4-trame pour pondre des œufs.
- T rande colonie d'abeilles avec du sirop de sucre PPN au jour 13 (Figure 2).
- Ajouter 1 L 50% de sirop de sucre PPN contenant 10 ou 100 ppm dans une boîte d'alimentation d'abeille en matière plastique (W x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) et de mettre la boîte au-dessus des cadres dans les colonies expérimentales.
Nota: Le groupe 1 ne reçoit pas le PPN à 13 jours que les cellules de couvain ont été scellées. - Alimenter le groupe de contrôle avec 1 L 50% de sirop de sucre (pas d'PPN) tel que décrit à l'étape 2.2.
- Ajouter 1 L 50% de sirop de sucre PPN contenant 10 ou 100 ppm dans une boîte d'alimentation d'abeille en matière plastique (W x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) et de mettre la boîte au-dessus des cadres dans les colonies expérimentales.
- Compter une larve d'un jour et enregistrer le taux d' éclosion des oeufs de 100 cellules de couvain marqués pour chaque groupe au jour 5 (Figure 2). œufs d'abeilles miel prennent habituellement 3 jours pour éclore en larves de 0 jour; Par conséquent, vérifier et étiqueter 100 œufs contenant des cellules de couvain au jour 1 et compter le nombre de larves âgées de jour 1 pour chaque groupe au jour 5 pour obtenir le pourcentage de taux d'éclosion.
- Contant les cellules operculées et enregistrer que le taux de recouvrement de 100 larves de cellules de couvain marqués pour chaque groupe au jour 11 (Figure 2). 6 à 7 jours vieux couvain larves seront coiffées avec de la cire d'abeille par les travailleurs d'abeilles pour nymphose des larves.
- Observer la maturation des nymphes et enregistrer le taux d'éclosion de 100 cellules de couvain marqués pour chaque groupe au jour 17 (Figure 2).
- Retirer la cire d'abeille de couvain operculé et prendre chrysalides avec une pince à épiler pointe douce doucement. Transférer les pupes dans une des plaques de culture tissulaire à 24 puits avec une double couche de tissus de laboratoire sous chaque puits.
- Garder les plaques de culture tissulaire à 24 puits dans un incubateur à 34 ° C et 70% d'humidité relative jusqu'à l'émergence.
- Observer et enregistrer les chrysalides et a émergé abeilles pour chaque groupe jusqu'à ce que le groupe 9 (49 jours expérimentaux).
Remarque: Chaque traitement a quatre répétitions biologiques.
- Statistiques
- Calculer les données enregistrées et présent sous forme de la moyenne± SD.
- Analyser les différences significatives entre les paires de traitements (par exemple , 0 ppm / 10 ppm, 10 ppm / 100 ppm et de 0 ppm / 100 ppm) dans chaque groupe à l'aide de deux t bilatéral de -test de l'élève. Définir comme statistiquement significative si P -value <0,05.
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Representative Results
Pour l'essai sur le terrain de l'abeille, une reine était limitée à la section 4 cadre pour la ponte des œufs. Cette étape pourrait augmenter la densité de géniteurs dans un cadre et faciliter les observations suivantes. Chaque traitement a été marqué, et le développement des abeilles a été clairement observée à travers une lame transparente. Dans l' alimentation in vivo de PPN-BLD aux larves d'abeilles dans la ruche a été réalisée pour évaluer avec précision l'influence des PPN sur le développement des abeilles dans la colonie. Utilisation de la méthode d'alimentation in vivo a facilité l'observation des effets des traitements chimiques sur la ruche.
Pour chaque dose de PPN-BLD, un total de cinquante cellules de couvain ont été marquées et traitées. Après avoir ajouté PPN-BLD, les cadres traités ont été retournés aux colonies d'origine pour l'observation dans des conditions naturelles. Les effets négatifs de la PPN-BLD sur les abeilles stade larvaire ont été facilement observed. Un effet dépendant de la dose a été observée. Le tableau 1 présente le nombre d'abeilles domestiques qui sont morts au stade larvaire aux deux doses les plus élevées de 10 et 100 ppm. Comme le montre le tableau 1, aux deux doses (0,1 et 1 ppm), les taux de coiffage, des jours à des taux d'émergence et Eclosion ne sont pas significativement différentes de 0 (alimentation BLD ajoutée) ou de la commande à jeun, avec seulement un pourcentage significativement plus élevé de abeilles avec des ailes déformées à 1 ppm. Mélanisation de pupes a été observée à de faibles concentrations de PPN. De plus, la proportion d'abeilles adultes est apparu avec des ailes déformées ont augmenté avec des doses plus élevées de PPN (tableau 1).
Pour simuler des colonies d'abeilles souffrent de résidus PPN environnement, alimentation de sirop PPN à toute la colonie d'abeilles de miel a été réalisée. Avant le traitement, chaque colonie a été divisée en 9 différents groupes temporels à 3 jours d' intervalle par deux à reine (Fifigure 2). Par conséquent, les effets de PPN sur les taux d'éclosion, le plafonnement et eclosion ont été observées simultanément dans des conditions similaires à celles de l'environnement naturel.
Les colonies ont été nourris avec du sirop 10 ou 100 ppm PPN au jour 13 (indiqué par le pointillé sur la figure 2 rouge). Théoriquement, le groupe 1 était un témoin sans PPN parce que le PPN-sirop a été introduit à jour 13 et les abeilles domestiques du groupe 1 étaient dans le stade nymphal et coiffé; les abeilles au stade larvaire ont commencé à être affectés dans les groupes 2 et 3, et les œufs seront affectés dans les groupes 4-9 en raison du temps d'exposition plus longue dans les ruchers contaminés PPN (Figure 2).
Dans cet essai, nous avons nourri des colonies d'abeilles avec du sirop PPN et le développement observé lorsque les abeilles adultes ont consommé le sirop et probablement nourris la reine et les larves. Cette hypothèse a été confirmée par le HATChing, bouchage et les taux d'Eclosion, et les abeilles ailes déformées ont été observés après les traitements PPN, comme représenté sur les figures 3A - 3D. Tous les paramètres diffèrent de manière significative à la dose plus élevée (100 ppm) en commençant par le groupe 3, à l' exception du taux d' éclosion (Figure 3A - 3D). De plus, après les traitements PPN-sirop, beaucoup chrysalides est mort avec cuticules noir ou en n'émerger. Dans le traitement PPN à 100 ppm, les cellules ont été détruites coiffés, et ont été éliminés les pupes blessés à partir de la colonie (Figure 3E).
Figure 1: Schéma de marquage couvain-cellules. (A) 1 jour larves âgées de travailleurs couverts par des papiers transparents et de diapositives ont été marquées par un marqueur permanent. (B) 1 jour Labellisé vieux couvain larves ouvrières; la flèche blanche indique un 1 larve de travailleur de jour à l'intérieur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Chronologie lorsque PPN est démarré par rapport aux 9 groupes expérimentaux. Différentes concentrations de PPN ont été alimentées au jour 13 (ligne en pointillé rouge). La colonie traitée a été divisé en une partie A et une partie B. Les échanges doubles de la partie A à la partie B et vice versa pour les œufs de pose sont représentés. Cela a été reproduit avec l' autorisation de Elsevier 16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 3: Développement des larves d'abeille de miel avant et après le repas 1 kg de sirop PPN dans les colonies d'abeilles testées. Au total, neuf groupes ont été interrogés dans cette expérience: (A) taux d' éclosion; (B) Taux de recouvrement; (C) Taux éclosion; et (D) Taux d'aile incorrect. Moyenne ± écart type sont présentés; Les flèches rouges indiquent le temps pendant lequel PPN peut commencer à agir sur les abeilles. astérisques noirs montrent une signification statistique par rapport au contrôle (0 ppm). astérisques rouges indiquent une signification statistique entre 10 et 100 ppm; (E) 100 ppm sirop PPN colonie d'abeilles traité a montré des cellules non coiffés, les pupes et les pupes noir et déformé probablement déformé. Cela a été reproduit avec l' autorisation de Elsevier 16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| PPN-BLD (ppm) | Non. Les larves | Le développement larvaire | ||
| Taux capé (en%) | taux de Eclosion (en%) | malformées ailes (en%) | ||
| 100 | 140 | 0b | 0b | - |
| dix | 139 | 22,2 ± 33.2b | 0b | - |
| 1 | 140 | 72,3 ± 17.9a | 67,7 ± 17.6a | 7,7 ± 5.7a |
| 0,1 | 136 | 78,3 ± 17.5a | 75,4 ± 22.8a | 1,4 ± 2.8b |
| 0 | 138 | 78,9 ± 5.4a | 78,9 ± 5.4a | 0b |
| Non-alimentation | 122 | 87,8 ± 9.1a | 86,1 ± 7.2a | 0,8 ± 1.5b |
Tableau 1: Effets de la poursuite 3 jours d' alimentation de PPN sur les larves d'un jour 1. Pour chaque cellule larvaire, 10, 10 et 20 pi de BLD ont été ajoutés de 1 à 3 jours, respectivement. Chaque essai contenait 25-38 larves dans une colonie et 4 colonies ont été testées. sont présentés moyenne ± écart type. Des lettres différentes dans la même colonne sont significativement différentes par le moindre test de différence quadratique (P <0,05) après l'analyse de variance a montré un effet significatif. Cela a été reproduit avec l' autorisation de Elsevier 16.
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Discussion
La méthode de ponte reine limitée et la méthode queen-échange sont des étapes essentielles pour la mise en place des groupes d'abeilles de miel pour les essais sur le terrain dans ce protocole. La méthode de ponte reine limitée permet la synchronisation du cycle de vie des abeilles. Par conséquent, les chercheurs peuvent choisir 1 jour larves âgées du même âge pour le traitement avec différentes doses de pesticides. Pour la méthode queen-échange, la reine a été échangée entre la partie A (4 cadres) et B (5 trames) pour obtenir différents stades de développement d'abeilles pour les essais sur le terrain pour évaluer les effets des résidus de pesticides et de pesticides. En outre, un grand nombre de cellules de couvain sélectionnées ont été enregistrées dans l'essai sur le terrain en utilisant des diapositives transparentes pour l'étiquetage. Cependant, l'œuf sur la pose entraîne parfois couvain insuffisantes pour la reine pondre des œufs. Par conséquent, la préparation des cadres vides est nécessaire pour la méthode reine-échange. Sinon, la méthode de ponte reine limitée pourrait également être utilisé pourpréparer les différents groupes d'abeilles pour tester dans la ruche. La séparation des trames en 2 trames dans la partie A et de 7 trames dans la partie B et le placement de la reine de la partie A (2 trames) peuvent limiter les œufs pondus par la reine dans les 2 trames.
Pour la méthode d'alimentation in vivo, PPN-BLD a été ajouté à chaque cellule de couvain. Les abeilles domestiques exposées acceptation plus élevé de BLD que le sirop 16, 20. Les larves d'abeille peut survivre et se développer sur un régime artificiel composé de la gelée royale, les sucres, extrait de levure et de l' eau distillée 22, 23. La composition de glucose et de fructose du BLD n'a pas d' incidence sur les taux de survie des larves in vitro 21, et par conséquent, BLD serait plus stable pour la croissance des abeilles dans la ruche. En particulier, l'utilisation de BLD frais pour l'alimentation pourrait également empêcher l'exclusion des larves des abeilles ouvrières pendantl'expérience d'alimentation des larves. De plus, au cours du processus d'alimentation, l'alimentation douce est d'abord nécessaire pour éviter la mort de 1 jour larves âgées.
Lors des essais sur le terrain, BLD chimiquement contaminés dans l'exclusion des larves parfois due ruche à la haute sensibilité olfactive des abeilles de soins infirmiers. La composition de sucre affecte de manière significative la survie des larves moyenne, le poids des larves pré-pupe, le poids des adultes, et les numéros 21 ovariole. Lorsque le sirop a été utilisé pour fournir le pollen transgénique ou un diazinon pesticide témoin positif pour les larves d'abeilles, les ouvriers ont enlevé quelques larves des cellules de couvain contenant des aliments ajoutés ou contaminés 21. Ainsi, la composition de sucre doit être notée. L'augmentation du nombre de 1 rassis larves ou la dispersion des sites cellulaires de couvain individuels testés peuvent également améliorer les problèmes. En effet, sur la base de l'observation des procédés de traitement PPN-BLD et les effets dramatiques dose-dépendantePPN-BLD sur le développement des abeilles, nous avons supposé que les infirmières ne retiraient pas la BLD artificiellement ajoutée aux cellules de couvain. De faibles concentrations de PPN causes mélanisation de chrysalides, probablement en raison d'une activité accrue de phenoloxidase, qui régule mélanisation et nymphose 24, 25, 26. Sur la base de l'utilisation d'une méthode d'alimentation artificielle pour chaque cellule de couvain, les effets dramatiques de PPN-BLD sur le développement des abeilles pourrait être due à un contact direct avec PPN dès le premier jour de l'éclosion.
Les dosages chimiques utilisés dans les expériences d'alimentation pourraient être conçus à partir des données de l'enquête pour les résidus de pesticides dans des échantillons de pollen frais prélevés dans des ruches d'abeilles. Il existe une variété de voies de contamination par les pesticides des colonies dans le milieu naturel. Les contaminants chimiques pourraient être ramenés aux colonies d'abeilles et ingérés par les larves en raison de l'alimentation de contrôle techniqueion des abeilles mellifères des travailleurs, influençant éventuellement le développement des larves. Pour évaluer l'impact des PPN au niveau de la colonie dans la ruche, le sirop a été utilisé à la place de pollen pour l'alimentation dans cette étude comme la plus rapide et la plus directe pour faire en sorte que les abeilles ont consommé le produit chimique. En outre, la condition du sirop peut être défini, alors que le contenu du pollen est difficile à contrôler (par exemple, les agents pathogènes ou la contamination par les pesticides).
Dans des conditions sur le terrain, différents stades de développement (œufs, larves, pupes et les abeilles adultes) des abeilles dans une colonie d'abeilles subissent le même facteur d'environnement. Dans notre configuration expérimentale, les conditions naturelles ont été simulées pour évaluer les impacts des produits chimiques sur les stades de développement des abeilles dans un environnement dynamique. Par conséquent, après le traitement PPN (13 jours), on a pu observer le taux de recouvrement sans influence dans le groupe 1, le taux de recouvrement influencé dans les huit autres groupes, et le stade larvaire influencés dans les groupes 2 et 3, etc. Dans ces conditions, les véritables effets au sein de la colonie et la route de la dispersion du produit chimique à la colonie sont claires.
Les colonies d'abeilles traitées avec du sirop PPN présentaient une distorsion des cellules coiffées et le retrait des pupes de la colonie. En outre, une vaste mélanisation de pupes a été observée dans le traitement PPN 100 ppm. Ainsi, la méthode d'alimentation PPN sirop a permis l'impact dynamique des produits chimiques sur le cycle de vie des abeilles dans la ruche à respecter. Dans ce procès, le sirop repris par les travailleurs et les abeilles soins infirmiers a été sans doute nourri à la reine et les larves. Pour confirmation, nos études futures utiliseront des marqueurs chimiques (comme un colorant alimentaire) dans le sirop contenant chimique pour faciliter davantage l'étude de la dynamique des ruchers chimiquement contaminés.
La source alimentaire des abeilles nourricières devrait provenir de butineuses ou dans la ruche et les larves sont nourris et mandibulaires hypopharyngsécrétions des glandes EAL produites par les infirmières abeilles 21, 25, 26, 27, 28. Lorsque les larves sont alimentées par des nourrices, des sécrétions produites par la glande hypopharynx dans les mandibules peuvent diluer le PPN-sirop. Cet effet de dilution biologique ressemble plus étroitement les conditions naturelles , mais explique les résultats différents à la méthode d'alimentation in vivo. Plusieurs matériaux, y compris d'autres pesticides, métaux lourds et les agents pathogènes d'abeilles pourraient être appliquées à cette méthode d'alimentation pour évaluer et traiter les rôles dans les populations d'abeilles.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par Grant 105AS-13.2.3-BQ-B1 du Bureau de santé animale et végétale inspection et de quarantaine, le Conseil de l'agriculture, Yuan exécutif et Grant 103-2313-B-197-002-MY3 du ministère de la science et de la technologie (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Honey bee box | SAN-YI Honey Factory | W1266 | Honeybees rearing |
| Queen excluder (between frames) | SAN-YI Honey Factory | I1575 | Queen limitation |
| Queen excluder (on top) | SAN-YI Honey Factory | I1566 | Queen limitation on top |
| Bee brush | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | W1414 | clean the bees on frame gently |
| Bee feeder | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | P0219 | feed sugar syrup to colony |
| Transparent slide | Wan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40) | 1139 | Mark the larval area on the frames (Material: Polyethylene Terephthalate, PET) (Size = Length*Width*thick = 29.7 mm * 21 mm * 0.1 mm) |
| 24 well tissu culture plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | TCP011024 | Rearing pupae from extraction |
| Autoclave | Tomin medical equipmenco., LTD. | TM-321 | Make sterilized distilled deionized water (ddH2O) |
| P20 pipetman | Gilson | F123600 | Add PPN into bee larval food pool |
| Incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-550RD | Rearing pupae from extraction |
| Kimwipes | COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD | KCS34155 | Rearing pupae from extraction |
| Royal jelly | National Ilan University (NIU) | NIU | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(-)-Fructose | Sigma | F0127 | Make basic larval diet (BLD) |
| Yeast extract | CONDA, pronadisa | 1702 | Make basic larval diet (BLD) |
| Sucrose | Taiwan sugar coporation | E01071010 | Make sugar syrup for bee food |
| Pyriproxyfen (11%) | LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD. | Registration No. 1937 | Insect growth regulator (IGR) used in the experiment |
References
- Ruffi nengo, S. R., et al. Integrated pest management to control Varroa destructor and its implications to Apis mellifera colonies. Zootecnia Trop. 32 (2), 149-168 (2014).
- Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries, implications for honey bee health. PLoS One. 5, e9754 (2010).
- Lu, C. A., Chang, C. H., Tao, L., Chen, M. Distributions of neonicotinoid insecticides in the Commonwealth of Massachusetts, a temporal and spatial variation analysis for pollen and honey samples. Environ. Chem. 13, 4-11 (2016).
- Tsai, W. T. Analysis of coupling the pesticide use reduction with environmental policy for agricultural sustainability in Taiwan. Environ. & Pollut. 2, 59-65 (2013).
- Weng, Z. H. Pesticide market status and development trend (in Chinese). PRIDE. , https://pride.stpi.narl.org.tw/ (2016).
- Kevan, P. G. Pollinators as bioindicators of the state of the environment, species, activity and diversity. Agric. Ecosys. Environ. 74 (1-3), 373-393 (1999).
- Kevan, P. G. Forest application of the insecticide fenitrothion and its effect on wild bee pollinators (Hymenoptera: Apoidea) of lowbush blueberries (Vaccinium SPP.) in Southern New Brunswick, Canada. Biol. Conserv. 7, 301-309 (1975).
- Crane, E., Walker, P. The impact of pest management on bees and pollination. , IBRA. Cardiff, UK. (1983).
- Haouar, M., Decormis, L., Rey, J. Fluvalinate applied to flowering apple trees-contamination of honey-gathering bees and hive products. Agronomie. 10 (2), 133-137 (1990).
- Chauzat, M. P., et al. A survey of pesticide residues in pollen loads collected by honey bees in France. J. Econ. Entomol. 99 (2), 253-262 (2006).
- Bonzini, S., Tremolada, P., Bernardinelli, I., Colombo, M., Vighi, M. Predicting pesticide fate in the hive (part 1), experimentally determined τ-fluvalinate residues in bees, honey and wax. Apidologie. 42 (3), 378 (2011).
- Sanchez-Bayo, F., Goka, K. Pesticide residues and bees-a risk assessment. PLoS One. 9 (4), e94482 (2014).
- Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. Pesticides and honey bee toxicity-USA. Apidologie. 41, 312-331 (2010).
- Yang, E. C., Chang, H. C., Wu, W. Y., Chen, Y. W. Impaired olfactory associative behavior of honeybee workers due to contamination of imidacloprid in the larval stage. PLoS One. 7, e49472 (2012).
- Urlacher, E., et al. Measurements of chlorpyrifos levels in forager bees and comparison with levels that disrupt honey bee odor-mediated learning under laboratory conditions. J. Chem. Ecol. 42 (2), 127-138 (2016).
- Chen, Y. W., Wu, P. S., Yang, E. C., Nai, Y. S., Huang, Z. Y. The impact of pyriproxyfen on the development of honey bee (Apis mellifera L.) colony in field. J. Asia Pac. Entomol. 19 (3), 589-594 (2016).
- Dennehy, T. J., DrGain, B. A., Harpold, V. S., Brink, S. A., Nichols, R. L. Whitefly Resistance to Insecticides in Arizona: 2002 and 2003 Results. , San Antonio, TX, USA. http://ag.arizona.edu/crop/cotton/insects/wf/whiteflyresistance0204.pdf 1926-1938 (2004).
- Yang, E. C., Wu, P. S., Chang, H. C., Chen, Y. W. Effect of sub-lethal dosages of insecticides on honey bee behavior and physiology. Proceedings of international seminar on enhancement of functional biodiversity relevant to sustainable food production, ASPAC, Tsukuba, Japan, , http://www.niaes.affrc.go.jp/sinfo/sympo/h22/1109/paper_06.pdf (2010).
- Fourrier, J., et al. Larval exposure to the juvenile hormone analog pyriproxyfen disrupts acceptance of and social behavior performance in adult honey bees. PLoS One. 10, e0132985 (2015).
- Hanley, A. V., Huang, Z. Y., Pett, W. L. Effects of dietary transgenic Bt corn pollen on larvae of Apis mellifera and Galleria mellonella. J. Apicult.Res. 42 (4), 77-81 (2003).
- Kaftanoglu, O., Linksvayer, T. A., Page, R. E. Rearing honey bees, apis mellifera, in vitro 1, effects of sugar concentrations on survival and development. J. Insect Sci. 11 (96), 1-10 (2011).
- Vandenberg, J. D., Shimanuki, H. Technique for rearing worker honey bees in the laboratory. J. Apicult. Res. 26 (2), 90-97 (1987).
- Peng, Y. S. C., Mussen, E., Fong, A., Montague, M. A., Tyler, T. Effects of chlortetracycline on honey bee worker larvae reared in vitro. J. Invertebr.Pathol. 60 (2), 127-133 (1992).
- Bitondi, M. M., Mora, I. M., Simoes, Z. L., Figueiredo, V. L. The Apis mellifera pupal melanization program is affected by treatment with a juvenile hormone analogue. J. Insect Physiol. 44 (5-6), 499-507 (1998).
- Zufelato, M. S., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L., Hartfelder, K. The juvenile hormone analog pyriproxyfen affects ecdysteroid-dependent cuticle melanization and shifts the pupal ecdysteroid peak in the honey bee (Apis mellifera). Arthropod Struct. Dev. 29 (2), 111-119 (2000).
- Santos, A. E., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L. Hormone-dependent protein patterns in integument and cuticular pigmentation in Apis mellifera during pharate adult development. J. Insect Physiol. 47 (11), 1275-1282 (2001).
- Brouwers, E. V. M. Glucose/Fructose ratio in the food of honeybee larvae during caste differentiation. J. Apicult.Res. 23 (2), 94-101 (1984).
- Howe, S. R., Dimick, P. S., Benton, A. W. Composition of freshly harvested and commercial royal jelly. J. Apicult. Res. 24 (1), 52-61 (1985).
