Summary
Hier präsentieren wir ein Verfahren Pestizid kontaminierte Lebensmittel sowohl mit einer einzelnen Honigbiene und einer Bienenkolonie zu ernähren. Das Verfahren bewertet die Pestizid Auswirkungen auf die einzelnen Honigbienen durch in - vivo - Zufuhr von basischen Larven Ernährung und auch auf den natürlichen Zustand der Bienenkolonie.
Introduction
Das Vorhandensein von Pestiziden in der Umwelt ist eines der gravierendsten Probleme , die Auswirkungen auf das Leben einer Honigbiene 1, 2, 3. Mehrere Studien haben die gemeinsame Präsenz von Pestizidrückständen in Bienenvölkern und Bienenprodukten unter Beweis gestellt. In Taiwan war die durchschnittliche Anwendung von Pestiziden 11-12 kg / ha pro Jahr (2005-2013). Die Menge an Pestiziden in Taiwan verwendet wird , ist höher als die der EU - Länder und die lateinamerikanischen Länder 4, 5. Mit anderen Worten, leidet die Bienenzucht Umwelt ernst Pestizid Stress, vor allem in Taiwan und möglicherweise in anderen Ländern.
Die Honigbiene Apis mellifera ist eine der wichtigsten Bestäuber in landwirtschaftlichen Systemen 6 und produziert auch wertvolle Produkte wie Honig. Expos jedoch Honigbienen sinded auf verschiedene Pestizide und diese Pestizide können nach Nahrungssuche auf Blumen zu beehives zurückgebracht werden , die mit Pestiziden besprüht wurden , wenn 7 Nektar und Pollen zu sammeln, 8. Sie können auch durch die Imker Pestizide ausgesetzt werden , sich Schädlingsprobleme zu steuern das Ziel, innerhalb der Nesselsucht 9, 10, 11. Da Honigbienenlarven von Ammenbienen gefüttert werden für ihre Entwicklung, Larven, Drohnen und sogar die Königin kann 12 dieser Pestizid-kontaminierten Nektare und Pollen ausgesetzt werden. Die Toxizität von verschiedenen Pestiziden Honigbienen muss 13 angesprochen werden.
Viele Anstrengungen wurden unternommen, um die Probleme der Umweltpestizidrückstände zu bewerten. Yang et al. den Einfluss des neurotoxischen Insektizid Imidacloprid auf der Entwicklung von Honigbienenlarven getestet in derBienenstock und berichtet , dass eine subletale Dosis von Imidacloprid in olfaktorischen assoziativen Verhalten der erwachsenen Bienen ergab 14. Auch Urlacher et al. die subletale Wirkungen eines Organophosphat - Pestizid geprüft, Chlorpyrifos, auf einer Lernleistung der Honigbiene Arbeiter unter Laborbedingungen 15. In unserer früheren Studie haben wir die Auswirkungen eines Insektenwachstumsregulator (IGR), Pyriproxyfen (PPN), auf Larvenhonigbienen 16.
In diesem Beitrag stellen wir Methoden für die chemischen Auswirkungen auf die Entwicklung von Honigbienen zu bewerten. Honigbiene Fütterungsmethoden wurden beschrieben und angewandt, um entweder einzelne Honigbienen oder zu einer Kolonie. Zunächst testeten wir verschiedene Konzentrationen von Pestiziden kontaminierte Grundlarvenfutter (BLD) auf Larven in den Kolonien , die Auswirkungen des Pestizids auf einzelne Honigbienen in vivo zu bewerten. Wir gingen dann die natürliche condit zu simulierenIonen des Pestizids durch pestizid kontaminierten Sirup des beehives verwenden. Bei diesem Verfahren wird PPN, die weit gegen Schadinsekten verwendet wird , 17 und sind schädlich für die Entwicklung von Honigbienenlarven und Puppen 16, 18, 19, wird ein Indikator sein , um die negative Wirkung des Pestizids auf dem Gebiet darstellen.
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Protocol
1. Vorbereitungen
- Machen 1 L 50% Zuckersirup. Man löst 1 kg Saccharose in 1 l ddH 2 O.
- Bereiten Pyriproxyfen (PPN) -Lösung in BLD. Make 1,1 L von 10.000 ppm PPN - Stammlösung und verdünnte 100 ml PPN - Lösung in 1 l sterilisierten ddH 2 O. Lagerung bei 4 ° C.
- Verdünne die PPN-Stammlösung auf Endkonzentrationen von 0,1, 1, 10 und 100 mg / kg (ppm) in dem BLD für das folgende Experiment.
- Machen PPN-Sirup (für die Kolonie-Ebene). Verdünne die PPN Lager auf Endkonzentrationen von 10 und 100 ppm in 50% Zuckersirup für das folgende Experiment.
- Honigbienenhaltung.
Hinweis: Hier ist die experimentelle Lage ist die National Ilan University (NIU) Imkerei, Yi-Lan City, Taiwan; (GPS - Koordinaten: N24.747278, E121.746200).- Überprüfen Honigbiene (Apis mellifera L.) für die Lebensmittelmenge wöchentlich Kolonien und Futtermittel mit 1 Liter 50% Zuckersirup , falls erforderlich (der Honig - Speicherbereich ist leer). Definieren Sie eine gesundeKolonie als 9 Bilder von Bienenwaben in jeder Kolonie mit einem Queen-Eier normalerweise legen.
- Bereiten Sie 100 ml Grund Larvaldiät (BLD). Man löst 6% D-glucose, 6% Fructose und 1% Hefeextrakt in sterilisiertem destilliertem deionisiertem Wasser (ddH 2 O) und ergänzt mit 50% Gelee royale. Lagerung bei 4 ° C, jedoch nicht länger als 3 Tage.
Hinweis: Pre-warm bis 35 ° C vor dem Experiment und innerhalb von 3 Tagen haben.
2. In - vivo - Fütterungsmethode
Hinweis: In - vivo - Fütterungsmethode wurde von Hanley et al modifiziert. 20
- Honigbienenlarven Auswahl und Kennzeichnung.
- Legen Sie eine Königin excluder 9 Rahmen einer gesunden Kolonie in 4 Rahmen und 5 Rahmen zu unterteilen, während die Königin zu dem Rahmenprofil 4 zu begrenzen. Verlassen mindestens einen leeren Rahmen in dem Rahmenteil 4 zur Eiablage.
- Nachdem die Königin Eier für 1 Tag VerlegungÜberprüfen, den Rahmen für das Auftreten von Eiern und halten Sie die Eier in den Bienenstöcken für 72 h (4. Tag) bis zum 1. Tag alten Larven schlüpfen. Nehmen Sie einen der Rahmen, die 1-Tage alten Arbeiterinnenlarven (innerhalb von 24 h schraffiert) aus dem Testbienenstock von Hand und entfernen Sie die Honigbiene Arbeiter aus dem Rahmen mit einer Biene Pinsel.
- Bedecken den Rahmen mit einer transparenten Rutsche (Size = Länge x Breite x Dicke = 29,7 mm x 21 mm x 0,1 mm) und Nagel die transparente Folie auf dem Rande des Rahmen mit thumbtacks (1A).
- Für jede Behandlung wählen zufällig 50 1 Tag alten Larven (4. Tag) und jede Brutzelle unter Verwendung von Permanentmarker Stifte auf dem transparenten Schieber (1A und 1B) markieren.
Hinweis: Schreiben Sie die Informationen jeder Behandlung auf dem Rahmen und transparente Folie als auch durch Permanentmarker Stifte mit der Verwirrung zwischen den verschiedenen Behandlungen zu vermeiden. Entfernen Sie die markierten Folien und halten für die in vivo </ Em> Fütterung und Beobachtung.
- In - vivo - Zuführung.
- Fügen unterschiedliche Konzentrationen von PPN-BLD (0,1, 1, 10 und 100 ppm) zu jeder markierten Brutzelle durch Pipettieren am Tag 1, 2 und 3 mit 10 ul, 10 ul und 20 ul, das jeweils entsprechend den Ansaugmenge der Larven Alter. Fügen Sie die gleiche Menge an BLD (kein PPN) zu einer Kontrollgruppe. Dadurch reichert sich die Gesamtdosis von PPN-BLD in jeder markierten Brutzelle bis 4, 40, 400 und 4000 pg.
HINWEIS: Erkennen Sie die markierten Brutzellen durch die markierten transparenten Folien und entfernen Sie die markierten transparenten Folien nach der Fütterung. Verwenden Sie frische BLD zum Zuführen der Reinigung der Brutzellen von den Arbeiterinnen zu verhindern. - Bringen Sie die PPN-behandelten Rahmen auf die ursprünglichen Kolonien für weitere Beobachtungen.
HINWEIS: Jede Behandlung hat vier biologische Wiederholungen in vier Kolonien.
- Fügen unterschiedliche Konzentrationen von PPN-BLD (0,1, 1, 10 und 100 ppm) zu jeder markierten Brutzelle durch Pipettieren am Tag 1, 2 und 3 mit 10 ul, 10 ul und 20 ul, das jeweils entsprechend den Ansaugmenge der Larven Alter. Fügen Sie die gleiche Menge an BLD (kein PPN) zu einer Kontrollgruppe. Dadurch reichert sich die Gesamtdosis von PPN-BLD in jeder markierten Brutzelle bis 4, 40, 400 und 4000 pg.
- Die Beobachtung der behandelten Larven am Tag 7.
- Zu beobachten the PPN-behandelten Larven, kehren die markierten transparenten Folien an den Rahmen die Sterblichkeit und Verschließmaschinen Raten in den markierten Brutzellen zu erfassen.
- Die Beobachtung der behandelten Puppen und Schlüpfen Raten am Tag 13.
- Entfernen Sie das Bienenwachs gedeckelter Brutzellen.
- Setzen Sie die weiche kippte Pinzette in Brutzelle und klemmen die Puppen sehr leicht dann Puppen nehmen vorsichtig aus.
- Übertragen der Puppen in 24-Well-Gewebekulturplatten mit einer Doppelschicht von Laborgewebe unterhalb jeder Vertiefung. Notieren Sie sich den Schaden und Mortalität während pupal Übertragung.
- Halten Sie die 24-Well - Gewebekulturplatten in einem Inkubator bei 34 ° C und 70% relative Luftfeuchtigkeit , bis Auftauchen (ca. 8 Tage).
- Bitte beachten und die Puppen und tauchte Honigbienen aufzunehmen.
- Statistiken
- Berechnen Sie die aufgezeichneten Daten und Gegenwart als Mittelwert ± SD
- Analysieren der Daten unter Verwendung der Varianzanalyse (ANOVA) durch SAS und verwenden den niedrigstwertige Unterschied (LSD) -Test die Unterschiede zwischen zwei mittels verschiedener Behandlungen zu analysieren. Definieren statistisch signifikant als P - Wert <0,05. Verschiedene Buchstaben in der gleichen Spalte der Tabelle zeigten einen signifikanten Effekt, der durch die statistische Analyse.
3. Toxizität von PPN bei Colony Ebene in Beehive
- Stellen Sie die Honigbiene Gruppen auf.
- Senkrecht eine Königin excluder 9 Frames eines gesunden Kolonie in 4 Rahmen (Teil A) und 5-Rahmen (Teil B) zu unterteilen, während die Königin zu dem Rahmenprofil 4 zu begrenzen. Verläßt mindestens einen leeren Rahmen in dem 4-Rahmenprofil für die Eiablage.
Hinweis: Legen Sie eine andere Königin EXCLUDER die auf der Oberseite der Königin Teil der Königin zu verhindern, zwischen den Teilen bewegt. - Nachdem die Königin Eier für 1 Tag legt, überprüfen Sie den Rahmen für das Auftreten von Eiern. Nehmen Sie die entsprechenden Rahmen Eier aus Teil A von Hand enthält, und entfernen Sie die Honigbiene Arbeitervon dem Rahmen mit einer Biene Bürste.
- Bedecken den Rahmen mit transparenter Rutsche und Nagel die transparente Folie in der Kante des Rahmens mit Reißzwecken.
- wählen zufall 100 Brutzellen Eier und markieren jede Brutzelle unter Verwendung von Permanent-Marker auf der transparenten Folie enthalten. Ordnen diese 100 Brutzellen als Gruppe 1, die Information von jeder Behandlung auf dem Rahmen und transparente Objektträger unter Verwendung von Permanent-Marker schreiben die Verwirrung zwischen den verschiedenen Behandlungen zu vermeiden.
- Bringen Sie den markierten Rahmen zu Teil A für 3 Tage und dann übertragen die Königin zu Teil B, Eier zu legen.
- Nach 1 Tag, überprüfen die Rahmen von Teil B, einen geeigneten Rahmen wählen und 100 Brutzellen enthaltende Eier Etikett als in Schritt 3.1.4 beschrieben. Ordnet diese 100 Brutzellen als Gruppe 2.
- Bringen Sie den markierten Rahmen zu Teil B für 3 Tage und dann die Königin übertragen, um ein Teil Eier zu legen.
- Wiederholen Sie die Königin Austausch zwischen Teil A und Teil B 6 weitere Male, und weisen Gruppen numerisch,jeweils (Abbildung 2). Es sollte von 9 Gruppen insgesamt sein.
- Senkrecht eine Königin excluder 9 Frames eines gesunden Kolonie in 4 Rahmen (Teil A) und 5-Rahmen (Teil B) zu unterteilen, während die Königin zu dem Rahmenprofil 4 zu begrenzen. Verläßt mindestens einen leeren Rahmen in dem 4-Rahmenprofil für die Eiablage.
- T reat Honigbienenvolk mit PPN Zuckersirup am Tag 13 (Abbildung 2).
- 1 L 50% PPN Zuckersirup, der 10 oder 100 ppm in einem Kunststoffbienenbeschickungskasten (W x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) und setzen den Kasten oben auf den Rahmen in den experimentellen Kolonien.
Hinweis: Gruppe 1 nicht die PPN erhält an 13 Tagen, da die Brutzellen versiegelt wurden. - Futtermittel die Kontrollgruppe mit 1 L 50% Zuckersirup (kein PPN), wie in Schritt 2.2 beschrieben.
- 1 L 50% PPN Zuckersirup, der 10 oder 100 ppm in einem Kunststoffbienenbeschickungskasten (W x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) und setzen den Kasten oben auf den Rahmen in den experimentellen Kolonien.
- Anzahl 1 Tage alte Larven und Aufzeichnung als die Bruteies Rate von 100 markierten Brutzellen für jede Gruppe am Tag 5 (Abbildung 2). Honigbiene Eier nehmen normalerweise 3 Tage in 0 Tagen Larven zu schlüpfen; Deshalb überprüfen und 5 für jede Gruppe am Tag 100 Eier haltigen Brutzellen am Tag 1 und zählen die Anzahl von 1 Tag alter Larven bezeichnen den Prozentsatz der Schlupfrate zu erhalten.
- Count die verkappten Brutzellen und Aufzeichnung als die Larven- Capping Rate von 100 markierten Brutzellen für jede Gruppe an Tag 11 (Abbildung 2). 6 bis 7 Tage alten Larvenbrutzellen werden mit Bienenwachs von Honigbienenlarven Arbeiter für Verpuppung begrenzt.
- Beobachten Puppen Reifung und notieren Sie die eclosion Rate von 100 markierten Brutzellen für jede Gruppe an Tag 17 (Abbildung 2).
- Entfernen Sie das Bienenwachs gedeckelter Brutzellen und nehmen Puppen aus mit weichen Spitzen versehenen Pinzette vorsichtig. Übertragen der Puppen in einer 24-Well-Gewebekulturplatten mit einer Doppelschicht von Laborgewebe unterhalb jeder Vertiefung.
- Halten Sie die 24-Well-Gewebekulturplatten in einem Inkubator bei 34 ° C und 70% RH bis zum Auftauchen.
- Bitte beachten und notieren Sie die Puppen und tauchte Honigbienen für jede Gruppe bis Gruppe 9 (49 Versuchstagen).
Hinweis: Jede Behandlung hat vier biologische wiederholt.
- Statistiken
- Berechnen Sie die aufgezeichneten Daten und Gegenwart als Mittelwert± SD.
- Analysiert die signifikanten Unterschiede zwischen Paaren von Behandlungen (zB 0 ppm / 10 ppm, 10 ppm / 100 ppm und 0 ppm / 100 ppm) in jeder Gruppe durch den Zwei-tailed t - Test nach Student verwendet. Definieren Sie als statistisch signifikant , wenn P - Wert <0,05.
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Representative Results
Für die Honigbiene Feldtest wurde eine Königin auf den für Eiablage 4-Rahmenabschnitt begrenzt. Dieser Schritt könnte die Brutdichte in einem Rahmen erhöhen und nachfolgende Beobachtungen erleichtern. Jede Behandlung wurde markiert, und die Entwicklung in den Honigbienen wurde eindeutig durch ein transparentes Dia beobachtet. In - vivo - Zufuhr von PPN-BLD auf Honigbienenlarven in dem Bienenstock wurde durchgeführt , um genau den Einfluss von PPN auf der Entwicklung von Honigbienen in der Kolonie zu bewerten. Unter Verwendung des in vivo - Fütterungsmethode erleichtert die Beobachtung der Auswirkungen der chemischen Behandlungen auf dem Bienenstock.
Für jede Dosis von PPN-BLD, wurden insgesamt fünfzig Brutzellen markiert und behandelt. Nach der Zugabe von PPN-BLD wurden die behandelten Rahmen auf die ursprünglichen Kolonien für die Beobachtung unter natürlichen Bedingungen zurückgeführt. Die negativen Auswirkungen des PPN-BLD auf Larvenstadium Honigbienen waren leicht Observed. Eine dosisabhängige Wirkung beobachtet. Tabelle 1 stellen die Anzahl von Honigbienen , die im Larvenstadium auf die beiden höheren Dosen von 10 und 100 ppm starben. Wie in Tabelle 1, bei den beiden Dosen gezeigt (0,1 und 1 ppm) wurden die Capping Raten Tage Entstehung und eclosion Raten nicht signifikant verschieden von 0 (BLD Lebensmitteln zugesetzt) oder der unfed Steuerung, mit nur einem deutlich höheren Prozentsatz an Bienen mit deformierten Flügeln bei 1 ppm. Melanization der Puppen wurde bei niedrigeren Konzentrationen von PPN beobachtet. Ferner zeigte der Anteil der erwachsenen Honigbienen mit deformierten Flügeln mit höheren Dosen von PPN erhöht (Tabelle 1).
Um Bienenvölker leiden Umwelt PPN Rückstand, Fütterung von PPN Sirup auf das gesamte Bienenvolk zu simulieren durchgeführt wurde. Vor der Behandlung wurde jede Kolonie in 9 verschiedene zeitliche Gruppen aufgeteilt in 3 - tägigen Intervallen von zwei Queen Excluders (FiAbbildung 2). Daher wurden die Effekte von PPN auf den Raten des Schraffur, Capping und Schlüpfen gleichzeitig ähnlich in der natürlichen Umgebung zu der unter Bedingungen beobachtet.
Die Kolonien wurden Sirup mit 10 oder 100 ppm PPN am Tag gefüttert 13 (durch die gepunkteten roten in Figur 2 angedeutet). Theoretisch 1, Gruppe war eine PPN-freie Kontrolle, da die PPN-Sirups am Tag zugeführt wurden, 13 und die Honigbienen in Gruppe 1 wurden in der Verpuppung und verschlossen; begannen die honeybees im Larvenstadium in den Gruppen 2 und 3 beeinflussten werden, und die Eier werden in Gruppen 4-9 durch die längere Belichtungszeit in dem PPN-kontaminierten beehives (Abbildung 2) beeinflusst werden.
In dieser Studie gefüttert wir Bienenvölker mit PPN Sirup und Entwicklung beobachtet werden, wenn die erwachsenen Bienen den Sirup verbraucht und fütterte vermutlich die Königin und Larven. Diese Annahme wurde durch die hatc bestätigtHängt, Capping und Schlüpfen Rate und verformte geflügelte Bienen wurden nach den PPN - Behandlungen beobachtet, wie in den 3A - 3D. Alle Parameter unterschieden sich signifikant bei der höheren Dosierung (100 ppm) , beginnend mit der Gruppe 3, mit Ausnahme der Schlupfrate (3A - 3D). Darüber hinaus wird nach den PPN-Sirup Behandlungen starben viele Puppen mit schwarzer Nagelhaut oder durch aufzutauchen scheitern. In der 100 ppm PPN - Behandlung wurden die Zellen mit einer Kappe bedeckt zerstört und die verletzten Puppen wurden aus der Kolonie (Figur 3E) entfernt.
Abbildung 1: Schema der Brutzellen Kennzeichnung. (A) 1 Tag alte Arbeiterinnenlarven durch transparentes Dia Papiere abgedeckt und wurden durch permanenten Marker markiert. (B) 1 Tag alte Arbeiter Larvenbrutzellen markiert; der weiße Pfeil zeigt ein 1 Tage alter Arbeiter Larve im Innern. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Zeitleiste für , wenn PPN wird relativ zu den 9 Versuchsgruppen gestartet. Verschiedene Konzentrationen von PPN wurden am Tag 13 (rot gestrichelte Linie) zugeführt. Die behandelte Kolonie wurde aufgeteilt in dem Teil A und Teil B. Die Königin Austausch von Teil A zu Teil B , und umgekehrt für die Eiablage wird gezeigt. Dies wurde mit Genehmigung von Elsevier 16 wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3: Entwicklung der Honigbienenlarven vor und nach 1 kg PPN Sirup in getestet Bienenvölker ernähren. Insgesamt neun Gruppen wurden in diesem Experiment untersucht: (A) Schlupfrate; (B) Capping Rate; (C) eclosion Rate; und (D) malformed wing Rate. Mittelwert ± SD vorgestellt; Rote Pfeile zeigen die Zeit, während der PPN beginnen kann auf Bienen wirken. Schwarz Sternchen zeigen statistische Signifikanz im Vergleich zur Kontrolle (0 ppm). Rote Sternchen zeigen statistische Signifikanz zwischen 10 und 100 ppm; (E) 100 ppm PPN Sirup behandelt Bienenkolonie zeigten uncapped Zellen, vermutlich verformt Puppen und schwarz und verformt Puppen. Dies wurde mit Genehmigung von Elsevier 16 wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| PPN-BLD (ppm) | Larvae No. | Larvalentwicklung | ||
| Capped Rate (%) | Eclosion Rate (%) | Malformed Flügel (%) | ||
| 100 | 140 | 0b | 0b | - |
| 10 | 139 | 22,2 ± 33.2b | 0b | - |
| 1 | 140 | 72,3 ± 17.9a | 67,7 ± 17.6a | 7,7 ± 5.7a |
| 0,1 | 136 | 78,3 ± 17,5A | 75,4 ± 22.8a | 1,4 ± 2.8b |
| 0 | 138 | 78,9 ± 5.4a | 78,9 ± 5.4a | 0b |
| Nichtfütterung | 122 | 87,8 ± 9.1a | 86,1 ± 7.2a | 0,8 ± 1.5b |
Tabelle 1: Auswirkungen der fort 3 Tage Fütterung von PPN am 1. Tag alten Larven. Zu jeder Zelle larvalen, 10, 10 und 20 ul BLD wurden von den Tagen 1 bis 3, die jeweils hinzugefügt. Jeder Test enthielt 25-38 Larven in einer Kolonie und 4 Kolonien wurden getestet. Mittelwert ± SD dargestellt. Unterschiedliche Buchstaben in der gleichen Spalte sind signifikant verschieden von dem kleinsten Quadraten Differenz-Test (P <0,05) nach der ANOVA einen signifikanten Einfluss zeigte. Dies wurde mit Genehmigung von Elsevier 16 wiedergegeben.
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Discussion
Die Königin begrenzte Eiablage Methode und Queen-Austauschverfahren sind wichtige Schritte zur Einstellung innerhalb dieses Protokolls Honigbiene Gruppen für den Feldtest auf. Die Königin begrenzte Eiablage Verfahren ermöglicht die Synchronisation des Lebenszyklus von Honigbienen. Folglich können die Forscher wählen Sie 1 Tage alte Larven der gleichen Altersgruppe für die Behandlung mit verschiedenen Dosen des Pestizids. Für die Königin-Austauschverfahren wurde die Königin zwischen Teil A (4 Rahmen) und B (5 Frames) zu erhalten verschiedene Entwicklungsstadien der Honigbiene für Feldversuche ausgetauscht die Auswirkungen des Pestizid und Pestizidrückstände zu bewerten. Darüber hinaus wird eine große Anzahl von ausgewählten Brutzellen wurden im Feldtest unter Verwendung von transparenten Folien zur Beschriftung aufgezeichnet. gelegentlich zu einer unzureichenden Brutzellen für die Königin jedoch Ei über legenden Eiablage. Daher wird die Herstellung von leeren Rahmen für die Königin-Austauschverfahren erforderlich. Alternativ könnte die Königin begrenzte Eiablage Verfahren auch verwendet werden,bereite verschiedene Honigbiene Gruppen für die Prüfung im Bienenstock. Die Trennung des Rahmen in Rahmen 2 in Teil A und 7-Frames in Teil B und die Platzierung der Königin in Teil A (2 Rahmen) können die Eier von der Königin in dem Rahmen 2 fest begrenzen.
Für die in vivo - Fütterungsmethode wurde PPN-BLD zu jeder Brutzelle hinzugefügt. Die Honigbienen höhere Akzeptanz von BLD als 16 Sirup ausgestellt, 20. Honigbienenlarven können auf einer künstlichen Diät überleben und wachsen , bestehend aus Gelée Royale, Zucker, Hefeextrakt, und destilliertes Wasser 22, 23. Die Glukose und Fruktose Zusammensetzung des BLD hatte keinen Einfluss auf die Überlebensraten der Larven in vitro 21, und daher würde BLD stabiler sein für Honigbiene Wachstum in den Bienenstock. Bemerkenswert ist, könnte die Verwendung von frischen BLD für die Fütterung auch die Arbeitsbienen Larven Ausgrenzung verhindern währenddas Larvenfütterungsexperiment. Darüber hinaus während der Fütterungsverfahren wird behutsame Zuführung zunächst erforderlich, um den Tod von 1 Tag alten Larven zu vermeiden.
Während Feldtests kontaminierten BLD chemisch in den Bienenstock gelegentlich verursacht Larven Ausschluss aufgrund der hohen Geruchsempfindlichkeit von Pflegebienen. Die Zuckerzusammensetzung beeinflusst signifikant die durchschnittliche Überlebenszeit der Larven, pre-pupal Larvengewichte, Erwachsenen- Gewichte und Ovariole Zahlen 21. Wenn Sirup verwendet transgene Pollen oder eine positive Kontrolle Pestizid Diazinon auf Honigbienenlarven zu liefern, entfernt die Arbeiter wenige Larven aus den 21 Lebensmitteln zugesetzt oder kontaminiert enthält Brutzellen. Somit sollte die Zuckerzusammensetzung festgestellt werden. Eine Erhöhung der Anzahl von 1 Tag alten Larven oder die getesteten einzelnen Brutzellenstandorte Dispergieren kann auch die Probleme verbessern. Tatsächlich basiert auf der Beobachtung der PPN-BLD Behandlungsverfahren und die dramatischen dosisabhängigen Auswirkungen vonPPN-BLD auf der Entwicklung von Honigbienen, gingen wir davon aus, dass die Krankenschwestern den künstlich hinzugefügt BLD zu den Brutzellen nicht entfernt haben. Niedrige Konzentrationen von PPN Ursache melanization von Puppen, möglicherweise aufgrund der erhöhten Phenoloxidase Aktivität, die 24 melanization und Verpuppung regelt, 25, 26. Basierend auf der Verwendung einer künstlichen Fütterungsmethode für jede Brutzelle, die dramatischen Auswirkungen des PPN-BLD auf der Entwicklung von Honigbienen können ab dem ersten Tag zu direktem Kontakt mit PPN fällig von dem Schlüpfen.
Die chemischen Dosierungen in den Fütterungsversuchen verwendet wird, könnten auf Basis von Umfragedaten für Pestizidrückstände in frischen Pollenproben aus Honig Bienenstöcken gesammelt entworfen werden. Es gibt eine Vielzahl von Routen von Pestizidbelastung von Kolonien in der natürlichen Umwelt. Chemische Verunreinigungen auf die Bienenvölker zurückgebracht und durch die Fütterung mot durch Larven aufgenommen werden könntenIon Arbeiter Honigbienen, beeinflussen schließlich die Entwicklung der Larven. Um die Auswirkungen der PPN in der Kolonie Ebene in den Bienenstock zu bewerten, wurde Sirup in dieser Studie statt Pollen verwendet für die Zufuhr als die schnellste und direkteste Weg, um sicherzustellen, dass die Honigbienen die Chemikalie verbraucht. Darüber hinaus kann der Zustand des Sirups definiert werden, während der Inhalt des Pollens schwer zu kontrollieren ist (zB Pathogene oder Pestizidkontamination).
Unter Feldbedingungen verschiedene Entwicklungsstadien (Eier, Larven, Puppen und adulten Bienen) von Honigbienen in einem Bienenvolk leidet den gleiche Umgebung Faktor. In unserem Versuchsaufbau wurden die natürlichen Bedingungen simuliert die Auswirkungen der Chemikalie auf den Entwicklungsstadien von Honigbienen in einem dynamischen Umfeld zu bewerten. Deshalb wird nach PPN Behandlung (13 Tage), könnten wir den unbeeinflussten Begrenzungssatz in der Gruppe 1 beobachten, die beeinflusste Begrenzungssatz in den anderen acht Gruppen und die beeinflusste Larvenstadiums in den Gruppen 2 und 3 usw. Unter diesen Bedingungen die wahren Auswirkungen innerhalb der Kolonie und der Weg der Ausbreitung der Chemikalie auf die ganze Kolonie sind klar.
Die Bienenvölker mit PPN Sirup behandelt zeigte Verzerrung von verkappten Zellen und Entfernung von Puppen aus der Kolonie. Darüber hinaus umfangreiche melanization der Puppen wurde in der 100 ppm PPN Behandlung beobachtet. Somit erlaubt die PPN-Sirup Fütterungsmethode der dynamischen Auswirkungen von Chemikalien auf den gesamten Lebenszyklus von Honigbienen im Bienenstock zu beobachten. In dieser Studie wird die Sirup durch die Arbeiter und Pflege Bienen aufgenommen wurde vermutlich an die Königin und Larven gefüttert. Zur Bestätigung, verwenden unsere zukünftigen Studien chemische Markern (wie ein essbaren Farbstoff) in dem chemischen haltigen Sirup, um die Untersuchung der Dynamik von chemisch verunreinigten beehives zu erleichtern.
Die Nahrungsquelle der Krankenschwester Bienen sollten aus foragers kommen oder in Bienenstock und Larven gefüttert Unterkiefers und hypopharyngEAL Drüse von Ammen hergestellt Sekrete 21, 25, 26, 27, 28. Wenn Larven von Ammen zugeführt werden, durch die hypopharyngeal Drüse im Unterkiefer erzeugen Sekrete können den PPN-Sirup verdünnen. Diese biologische Verwässerungseffekt ähnelt mehr den natürlichen Bedingungen , sondern erläutert die unterschiedlichen Ergebnisse der in - vivo - Fütterungsmethode. Verschiedene Materialien, einschließlich anderer Pestizide, Schwermetall und Honigbienenkrankheitserreger könnten zur Bewertung und Bewältigung der Rollen in Honigbienenpopulationen auf diese Fütterungsmethode angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von Grant 105AS-13.2.3-BQ-B1 aus dem Bureau of Tier- und Pflanzengesundheit Inspektion und Quarantäne, der Rat für Landwirtschaft, Exekutiv-Yuan und Grant 103-2313-B-197-002-MY3 vom Ministerium unterstützt für Wissenschaft und Technologie (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Honey bee box | SAN-YI Honey Factory | W1266 | Honeybees rearing |
| Queen excluder (between frames) | SAN-YI Honey Factory | I1575 | Queen limitation |
| Queen excluder (on top) | SAN-YI Honey Factory | I1566 | Queen limitation on top |
| Bee brush | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | W1414 | clean the bees on frame gently |
| Bee feeder | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | P0219 | feed sugar syrup to colony |
| Transparent slide | Wan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40) | 1139 | Mark the larval area on the frames (Material: Polyethylene Terephthalate, PET) (Size = Length*Width*thick = 29.7 mm * 21 mm * 0.1 mm) |
| 24 well tissu culture plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | TCP011024 | Rearing pupae from extraction |
| Autoclave | Tomin medical equipmenco., LTD. | TM-321 | Make sterilized distilled deionized water (ddH2O) |
| P20 pipetman | Gilson | F123600 | Add PPN into bee larval food pool |
| Incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-550RD | Rearing pupae from extraction |
| Kimwipes | COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD | KCS34155 | Rearing pupae from extraction |
| Royal jelly | National Ilan University (NIU) | NIU | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(-)-Fructose | Sigma | F0127 | Make basic larval diet (BLD) |
| Yeast extract | CONDA, pronadisa | 1702 | Make basic larval diet (BLD) |
| Sucrose | Taiwan sugar coporation | E01071010 | Make sugar syrup for bee food |
| Pyriproxyfen (11%) | LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD. | Registration No. 1937 | Insect growth regulator (IGR) used in the experiment |
References
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