Summary
ここで我々が提示 個々ミツバチと蜂の巣コロニーの両方に農薬汚染された食物を供給するための方法。手順は、基本的な幼虫の食事のとも蜂の巣コロニーの自然条件にin vivoで供給することにより、個々のミツバチへの農薬の影響を評価します。
Introduction
環境中の農薬の存在が影響ミツバチ1、2、3の人生で最も深刻な問題の一つです。いくつかの研究は、ミツバチのコロニーとミツバチ製品中の残留農薬の一般的な存在を証明しています。台湾では、農薬の平均的なアプリケーションは、（2005年から2013年まで）キログラム/ヘクタール、毎年11〜12でした。台湾で使用される農薬の量は、EU諸国のそれよりも高く、そしてラテンアメリカ諸国4、5です。言い換えれば、養蜂環境は、特に台湾では、おそらく他の国では、深刻な農薬ストレスを受けています。
ミツバチミツバチは農業システム6の主要な花粉媒介の一つであり、それはまた、蜂蜜などの貴重な製品を生産しています。しかし、ミツバチは、博覧会です様々な農薬やこれらの農薬へのedは蜜や花粉7、8を収集する際に農薬を噴霧してきた花で採餌した後、ハチの巣に戻すことができます。彼らはまた、自身がじんましん9、10、11内部の害虫問題を制御することを目指し養蜂家によって農薬に暴露することができます。ミツバチの幼虫は、その開発のための看護師ミツバチによって供給されるので、幼虫、ドローンとも女王は、これらの農薬汚染ネクターと花粉12に露出されてもよいです。ミツバチへの各種殺虫剤の毒性は13を対処する必要があります。
多くの努力は、環境残留農薬の問題を評価するために行われています。 Yang ら。でミツバチの幼虫の開発に神経毒性殺虫剤イミダクロプリドの影響をテストしました蜂の巣はとイミダクロプリドのサブ致死量は成人の蜂14の嗅覚連想行動をもたらしたことを報告しました。また、アーラッカーら。実験室条件の下で15ミツバチの労働者の学習パフォーマンス上の有機リン系農薬、クロルピリホス、の亜致死影響を調べました。私たちの以前の研究では、幼虫のミツバチ16上（PPN）ピリプロキシフェン昆虫成長調節（IGR）の影響を、評価しました。
本稿では、ミツバチの開発に化学的影響を評価するための方法を提示します。ミツバチ供給方法が記載され、いずれかの個々のミツバチまたはコロニーに適用しました。最初に、我々は、in vivoでの個々のミツバチへの農薬の影響を評価するためにコロニーに幼虫に殺虫剤に汚染された基本的な幼虫の食（BLD）の異なる濃度をテストしました。私たちは、その後、自然コンディットをシミュレートするために進めハチの巣内農薬汚染シロップを使用することによって殺虫剤のイオン。この方法では、広く害虫17に対して使用され、ミツバチの幼虫および蛹16、18、19の発展に有害であるPPNは、フィールド内の農薬の負の効果を表す指標であろう。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.準備
- 50％の砂糖シロップの1リットルを作ります。 1リットルのddH 2 Oに1kgのスクロースを溶解
- BLDにおけるピリプロキシフェン（PPN）溶液を調製します。 10,000ppmのPPNストック溶液1.1 Lを作成し、4℃でのddH 2 Oストア滅菌1L中100mLのPPN溶液を希釈します。
- 以下の実験のためにBLD 0.1、1、10及び100mg / kgの（PPM）の最終濃度にPPNストック溶液を希釈します。
- （コロニーレベル用）PPN-シロップを作ります。以下の実験のために50％の砂糖シロップに10と100 ppmの最終濃度にPPNストックを希釈します。
- ミツバチ飼育。
注：ここでは、実験場所は国立宜蘭大学（NIU）養蜂場、李-LAN市、台湾です。 （GPS座標：N24.747278、E121.746200）。- ミツバチ（ ミツバチ L.）は食物量毎週コロニーをチェックして（蜂蜜記憶領域が空である）、必要に応じて1リットルの50％砂糖シロップとフィード。健康の定義通常産卵クイーン各コロニーにおけるミツバチコームの9つのフレームとしてコロニー。
- 基本的な幼虫の食（BLD）の100ミリリットルを準備します。滅菌蒸留脱イオン水（のddH 2 O）中の6％D-グルコース、6％フルクトース、および1％酵母抽出物を溶解し、50％ローヤルゼリーで補います。 4°Cで保管してくださいではなく、3日以上のため。
実験の前に35°Cまでの事前暖かく、3日以内に使用します。注意してください。
インビボ供給方法2.
注意： インビボでの供給方法は、ハンリーらから変更されています。 20
- ミツバチの幼虫の選択とラベリング。
- 4フレーム区間に女王を制限しながら4つのフレームと5つのフレームに健康なコロニーの9つのフレームを分割するクイーン圧排を挿入します。産卵するための4フレーム区間内の少なくとも1つの空のフレームを残します。
- 女王は1日の卵を産卵した後、、卵の外観のためのフレームをチェックし、1日齢幼虫が孵化するまで72時間（4 日目 ）のためのハチの巣の内部に卵を保ちます。手で試験ハイブから（24時間以内に斜線）1日齢ワーカー幼虫を含むフレームのうちの1つを取り、蜂ブラシ付きフレームからミツバチの労働者を削除します。
- 透明スライド（サイズ=縦×横×厚さ= 29.7ミリメートル×21ミリメートル×0.1ミリメートル）でフレームをカバーし、画鋲（ 図1A）とフレームのエッジに透明スライドを爪。
- 各治療のために、ランダムに50一日齢の幼虫（4 日目 ）を選択し、透明スライド上に油性マジックペンを使用して、各ひな細胞をマークする（ 図1Aおよび1B）。
注：異なる処理の間での混乱を避けるために、恒久的なマーカーペンを使用することにより、同様のフレームと透明スライド上の各処理の情報を書き込みます。マークされたスライドを削除し、in vivoでのために保ちます</ em>の給餌と観察。
- 生体内給餌で 。
- の摂取量に応じて、それぞれ10μL、10μL、20μL、一日1,2および3にピペッティングすることによって、各標識ひなセルにPPN-BLD（0.1、1、10及び100 PPM）の異なる濃度を追加幼虫時代。対照群にはBLD（無PPN）の同量を追加します。これにより、各標識ひなセルにおけるPPN-BLDの総用量は、4、40、400、4000 PGに蓄積します。
注：マーク透明スライドによって標識ひな細胞を認識し、給餌後にマーク透明スライドを削除します。働きバチによってひな細胞の洗浄を防ぐために供給するための新鮮なBLDを使用してください。 - さらに観測の元植民地にPPN処理されたフレームを返します。
注：各処理は、4個のコロニーの4つの生物学的反復配列を持っています。
- の摂取量に応じて、それぞれ10μL、10μL、20μL、一日1,2および3にピペッティングすることによって、各標識ひなセルにPPN-BLD（0.1、1、10及び100 PPM）の異なる濃度を追加幼虫時代。対照群にはBLD（無PPN）の同量を追加します。これにより、各標識ひなセルにおけるPPN-BLDの総用量は、4、40、400、4000 PGに蓄積します。
- 7日目の治療の幼虫の観察。
- 目を観察するために、電子PPN処理した幼虫は、標識されたひな細胞に死亡し、キャッピング率を記録するためのフレームにラベルされた透明のスライドを返します。
- 13日目での治療蛹および羽化率の観察。
- 頂いたひな細胞のミツロウを削除します。
- ひなセルに柔らかい先端がピンセットを入れて、クランプ蛹を非常にわずかにそっと蛹を取ります。
- 各ウェルの下に実験室組織の二層を有する24ウェル組織培養プレートに蛹を転送します。蛹転送時の損傷や死亡率を記録します。
- （ 約 8日間）出現するまで、34℃、相対湿度70％のインキュベーターで24ウェル組織培養プレートを保ちます。
- 観察し、蛹と登場ミツバチを記録。
- 統計
- 記録したデータを計算し、平均値±SDとして存在
- SAによって分散分析（ANOVA）を使用してデータを分析Sとは異なる治療法の二つの手段の違いを分析するために最小有意差（LSD）テストを使用します。 P -値<0.05として統計的に有意で定義します。テーブルの同じ列における異なる文字は、統計分析によって有意な効果を示しました。
ビーハイブでコロニーレベルでのPPNの3毒性
- ミツバチのグループを設定します。
- 4フレーム区間に女王を制限しながら4つのフレーム（パートA）及び5つのフレーム（パートB）に健全なコロニーの9つのフレームを分割する垂直クイーン圧排を挿入します。産卵するための4フレーム部に少なくとも1つの空のフレームを残します。
注意：別の女王は、部品間を移動するから女王を防ぐために、女王の部分の上にエクスクルー置きます。 - 女王は1日の卵を産卵した後、卵の出現のためのフレームをご確認ください。手でパートAから卵を含む適切なフレームを取り、ミツバチの労働者を削除します蜂ブラシでフレームから。
- 透明スライドとフレームをカバーし、画鋲のフレームのエッジに透明スライドを爪。
- ランダムに卵を含む100個のひな細胞を選択し、透明スライド上の永久的なマーカーを使用して、各ひなセルをマーク。グループ1は、異なる処理間の混乱を避けるために、恒久的なマーカーを使用して、フレームと透明スライド上の各処理の情報を書くように、これら100個のひな細胞を割り当てます。
- 3日間パートAにラベルされたフレームを返し、その後、卵を産むためにパートBに女王を転送します。
- 1日後、パートBのフレームをチェックする1つの適切なフレームを選択し、ステップ3.1.4で説明したように卵を含む100個のひな細胞を標識します。グループ2としてこれらの100個のひな細胞を割り当てます。
- 3日間パートBへの標識フレームを返し、その後、卵を産むためにパートAに女王を転送します。
- 6回パートAとパートBとの間のクイーン交換を繰り返し、数値グループを割り当て、それぞれ（ 図2）。 9基の合計があるはずです。
- 4フレーム区間に女王を制限しながら4つのフレーム（パートA）及び5つのフレーム（パートB）に健全なコロニーの9つのフレームを分割する垂直クイーン圧排を挿入します。産卵するための4フレーム部に少なくとも1つの空のフレームを残します。
- 13日目にPPN糖シロップとT reatミツバチコロニー（ 図2）。
- 1 Lの50％プラスチック蜂フィーダボックス10または100 ppm含有PPN糖シロップ（幅×長さ×H = 20センチメートルX 30センチメートル×3.5 cm）を追加し、実験コロニーにおけるフレームの上にボックスを置きます。
注意：ひな細胞が封入されているとして、グループ1は13日でPPNを受信しません。 - ステップ2.2で説明したように1 Lの50％砂糖シロップ（NO PPN）と対照群を供給する。
- 1 Lの50％プラスチック蜂フィーダボックス10または100 ppm含有PPN糖シロップ（幅×長さ×H = 20センチメートルX 30センチメートル×3.5 cm）を追加し、実験コロニーにおけるフレームの上にボックスを置きます。
- 5日目に、各グループの100個のラベルされたひな細胞の卵孵化率（ 図2）として1日齢幼虫やレコードをカウントします。ミツバチの卵は、通常、0日の幼虫に孵化するために3日かかります。そのため、チェックして、100個の卵を含む1日目にひなの細胞を標識し、孵化率の割合を得るために、5日目に、各グループのために1日齢幼虫の数を数えます。
- C11日目に各群の100個の標識ひな細胞の割合をキャッピング幼虫（ 図2）のようにキャップされたひな細胞およびレコードをount。 6〜7日齢の幼生ひな細胞は幼虫pupatingのためのミツバチの労働者によってミツロウでキャップされます。
- 蛹の成熟を観察した（ 図2）、17日目に各群の100個の標識ひな細胞の羽化率を記録します。
- 頂いたひな細胞のミツロウを外し、優しく柔らかな先端ピンセットで蛹を取り出します。各ウェルの下に実験室組織の二層を有する24ウェル組織培養プレートに蛹を転送します。
- 出現するまで34℃、70％RHのインキュベーター中で24ウェル組織培養プレートを保ちます。
- 観察し、記録蛹をし、グループ9（49実験日）まで、各グループのミツバチが登場。
注意：各処理は4つの生物学的反復配列を持っています。
- 統計
- 記録したデータを計算し、平均値として存在します±SD。
- スチューデントの両側tの検定を用いて、各グループの治療のペア間の有意差（ 例えば 、0 PPM / 10ppmで、10 PPM / 100ppmの0 PPM / 100 ppm）を分析します。 P -値<0.05かのように、統計的に有意で定義します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ミツバチのフィールドテストのために、女王が産卵するための4フレーム部に限られていました。このステップは、1つのフレーム内ひな密度を増加させ、後続の観察を容易にすることができます。各処理は標識し、そしてミツバチの開発は明らかに透明スライドで観察しました。蜂の巣でミツバチの幼虫にPPN-BLDの生体送りで正確にコロニーにおけるミツバチの開発にPPNの影響を評価するために行きました。 インビボ給餌法を使用して蜂の巣に化学処理の影響の観察を容易にしました。
PPN-BLDの各用量について、50個のひな細胞の総数は、マークと処理しました。 PPN-BLDを添加した後、処理されたフレームは、自然条件下で観察するため、元のコロニーに戻しました。幼虫の段階のミツバチのPPN-BLDの負の効果は簡単だったOBSErved。用量依存的効果が観察されました。 表1は、10および100ppmの二高用量で幼虫の段階で死亡したミツバチの数を提示します。 表1に示すように、2つの用量（0.1及び1のppm）で、キャップレートは、出現と羽化率へ日の唯一の有意に高い割合で、有意に0とは異なる（BLD食品添加）又は無給電制御なかったです1 ppmの変形翼を持つミツバチ。蛹のメラニンはPPNの低濃度で観察されました。さらに、成人ミツバチの割合は、変形翼で現れPPNの高用量（ 表1）で増加しました。
環境PPN残基に苦しんでミツバチのコロニーをシミュレートするために、全体のミツバチコロニーにPPNシロップの供給を行いました。治療前に、各コロニーをクイーンサイズexcludersによって3日間隔で9つの異なる時間的グループに分けた（FIグレ2）。したがって、孵化キャッピングおよび羽化率のPPNの影響は、自然環境と同様の条件で同時に観察しました。
コロニーは、（ 図2に赤い点線で示す）13日目で10または100 ppmのPPNとシロップを与えました。 PPN-シロップを13日目に供給し、グループ1のミツバチが蛹期にあったし、蓋をしたため、理論的には、グループ1がPPNを含まない対照でした。幼虫段階におけるミツバチは、グループ2及び3に影響を受けるようになった、そして卵が原因PPN汚染ハチの巣でより長い露光時間（ 図2）にグループ4-9に影響を受けるであろう。
この試験では、PPNシロップとミツバチのコロニーを供給し、大人のミツバチは、シロップを消費し、おそらく女王と幼虫を与えたときに、開発を観察しました。この仮定はHATCによって確認されました興、キャッピング及び図3Aに示すように、羽化率、変形翼のハチは、PPN処置後に観察された- 3D。すべてのパラメータは、孵化率（ - 3D 図3A）を除いて、グループ3から始まる高用量（100ppm以下）で有意に異なりました。また、PPN-シロップ処理後、多くの蛹は黒キューティクルまたは出現しないことにより死亡しました。 100ppmのPPN処理において、キャップされた細胞が破壊された、および損傷した蛹をコロニー（ 図3E）から除去しました。
図1： ひな細胞のラベル付けの回路図。 （A）1日齢労働者幼虫透明スライド論文で覆われ、永久的なマーカーで標識しました。 （B）は、1日齢の幼生労働者ひな細胞を標識。白い矢印は1を示し、日齢の内部ワーカー幼虫。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：PPN は、9つの実験群に比べて開始されたときのためのタイムライン。 PPNの異なる濃度は13日目（赤点線）で供給しました。処理されたコロニーは、産卵の部品Bとその逆にパートAからクイーン交換が示されているパートAおよびパートBに分けました。これは、エルゼビア16からの許可を得て再現されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
6 / 55296fig3.jpg」/>
図3： 前とテスト蜂のコロニーに1キロPPNシロップを供給した後、ミツバチの幼虫の開発。 9つのグループの合計は、この実験で調査した：（A）孵化率。 （B）キャッピングレート; （C）羽化率。および（D）不正な翼レート。平均±SDが提示されています。赤い矢印は、PPNがミツバチに作用し始めることがあり、その間の時間を示しています。黒のアスタリスクは、コントロール（0 PPM）に比べて統計的有意性を示しました。赤いアスタリスクは、10と100 ppmの間の統計的有意性を示します。 （E）は100ppm PPNシロップ処理されたミツバチのコロニーは、おそらく変形蛹及び黒変形蛹、キャップされていない細胞を示しました。これは、エルゼビア16からの許可を得て再現されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| PPN-BLD（PPM） | 幼虫号 | 幼虫開発 | ||
| キャップされた割合（％） | 羽化率（％） | 不正な形式の翼（％） | ||
| 100 | 140 | 0B | 0B | - |
| 10 | 139 | 22.2±33.2b | 0B | - |
| 1 | 140 | 72.3±17.9a | 67.7±17.6a | 7.7±5.7A |
| 0.1 | 136 | 78.3±17.5A | 75.4±22.8a | 1.4±2.8b |
| 0 | 138 | 78.9±5.4A | 78.9±5.4A | 0B |
| 非給餌 | 122 | 87.8±9.1a | 86.1±7.2A | 0.8±1.5B |
表1：1 日齢幼虫のPPNの継続的な3日間の給餌の 影響 。各幼虫のセルに、BLDの10、10および20μLを、それぞれ、3日1から加えました。各アッセイは、植民地で25-38幼虫を含んでおり、4個のコロニーを試験しました。平均値±SDを提示されています。 ANOVAは、有意な効果を示した後に、同じ列における異なる文字は最小二乗差検定（P <0.05）で有意に異なります。これは、エルゼビア16からの許可を得て再現されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
クイーン制限産卵法、クイーン交換方法は、このプロトコル内のフィールドテストのためのミツバチのグループを設定するための重要なステップです。クイーン制限産卵方法はミツバチのライフサイクルの同期が可能になります。その結果、研究者は、農薬の異なる用量での治療のための同じ年齢の1日齢幼虫を選択することができます。クイーン交換法のために、女王は、農薬及び農薬残留物の影響を評価するために、フィールドテストのためのミツバチの異なる発達段階を取得するためにパートA（4つのフレーム）とB（5つのフレーム）との間で交換しました。また、選択されたひな細胞の多数は、標識用透明スライドを使用してフィールドテストで記録しました。しかし、過剰産卵は時折卵を産む女王には不十分ひな細胞になります。したがって、空のフレームの準備には、クイーン交換法のために必要とされます。あるいは、クイーン限定産卵方法でも使用することができます蜂の巣でのテストのために異なるミツバチグループを準備します。パートA（2つのフレーム）におけるB部と女王の配置におけるA部における2つのフレームと7つのフレームにフレームの分離は、2つのフレーム内の女王によって卵を制限することができます。
in vivoでの供給方法については、PPN-BLDは、各ひなセルに添加しました。ミツバチは、シロップ16、20よりBLDの高い受諾を示しました。ミツバチの幼虫が生き残るためには、ローヤルゼリー、糖類、酵母エキス、及び蒸留水22、23で構成人工飼料に成長することができます。 BLDのブドウ糖と果糖組成物は、 試験管 21 に幼虫の生存率に影響を与えなかったため、BLDは蜂の巣でミツバチの成長のためのより安定していることでしょう。特に、供給のための新鮮なBLDの使用はまた、中に働き蜂幼虫の除外を防ぐことができます幼虫の摂食実験。また、給紙プロセス中に、穏やか供給は当初、1日齢幼虫の死を回避するために必要です。
フィールドテスト、蜂の巣で化学的に汚染されたBLDの間、時折による看護ミツバチの高い嗅覚感度に幼虫の排除を引き起こしました。糖組成が著しく平均幼虫の生存、プリ蛹幼虫重み、成人の重み、及びovariole番号21に影響を与えます。シロップは、ミツバチの幼虫に、トランスジェニック花粉又は陽性対照農薬ダイアジノンを送達するために使用された場合、作業者は、追加または汚染された食品21を含むひな細胞からのいくつかの幼虫を除去します。したがって、糖組成は注意すべきです。 1日齢幼虫の数を増やすか、テストした個々のひなセルサイトを分散させても問題が改善されることがあります。確かに、PPN-BLD処理プロセスの観察との劇的な用量依存性の影響に基づいて、PPN-BLDは、ミツバチの開発に、私たちは、看護師がひな細胞に人為的に追加BLDを削除しなかったと仮定しました。メラニンおよび蛹化24、25、26を調節増加フェノールオキシダーゼ活性におそらく蛹のPPN原因メラニン、低濃度。各ひなセル用人工栄養法の使用に基づいて、ミツバチの開発にPPN-BLDの劇的な影響は孵化の初日からPPNとの直接接触が原因である可能性があります。
供給実験で使用される化学物質の投与量は、ミツバチの巣箱から採取し、新鮮な花粉試料中の残留農薬のための調査データに基づいて設計することができます。自然環境でのコロニーの農薬汚染経路の様々なものがあります。化学汚染物質が原因送りMOTにミツバチコロニーに戻し、幼虫に摂取することができ労働者ミツバチのイオンは、最終的には幼虫の発育に影響を与えます。蜂の巣中のコロニーレベルでPPNの影響を評価するために、シロップは、ミツバチが化学物質を消費していることを確認するために最速かつ最も直接的な方法として、本研究で供給するための代わりに花粉を使用しました。花粉のコンテンツ（ 例えば 、病原体または農薬汚染）を制御することが困難であるのに対し、また、シロップの条件は、定義することができます。
フィールドの条件の下では、ミツバチのコロニーにおけるミツバチの異なる発達段階（卵、幼虫、蛹および成人のミツバチが）同じ環境要因を被ります。私たちの実験では、自然条件は、動的な環境でミツバチの開発段階での化学物質の影響を評価するためにシミュレーションを行いました。したがって、PPNの治療（13日）の後、我々はグループ1に影響を受けないキャッピング率を観察することができ、他の8つのグループで影響を受けたキャッピング率、および影響を受けた幼虫期等グループ2及び3におけるSは、これらの条件下で、コロニー全体コロニーへの化学物質の分散の経路内の真の効果は明らかです。
PPNシロップで処理されたミツバチのコロニーは、蓋をした細胞やコロニーから蛹の除去の歪みを示しました。また、蛹の広範囲メラニンは、100ppmのPPN処理で観察されました。したがって、PPN-シロップ供給方法は、蜂の巣にミツバチのライフサイクル上の化学物質の動的影響を観察することができました。この試験では、労働者や看護蜂によって取り込まれたシロップは、おそらく女王と幼虫に供給しました。確認のため、今後の研究では、さらに、化学的に汚染されたハチの巣のダイナミクスの研究を容易にするために、化学含有シロップに（例えば、食用色素など）、化学的マーカーを使用します。
看護師のミツバチの食料源は、飼料収穫機からか送られ蜂の巣と幼虫下顎とhypopharyngに来る必要があります看護師ミツバチ21、25、26、27、28によって生成EAL腺分泌。幼虫は、看護師ミツバチによって供給されたときに、下顎骨に下咽頭腺によって生成される分泌物はPPN-シロップを希釈してもよいです。この生物学的な希釈効果はより密接に自然条件に類似しているが、in vivoの供給方法に異なる結果を説明しています。他の農薬、重金属やミツバチの病原体を含むいくつかの材料が評価し、ミツバチ集団における役割に対処するため、この給紙方法にも適用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、動物の局と植物衛生検査検疫、農業委員会、行政院とグラント103から2313-B-197から002-MY3から省からの助成金105AS-13.2.3-BQ-B1によってサポートされていました科学技術（MOST）の。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Honey bee box | SAN-YI Honey Factory | W1266 | Honeybees rearing |
| Queen excluder (between frames) | SAN-YI Honey Factory | I1575 | Queen limitation |
| Queen excluder (on top) | SAN-YI Honey Factory | I1566 | Queen limitation on top |
| Bee brush | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | W1414 | clean the bees on frame gently |
| Bee feeder | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | P0219 | feed sugar syrup to colony |
| Transparent slide | Wan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40) | 1139 | Mark the larval area on the frames (Material: Polyethylene Terephthalate, PET) (Size = Length*Width*thick = 29.7 mm * 21 mm * 0.1 mm) |
| 24 well tissu culture plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | TCP011024 | Rearing pupae from extraction |
| Autoclave | Tomin medical equipmenco., LTD. | TM-321 | Make sterilized distilled deionized water (ddH2O) |
| P20 pipetman | Gilson | F123600 | Add PPN into bee larval food pool |
| Incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-550RD | Rearing pupae from extraction |
| Kimwipes | COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD | KCS34155 | Rearing pupae from extraction |
| Royal jelly | National Ilan University (NIU) | NIU | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(-)-Fructose | Sigma | F0127 | Make basic larval diet (BLD) |
| Yeast extract | CONDA, pronadisa | 1702 | Make basic larval diet (BLD) |
| Sucrose | Taiwan sugar coporation | E01071010 | Make sugar syrup for bee food |
| Pyriproxyfen (11%) | LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD. | Registration No. 1937 | Insect growth regulator (IGR) used in the experiment |
References
- Ruffi nengo, S. R., et al. Integrated pest management to control Varroa destructor and its implications to Apis mellifera colonies. Zootecnia Trop. 32 (2), 149-168 (2014).
- Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries, implications for honey bee health. PLoS One. 5, e9754 (2010).
- Lu, C. A., Chang, C. H., Tao, L., Chen, M. Distributions of neonicotinoid insecticides in the Commonwealth of Massachusetts, a temporal and spatial variation analysis for pollen and honey samples. Environ. Chem. 13, 4-11 (2016).
- Tsai, W. T. Analysis of coupling the pesticide use reduction with environmental policy for agricultural sustainability in Taiwan. Environ. & Pollut. 2, 59-65 (2013).
- Weng, Z. H. Pesticide market status and development trend (in Chinese). PRIDE. , https://pride.stpi.narl.org.tw/ (2016).
- Kevan, P. G. Pollinators as bioindicators of the state of the environment, species, activity and diversity. Agric. Ecosys. Environ. 74 (1-3), 373-393 (1999).
- Kevan, P. G. Forest application of the insecticide fenitrothion and its effect on wild bee pollinators (Hymenoptera: Apoidea) of lowbush blueberries (Vaccinium SPP.) in Southern New Brunswick, Canada. Biol. Conserv. 7, 301-309 (1975).
- Crane, E., Walker, P. The impact of pest management on bees and pollination. , IBRA. Cardiff, UK. (1983).
- Haouar, M., Decormis, L., Rey, J. Fluvalinate applied to flowering apple trees-contamination of honey-gathering bees and hive products. Agronomie. 10 (2), 133-137 (1990).
- Chauzat, M. P., et al. A survey of pesticide residues in pollen loads collected by honey bees in France. J. Econ. Entomol. 99 (2), 253-262 (2006).
- Bonzini, S., Tremolada, P., Bernardinelli, I., Colombo, M., Vighi, M. Predicting pesticide fate in the hive (part 1), experimentally determined τ-fluvalinate residues in bees, honey and wax. Apidologie. 42 (3), 378 (2011).
- Sanchez-Bayo, F., Goka, K. Pesticide residues and bees-a risk assessment. PLoS One. 9 (4), e94482 (2014).
- Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. Pesticides and honey bee toxicity-USA. Apidologie. 41, 312-331 (2010).
- Yang, E. C., Chang, H. C., Wu, W. Y., Chen, Y. W. Impaired olfactory associative behavior of honeybee workers due to contamination of imidacloprid in the larval stage. PLoS One. 7, e49472 (2012).
- Urlacher, E., et al. Measurements of chlorpyrifos levels in forager bees and comparison with levels that disrupt honey bee odor-mediated learning under laboratory conditions. J. Chem. Ecol. 42 (2), 127-138 (2016).
- Chen, Y. W., Wu, P. S., Yang, E. C., Nai, Y. S., Huang, Z. Y. The impact of pyriproxyfen on the development of honey bee (Apis mellifera L.) colony in field. J. Asia Pac. Entomol. 19 (3), 589-594 (2016).
- Dennehy, T. J., DrGain, B. A., Harpold, V. S., Brink, S. A., Nichols, R. L. Whitefly Resistance to Insecticides in Arizona: 2002 and 2003 Results. , San Antonio, TX, USA. http://ag.arizona.edu/crop/cotton/insects/wf/whiteflyresistance0204.pdf 1926-1938 (2004).
- Yang, E. C., Wu, P. S., Chang, H. C., Chen, Y. W. Effect of sub-lethal dosages of insecticides on honey bee behavior and physiology. Proceedings of international seminar on enhancement of functional biodiversity relevant to sustainable food production, ASPAC, Tsukuba, Japan, , http://www.niaes.affrc.go.jp/sinfo/sympo/h22/1109/paper_06.pdf (2010).
- Fourrier, J., et al. Larval exposure to the juvenile hormone analog pyriproxyfen disrupts acceptance of and social behavior performance in adult honey bees. PLoS One. 10, e0132985 (2015).
- Hanley, A. V., Huang, Z. Y., Pett, W. L. Effects of dietary transgenic Bt corn pollen on larvae of Apis mellifera and Galleria mellonella. J. Apicult.Res. 42 (4), 77-81 (2003).
- Kaftanoglu, O., Linksvayer, T. A., Page, R. E. Rearing honey bees, apis mellifera, in vitro 1, effects of sugar concentrations on survival and development. J. Insect Sci. 11 (96), 1-10 (2011).
- Vandenberg, J. D., Shimanuki, H. Technique for rearing worker honey bees in the laboratory. J. Apicult. Res. 26 (2), 90-97 (1987).
- Peng, Y. S. C., Mussen, E., Fong, A., Montague, M. A., Tyler, T. Effects of chlortetracycline on honey bee worker larvae reared in vitro. J. Invertebr.Pathol. 60 (2), 127-133 (1992).
- Bitondi, M. M., Mora, I. M., Simoes, Z. L., Figueiredo, V. L. The Apis mellifera pupal melanization program is affected by treatment with a juvenile hormone analogue. J. Insect Physiol. 44 (5-6), 499-507 (1998).
- Zufelato, M. S., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L., Hartfelder, K. The juvenile hormone analog pyriproxyfen affects ecdysteroid-dependent cuticle melanization and shifts the pupal ecdysteroid peak in the honey bee (Apis mellifera). Arthropod Struct. Dev. 29 (2), 111-119 (2000).
- Santos, A. E., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L. Hormone-dependent protein patterns in integument and cuticular pigmentation in Apis mellifera during pharate adult development. J. Insect Physiol. 47 (11), 1275-1282 (2001).
- Brouwers, E. V. M. Glucose/Fructose ratio in the food of honeybee larvae during caste differentiation. J. Apicult.Res. 23 (2), 94-101 (1984).
- Howe, S. R., Dimick, P. S., Benton, A. W. Composition of freshly harvested and commercial royal jelly. J. Apicult. Res. 24 (1), 52-61 (1985).
