Introduction
विवो प्रणालीगत घटक विश्लेषण में वैज्ञानिकों को सेलुलर व्यवहार को सबसे विश्वसनीय तरीके से जांचना पड़ता है। यह विशेष रूप से सच है जब जांच के तहत गतिविधि तंत्रिका तंत्र में सेल-सेल (दोनों संपर्क- और गैर संपर्क-निर्भर) संपर्कों से प्रभावित होती है, जहां झिल्ली वोल्टेज उत्तेजनात्मक कोशिकाओं के बीच संचार को गति प्रदान करता है। इन विद्युत संकेतों द्वारा एन्कोड की गई जानकारी की समझ, तंत्रिका तंत्र दोनों शारीरिक और रोग दोनों राज्यों में काम करने के तरीके को समझने की कुंजी है।
अधिकांश गैर इनवेसिव शारीरिक परिस्थितियों में सेल विद्युत गुणों का अध्ययन करने के लिए, कई आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड वोल्टेज संकेतकों को हाल ही में 1 विकसित किया गया है। ऑप्टिकल वोल्टेज सेंसर की पिछली पीढ़ियों (मुख्य रूप से वोल्टेज-संवेदनशील डाईज) के विपरीत, जीईवीआई बरकरार तंत्रिका तंत्र के विवो विश्लेषण में अनुमति देते हैं, औरउनकी अभिव्यक्ति विशिष्ट सेल प्रकार या जनसंख्या के लिए सीमित हो सकती है
जीबिजिश भ्रूण GEVIs के लिए जिम्मेदार महान क्षमता का लाभ लेने के लिए पसंद के vivo "सब्सट्रेट" में है। वास्तव में, इसकी ऑप्टिकल स्पष्टता और इसके सरलीकृत अभी तक विकासशील संरक्षित तंत्रिका तंत्र के लिए धन्यवाद, zebrafish मॉडल नेटवर्क में हर सेलुलर घटक के सीधा पहचान और हेरफेर की अनुमति देता है। दरअसल, FRET- आधारित GEVI मत्स्यस्त्री 3 के रोजगार ने एमियोथ्रोफिक पार्श्व स्केलेरोसिस (एएलएस) 4 के एक ज़ेब्राफिश मॉडल में स्पाइनल मोटर न्यूरॉन व्यवहार में पूर्व-लक्षण-परिवर्तन की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया।
विवो प्रोटोकॉल में निम्नलिखित वर्णित हैं कि कैसे न्यूरॉनल-विशिष्ट तरीके से मरमेड को व्यक्त करने वाले बरकरार zebrafish भ्रूण में रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स के विद्युत गुणों की निगरानी करना। इसके अलावा, यह दर्शाता है कि फार्माकोलॉजिकल रूप से प्रेरित चानऐसे विद्युत गुणों में जीई को भ्रुण स्वभाविक कॉयलिंग की आवृत्ति में बदलाव के साथ जोड़ा जा सकता है, स्टैरियोटाइपिक मोटर गतिविधि जो कि विकास के प्रारंभिक दौर में zebrafish के आंदोलन व्यवहार को दर्शाती है।
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Protocol
1. पीएचयूसीएममैड प्लास्मिड जनरेशन
नोट: मरमेड एक बायोसेन्सर है जिसे सीओना आंतों के वोल्टेज-सेन्सिंग डोमेन ( वीएसडी ) को जोड़कर विकसित किया गया है (अब सीओना रोबस्टा ) FRET पार्टनर फ्लोरोफोर्स यूमी-किनोको ग्रीन (एमयूकेजी: दाता) और नारंगी-उत्सर्जन वाले फ्लोरोसेंट प्रोटीन कुसाबीरा ऑरेंज (एमकेओक: स्वीकर्ता) के एक मोनोमेरिक संस्करण के साथ फॉस्फेटस (सीआई-वीएसपी) वाला 5 वोल्टेज सेंसर। इस बायोसेंसर के लिए, झिल्ली विध्रुवण द्वारा प्रेरित वीएसडी डोमेन में गठनात्मक परिवर्तन, दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट प्रोटीन की निकटता में वृद्धि, इस प्रकार उनके बीच ऊर्जा अंतरण बढ़ाना (FRET अनुपात में वृद्धि) 3 । वीएसडी प्लाज्मा झिल्ली पर बायोसेंसर के कुशल स्थानीयकरण का आश्वासन देता है। बायोसेन्सर की न्यूरोनल अभिव्यक्ति (रीढ़ की हड्डी में, संकेत दोनों इंटीरियर और मोटर न्यूरॉन्स में खोजा जा सकता है) मरमेड ऑप्शन क्लोनिंग द्वारा प्राप्त किया जाता हैZebrafish पैन तंत्रिका प्रमोटर HuC 6 के तहत एन पढ़ने के फ्रेम (ओआरएफ)
- पॉलियारेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) से मत्स्यस्त्री ओआरएफ पीएसएस 4 + मत्स्यस्त्री प्लाज्मिड 3 से पीएफयू (प्रूफरीडिंग) डीएनए पोलीमरेज़ के साथ टी 3 यूनिवर्सल प्राइमर और मरमेड स्मा आई प्राइमर (5'टीएटीसीसीसीजीजीजीटीटीसीजीएसीजीजीटीटीसीएएटीएटीएटीटीए) का इस्तेमाल करते हुए एक Sma I प्रतिबंध साइट अपस्ट्रीम सम्मिलित करने के लिए मरमेड ओआरएफ का
- निम्न पीसीआर मिश्रण का प्रयोग करें: पीएफयू डीएनए पोलीमरेज़ के 0.5 μL, 10x बफर के 7.5 μL, 10 एमएम डीएनटीपी के 1 μL, डाइमिथाइल सल्फोक्सीड (डीएमएसओ) के 2.5 μL, प्लाज्मिड तैयारी के 0.5 μL (50 एनजी) और 1 50 माइक्रोन के कुल मात्रा में प्रत्येक प्राइमर के 20-माइक्रोन स्टॉक समाधानों का μL।
- पीसीआर मिश्रण को 15 डिग्री सेल्सियस 95 डिग्री सेल्सियस तक गरम करें, 15 डिग्री सेल्सियस के लिए इसे 50 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और कुल 35 चक्रों के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर इसे 4 मिनट के लिए बढ़ाएं।
- विशिष्ट कुंद को जेल-शुद्ध करेंनिर्माता की प्रोटोकॉल के बाद, व्यावसायिक जेल शुद्धि किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद।
- निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद डीसीएन टुकड़ा को पीसीएमवी-एससी कंधे सदिश में क्लोन करें।
- ह्यूसी प्रमोटर के निम्नलिखित सम्मिलन के लिए स्मा I प्रतिबंध एंजाइम के साथ मरमेड-पॉजिटिव प्लास्मिड (पीसीएमवी-एससीएममेड नामित) को रेखांकित करें।
- अनुपालन के रूप में प्रतिबंध प्रतिक्रिया को सेट करें: स्मा I प्रतिबंध एंजाइम के 0.5 μL (10 यू), किट 10x बफर के 2 μL, और 20 μL की कुल मात्रा में प्लाज्मिड डीएनए का 5 ग्रा। 1 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं।
- निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद वाणिज्यिक जेल शुद्धि किट का उपयोग करके जेल-पचाने वाले प्लाज्मिड को जेल-शुद्ध करें।
- पीसीआर- एचयूसी प्रमोटर (पीएचयूसी), एचपीसी-विशिष्ट प्राइमरों की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, पीएफयू डीएनए पोलीमरेज़ और ज़ेबराफिश जीनोमिक डीएनए के साथ टेम्पलेट के रूप में विस्तारित करें (ह्यूसीप्रॉम-फोर्वा 1 सीलआई: 5'-जीपीएसटीसीएजीएसीएसीटीटीटीसीटीएएएजीजीजीटीसीसीए और हूकप्रोM-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) और एटीजी की एक 3,150-बीपी क्षेत्र अपस्ट्रीम फैले।
- निम्न योजना का उपयोग करते हुए पीसीआर मिश्रण को सेट करें: 0.5 एफसी डीएनए पॉलीमरेज़ की μL, 10x बफर के 7.5 μL, 10 एमएम डीएनटीपी के 1 μL, डीएमएसओ के 2.5 μL, 200 एनजी जीनोमिक डीएनए, और 1 माइक्रोन 20 माइक्रोग्राम 50 μL की कुल मात्रा में प्रत्येक प्राइमर के स्टॉक समाधान
- 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के प्रारंभिक चरण के बाद, पीसीआर मिश्रण को 15 डिग्री सेल्सियस 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें, यह 15 डिग्री सेल्सियस के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर प्राइवेट करें, और कुल 35 चक्रों के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए इसे बढ़ाएं ।
- निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद एक वाणिज्यिक जेल शुद्धि किट का उपयोग करते हुए जंक-विशिष्ट कुंद पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करता है।
- 10 μL की कुल मात्रा में शुद्ध 10 इंच के बफर के 1 एल्यूएल टीएन डीएनए लैगेज और 1 μL का इस्तेमाल करते हुए शुद्ध पीसीएमवी-एससीएमर्मैड (चरण 1.5) और पीएचयूसी डीएनए (चरण 1.7) के एक समान मात्रा में ल्यूगेट करें। 16 घंटे के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं4 डिग्री सेल्सियस
- निर्माता के निर्देशों के बाद 5 μL लगी प्रतिक्रिया (चरण 1.8) के साथ सक्षम कोशिकाओं का एक विभाज्य रूपांतरण करें।
- पीएलईसी पॉजिटिव क्लोन (पीएचयूसीएममैड) का चयन करें, जिसमें सेल आई- इको आर.वी. डबल पाचन द्वारा उचित अभिविन्यास में डाला गया है ( सैल I प्रतिबंध साइट को चरण 1.6 में प्रमोटर टुकड़ा के ऊपर से जोड़ा गया है, जबकि ईको आर.वी. प्रतिबंध साइट पीएसीएमवी-एससी प्लास्मिड के पॉलीएडेनीलाइशन क्षेत्र की पॉलीए, डाउनस्ट्रीम स्थित है)।
- अनुपालन के रूप में प्रतिबंध प्रतिक्रिया को सेट करें: सैल I और इको आर.वी. प्रतिबंध एंजाइमों के 0.5 μL (10 यू), किट 10 एक्स बफर के 2 μL, और 20 μL की कुल मात्रा में पीओएचसीएमएमआरडीएडी डीएनए की 1 ग्राम। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं। एक agarose जेल पर प्रतिक्रियाओं को चलाने।
2. भ्रूण Microinjection
- निषेचित उदाजंगली प्रकार (एबी तनाव) या Sod1-G93R वयस्क zebrafish 4 से प्राप्त एक 10 मिमी पेट्री डिश एक प्लास्टिक विंदुक का उपयोग कर।
- भ्रूण को ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) मछली के पानी में कुल्ला और तुरंत सूक्ष्म सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके 200 pg of pHuC_Mermaid प्लाज्मिड के साथ उन्हें जर्दी में सूक्ष्म डालें (माइक्रोिनेंसी प्रक्रिया के समग्र और विस्तृत विवरण के लिए, संदर्भ 7 और 8 देखें)।
- प्लास्टिक विंदुक का प्रयोग करना, भ्रूण को पेट्री डिश में ट्रांसफर करना और उन्हें 28 डिग्री सेल्सियस तक मछली के पानी में सेते रहें जब तक वे निम्नलिखित विश्लेषण के लिए वांछित विकास चरण (20-24 एच बाद के निषेचन, एचपीएफ) तक पहुंचें।
3. स्वायत्त टेल कोयलिंग विश्लेषण
नोट: 20-24 एचपीएफ भ्रूण में दवा के बिना या बिना रीलजोल के सहज पूंछ कोयलिंग व्यवहार का मूल्यांकन करें।
- एक भ्रूण को 9 0 मिमी के पेट्री डिश में मछली के पानी से भरकर 0.2% डीएमएसओ (रीलोजोल वाहन) से स्थानांतरित करें और मैन्युअल रूप से इसे दोहराएं।तेज सुझाव के साथ जौहरी के संदंश 5 मिनट के लिए भ्रूण सेते हैं
- एक 1 मिनट के वीडियो रिकॉर्डिंग के दौरान आरटी पर पूंछ कोयल का पता लगाने के लिए एक स्टिरीओमिसरोस्कोप पर एक डिजिटल कैमरा लगाया गया। 30 फ्रेम / एस के एक समय के संकल्प पर समय श्रृंखला प्राप्त करें
- प्रति टाइम इकाई झुकाव की संख्या (द्विपक्षीय और ipsilateral दोनों) की संख्या की गणना करके सहज पूंछ कोयला की आवृत्ति की गणना करें
- ड्रग रिलोजोल के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, धीरे-धीरे एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें ताकि भ्रूण को 5 एमएम रिलोजोल युक्त मछली के पानी से भरे नए 90 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित किया जा सके।
- 1 मिनट का वीडियो रिकॉर्ड करने और इसके बाद के संस्करण के अनुसार व्यवहार विश्लेषण करने से पहले भ्रूण को 5 मिनट के लिए सेते हैं।
4. लिविंग भ्रूण में मरमेड बायोसेंसर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए इमेजिंग सेटअप: डोनर और एसेप्टर सिग्नल की एक साथ जांच
- माउंट 20-24 एचपीएफ भ्रूण को 1% कम गलनांक-बिंदु agarose में मछली के पानी में माउंट करें35 मिमी कांच के नीचे इमेजिंग डिश के अंदर 37 डिग्री सेल्सियस ओरिएंट अपने पक्षों पर भ्रूण। कमरे के तापमान पर agarose स्थिर होने तक प्रतीक्षा करें
- एक उल्टे खुर्दबीन पर घुड़सवार एक उल्टे confocal के स्तर पर इमेजिंग डिश स्थानांतरण। 488 एनएम आर्गॉन लेजर लाइन के साथ रोमांचक एमयूकेजी द्वारा 20X उद्देश्य (0.7 संख्यात्मक एपर्चर, एनए) के साथ बायोसेंसर को व्यक्त करने वाले मोटर न्यूरॉन्स को पहचानें और 495 और 525 एनएम के बीच अपने उत्सर्जन को रिकॉर्ड कर रहा है।
- FRET माप के लिए, एमएकेजी को उत्तेजित करें, जो 488 एनएम लेजर लाइन के साथ, FRET जोड़ी के दाता है। द्विदिश मोड में 8,000 हर्ट्ज पर चलने वाले एक गुंजयमान स्कैनर के साथ ही, दाता (495 और 525 एनएम) के बीच और एमकेओके स्वीकर्ता (550 और 650 एनएम, एफआरईटी चैनल के बीच) द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति। यदि उपलब्ध है, तो 473 एनएम लेजर का उपयोग करें।
नोट: दाता की उत्तेजना की दक्षता थोड़ा कम हो जाएगी (9 58% के बजाय 9 3% की बजाय 85%), लेकिन स्वीकार्य का क्रॉस-उत्तेजनासाथ ही कम किया जा सकता है (47% एनएम लेजर लाइन के साथ 48% एनएम से 9% के साथ 17% से)। - फोटोटोक्सिसिटी और फ्लोरोफोरे विरंजन को कम करने के लिए, लेजर लाइन (अधिग्रहण सॉफ्टवेयर की बीम पथ विंडो पर) की शक्ति को कम करके नमूने की रोशनी को कम करता है।
- प्रयोग की शुरुआत में निर्धारित लाभ और ऑफसेट मापदंडों को पूरा करने के लिए उत्तेजना को अनुकूलित करें और पूरे सत्र में लगातार बने रहे। ऑफ़सेट सेट करने के लिए, छवि का रंग तीव्रता मूल्यों में परिवर्तित करें (क्यू लुक-अप तालिका का उपयोग करके) और लेजर बंद के साथ स्कैनिंग करते समय ऑफसेट घुंडी बारी (स्मार्ट ऑफसेट) को बदल दें ताकि पृष्ठभूमि पिक्सल में थोड़ा तीव्रता हो शून्य से अधिक स्कैनिंग के समय लेज़र पर स्विच करके, एक ही लुक-अप टेबल के साथ, संतृप्त पिक्सल से बचने के लिए सावधान रहने से, सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए लाभ गूंथ (स्मार्ट लाभ) को बदल दें।
- एक खोखले पिनहोल (2 हवादार इकाइयों) का उपयोग करना, मात्रात्मक के लिए पर्याप्त गतिशील रेंज प्रदान करने के लिए 16-बिट छवियां प्राप्त करनाई विश्लेषण करती है अधिग्रहण की गति में वृद्धि करने और फोटोबलीचिंग को कम करने के लिए औसत से बचें।
- सॉफ्टवेयर अधिग्रहण विंडो में, ड्रॉप-डाउन मेनू से 512 x 64 पिक्सल का एक छवि फ़ील्ड आकार चुनें (पिक्सेल आकार: 605 एनएम)
- अधिग्रहण मोड विंडो से, एक्सआईटी (सिंगल एक्सआई प्लेन पर एक समय चूक) ड्रॉप-डाउन मेन्यू पर क्लिक करें और एक एक्सआई प्लेन प्राप्त करके भ्रूण रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन वोल्टेज में परिवर्तन रिकॉर्ड करें, प्रत्येक 30 में एक छवि रिकॉर्ड करने के लिए अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें 1 मिनट के लिए एमएस
- एक ही न्यूरॉन में झिल्ली विध्रुवण पर रिलुज़ोले प्रशासन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, 5 माइक्रोग्राम रिलोजोल वाले मछली के पानी के अतिरिक्त 5 मिनट बाद एक नया डाटासेट प्राप्त करें।
- FRET विश्लेषण के लिए, ImageJ मैक्रो Biosensor_FRET का उपयोग करें (एकल-श्रृंखला FRET BIOSENSERS को व्यक्त करना
- टी 1 पर प्रत्येक न्यूरॉन के आधार झिल्ली FRET अनुपात का मूल्यांकन करें ((FRET मतलब - FRET पृष्ठभूमि) / (दाता मतलब - दाता पृष्ठभूमि)), जहां FRET और डॉनया मतलब की तीव्रता मतलब प्रत्येक प्रति चैनल के लिए सेल के चारों ओर खींचा गए ब्याज (आरओआई) में गणना की जाने वाली औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता है और FRET और दाता पृष्ठभूमि फ़्लोरोसेंट नमूने के बिना देखने के क्षेत्र के आरओआई में गणना की गई प्रतिदीप्ति तीव्रता का मतलब है।
नोट: प्लगइन के उपयोग का एक विस्तृत चरण-दर-चरण विवरण www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret वेबसाइट पर पाया जा सकता है। - विभिन्न प्रायोगिक मानदंडों के बीच आवृत्ति, आयाम, और विध्रुवण की अवधि की तुलना करने के लिए ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। एक अनपेक्षित छात्र की टी- टेस्ट का उपयोग करके दो समूहों की तुलना करें और पी <0.05 जब सांख्यिकीय रूप से अलग-अलग मानों पर विचार करें।
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Representative Results
पीएचयूसी पैन-न्यूरोनल प्रमोटर के नियंत्रण में एफईआरटी-आधारित मर्मेड बायोसेंसर कोडिंग अनुक्रम वाले एक अभिव्यक्ति वेक्टर, जो नर्वस सिस्टम में विशेष रूप से प्रोटीन के संश्लेषण को संचालित करता है, को माइक्रो-इंजेक्शन के माध्यम से एक सेल निषेचित अंडे में दिया गया था क्षणिक ट्रांसजेनिक भ्रूण प्राप्त करने के लिए आदेश ( चित्रा 1 , बाएं पैनल) माइक्रोिनगेनाइजेशन तकनीक को माहिर करने के बाद, मरमेड-पॉजिटिव भ्रूण का प्रतिशत 100% के करीब था। इनमें से केवल प्लाज्मा झिल्ली पर मरमेड बायोसेंसर की उचित मात्रा को व्यक्त करने वाले भ्रूण को एफईआरटी विश्लेषण / छवि अधिग्रहण के लिए माना जाता था।
स्वाभाविक coilings, मोटर प्रतिक्रियाओं है कि पूंछ की नोक 9 9 , 9 को लाने के पूर्ण शरीर संकुचन के विशेष रूप से शामिल है, 20 के स्तर पर दर्ज किए गए थे-24 एचपीएफ नियमित मछली के माध्यम में ( चित्रा 1 , केंद्र पैनल और वीडियो 1 ) और 5 सुक्ष्ममापी रीलोजोल ( वीडियो 2 ) में निम्नलिखित ऊष्मायन। ड्रग रिलोजोल द्वारा उत्पन्न होने वाली सहज-पूंछ पूंछ के आवृत्तियों में हुए परिवर्तनों के सांख्यिकीय विश्लेषण में कहीं और 4 की सूचना दी गई है।
यह जांचने के लिए कि रीढ़ की हड्डी के न्यूरॉन्स की विद्युत गतिविधि में परिवर्तन सहज-कोयल आवृत्ति में रिलुज़ोल प्रेरित परिवर्तन के आधार पर किया गया था, भ्रूण रीढ़ की हड्डी की मोटर न्यूरॉन्स में झिल्ली की क्षमता एक गैर इनवेसिव फैशन में अध्ययन की गई थी, प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने दाता / स्वीकर्ता के अनुपात, मरमेड बायोसेंसर (एफआरईटी अनुपात: चित्रा 1 , दायां पैनल) की फ्रेट जोड़ी। बायोसेन्सर को व्यक्त करने वाले प्राथमिक रीढ़ की हड्डी की मोटर न्यूरॉन्स की पहचान की गई ( चित्रा 2 ए ) और उनके बेसल सहज उत्प्रवासन गतिविधियों को दर्ज किया गया था (
चित्रा 1: प्रायोगिक प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट। सिंगल-सेल-स्टेज भ्रूण एकत्र किए जाते हैं और पैन-न्यूरॉनल फ़ैशन में मत्स्यस्त्री FRET-voltage biosensor को व्यक्त करने के लिए तुरंत पीएचयूसीएमर्माइड प्लास्मिड के साथ सूक्ष्मक्षिप्त हो जाते हैं। 28 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के साथ 20-24 एचपीएफ पर, एकल भ्रूण एक स्टीरियोमोरिक्रोस्कोप और उनके सहज पूंछ कोलिंग गतिविधि के तहत, मछली के पानी में मौजूद दवा रीलोजोल के बिना स्थानांतरित किया जाता है, वीडियो रिकॉर्ड और विश्लेषण किया जाता है। मोटर न्यूरॉन झिल्ली क्षमता में परिवर्तन को मापने के लिए एक ही भ्रूण विवो FRET विश्लेषण से गुजरता है ।Href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55297/55297fig1large.jpg" target = "_ blank"> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: मोटर न्यूरॉन झिल्ली संभावित में परिवर्तनों को मापने के लिए विवो FRET विश्लेषण में। ( ए ) रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन में FRET- आधारित वोल्टेज बायोसेंसर मरमेड के मोज़ेक अभिव्यक्ति के साथ जंगली प्रकार के zebrafish भ्रूण (ए) उज्ज्वल क्षेत्र की छवि काले बॉक्स (एससीः रीढ़ की हड्डी; एमएस: मायोसपेप्टम; एम: मायटोम) द्वारा पहचानी गई zebrafish ट्रंक के क्षेत्र को दर्शाती है। (ए) प्रतिदीप्ति संकेत पर (superimposing) खोज (बी), एक प्राथमिक रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन (पीएम) में biosensor की कुशल अभिव्यक्ति स्पष्ट रूप से कल्पना की जा सकती है। दाता (सी) और FRET (डी) चैनल का पता लगाया गया संबंधित हरी और मैजेन्टा लुक-अप टेबल (एलयूटी) के साथ दिखाया गया हैदाहिने तरफ़। सभी भ्रूण एक कपाल-टू-दुल्हन अभिविन्यास में बढ़ते हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन ( बी ) एफआरईटी अनुपात मैप एफईआरटी अनुपात को दर्शाता है जो प्रत्येक मोटर मोटर न्यूरॉन में 0.03 एस की गणना करता है। यह बेसल उत्स्फोटन विध्रुवण गतिविधि को दर्शाता है जो कि सेल से गुजरता है। मरमेड बायोसेंसर के लिए, एफआरईटी अनुपात में वृद्धि तब होती है जब झिल्ली की क्षमता बढ़ जाती है। स्केल बार = 10 माइक्रोन ( सी ) एक 1 मिनट की रिकॉर्डिंग के दौरान एक Sod1-G93R zebrafish भ्रूण के रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन में होने वाली सहज अनुमान FRET अनुपात परिवर्तन का प्रतिनिधि उदाहरण रिलुज़ोले प्रशासन स्वाभाविक विधवाओं की आवृत्ति कम कर देता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
मूवी 1:24-एचपीएफ वाइल्ड-टाइप कंट्रोल भ्रूण में स्पोन्टेनिययल टेल कोयलिंग प्रतिनिधि मछली पकड़ने वाले मछली के पानी में incubated एक 24 एचपीएफ जंगली प्रकार के नियंत्रण भ्रूण में सहज पूंछ coiling दिखा। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)
मूवी 2: 24- एचपीएफ जंगली-प्रकार के रिलोजोले-इलाज भ्रूण में स्पोंटेनिययल टेल कोयलिंग। 5 माइक्रोन रिलुज़ोल (+ आर) में incubated एक 24 एचपीएफ जंगली प्रकार के नियंत्रण भ्रूण में स्वैच्छिक पूंछ coiling दिखा प्रतिनिधि। नियंत्रण के मुकाबले, + आर भ्रूणों ने 24 एचपीएफ पर स्वैच्छिक पूंछ कोयलिंग व्यवहार की आवृत्ति में एक महत्वपूर्ण कमी दिखायी। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (रिगडाउनलोड करने के लिए एचटी-क्लिक करें।)
मूवी 3: बेसल स्वायत्त डिप्ररएवर 20 एचपीएफ में वन्य-प्रकार के जैबरीफिश भ्रूण के रीढ़ की हड्डी में प्राथमिक मोटर न्यूरॉन की गतिविधि। मरमेड बायोसेंसर इतना संवेदनशील है कि यह बरकरार भ्रूण के रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन झिल्ली की क्षमता में तेजी से बदलाव का पता लगा सकता है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)
मूवी 4: स्वाधीन डिप्ररएवर गतिविधि पेशी संकुचन के लिए युग्मित है। 20 एचपीएफ में एक जंगली प्रकार के zebrafish भ्रूण के रीढ़ की हड्डी में एक माध्यमिक मोटर न्यूरॉन सहज अभिव्यक्तिकरण से गुजरती है। इस मामले में, प्रत्येक डेध्रुवीकरण zebrafish मांसपेशियों के संकुचन से जुड़ा है, इस कार्यात्मक रूप से सिंक्रनाइज़ syncytium में इस विकास के चरण में आयोजित कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)
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Discussion
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल ने हमें zebrafish भ्रूण रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स और सहज coiling व्यवहार, सबसे प्रारंभिक स्टीरियोटाइपिक मोटर गतिविधि, जो भ्रूण के विकास के 17 एचपीएफ के आसपास दिखाई देता है और 24 एचपीएफ 10 तक रहता है के विद्युत गुणों के बीच संबंध का पता लगाने के लिए अनुमति देता है।
हमारा दृष्टिकोण शोधकर्ताओं को अखंड भ्रूण के तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपकरण के साथ प्रदान करता है, जो एक विकासशील कार्यात्मक नेटवर्क में कोशिकाओं के बीच की बातचीत की जटिलता को पूरी तरह से संरक्षित करता है। ज़ीब्राफिश भ्रूण के विवो इमेजिंग में उन्हें आसानी से कम पिघलने वाले agarose में विसर्जन के माध्यम से स्थिर कर दिया गया है। बायोसेंसर के प्रयोग से सेल झिल्ली की क्षमता में परिवर्तन का अध्ययन इस विधि के मुख्य लाभों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। कैनोनिकल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण, जहां न्यूरॉन्स को आवरणों के ऊतकों को हटाकर शारीरिक रूप से एक्सेस किया जाना चाहिए 11 , प्रक्रियात्मक हैंपरीक्षा के तहत कोशिकाओं के विद्युत गुणों को बदल सकता है। इसके अलावा, FRET- आधारित बायोसेन्सर दृष्टिकोण से सेल इलेक्ट्रिकल गुणों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है बिना एनेस्थेटिक्स ( यानी, ट्राइकेन, एक सोडियम चैनल अवरोधक) के इस्तेमाल के लिए, रसायनों के प्रशासन ( यानी, रिलुज़ोल यहाँ) से संबंधित किसी भी संभावित अशांति से बचने के लिए अनुमति देता है, जो प्रायोगिक योजना में महत्वपूर्ण हो सकता है इस पद्धति ने हमें विद्युत गतिविधि दोनों के मॉड्यूलेशन और सहज पूंछ के आवृत्तियों की आवृत्ति पर ध्यान देने की अनुमति दी, एक व्यवहारिक प्रतिक्रिया जो ज्यादातर मामलों में, एनेस्थेटिक्स के प्रशासन के बिना इलेक्ट्रोफिजिकल रिकॉर्डिंग को रोकती है। अंत में, GEVIs का रोजगार उच्चतम अस्थायी प्रायोगिक नियंत्रण प्रदान करता है क्योंकि यह एक विशिष्ट भ्रूण विकास के चरण में काम करने की अनुमति देता है। हमारे इमेजिंग / रिकॉर्डिंग सत्रों में एक बहुत ही सीमित समय खिड़की फैल गई, जिससे हमें वास्तविक समय में विभिन्न भ्रूण के विकास के चरणों की तुलना करने की इजाजत मिल सके। सबपारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग, इसके विपरीत, आमतौर पर बड़े और कम सटीक समय सीमा में आयोजित किए जाते हैं।
इमेजिंग तकनीकों के द्वारा वोल्टेज परिवर्तन को मापना, हालांकि, सिग्नल की प्रकृति के कारण आंतरिक रूप से कठिन है, जो गति में भिन्नता, आवृत्ति में, और झिल्ली क्षमता में परिवर्तन के आकार में हो सकती है। एक आदर्श वोल्टेज संवेदक को तेजी से उत्तरदायित्व, उच्च संवेदनशीलता और उच्च फोटॉन उत्सर्जन को जोड़ना चाहिए। अधिकांश फ्रेट-आधारित जीईवीआई के लिए, अनुपात परिवर्तन झिल्ली वोल्टेज विविधताओं के एक समारोह के रूप में भिन्नता है, लेकिन प्रतिदीप्ति अनुपात में परिवर्तन के आयाम कूटपूर्वक विध्रुवण घटनाओं की अवधि के साथ जुड़ा हुआ है। हाल ही में, नए जीईवीआई विकसित और लुभाई गईं, इस प्रकार प्रयोगात्मक मुद्दे, मॉडल और इमेजिंग डिवाइस के प्रकार के संबंध में सबसे अच्छी जांच चुनना संभव है।
वोल्टेज बायोसेंसर अभिन्न झिल्ली प्रोटीन हैं। जब सुसंस्कृत कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट या प्रक्षेपणजी जीवों में जी, प्लाज्मा झिल्ली के प्रतिदीप्ति-स्थानीयकृत सेंसर एक निश्चित सीमा तक होगा, जो अन्य इंट्रासेल्युलर डिब्बों में संवेदक के प्रतिदीप्ति से जुड़ा होता है- जहां प्रोटीन को गलत तरीके से समझाया जा सकता है-इस प्रकार एक पृष्ठभूमि संकेत उत्पन्न करता है जीवित जीवों में बायोसेंसर का उपयोग करने से पहले अभिव्यक्ति का स्तर और प्रत्येक निर्माण के उचित झिल्ली स्थानीयकरण को सरलीकृत प्रायोगिक मॉडल ( यानी, सेल लाइनों या प्राथमिक संस्कृतियों को ट्रांसफ़र करना) में निगरानी की जानी चाहिए।
वर्तमान प्रयोगात्मक सेटअप में, प्रोटोकॉल का एक और संभावित महत्वपूर्ण चरण ट्रांसजेनेसिस प्रक्रिया की दक्षता से प्रतिनिधित्व किया जा सकता है। यदि आवश्यक हो, तो Tol2 ट्रांसपोसन सिस्टम 12 को नियोजित करके प्लाज्मिड-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत काफी बढ़ सकता है। एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण पहलू को ध्यान में रखने की आवश्यकता है जो दाता फ्लोरोफोरे में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की हानि और FRET सिग में नुकसानतीव्र रोशनी के कारण इमेजिंग सत्र के दौरान होने वाली नल। नमूने के रोशनी को कम करके, प्रयोग की जाने वाली लेजर लाइन की शक्ति को कम करने से इसे टाला जाना चाहिए। इसी तरह, फोटोटल्टीप्लियरों के लाभ और ऑफसेट को ध्यान से प्रत्येक रिकॉर्डिंग सत्र की शुरुआत में अधिग्रहीत चित्रों में सर्वोत्तम संकेत-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के साथ-साथ संतृप्त पिक्सल से बचने के लिए ध्यान से देखते रहना चाहिए। इन सभी मापदंडों की जांच की जाने वाली सेल के प्रकार, बायोसेंसर की विशेषताओं और छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किए गए उपकरणों (व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का इस्तेमाल हाल ही में वर्णित 13 के रूप में भी किया जा सकता है) के आधार पर भिन्न हो सकता है। शोधकर्ता को हमेशा विचार करना चाहिए, कि विवो इमेजिंग के दौरान, शोर स्तर इन विट्रो रिकॉर्डिंग से अधिक सेंसर के विशिष्ट सिग्नल में हस्तक्षेप कर सकता है। अंत में, यदि उपलब्ध है, तो उत्परिवर्ती जांच का उपयोग कर नियंत्रण माप, जो वोल्टेज का जवाब नहीं देते, एक सुविधाजनक तरीका होगासिस्टम-विशिष्ट शोर और / या कलाकृतियों के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए
जेब्राफिश भ्रूण का रोजगार इस दृष्टिकोण की एक प्रमुख विशेषता का प्रतिनिधित्व करता है, जो आनुवांशिक हेरफेर और सूक्ष्म जांच के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के लिए धन्यवाद करता है। वास्तव में, ये विशेषताओं क्षणिक transgenesis और न्यूरॉनल विद्युत गुणों के FRET- आधारित विश्लेषण संभव है। हमारे विचार में, सर्वश्रेष्ठ अनुकूल प्रमोटर और बायोसेन्सर संयोजनों के साथ, यह संभवतः संभव है कि किसी भी सेल प्रकार के ब्याज की विद्युत गतिविधि का चयन करने के लिए और भ्रूण संबंधी प्रोटोटाइप के साथ ऐसी गतिविधि को समानांतर करने के लिए संभवतः विश्लेषण किया जा सके।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 | |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 600389 | |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | ||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 | |
| Universal SmaI primer | Eurofins | ||
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 240228 | |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| 35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 | |
| forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F | |
| Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX | |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | ||
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | ||
| Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | |||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
References
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515 (2016).
- Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879 (2015).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).
- Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566 (2016).
