Summary
本論文では、遺伝子操作された細胞およびプログラマブル材料表面を制御し、操作するために、合成遺伝子操作大腸菌を有効に官能基化表面を開発するための一連のプロトコルを提示します。
Abstract
私たちは、操作された細胞は、官能面の材料特性を制御することを可能にする非生物的・生物インタフェースを開発しました。 大腸菌細胞の合成的に操作された株と官能物質界面このシステムは、二つのモジュールを作成することによって行われます。この論文の中で、私たちの詳細遺伝的分子クローニング戦略を用いて、 大腸菌株内で選択行動を操作するためのプロトコル。化学誘導物質にさらされたときに一度開発し、この株はビオチンのレベルの上昇を生成します。セル合成ビオチンに応答することができ、それぞれが2つの異なる官能化表面を作成するために加え、我々詳細プロトコル。まとめると、我々が操作された細胞は、非生物の基板上に材料組成およびアセンブリを制御することを可能にリンクされ、非生物的・生物システムを作成するための方法論を提示します。
Introduction
ここでは、操作された細胞株からの化学信号に応答することができるプログラム可能な基板を開発するための手順を報告しています。 1我々は、合成的に操作された大腸菌（E. coli）細胞によって産生されるビオチンに応答ビオチン-ストレプトアビジンのインタフェースを作成することによってこれを行います。以前は、プログラム可能な表面は、毒素検出2と防衛・安全保障へのポイントオブケア診断3からのアプリケーションの広い範囲のために設計されています。プログラム可能な表面は、センサやアクチュエータとして有用であり得る4が、それらは異なる環境課題に適応する能力でそれらを持たせることにより、「よりスマート」にすることができます。対照的に、 大腸菌なども簡単な微生物は、固有の適応性を有しており、洗練された、多くの場合、予期しない溶液でのチャレンジに応答することが可能です。この適応性は、Eを有効にしていますその複雑な遺伝子ネットワークによって制御される大腸菌集団は、費用対効果的にするために資源を求め、5は高付加価値製品、6、さらには電力マイクロスケールのロボットを作成します。 7プログラム可能な表面の使用で生細胞の適応の利点を結合することによって、我々は、異なる環境条件に対応できるスマートな基板を作成することができます。
合成生物学は生物の動作をプログラムするために研究者に新しい能力を与えています。新しい遺伝子調節ネットワークを含むように細胞を操作することによって、研究者は、プログラムされた行動の範囲を示す細胞を設計することができます。 図8に示すように 、基礎研究を超えて9、これらの行動は、このような材料のアセンブリを制御し、生物学的に付加価値製品を製造するような用途に使用することができます。我々はアンに合成生物学のツールを使用する方法10ここで、私たちの詳細誘導時にビオチンを合成する大腸菌株をgineer。この株は、プラスミド、pKE1-のlacI-のbioBを組み立てるために、制限酵素クローニング法を使用して開発されました。このプラスミドは、 大腸菌 K-12株MG1655に形質転換されたときに、bioBのレベルの上昇を発現する能力、ビオチン合成に必須の酵素で細胞を付与します。形質転換された細胞は、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導し、ビオチン前駆体、デスチオビオチン（DTB）で提供された場合には、ビオチンのレベルの上昇を作製しました。
ストレプトアビジンとビオチンの結合相互作用は、自然界に見られる最も強い非共有結合の一つです。このように、ビオチン - ストレプトアビジン相互作用は、両方のよく特徴付けられ、非常にバイオテクノロジーに採用します。 図11は、この原稿の中で、我々は、官能表面と細胞産生ビオチンを感知し、検出するために、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用を利用する2つの戦略を提示します。我々「間接的」と「直接」の制御方式として、これらの対照的な面を参照してください。間接的な制御方式では、セル生産ビオチンコンジュゲートとの結合部位をストレプトアビジンポリスチレン表面上に固定化されたビオチンと競合します。また、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）とコンジュゲートされています。 HRPは3、3 '、5、5'-テトラメチルベンジジン（TMB）は、450nmで（OD 450）での分光吸光度（ すなわち 、光学密度）を定量することによってモニターすることができる光信号12を生成するように修正します。このように、間接的な制御方式は、研究者がOD 450信号のattentuationを監視することにより、細胞産生ビオチンを測定することができます。
直接制御方式は、材料表面に直接ストレプトアビジンを固定化し、結合部位をストレプトアビジンのために競争するために、セル生産ビオチンおよびビオチン化HRPを可能にすることにより、ストレプトアビジン - ビオチンイベントを利用します。ここでも、細胞産生ビオチンの相対レベルは、OD 450の信号を測定することによって監視されています。
まとめると、遺伝子操作された細胞と官能基化表面は、私たちが生きている細胞内でネットワークを誘導することによって、プログラム可能な表面の特性を制御することができます。言い換えれば、私たちは一緒に、これらのシステムを連携することにより操作材料界面の生物の適応性と信頼性と仕様を活用するシステムを作成しました。
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Protocol
1.メディアと文化の準備
- 脱イオン（DI）水1 Lを含むLB粉末の株式の25グラムを混合し、滅菌する20分間121℃で溶液をオートクレーブでLB培地（LB）メディアを準備します。
- 、LBプレートを準備滅菌前のLB培地に15gの寒天（1.5％）を追加するには
- DI水で1,000倍カルベニシリン（CB）（50 mg / mlで）のストック溶液を準備します。
- 耐性形質転換体の選択のための抗生物質を含んでいるLB培地を準備する場合は、滅菌LB培地の温度が60℃以下になるまで待ってから、すべての1 mLのLBのメディアのための抗生物質の在庫の1μLを追加します。
- 5×M9塩（56.4グラム/ L）、1 MのMgSO 4、1 M CaCl 2を、20％グルコース、2％ビオチンフリーカザミノ酸：M9最少培地（表1）については、以下の別々のストック溶液を調製します。
- オートクレーブ安全なボトルでは、5×M9塩20mLのを組み合わせて、200＆＃181; 1MのMgSO 4、1MのCaCl 2の10μL、20％グルコース、2％のビオチンフリーカザミノ酸を1mL、およびDI水76.8ミリリットルの2ミリリットルのL。
- 20分間121℃で、ステップ1.2.1で調製した溶液をオートクレーブ。
- 400rpmで攪拌しながら37℃ですべての文化をインキュベートします。インキュベーション時間は、実験やひずみに応じて変化するが、通常、8〜12時間続きます。
ビオチン産生大腸菌の2世代（プラスミドpKE1-のlacI-のbioB）
注：原因のtetRリプレッサータンパク質の不在に構成的発現をもたらすlacIリプレッサー 、P Lによって駆動される、のtetO-1プロモーター、ならびにPのTRC-2を含むビオチン発現システム：遺伝回路は、2つの部分が含まれていますプロモーターは、bioBのの発現を駆動する強力なリボソーム結合部位（RBS）が続きます。すべてのクローニングは商用、急速に分裂大腸菌ストラで実行されましたで。最終構築物は、テストのために、大腸菌 MG1655WTに形質転換しました。プライマー（ 表2）は 、商業的に購入しました。
- 全細胞ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行うことにより、大腸菌ゲノム由来のbioB遺伝子を単離します。
- 37℃で一晩、大腸菌 MG 1655WT細胞を成長させます。
- 0.2mLのPCRチューブでは、滅菌DI水の9μLとステップ2.1.1で製造した一晩培養物1μLを兼ね備えています。
- サーモサイクラー中で95℃で5分間チューブをインキュベートし、直ちに細胞を溶解するために10分間、-80℃の冷凍庫にチューブを移します。これは、PCRの鋳型として機能するゲノムDNAを可能にします。
- （ⅰ）2.5μLnBioB2-f1とnBioB2-Rの各プライマー、解決策を解凍し、追加（ii）の5 5倍DNAポリメラーゼ緩衝液のμL、（iii）のDNAポリメラーゼの0.25μL、（iv）のdNTPミックスの0.5μL 25μLの総反応容量のためのDI水、および（v）は6.75μL（ 表4）。
- その内容物を混合すること（ すなわち 、フリック）チューブの側面に当たります。次に、すぐにサンプルがチューブの底にあることを確認するために（〜2秒）すぐにチューブをスピンダウン。
- PCRサーモにチューブを置き、プロトコルの開始時に95℃で3分間の追加のステップと、表3に記述されたプログラムを使用します。
- トリス塩基、酢酸、EDTA緩衝液（TAE）に - （DI水+エチジウムブロマイドで1.2％アガロース1.0）ゲル電気泳動を用いてPCRの成功を確認してください。 PCR産物は、1070塩基対（bp）の長さでなければなりません。
- ステップ2.1.7からゲルからDNA断片を抽出するために、製造業者の指示に従って市販のキットを使用してください。
- P TRC-2プロモーターおよびプラスミドpKDL071 13（MITのジェームズ・コリンズのラボの礼儀）からのlacIオペロンを分離します：
- 含む大腸菌細胞を成長させます37℃でLB + Cbの中で一晩pKDL071プラスミド。
- 製造業者の指示に従って商業ミニプレップキットを用いて細胞からプラスミドDNAを抽出します。プラスミドをPCRの鋳型として機能します。
- ステップ2.1.4からのPCRプロトコルに従ってください。 2.1.8へ。以下の変更を加えました：
- ステップ2.2.2でのプラスミド抽出物で溶解した細胞を交換してください。
- 2.5μLの1-fおよびlacIリカセット抽出のための1-Rプライマーのそれぞれを使用してください。代わりに、2.5μLnBioB1-fおよびP TRC-2抽出のためのnBioB1-Rの各プライマーを使用しています。
- PCR産物は、lacIリカセットとP TRC-2プロモーター部位であることを確認するため、ゲル電気泳動（ステップ2.1.7）を実行します。彼らは、それぞれ1213 bpおよび109 bpの長さであるべきです。
- 含むbioBのカセットを構築するためにオーバーラップ伸長（SOE）PCRによりスプライシングを使用してP TRC-2、プライマーnBioB2-F2で合成リボソーム結合部位（RBS）、およびbioBの 、表3に見られます。
- ベクターを消化することによってpKE1-MCSプラスミドベクター13バックボーン（MITのジェームズ・コリンズの研究室提供）への構築物（P L、のtetO-1 + のlacIおよびP TRC-2 + のbioB）を挿入し、制限酵素で挿入します。
- 制限酵素およびゲル電気泳動を用いて遺伝子を抽出します。各反応は、（i）10×反応緩衝液の5μL、制限酵素1の（ii）の1μL、（iii）の制限酵素2の1μL、DNAの（iv）の少なくとも1μgの、および（v）のDI水にが含まれています50μL（ 表5）への最終的なボリュームをもたらします。 lacIリカセットのための酵素をAatII及びEcoRIでとbioBのカセットのための酵素HindIIIおよびSacIIで消化。
- 反応が組み立てられた後、すぐに37℃で1時間インキュベーションする前に、短時間の遠心分離（約2秒）ボルテックス。
- 間に消化は、標準的なプロトコルに従って電気泳動用ゲルを準備します。
- ゲル電気泳動6×ローディングバッファーで消化したDNAを兼ね備えています。
- 所望の構築物の位置を確認するために、2対数ラダーを使用してゲルからDNA断片を切断し、ゲルからDNA断片を抽出し、製造業者の指示に従って商用ゲル抽出キットを使用します。
- 分光法を用いてDNAを定量し、0ボリュームを計算する：式1を使用してベクトルにインサートの1モル比：1,1：1、及び3：
式（1）
式1において、Mは、ベクターへのインサートの比である（0,1、または3）、X iは、挿入DNAの量である、BP iは塩基対の挿入の長さ、塩基対vはベクトルの長さであります塩基対であり、X vはベクトル（50 NG）の量です。 - （ii）は、1μLの10×リガーゼ緩衝液（I）組み合わせることにより、ライゲーション反応ミックス1μLT4リガーゼ、（iii）は50 ngのベクターDNA、（iv）の10μL総反応容量（ 表6）に各反応に特有のインサートDNA、及び（v）のDI水の塊。
- 1時間室温（RT）でインキュベートします。
- ステップ2.7でのライゲーションインキュベーションの間、化学的コンピテント細胞を準備します。
- 1.5 mL遠心チューブに一晩培養物のアリコート1ミリリットル。
- 1分間16,200×gで遠心分離します。
- 上清を除去し、（氷上で）チルドの200μLの100mMのCaCl 2でペレットを再懸濁。軽くピペッティングしてペレットを再懸濁。 ボルテックスしないでください。
- 氷上で10分間マイクロ遠心チューブを置きます。
- 遠心分離は、上清を除去し、冷却し、100mMのCaCl 2を100μLにペレットを再懸濁し、再びチューブを氷上に置きます。
- 遠心分離管の最終時間とチルドの100mMのCaCl 2の50μLにペレットを再懸濁します。
- 場所氷上のチューブと、すぐに化学的コンピテント細胞を使用しています。
- ステップ2.8で調製したコンピテント細胞の各チューブに、ステップ2.6および2.7で調製した連結DNAの5μLを、追加。
- 側（フリック）チューブを叩いてチューブを軽く撹拌し、その後30分間氷上でチューブを置きます。
- 熱は42℃で45秒間のチューブに衝撃を与え、2分間氷にチューブを返します。
- ピペット細胞選択的LB寒天+抗生物質プレート上ガラスメッキビーズを用いて細胞を広げます。
- 37℃で一晩培養します。
- 翌朝は、インサート陽性プレートからコロニーを選ぶ（ すなわち 、1：1と3：1のプレート）。 1ネガティブコントロールプレート全く成長を示さない、または0の場合5-8コロニーをピックアップ：：0があれば3個のコロニーを選ぶ1プレートは、いくつかの成長を持っています。抗生物質5mLのLB +を接種し、攪拌しながら37℃で8時間増殖する選んだコロニーを使用してください。
- miniprを用いて、細胞からプラスミドDNAを抽出EPキットを、製造業者の指示に従って。 （ステップ2.4.1で詳述同じ手順に従って。）の制限酵素を使用して、テストカットを行います。
- 正しい構築物から予想される結果で消化したDNA断片の長さを比較することによって、成功した構築物で細胞を識別します。成功したプラスミド構築物を保有する培養物（DI水中）滅菌濾過し、40％グリセロール溶液を等量の培養物を混合し、-80℃で混合物を凍結することによって保存することができます。
注：他の大腸菌株（ すなわち 、MG1655WT）へのプラスミドのトランスフォーメーションは、化学的コンピテント細胞を作製するための上記の手順に従うことによって達成することができます。
式（1） 3.セルのキャラクタリゼーション：成長曲線および用量反応
- 適切な抗生物質を一晩LB培地に操作された株を成長させます。
- 成長曲線の場合は、0.5 M sからIPTGとない最小限のM9培地（50mLのを準備タック）および/またはDTB（）を500μg/ mLのストックから、次のように：
- 0 ngの/ mLのDTB（株式の0μL）/ 0 mMのIPTG（株式の0μL）を準備します。
- 200 ngの/ mLのDTB（株式の200μL）/ 0 mMのIPTG（株式の0μL）を準備します。
- 0 ngの/ mLのDTB（株式の0μL）/ 0.5 mMのIPTG（株式の50μL）を準備します。
- 200 ngの/ mLのDTB（株式の200μL）/ 0.5 mMのIPTG（株式の50μL）を準備します。
- 1で一晩培養物を接種する：上記で指定したメディアで100。
- 96ウェルプレート、培養物のアリコート200μLで、トリプリケートで、各ウェルに。
- OD 600プレートリーダーで、37℃で連続振とうインキュベーションと5分ごとに24時間以上を測定します。
- 用量応答研究のために、リアルタイム光定量化のためのmCherryを持つpKE1-のlacI-bioBの中のbioB遺伝子 （赤色蛍光タンパク質）を交換してください。
- 0.1ミリモルの発現を誘導する5 mMの範囲のIPTGの量を変化させる追加LB培地インチ
- 100：1の希釈で一晩培養して接種します。
- 蛍光を15時間30分毎に測定します。
操作された細胞と上清の準備からビオチン産生を誘導する4
- LB培地中で一晩大腸菌 MG1655株にpKE1-のlacI-のbioBを成長させます。
- DTBは30から200 ngの/ mLの範囲でM9培地を補います。
- ビオチンの合成を誘導するために0.5mMのIPTGを追加します。
- 1：100希釈での一晩の培養で補足し、ビオチンフリー最小限のM9培地に接種。
- 成長の24時間後、遠心分離細胞とビオチンに富む上清を収集します。
- 間接制御と直接制御官能基化表面を有するビオチンに富む上清を測定します。ステップそれぞれ5.23と6.12、中のビオチンのサンプルの代わりに上清を使用してください。
5.間接制御方式官能表面調製
- 目を準備e。次のソリューション。
- ジメチルスルホキシド（DMSO）中の20mg /スクシンイミジルトランス-4- mLの（マレイミジルメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）からなるSMCC溶液を調製します。
- 20 MgからなるSPDP溶液を調製/スクシンイミジル3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネートDMSO中の（SPDP）のミリリットル。
- DMSO中の20mg / mLのLC-LC-ビオチンを準備します。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に10mg / mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を準備します。
- PBS中の10mg / mLのストレプトアビジン（SA）を準備します。
- PBS中10mg / mLのウシ血清アルブミン（BSA）を準備します。
- DI水中の100mMジチオトレイトール（DTT）を準備します。
- PBS中の5 mMのethylenediaminetetaacetic酸（EDTA）を準備します。
- PBS中の0.5％カゼインを準備します。
- DI水中で20％のTween 80の在庫を準備します。
- PBS中の0.05％のTween 80（20％ストックから）を準備します。
- DI水中の酢酸ナトリウムの50 mMのを準備します。
- DMSO中の1％のTMBを準備します。
- 3％H 2 O 2 Iを調製n個の脱イオン水。
- DI水中で2 MH 2 SO 4を準備し ます。
- 20μLSA溶液にSPDP溶液の1.4μLを追加します。
- 光への暴露を避けるために、アルミホイルで包み、室温で1.5時間、5.2からの溶液をインキュベートします。このステップは、SPDP架橋剤はピリジルジチオ活性化SAを形成するアミノ基を介してSAに結合することができます。
- ステップ5.3からソリューションへのDDT溶液を2.4μLを加え、室温で1時間インキュベートします。これは、スルフヒドリル活性化SAで、その結果、ピリジン-2-チオンの切断を可能にします。
- 72μLのHRP溶液に7.5μLSMCC溶液を添加し、光への暴露を避けるために、アルミホイルで包んでRTで1.5時間、インキュベートします。これは、アミノ基によって結合されたマレイミド活性化HRPをもたらします。
- 200μLのBSA溶液で17μLLC-LC-ビオチン溶液を混合し、光への露出を避けるために、アルミホイルで包んでRTで1.5時間、インキュベートします。このステップは、共役トンにビオチンを可能にしますアミド結合を介して、BSAがo。
- スピンチューブ内で遠心濃縮を分離するための手順5.4、5.5および5.6からのソリューションを転送します。
- ステップ5.4からSA-SPDPを含むチューブについては、万×gで遠心分離管容積が100μLに達するか、16分間まで。 PBS-EDTAで500μLにスピンチューブを埋めます。
- 手順を繰り返し5.8 5回。 4℃での在庫を保管してください。
- ステップ5.5からHRP-SMCCを含むチューブについては、万×gで遠心分離容量は25μLに達するか、16分間まで。 PBSで500μLにスピンチューブを埋めます。
- 手順を繰り返し5.9 5回。 4℃での在庫を保管してください。
- ステップ5.6からのBSAビオチンを含むチューブについては、万×gで遠心分離器容積が100μLに達するか、12分間まで。 PBSで500μLにスピンチューブを埋めます。
- 手順を繰り返し5.10 4回。
- ボリュームは100μLに達するまで万×gで遠心分離または12分間。チューブに100μlのPBSを追加します。 4℃での在庫を保管してください。
- 4℃で一晩を10mg / mL SA溶液及び店の25μLとの10mg / mLのHRP溶液25μLを追加します。これは、SAがチオエーテル結合を介してHRPと共役になるようになります。
- 4℃の冷蔵庫で一晩溶液と、ストアと4作業溶液：1を準備します。 -20℃で保存残りの溶液。
- PBSの490μLにBSA-ビオチン株式（または10μLBSAストック）の10μLを追加することにより、PBS中のBSAビオチン（またはBSA）からなる二つの溶液を準備します。
- ステップ5.12から96ウェルポリスチレンプレートの各ウェルに溶液100μLを加えます。
- ホイルで包んで1時間、37℃でプレートをインキュベートします。
- 0.05％のTween 80でプレートのウェルを洗浄します。
- ウェルに0.05％PBS-Tweenで80の200μLを追加します。室温で2分間インキュベートします。液体をデカントします。 <LI>の手順を繰り返し5.15.1 3回。
6.ダイレクト制御方式官能表面調製
- 次の溶液を準備します。
- DMSO中の20mg / mLのLC-LC-ビオチンを準備します。
- PBS中の10mg / mLのHRPを準備します。
- PBS中に0.17μgの/ mLのSAを準備します。
- PBS中の0.5％カゼインを準備します。
- DI水中で20％のTween 80の在庫を準備します。
- PBS中の0.05％のTween 80（20％ストックから）を準備します。
- DI水中の酢酸ナトリウムの50 mMのを準備します。
- DMSO中の1％のTMBを準備します。
- DI水中で3％のH 2 O 2を準備します。
- 準備2 MH 2 SO 4 インチ
- 72μLのHRPに7.5μLLC-LC-ビオチンを追加し、光への暴露を避けるために、アルミホイルで包んでRTで1.5時間、のためにインキュベートします。このステップは、アミド結合を介して、HRPにコンジュゲートするために、ビオチンを引き起こします。
- スピンチューブ内に遠心濃縮にステップ6.2からの溶液を移し
- 遠心分離万×gでソリューションボリュームは100μLに達するか、12分間まで。 PBSで500μLにスピンチューブを記入し、遠心分離し、PBSの添加4回繰り返します。 4℃での在庫を保管してください。
- 96ウェルポリスチレンプレート内の各ウェルに6.1.3からSA溶液100μLを加えます。
- ホイルで包んで1時間、37℃でプレートをインキュベートします。
- 0.05％のTween 80でプレートのウェルを洗浄します。
- ウェルに0.05％のTween 80の200μLを追加します。室温で2分間インキュベートします。液体をデカントします。
- 6.6.1 3回繰り返します。
- 96ウェルプレート中の各ウェルに0.5％カゼイン溶液200μLを追加します。
- 37℃で1時間プレートをインキュベートします。
- 繰り返しステップ6.6 3回、ウェルを洗浄します。
- ステップ6.3で調製した溶液を用いて、1：10,000ビオチンHRP株式1に希釈します。
- 96ウェルプレートの各ウェルに、ステップ6.10で調製した溶液の80μLを加えます。
- ポリスチレンプレートの各ウェルに準備されたビオチンサンプルの20μLを追加します。 4.6で調製した上清を、この段階でのビオチンサンプルとして使用することができます。
- 37℃で1時間プレートをインキュベートします。このステップでは、競争力が固定化されたSAの結合部位のための無料のビオチンおよびビオチンHRP間の結合を可能にします。
- ウェルを3回洗浄する手順を繰り返し6.6。
- 10：1の比（20mLの総容量）の50mM酢酸ナトリウム溶液、1％のTMB溶液を、1000で、3％H 2 O 2溶液を混合します。
- ステップ6から溶液200μLを追加します。各ウェルに15とホイルで覆い、室温にて15分間インキュベートします。
- 反応を停止するために各ウェルに2 MH 2 SO 4溶液50μLを追加します。プレートリーダーを用いてOD 450を測定します。
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Representative Results
代表的な結果を伴う5図に示されています。読者が視覚的に合成操作されたE. coli株を作成するための重要なステップに従うことができるように、まず、我々はグラフィカルにクローニングプロセス（ 図1）を提示します。細胞集団動態を特徴付けるために、我々は、集団の600ナノメートル（OD 600）での光学密度を測定することによって生成された成長曲線（ 図2）を提供します 。そして、私たちは私たちは、光学的にIPTGで誘導時に細胞によって産生されることになるのbioBの相対量を測定することを可能にする、bioBのためのプロキシ（ 図3）としてmCherryをを使用することにより、調節遺伝子ネットワークが検証される方法を示しています。次に、我々は間接制御とダイレクト制御官能基化表面のための応答データを提示します。これらのデータプロット（ 図4）は、遊離の測定された溶液を使用して開発しました。官能化された表面の応答プロファイルを特徴付けるためのビオチン。最後に、操作された細胞は、それによって官能化面を修正する、ビオチン（ 図5）を生成するように誘導される方法を示す特性データを提示します。
図1：誘導性の設計と構築、操作された細胞。 （A）プライマーは、ビオチン合成経路において重要な酵素をコードする大腸菌ゲノムからのbioB遺伝子を単離するために設計しました。 （B）P L、のtetO-1 -lacI及びP TRC-2配列は、対応するプライマーを用いて遺伝子トグルスイッチを含むプラスミドから単離することができます。 （C）抽出のbioB遺伝子トグルスイッチからの2つのフラグメントを、次いで、遺伝子回路を作成するために使用することができます。その後、indはできIPTGを添加DTBはbioBのための基質として追加されたときのbioB、それによってビオチン合成の発現をUCE。 （D）組み立てられたプラスミドを、K-12 MG1655 大腸菌に形質転換しました。これは、DTBを基質としたときに操作された細胞株によってのbioB、それによりビオチン合成の発現を誘導するIPTGの存在に起因します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：操作細胞の成長曲線。工学的、誘導性MG1655野生型細胞を成長させ、最少培地（ すなわち 、ビオチンを含まないM9培地）、ならびに最小培地DTBを補った（200 ngの/ mL）および/またはIPTG（0.5 mM）の中でモニターしました。プロットは、すべての5マイル測定OD 600読み取りを示し、 24時間のn。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：エンジニア遺伝子ネットワークをテストします。蛍光タンパク質mCherryをの代わりに使用しました bioBの遺伝子操作された細胞は、IPTGで誘導したときに我々は、光学的に誘導プロファイルを測定することができるように。私たちは、IPTG（ブルーダイヤモンド）で誘導していない細胞でIPTG（赤い菱形）で誘導された細胞を対比します。これらの結果は、誘導性遺伝子ネットワークの有効性を実証します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図4：官能素材インタフェースの検証。ビオチンの様々な濃度に私達の官能化された表面を曝露することによって、我々は、OD 450の吸光度を測定することにより、光学応答を測定することができます。これらの結果は、対応の光強度にビオチンの濃度を結ぶ、私たちは、較正曲線を作成することを可能にします。ここでは、間接的な（左）と、直接（右）表面機能化方式の両方の光信号曲線対ビオチンを提示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：操作された細胞は、素材インタフェースを制御します。プロトコルセクション5または6を利用することによって、我々は、誘導され、操作されたCの製品を使用することができ化学的に機能面を修正するells。私たちは、OD 450を測定することにより、光学的にこれらの応答を監視することができます。また、図4に開発された検量線を用いて、我々は濃度内ビオチンに対する応答の光強度をリンクすることができます。ここでは、野生型細胞（白）、pKE1-のlacI-bioBのプラスミド（オレンジ色）を含む非誘導細胞、およびpKE1-のlacI-のbioBを含む誘導された細胞のための当社の間接的な制御方式官能面で測定された別のビオチン濃度を、提示しますプラスミド（灰色）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 化学物質 | 最終濃度 | 量 |
| 5倍M9塩 | 1倍 | 20 mLの |
| 1 MのMgSO 4 | 2 mMの | 200μL |
| 1 MのCaCl 2 | 0.1 mMの | 10μL |
| 20％グルコース | 0.40パーセント | 2 mLの |
| 2％ビオチンフリーカザミノ酸 | 0.02％ | 1 mLの |
| DI水 | N / A | 76.8 mLの |
表1：M9メディアのレシピ。
| 名 | プライマー配列 | 使用法 | |
| 1-F | CCGCCGGAATTCTCCCTATCAGTGATAGAGATT | lacIリカセット抽出 | |
| 1-R | C言語CGACGTCTCACTGCCCGCTTTCCAGTC | lacIリカセット抽出 | |
| nBioB1-F | CCCAAGCTTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCAT | P TRC-2抽出 | |
| nBioB1-R | GGGGGGTTCTTTTAATAAAGGTACCGTGTGAAATTGTT | P TRC-2抽出 | |
| nBioB2-F1 | ACCCCCCTAAGGAGGTCATCATGGCTCACCGCCCACG | bioBの抽出 | |
| nBioB2-R | TCCCCGCGGTCATAATGCTGCCGCGTTGTAATATTC | bioBの抽出 | |
| nBioB2-F2 | ACGGTACCTTTATTAAAAGAACCCCCCTAAGGAGGTCATC | 合成RBSの追加 | |
表2：プライマーのリスト。
| ステップ2 | ステップ3 | ステップ4 | ステップ5 | ステップ6 | ステップ7 | ステップ8 | ステップ9 | |
| 98°C | 98°C | 70°C | 72°C | 98°C | 60°C | 72°C | 72°C | 4°C |
| 0時30分 | 0時10分 | 0時30分 | 01：00 /キロバイト | 0時10分 | 0時30分 | 01：00 /キロバイト | 2：00 | ∞ |
| 12回繰り返します | 25回繰り返します | |||||||
| -1 C /サイクル° | ||||||||
表3：PCRプログラム。
| 名 | ボリューム |
| 細胞溶解物（テンプレート） | 10μL |
| プライマー（それぞれ） | 0.625μL（各） |
| 5×Q5バッファ | 5μL |
| Q5ポリメラーゼ | 0.25μL |
| dNTPミックス | 0.5μL |
| DI水 | 6.75μL |
表4：全細胞PCR反応（25μL）。
| 名 | ボリューム |
| 10X反応緩衝液 | 5μL |
| 酵素1 | 1μL |
| 酵素2 | 1μL |
| テンプレートDNA | 1μgの |
| DI水 | 43μL - DNAの量 |
表5：制限酵素消化反応（50μL）。
| 名 | ボリューム |
| DNA | 50μgのベクトル+ Xμgの挿入 |
| 10×リガーゼバッファー | 1μL |
| T4リガーゼ | 1μL |
| DI水 | 8μL - DNAの量 |
表6：ライゲーション反応（10μL）。
| 名 | 濃度 | ノート |
| CaCl 2 | 100 mMの | |
| Carbeniccilin | 50 mg / mlで（1000倍） | |
| DTB | 50μg/ mlの | |
| IPTG | 0.5 M | |
| SMCC | 20 mg / mlで | 100UL DMSOに2mgの |
| SPDP | 20 mg / mlで | 100UL DMSOに2mgの |
| LC-LC-ビオチン | 20 mg / mlで | 100UL DMSOに2mgの |
| HRP | 10 mg / mlで | PBSで |
| SA（間接） | 10 mg / mlで | PBSで |
| SA（直接） | 0.17 / mlの | PBSで |
| BSA | 20 mg / mlで | PBSで |
| DTT | 100mMの | DI水の中 |
| EDTA | 5 mMの | 10 mLのPBSに18.6 mgの |
| カゼイン | 0.50％ | PBSで |
| トゥイーン80 | 20％ | DI水の中 |
| PBS中のトゥイーン80 | 0.05％ | |
| 酢酸ナトリウム | 50 mMの | DI水で、3 M HClを用いて5.1のpHに調整します |
| TMB | 1％ | DMSO中 |
| H 2 O 2 | 3％ | DI水の中 |
| H 2 SO 4 | 2 M | DI水の中 |
表7：試薬ソリューションの一覧。
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Discussion
私たちは、官能材料表面との生活設計された細胞をインタフェースするための新たな戦略を提示しています。これは、IPTGで誘導した場合に、ビオチンの上昇したレベルを合成することができる細胞株を開発することによって達成されました。ビオチンの上昇したレベルは、その後、官能化された表面を修飾するために使用することができます。プロトコルは、 大腸菌細胞株を操作する方法を2つの異なる官能化表面を作成する方法を詳述します。
このプロトコルでの重要なステップは、操作された細胞株の構築を通じて起こります。下流の問題を回避するために、成長曲線（ 図2）と、蛍光応答の両方で操作された細胞株を特徴付ける（ 図3）が推奨されます。手続き上の問題が発生する必要があり、このようなPCRの抽出及びギブソンアセンブリ14のような他の分子クローニング戦略は、ここでの手順のために適切に置換されてもよいです。ビオチンyieを最適化するため操作された細胞株のLDは、DTBの十分な量を細胞に提供されることを確実にするために重要です。我々の研究では、細胞をIPTGで誘導した場合、200 ngの/ mlのDTBは、ビオチン生産の実質的かつ統計学的に有意な増加を誘発したことを見出しました。さらに、BSAビオチン、SA-HRP、およびビオチンHRPのコンジュゲーションの成功は、効果的に実行すると、間接および直接制御スキームを監視するために重要です。光への不要な暴露を避けるとのコンジュゲートは、効果的な複合体が形成されていることを確認するために4℃で一晩インキュベートすることを可能にするように注意してください。
私たちのプロトコルは、そのような4'-ヒドロキシアゾベンゼン-2-カルボン酸をベースとするもののような市販のビオチン検出キットと比較（PG / mLのスケール）生物学的に関連しているビオチンの少量を検出する能力に代替方法15を超える利点を提供しています競合的結合の戦略。ストレプトアビジンバイオを使用しているがスズシステムは、ビオチンの少量に対応するため、当社のシステムの能力は、私たちが直接、官能化表面との遺伝的に操作された細胞株をリンクすることができ、バイオテクノロジー16、17で一般的です。
私たちのプロトコルの一つの潜在的制限は、ビオチン検出の結果のダイナミックレンジです。間接および直接制御方式では、10 2〜10 3をそれぞれ10 4 -10 6 pg / mlで、（ 図4）との間にビオチンを検出することができます。幸いなことに、間接的な制御方式の低域は、私たちは容易に操作された細胞からのビオチンの産生を検出することができます。しかし、間接的な制御のダイナミックレンジの緊密なバンドは、ビオチン濃度の大きな変化（100倍）を感知する能力を制限します。間接および直接制御方式の両方のためのダイナミックレンジを変更すると、追加のエンジニアリングを必要とするであろう。しかし、細胞農産物の検出の場合Dビオチンは、間接的な制御方式（ 図5）のダイナミックレンジをターゲットにする研究者を可能にしなければならないステップ4.6でビオチン上清の希釈液を調製し、問題です。上清の5希釈私たちは効果的に間接的な制御方式のダイナミックレンジをターゲットにすることができ：我々は1がことがわかりました。この希釈戦略は、直接ダイナミックレンジを変更する必要性を軽減する必要があります。
ここに提示二部分、細胞材料系は、官能化された表面の組成を変更するために、細胞を操作することを可能にします。動的な、生きている細胞は、遺伝的応答を生成するためにそれらの化学的環境を解釈することができます。ビオチン生産を増加させるために、この遺伝的応答を操作することによって、我々は、官能化された表面を制御し、操作する能力で操作の生細胞を付与することができます。提示されたプロトコルに従うことにより、操作された細胞は、読み取り、処理することのできるような動的センサーを、行動することができ、かつ目の周り条件を記録します官能化されたインターフェースを介してのem。この技術は、分子医学からの環境改善のための検体検出までのフィールドに影響を与える可能性があります。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
作者は感謝して、米国の科学研究の空軍オフィスから受賞FA9550-13-1-0108からの支援を認めます。著者はさらに、米国の海軍研究局から表彰N00014-15-1-2502からバージニア工科大学での重要な技術と応用科学研究所から、国立科学財団大学院研究からの資金を支援を認めますフェローシッププログラム、受賞番号1607310。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
References
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