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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Published: August 15, 2017 doi: 10.3791/55301
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology, Cornell University

Summary

Pflanze interzelluläre Verbindungen, die Plasmodesmata (Pd), spielen zentrale Rollen im Werk Physiologie und Pflanzenvirus Interaktionen. Entscheidend für den Pd-Transport sind Signale, die Proteine zu Pd direkte sortieren. Unser Wissen über diese Sequenzen ist jedoch noch in den Kinderschuhen. Wir beschreiben eine Strategie zur te-Lokalisierung-Signalen in Pd gezielt Proteine zu identifizieren.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) sind Zell-Zell-Verbindungen, die als Gateways fungieren durch die kleine und große Molekülen zwischen den Pflanzenzellen transportiert werden. Während Pd Transport von kleinen Molekülen, wie Ionen und Wasser, angenommen wird, dass passiv auftreten, Zell-Zell-Transport von biologischen Makromolekülen, solche Proteine am ehesten erfolgt über einen aktiven Mechanismus, spezifische targeting Signale auf der Molekül transportiert. Die Knappheit der identifizierten Plasmodesmata (Pd) Lokalisierung Signale (PLSs) hat stark eingeschränkt, das Verständnis der Protein-Sortierung Bahnen beteiligt zu Pflanzen, makromolekulare Transport von Zelle zu Zelle und Kommunikation. Aus einer Fülle von Pflanzen endogene und virale Proteine bekannt für den Verkehr durch Pd, nur drei PLSs gemeldet wurden bis heute wurden alle von endogenen pflanzlichen Proteinen. So ist es wichtig, eine zuverlässige und systematische experimentelle Strategie um einen Funktionsablauf PLS zu identifizieren, die sowohl notwendig und ausreichend für Pd-targeting, direkt im Wohnzimmer zu entwickeln Pflanzenzellen. Hier beschreiben wir eine solche Strategie verwenden als Paradigma der Zelle zu Zelle Bewegung Protein (MP) das Tabakmosaikvirus (TMV). Diese Experimente, die identifiziert und charakterisiert die erste virale PLS plant, kann für Entdeckung der PLS-Sequenzen in den Pd-bezogenen Proteinen angepasst werden.

Introduction

Plasmodesmata (Pd) Funktion als Kanäle für den interzellulären Transport der wichtigsten Regulatoren der Pflanzenentwicklung und Morphogenese von Transkriptionsfaktoren bis hin zu mRNA und kleine RNA-Moleküle. Darüber hinaus ist dieser makromolekularen Transport Pd durch die meisten Pflanzenviren für ihre interzellulären Ausbreitung während der Infektion ausgelastet; um Pd zu durchlaufen, entstanden Pflanzenviren spezialisierte Proteinen bezeichnet Bewegung Proteine (MPs), die gezielt auf Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekulare Signalwege Pd Transportmittel sind höchstwahrscheinlich mit spezifischen Sequenzen, die auf die transportierten Proteine in diese Bahnen eng verbunden. So kann Identifikation dieser Pd Lokalisierung Signale (PLSs) Diagnose der entsprechenden Pd Transport Weg sein. Dies ist analog der Pd Transport8, z. B. zu verschiedenen nuklearen Import Pathways, die spezifisch für verschiedene nukleare Lokalisierung Signal (NLS) Sequenzen9,10sein kann. Im Prinzip stehen für NLSs und PLSs nicht spaltbaren subzelluläre targeting-Sequenzen, die notwendig und ausreichend für die Ausrichtung sind. Im Gegensatz zu NLSs11ist jedoch die Reihenfolge Informationen über PLSs stark eingeschränkt. Insbesondere wurden nur vier Proteinsequenzen beteiligt bei der Ausrichtung der Pd mit allen von ihnen abgeleitet von endogenen pflanzlichen Proteinen beschrieben. Ersteres wird durch ein Homeobox-Domäne der KN112 – einen Transkriptionsfaktor, der Epidermis der Pflanze Blatt13 aus inneren Zellschichten bewegt – und seine KNOX homologe14dargestellt. Das zweite ist auch aus einen Transkriptionsfaktor, Dof, enthält eine vermeintliche PLS beschrieben als der interzellulären Handel (IT) Motiv15. Die dritte Sequenz ist aus das Membranprotein PDLP1 Plasmodesmata ansässige Typ 1, und es wird durch eine transmembrane Domäne16dargestellt. Schließlich die vierte Pd targeting Sequenz wurde kürzlich berichtet, für Glycosylphosphatidylinositole (GPI)-verankerte Proteine und es wird durch die Glycosylphosphatidylinositole (GPI) Änderung Signal17dargestellt.

Interessant ist, bis vor kurzem keine PLSs gemeldet wurden für virale MPs. Frühere Studien gezeigt das Vorhandensein von vermeintlichen PLS Sequenzen im Werk virale MPs18,19, aber keine wahre PLS, d. h., eine minimale Aminosäure-Sequenz notwendig und ausreichend für Pd Angriffe auf eine unabhängige Ladung Molekül ( zB., GFP) in eine virale MP identifiziert worden. Noch war eines dieser Proteine, MP das Tabakmosaikvirus (TMV), das erste für die Pd Lokalisierung und Transport demonstrierten20gewesen sein.

Um diese Lücke zu begegnen, entwickelten wir eine experimentelle Strategie um TMV MP PLS zu identifizieren. Diese Strategie basierte auf drei Konzepte. (i) Wir haben PLS als eine minimale Aminosäure-Sequenz, die notwendig und ausreichend für das Protein targeting auf Pd21ist definiert. (Ii) weil TMV MP richtet sich zunächst an Pd und dann durch diese Kanäle22translocates, wollten wir Entkopplung diese beiden Tätigkeiten und der Ausarbeitung der bona-fide PLS, welche Funktionen nur für Pd targeting und nicht für den nachfolgenden Verkehr. (Iii) wir analysiert die identifizierten PLS für Aminosäurereste wichtig für seine Pd targeting Aktivität, ob strukturell oder funktional. Mithilfe dieses Ansatzes abgegrenzt wir eine 50-amino Acid Rückstände Sequenz am amino-Terminus des TMV MP, die als bona fide PLS dient. Dies geschah durch produziert eine Reihe von TMV MP-Fragmente, die die gesamte Länge des Proteins gesättigt, tagging ihre Carboxylgruppen-Termini mit GFP und vorübergehend in Pflanzengewebe auszudrücken. PD-Lokalisierung aller getesteten Fragmente wurde durch coexpressing sie mit einem Pd Marker Protein, PDCB1 (Pd Zellstress bindendes Protein 1)23bestimmt. Die kleinsten Fragment, das nach wie vor auf Pd lokalisiert, aber nicht durchqueren, Pd, galt als PLS darstellen. Schließlich war die PLS Alanin gescannt, die wichtige Aminosäurereste benötigt für seine Struktur und/oder Funktion zu bestimmen.

Während hier wir diesen Ansatz mit der Kennung des TMV MP PLS Beschreibung veranschaulichen, können verwendet werden PLSs in jeder anderen Pd-bezogenen Proteinen zu entdecken ob Pflanzenpathogene oder die Pflanzen selbst kodiert; und zwar deshalb, weil unsere Methode keine Besonderheiten des viralen MPs in Bezug auf ihre Fähigkeit zum Ziel Pd nutzen.

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Protocol

(1) Pflanzenmaterial

  1. Wahl der Pflanzenarten
  2. Verwenden Sie die Pflanzenarten heimisch in das Protein von Interesse, d. h., die dieses Protein für körpereigene Proteine kodiert oder der natürliche Wirt für den Erreger für virale Proteine darstellt. Darüber hinaus müssen die ausgewählten Pflanzenarten der gewählten Methode der Transienten genetische Transformation zugänglich sein.
    Hinweis: Die Studien beschäftigen routinemäßig Nicotiana Benthamiana, die einen guten Gastgeber für TMV darstellt und effizient durch die gentechnische Transformation mit Agrobakterien-vermittelten Technik, d. h., Agroinfiltration umgewandelt (siehe Schritt 3). N. Benthamiana Pflanzen auch leicht angebaut und haben große Blätter, die leicht durch Agrobacterium geimpft sind und leicht durch konfokale Mikroskopie analysiert.
  3. Pflanzenwachstum
    1. Pflanzensamen Sie N. Benthamiana in feuchter Erde in hoher Dichte. Halten sie in einer kontrollierten Umgebung Kammer bei 20-25 ° c unter 16 h Licht bei ~ 75 µmol Photonen m-2 s-1 und 8 Stunden der Dunkelheit. Nachdem der Durchmesser des Euphyll 0,5 cm erreicht hat, sorgfältig übertragen Sie die Keimlinge in größere Töpfe und fortzusetzen Sie Wachstum in der gleichen Kammer unter den gleichen Bedingungen.
    2. Pflegen Sie die Pflanzen, bis sie auf 4-8-Blatt-Stadium innerhalb von 4 Wochen wachsen als die größten Blätter 4-6 cm Durchmesser sind; zu diesem Zeitpunkt können sie für Agroinfiltration verwendet werden (siehe Schritt 3).
      Hinweis: Verwenden Sie wichtig ist, niemals die Pflanzen wenn sie begann zu blühen, da in diesem Entwicklungsstadium die Blatt-Architektur oft24,25, manchmal führt zu inkonsistenten Ergebnissen variiert.

(2) Ausdruck Vektor Bau

  1. Wahl des Expressionssystems
    1. Wählen Sie den Ausdruck System, d. h., Vektoren und Vektor Versandweg, bestens geeignet für Expression des Proteins des Interesses an der Pflanzenarten untersucht.
      Hinweis: Gelegentlich solche spezifischen Kombinationen der getestete Protein/Pflanzenarten können erfordern spezifische Vektoren und Vektor-Übermittlungsmethode für optimale Expression und Funktion des Proteins des Interesses. Wählen Sie für die meisten zweikeimblättrige Pflanzen jedoch binäre Plasmide als Expressionsvektoren und Agroinfiltration als Delivery-System.
  2. Tagging-fluoreszierende Protein
    1. Eindringmittel tag jedes exprimierten Protein für die Analyse von seine subzelluläre Verteilung22, einschließlich Pd Lokalisierung.
      Hinweis: Verwenden Sie Autofluorescent Proteine, wie GFP und DsRed2, als Tags. Tag der getesteten Proteins mit GFP und coexpress es mit einer kostenlosen DsRed2. GFP-Funktionen als Tag sowie ein Virus-unabhängige Ladung-Molekül. DsRed2 Funktionen Gesamteffizienz des Transienten Expression zu kalibrieren und, weil es Handy-autonomen, zu identifizieren, die zunächst transformierte Zelle; Diese letztere Funktion ist wichtig, bei der Beurteilung von Zelle zu Zelle Bewegung möglicherweise nicht-Zelle-autonomen getesteten Proteine. Für Coexpression mit dem Pd-Marker PDCB1, die auch Zelle autonom ist, tag der getesteten Proteins mit GFP und PDCB1 mit DsRed2.
    2. Als Faustregel gilt Sicherung der Autofluorescent Tag an den Carboxylgruppen-Terminus des Proteins ausgedrückt. Aber wenn die tagged in voller Länge getestete Protein Exponate Pd targeting gefährdet, übertragen Sie das Tag an den amino-Terminus des Proteins.
    3. Klonen Sie die kodierenden Sequenzen der Proteine in einer geeigneten Anlage Expressionsvektor getestet werden.
      Hinweis: Es gibt viele verschiedene Pflanzenarten Expressionsvektoren, die fluoreszierende tagging ermöglichen. Wir verwenden eine Reihe von pSAT Plasmide26 oder einige ihrer Derivate27,,28, die eignen sich für das Klonen von der Reihenfolge des Interesses direkt im Rahmen mit den vorgeschlagenen Autofluorescent Tags (siehe Schritt 2.2.1) in beiden amino- und Carboxylgruppen-Terminal Orientierungen.
    4. Übertragen Sie jedes Expressionskassette in einer binären Vektor Agrobacterium.
      Hinweis: Obwohl pSAT basierende Konstrukte sind geeignet für direkte biolistischen Lieferung ins Pflanzengewebe, Agroinfiltration, nämlich die Transformationsmethode empfohlen hier (siehe Schritt 3), verlangt, dass die Expressionskassette liegen zwischen der T-DNA soll Grenzen einer Binärdatei Vektor-29.
      Hinweis: Alle pSAT Vektoren sind entworfen, um solche Versetzung auf die pPZP-RCS2 multigene Ausdruck binären Vektor26,30 durch einen einstufigen Klonen mit seltenen schneiden Nukleasen AscI-PpoI, -SceI, ich-CeuI, PI-PspI und PI-TliI 26. Forscher, die lieber recombinatorial Klonen, nutzen z.B.mit heterologen Lox Seiten31, pSAT Vektor Varianten26,27beschäftigen können.
    5. Für Coexpression, beiden Expressionskassetten zu übertragen, z.B., getestete Protein GFP und DsRed2 oder getestete Protein GFP und PDCB1-DsRed2 (siehe Schritt 2.1), auf den gleichen pPZP-RCS2 binären Vektor.
      Hinweis: Alternativ Agrobacterium Kulturen beherbergen einzelne binären Konstrukte können gemischt werden für Infiltration in N. Benthamiana (siehe Schritt 3.1).

(3) Agroinfiltration

  1. Fügen Sie 1 µg der ein pPZP-RCS2-basierte Plasmid aus Schritt 2.2.5 bis 100 µL Kultur zuständigen Zellen des Agrobacterium Tumefaciens Stamm EHA105 oder GV3101 als beschrieben32vorbereitet, Inkubation für 30 min auf Eis, Schockfrosten in flüssigem Stickstoff für 1 min, und bei 28 ° C für 15 min inkubieren.
    1. Dann fügen Sie 1 mL LB-Medium (10 g/L Tryptone, Hefeextrakt 5 g/L und 10 g/L NaCl) auf die zuständigen Zelle Mischung und bei 28 ° C für 2 h Spin die Zellen bei 3.000 × g für 1 min inkubieren, wieder auszusetzen in 0,2 mL LB , und sie auf LB-Agar mit geeigneten Antibiotika (z.B.100 mg/L Spectinomycin und 50 mg/L Rifampicin für pPZP-RSC2-basierte Vektoren26,30) ergänzt. Wachsen Sie bei 28 ° C für 48 h, bis die einzelnen Kolonien sichtbar werden.
  2. Wählen Sie und mehrere einzelne Kolonien auf eine frische LB-Agar-Platte-Platte (siehe Schritt 3.1), wachsen bei 28 ° C für 48 h, und nehmen Sie eine kleine Menge von Bakterien für die Analyse von Kolonie-PCR-33 um das Vorhandensein der spezifischen binären Konstrukte bestätigen.
  3. Wachsen Sie jede Agrobacterium Kolonie mit dem Konstrukt von Interesse über Nacht bei 28 ° C in 5 mL LB-Medium mit geeigneten Antibiotika (siehe Punkt 3.1.1) ergänzt. Die Zellen bei 3.000 × g zentrifugiert, und wieder auszusetzen, OD600= 0,5 im Agroinfiltration-Puffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 150 µM Acetosyringone). 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    1. Wenn Sie eine Mischung aus binären Plasmide, anstatt einer einzigen multigene Ausdruck Plasmid für Protein Coexpression verwenden, mischen Sie die entsprechenden Zellkulturen im Verhältnis 1:1 V/V vor Eindringen. Inkubieren Sie dann die Zellen bei 28 ° C für 2 h.
  4. Laden Sie das Inokulum in eine 1 mL Kunststoffspritze und drücken Sie die Düse der Spritze (ohne Nadel) gegen die untere (abaxial) Epidermis der vollreifen N. Benthamiana verlässt. Halten Sie das Blatt mit einem behandschuhten Finger auf die adaxial Gesicht34,35.
    1. Die Agrobacterium Infiltration Medium durch langsame Injektion einzuführen. Statistische Signifikanz sind mehrere Blätter auf jede Pflanze zu infiltrieren.
      Hinweis: Beachten Sie, dass die ältesten Blätter nicht verwendet werden, da sie konsequent Ausdruck Niveaus nicht nachgeben.
    2. Alle Blätter in Situzu impfen. Pflegen Sie die infiltrierte Pflanze bis Beobachtung, wie in Schritt 1.2.

4. der konfokalen Mikroskopie

  1. Verwenden Sie eine Klinge, um jedes Blatt in Fragmente zwischen den Adern geschnitten 24-48 h nach der Infiltration (abhängig von der Effizienz der Transienten Expression des getesteten spezifischen Proteins); die Größe der einzelnen Segmente Gewebe sollte so sein, dass die Scheibe durch das Deckglas (22 x 40 mm) für die Mikroskopie verwendet vollständig bedeckt ist.
  2. Ort, an dem die Blatt-Scheiben auf das Objekt mit der abaxial Blattoberfläche nach oben schieben geben Sie einen Tropfen Wasser auf das Blatt-Scheibe und mit dem Deckglas abdecken. Das Deckglas mit kleinen Klebestreifen auf jeder Seite zu immobilisieren.
  3. Beobachten Sie das Agroinfiltrated Gewebe unter einem Laser-scanning-confocal Mikroskop und zeichnen Sie die daraus resultierenden Bilder.
    1. Zuerst verwenden Sie ein 10 X-Objektiv, um Zellen mit dem Signal zu identifizieren, und verwenden Sie dann 63 X Objektiv für genauere Beobachtungen.
    2. Verwendung der 458 nm Wellenlänge aus eine Argon-Ionen-Laser GFP und 543 begeistern nm DsRed2 begeistern. Behalten Sie alle Einstellungen für die Bildaufnahme, d. h., Laserintensität und Photomultiplier Röhre (PMT) Einstellungen zwischen Experimente. Im Durchschnitt 100-120 Zellen für jede experimentelle Bedingung zu prüfen.

5. Identifizierung der PLS

  1. Die Lokalisierung des getesteten Proteins mit confocal Mikroskop (Abschnitt 4) zu diagnostizieren. Überprüfen Sie, ob das getestete Protein die charakteristische peripheren punktförmige Muster25,36,37,38,39,40,41 hat und colocalizes mit dem Pd-Marker PDCB123. Dies bedeutet, dass das getestete Protein am ehesten PLS Sequenzen enthält.
  2. Nach Bestätigung der PLS Tätigkeit der getesteten Protein, schrittweise seine offenen Leserahmen (ORF) (Genbank Zbl-Nummer BAF93925.1) in kleinere Fragmente, Autofluorescently, (z. B.GFP) unterteilen beschriften Sie jeden von ihnen und analysieren ihre subzelluläre Lokalisation wie in Schritt 4 beschrieben. Zunächst empfiehlt sich die Größe von 100 Aminosäurereste für jedes Fragment unterteilt.
  3. Weiter unterteilen die abgeschnittenen Fragmente, die haben die PLS-Aktivität und überprüfen Sie ihre subzelluläre Lokalisation, wie unter Schritt 4 bis zu den kleinsten Fragment, die noch auf Pd lokalisiert, d.h. ist ausreichend, um den Autofluorescent Tag Fracht transportieren für Pd identifiziert. Dieses Fragment ist vermutlich die PLS-Sequenz darstellen.
  4. Löschen Sie der vermeintlichen PLS vom Full-length getestete Protein, d.h. Sicherung den restlichen Teil des Proteins Test ohne vermeintliche PLS Autofluorescent Tag, und bestimmen Sie die subzelluläre Lokalisation des daraus resultierenden mutierten Proteins zu, wie in Schritt beschrieben (4) Unterlässt diese mutierten Proteins, die vermeintliche PLS fehlt, Pd zu lokalisieren, wird dies bedeuten, dass die identifizierten PLS nicht nur ausreichend (siehe Schritt 5.3), aber auch für den Pd-Transport des getesteten Proteins notwendig ist.
  5. Agroinfiltrate bauen die Blätter mit einer Mischung aus Agrobacterium Kulturen beherbergen den Ausdruck für die GFP-Tags PLS und kostenlose DsRed2 (siehe Schritt 3.3). Infiltrierten Gewebe mit Objektiv 10 x mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 4.3 confocal Mikroskop zu beobachten.
  6. Zellen, die GFP und DsRed2 Signale als anfangs infiltrierten Zellen enthalten, und Gäste der benachbarten Zellen, die nur das GFP-Signal als diejenigen enthalten diese Ausstellung Bewegung der Gäste.
    Hinweis: Dieser Schritt prüft der identifizierten PLS für seine potentielle Bewegungsfähigkeit der Zelle zu Zelle; und zwar deshalb, weil viele Proteine, die auf Pd (darunter die meisten Pflanzen virale MPs) auch durch Pd zu den benachbarten Zellen zu bewegen. Die Konzentration von Agrobacterium verwendet für Infiltration hängt der Ausdruck Effizienz unterschiedlicher Strukturen bzw.. Agroinfiltration stellen Sie sicher, die Zelle-Kultur-Verdünnung, die (i) die Umwandlung der Einzelzellen, verlassen die benachbarten Zellen untransformierten gewährleistet, (Ii) erreicht eine ähnliche Effizienz des Ausdrucks zu verwenden. Zum Beispiel nutzen unsere Experimente bzw. OD600 0,01 und 0,005 für Ausdruck der GFP-Tags PLS und kostenlose DsRed2.

6. Identifikation der Schlüssel PLS Rückstände mit Alanin Scannen42

  1. Verwenden Sie PCR-Standardprotokolle, um Codierung Sequenz mit ein paar Zündkapseln enthalten wie beschrieben die gewünschte Mutation, d. h., Substitution von Ziel Aminosäurerest mit Alanin in der zentralen Region jeweils Fibel soll PLS verstärken 21. besser gekleideteres Design und Verwendung der Site-verwiesene Mutagenese-Kit für Site-verwiesene Mutagenese nach den Anweisungen des Herstellers durchzuführen.
  2. Die daraus resultierende PCR-Produkte mit jeder Standardbausatz DNA Reinigung reinigen und verdauen sie bei 37 ° C mit DpnI der Elternzeit zu beseitigen (d. h.nicht mutiert) methyliert und Hemimethylated DNA. Kühlen Sie das für 5 min bei Raumtemperatur (nicht auf dem Eis ab). Dann umwandeln Sie die Mischung direkt in E. Coli kompetente Zellen43, und identifizieren Sie Kolonien mit der gewünschten mutierte Konstrukte zu, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
  3. Führen Sie die mutierten Konstrukte in der binären Vektor ein, wie unter Punkt 2.2.4 beschrieben, führen Sie Agroinfiltration, wie in Schritt 3 beschrieben, und bewerten Sie Pd Ausrichtung wie in den Schritten 4 und 5.1 beschrieben.

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Representative Results

Die repräsentativen Daten, die treu illustrieren die beschriebenen Protokolle erwarteten Ergebnisse und der TMV MP PLS zu identifizieren, werden angepasst von Yuan Et al. 21. Abbildung 1A zuerst fasst wichtige Konstrukte, die mit dem Ausdruck der Full-length TMV MP (1-268), TMV MP PLS (bestehend aus den ersten 50 Aminosäurereste des Proteins, 1-50), und seine Alanin Scannen V4A Derivate mit GFP (generiert als verschmolzen beschriebenen Schritte 2.2, 5.2 und 6) während Abbildung 1 b fasst und die subzelluläre Lokalisation dieser tagged Proteine quantifiziert. Abbildung 1 zeigt die charakteristischen peripheren punctata Pd Lokalisierung beobachteten Mustern für TMV MP-GFP und für TMV MP PLS-GFP als auch für den coexpressed Pd-Marker, PDCB1-DsRed2 (siehe Schritt 5.1). Abbildung 2A zeigt Pd Ausrichtung des TMV MP-GFP und für TMV MP PLS-GFP und Nucleocytoplasmic Verteilung der coexpressed freie DeRed2 (siehe Schritt 5.1). Zu guter Letzt zeigt Abbildung 2 b den Verlust von Pd-targeting von TMV MP und TMV MP PLS mit einer einzigen Alanin Substitution V4A, darauf hinweist, dass dieser Rückstand für die PLS-Struktur oder Funktion wichtig ist; in den gleichen Zellen den coexpressed PDCB1 noch, Pd lokalisiert Pd-Marker (siehe Schritt 6).

Diese Daten zeigen, dass diese konzeptionell und technisch einfache Prozedur der systematische Erstellung von Proteinfragmente, Fusion, ein Autofluorescent-Marker-Cargo-Protein und Test für die Fähigkeit, auf Pd lokalisieren eine minimale Proteinsequenz identifizieren können notwendig und ausreichend für Pd targeting, d. h., PLS. Für eine korrekte Interpretation dieser Lokalisierung-Daten, ist es wichtig, NS1 Experimente mit einem bekannten Pd-Protein, z.B., PDLP oder PDCB Familienmitglieder16,23 oder eines Werks virale MPs, die auf Pd44 sortieren . Natürlich muss die NS1 nicht vollständig sein, da nicht alle P-Lokalisierung von Proteinen zu den gleichen Pd ausgerichtet sein können, sondern eine statistisch signifikante NS1 mit mindestens einem Pd-Marker-Proteine notwendig ist für die Definition der PLS-Aktivität.

Figure 1
Abbildung 1: Identifizierung des TMV MP pls (A) Zusammenfassung der wichtigsten GFP-Fusion-Konstrukte zum TMV MP pls TMV MP Sequenzen, grüne Felder identifizieren; GFP, blauen Kästen; P, Förderer; T, Terminator. Zahlen auf der linken Seite zeigen die Aminosäurereste in jedem TMV MP-Fragment enthalten. (B) Zusammenfassung der subzellulären Lokalisierung von Fusionsproteinen in (A) gezeigt. PD-Lokalisierung oder Nucleocytoplasmic Lokalisierung wurde basierend auf die Lokalisierung der entsprechenden subzelluläre Marker, PDCB1-DsRed2 und kostenlose DsRed2 bzw. bestimmt. Der Anteil der Zellen, die jede Lokalisierung Muster ausstellen wird basierend auf 100 mit dem Ausdruck ihrer Zellen pro Konstrukt in drei unabhängigen Experimenten scoring angezeigt. Daten sind Mittelwert ± Standardfehler (SE). (C) Pd Ausrichtung der TMV MP-GFP, TMV MP PLS-GFP und der Pd-Marker PDCB1-DsRed2. GFP-Signal ist in blau; DsRed2 Signal ist in lila; Plastiden Autofluoreszenz wurde herausgefiltert. Bilder sind einzelne konfokale Abschnitte. Skalieren von Balken = 10 µm. DIC, Differential Interferenz Kontrast Schliffbild. Diese Zahl ist von Yuan Et al. 21. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Pd Ausrichtung der TMV MP, TMV MP PLS und ihre Alanin-Scannen durch Mutation entstehende Variationen. (A) subzelluläre Lokalisation des TMV MP-GFP, TMV MP PLS-GFP und der Nucleocytoplasmic Marker DsRed2. (B) Verlust von Pd auf Fähigkeit der V4A Alanin-scanning Mutanten TMV MP PLS-GFP und TMV MP-GFP. Te wurden durch Coexpression von der Pd-Marker PDCB1-DsRed2 visualisiert. GFP-Signal ist in blau; DsRed2 Signal ist in lila; Plastiden Autofluoreszenz wurde herausgefiltert. Bilder sind einzelne konfokale Abschnitte. Skalieren von Balken = 10 µm. DIC, Differential Interferenz Kontrast Schliffbild. Diese Zahl ist von Yuan Et al. 21. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Dieses Protokoll hat vier Kern-Bestandteile: das Konzept der Identifizierung einer Sequenz, die notwendig und ausreichend für die Zielgruppenadressierung auf Pd, systematische Einteilung des Proteins des Interesses der Fragmente, die in der Länge, degressiv sind Absicherung der getesteten Fragmente, ein Autofluorescent Protein, die dient sowohl als Tag als makromolekulare Fracht- und funktionelle Assay für Pd-targeting in lebenden Pflanzen Gewebe nach transiente Expression von den getesteten Fusionsproteinen. Beachten Sie, dass Transienten Expression Agrobakterium-vermittelten Daten innerhalb relativ kurzer Zeit, d. h., mehrere Tage, im Vergleich zu benötigt für die Herstellung von transgenen Pflanzen, die häufig in ähnlichen Studien15Monate generiert.

Coexpression des Proteins des Interesses mit subzelluläre Lokalisation Marker, z. B.PDCB1 oder kostenlose DsRed2 in der Regel erfolgt aus einem multigene Expressionsvektor. Jedoch wenn Übertragung von mehreren Expressionskassetten in einen einzigen Vektor technisch problematisch ist, Coexpression kann auch durchgeführt werden durch jede Kassette in eine separate binäre Konstrukt zu übertragen und entspricht Volumen der flüssigen Kulturen der kombinieren die daraus resultierende Agrobakterium Stämme für Agroinfiltration. Da dieses Protokoll transiente Expression nutzt, muss der binären Vektor nicht Selektionsmarker für stabile Transformation ausführen, obwohl ihre Anwesenheit nicht nachteilig auf die Effizienz der Ausdruck ist.

Dieses Protokoll ist optimiert für die Proteinexpression und targeting in N. Benthamiana; Allerdings kann es in anderen Pflanzenarten, darunter Arabidopsis45,46, offen für gentechnische Transformation durch Agrobacterium verwendet werden. Für andere Pflanzenarten oder falls anders gewünscht, kann dieses Protokoll biolistischen Lieferung41 für transiente Expression direkt vom pSAT-basierte Vektoren, vermeiden die Notwendigkeit, die Expressionskassetten auf binäre Vektoren übertragen nutzen angepasst werden.

Ein kritischer Punkt in diesem Protokoll ist der konsequente physiologische und Entwicklungsstörungen Zustand des Pflanzenmaterials. Insbesondere müssen alle Pflanzen gesund durch das ganze Experiment sein und für Agroinfiltration, N. Benthamiana Pflanzen müssen kleiner sein als 4 Wochen alt und bei 4-8-Blatt-Stadium mit dem größten Blatt wird ca. 4-6 cm im Durchmesser. Wenn die Pflanzen zu jung sind, werden die Auswirkungen der Agroinfiltration zu streng, Ausdruck und Lokalisierung der tagged Proteine stören. Auf der anderen Seite weisen die älteren Pflanzen oft Variable Architektur Pd24,25, auch Auswirkungen auf die Konsistenz der Pd-targeting Muster.

Noch, aufgrund der unterschiedlichen physiologischer Bedingungen des Werkes als Ganzes und seiner transformierten Zellen insbesondere, die Effizienz der Pd Ausrichtung in jedem Experiment etwas variieren. So ist es wichtig zu analysieren, eine relativ große Anzahl von Zellen (> 100) pro Experiment, und mindestens drei biologische Wiederholungen der einzelnen Experimente durchführen. Im Allgemeinen betrachten wir eine getestete Fragment Pd targeting Aktivität enthalten, wenn es Pd Lokalisierung in mindestens 70 % der transformierten Zellen aufweist. Unterschiede in der Ausrichtung auf Effizienz jedes Fragment, z.B., Prozent der transformierten Zellen zeigen das Pd-spezifische punktförmige Anreicherung Muster, Pd sollte analysiert werden, indem der Student t-Test und p-Werte < 0,05-0.01, entsprechend der statistische Wahrscheinlichkeit von mehr als 95-99 %.

Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Position der fluoreszierenden Tag/Fracht in die Fusion-Molekül. Einige Pd gezielt Proteine auch assoziieren mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER), und dieser Vereinigung kann die freie amino-terminalen Sequenz erfordern. In diesen Fällen, amino-terminalen Fusionen, in denen die Carboxylgruppen-Terminus des Proteins Fragments des Interesses an den amino-Terminus des fluoreszierenden Tags verschmolzen wird sollte z. B.GFP oder DsRed2, verwendet werden. Diese Standard-Platzierung des Tags kann in folgenden Fällen geändert werden. (i) wenn die amino-terminalen Fusionen nicht nutzbar – d. h., sie nicht sinnvolle subzelluläre Lokalisation Muster aufweisen, werden schlecht ausgedrückt oder erzeugen keine Fluoreszenzsignal ausreichend für zuverlässige Erkennung – und wenn das Protein des Interesses amino-terminalen Signalsequenzen oder Carboxylgruppen-terminale Fusionen in denen amino-Terminus des getesteten Fragments an den Carboxylgruppen-Terminus des Tags verschmolzen ist nicht enthalten, sie sollte versucht werden. (Ii) die Carboxylgruppen-terminale Fusionen sollte auch verwendet werden, wenn das Protein des Interesses Signalsequenzen an seine Carboxylgruppen-Endstation enthält. (Iii) wenn das Protein des Interesses beide amino - und Carboxylgruppen-Terminal-Signale, z. B. auf GPI-verankerte Proteine hat, oder wenn es ein amino-terminalen Signalpeptid enthält noch die amino-terminalen Verschmelzung nicht verwendbar ist, sollte die Beschriftung werden intern platziert) oder stromabwärts des amino-terminalen Signals oberhalb der Carboxylgruppen-Terminal-Signal). Einige nützlichen Verfahren für interne fluoreszierende tagging von Proteinen werden in unseren früheren Publikationen47,48beschrieben.

Derzeit gibt es keine bekannten Konsensussequenz für PLS. Als solche (im Schritt 5.2) empfehlen wir, zunächst Unterteilung des Proteins in zusammenhängenden ~100-200 Rückstand lange Fragmente. Diese können dann schrittweise kürzer gemacht werden anhand der beobachteten Pd-targeting-Aktivität oder das Fehlen derselben. Man sollte eingedenk der anderen potenziellen targeting Signale in das Protein (z.B.NLS, Signal-Peptide, etc.) vorhanden sein. Da die mögliche Überschneidung von solcher Sequenzen mit PLS-Sequenzen nicht bekannt ist, sollte dieser Protein-Regionen in dieser seiner Analyse enthalten.

Bisher wurde dieses Protokoll verwendet, um einen einzigen PLS in einer Protein-Molekül-21zu identifizieren. Potenziell, jedoch kann ein Protein enthalten, mehr als eine Signalsequenz; in der Tat mehrere NLSs wurden in vielen nuklearen Proteine, einschließlich GATA Transkription Faktoren49beschrieben. So bei der Analyse der verschiedenen Fragmente des getesteten Proteins für Pd-targeting ist es möglich, dass mehrere solcher Fragmente identifiziert werden, auf das Vorhandensein von mehreren PLSs, die unabhängig voneinander oder synergistisch wirken kann.

Die Haupteinschränkung dieses Protokolls ist, dass nach Agroinfiltration, Visualisierung der subzellulären Lokalisierung von vorübergehend exprimierten Proteine des Interesses am besten erreicht, in Epidermiszellen und relativ schmalen Wachstumsphase. Bei Bedarf kann diese Einschränkung durch Herstellung transgener Pflanzen, die stabil jedes der getesteten Proteine in den meisten Geweben und Zelltypen ausdrücken überwunden werden. Dieses Protokoll wäre auch nicht nützlich für die Studien der viralen MPs oder andere Pd gezielt Proteine, die nur in Pflanzenarten funktionieren, die nicht vergänglich genetische Transformation zugänglich sind.

Während wir diese Technik zur Identifikation von einem PLS TMV MP entwickelt, kann es verwendet werden, für die Entdeckung der PLSs in einer anderen Anlage virale MPs oder bei endogenen Pflanzeneiweiß, die vorübergehend oder dauerhaft, Pd, lokalisieren. Darüber hinaus ist, wenn in Kombination mit entsprechenden subzelluläre Lokalisation Marker47dieses Protokoll zur Identifizierung von vielen anderen targeting Signale innerhalb der Proteine des Interesses an Pflanzen geeignet.

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Disclosures

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Acknowledgments

Für den Mangel an Raum meist Review-Artikel haben wir angeführt, und wir entschuldigen uns bei unseren Kollegen, deren ursprüngliche Arbeit nicht zitiert wurde. Die Arbeit im Labor V.C. wird unterstützt durch Zuschüsse aus NIH, NSF, USDA/NIFA, BARDEN und BSF, V.C. und das S.G.L. Labor wird unterstützt von NIH und Fonds aus den Abteilungen der Pflanzenpathologie und Pflanze-Mikroben Biologie, S.G.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologie Ausgabe 126 Plasmodesmata Lokalisierung Signal (PLS) Protein-tagging subzelluläre Lokalisation Bewegung von Zelle zu Zelle Proteine Viren zu Pflanzen Pflanzen genetische Transformation
Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine <em>In Planta</em>
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Yuan, C., Lazarowitz, S. G.,… More

Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).

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