Summary
We beschrijven eenvoudige methoden de regulering van intestinale serotonine transporter (SERT) functie en expressie onder toepassing van een in vitro celkweek model van Caco-2-cellen gekweekt in 3D en een ex vivo model van muis darmen bestuderen. Deze methoden zijn geschikt voor de studie van andere epitheliale transporters.
Abstract
Het darmepitheel heeft belangrijke transport en barrière functies die een belangrijke rol spelen in de normale fysiologische functies van het lichaam, terwijl het verstrekken van een barrière voor vreemde deeltjes. Verminderde epitheliale transport (ionen, nutriënten of drugs) is geassocieerd met vele ziekten en kan gevolgen die verder gaan dan de normale fysiologische functies van de transporteurs, zoals door beïnvloeding van epitheliale integriteit en de darmen microbiome hebben. Inzicht in de functie en regulatie van transporteiwitten is cruciaal voor de ontwikkeling van verbeterde therapeutische interventies. De grootste uitdaging in de studie van epitheliale transport ontwikkelt een geschikt modelsysteem dat belangrijke kenmerken van de natieve darmepitheelcellen recapituleert. Verscheidene in vitro celkweekmodellen, zoals Caco-2, T-84, en HT-29-cellen Cl.19A worden doorgaans gebruikt in epitheliale vervoersonderzoek. Deze cellijnen zijn een reductionistische benadering van het modelleren van de epithelium en zijn gebruikt in tal van mechanistische studies, met inbegrip van hun onderzoek van epitheliale-microbiële interacties. Echter, celmonolagen geen nauwkeurige weergave van cel-cel interacties en in vivo micro-omgeving. Cellen gekweekt in 3D blijkt veelbelovend modellen permeabiliteit studies. We laten zien dat Caco-2-cellen in 3D kan worden gebruikt voor epitheliale transporters bestuderen. Het is ook belangrijk dat studies in Caco-2-cellen worden aangevuld met andere modellen uitsluiten celspecifieke effecten en rekening houdend met de complexiteit van de natieve darm. Verscheidene werkwijzen zijn eerder gebruikt om de functionaliteit van transporteurs, zoals eversie sac en opname in geïsoleerde epitheelcellen of geïsoleerde plasmamembraan vesikels beoordelen. Rekening houdend met de uitdagingen op ten opzichte van modellen en het meten van transportfunctie, tonen we hier een protocol voor Caco-2 cellen groeien in 3D en beschrijven het gebruik van een Ussing kamer alseffectieve aanpak serotonine transport, zoals in intacte gepolariseerde intestinale epitheel te meten.
Introduction
Het darmepitheel is voorzien van diverse transporteiwitten (kanalen, ATPasen, co-transporters en wisselaars) dat talrijke functies variërend van de opname van voedingsstoffen, elektrolyten voeren, en middelen om de uitscheiding van vocht en ionen in het lumen. Transporteiwitten genereren elektrochemische gradiënt die de beweging van ionen of moleculen toestaan in een vectoriële wijze. Dit wordt bereikt door de asymmetrische verdelingen van de transportsystemen van de apicale en basolaterale membranen van gepolariseerde epitheliale cellen. Bovendien tight junctions die tegen epitheelcellen tether, spelen een belangrijke rol in dit proces door als een barrière voor het intramembraan diffusie van componenten tussen de apicale en basolaterale membraan domeinen. Geschikte modelsystemen bootsen deze kenmerken van de natieve darm (bijvoorbeeld polariteit, differentiatie en tight junction integriteit) zijn essentieel voor de studie van de functionaliteit van epitheliale transportsystemen.
Met betrekking tot de modellen, de typische cellijnen die momenteel worden gebruikt in intestinale epitheliale transport onderzoek zijn Caco-2, een model van volledig gedifferentieerde, absorberend dunne darm epitheelcellen; en T84 cellen of HT-29 subklonen, modellen of-crypt afgeleide grote darmepitheelcellen 1. Gewoonlijk worden deze cellijnen gekweekt als monolagen in kunststofoppervlakken of beklede Transwell inzetstukken. Trans-well celcultuur inserts enigszins lijken op de in vivo omgeving doordat gepolariseerde cellen basolateraal voeden. Echter een beperking in conventionele 2D kweeksystemen is dat de cellen moeten aanpassen aan een kunstmatige, vlak en stijf oppervlak. Aldus wordt de fysiologische complexiteit van de natieve epitheel niet correct in een 2D systeem. Deze beperking overwonnen door werkwijzen om cellen groeien in 3D in een bepaald micro-omgeving, zoals gelatineuze eiwit Mixture, met een verscheidenheid van extracellulaire matrixcomponenten 2, 3. Niettemin kan het in vitro kweken van de complexiteit van het darmepitheel, die meerdere celtypes en regiospecifieke architectuur in de darm niet simuleren. Zo, de studies met behulp van celkweek modellen vereisen verdere validering in de moedertaal darm. Met behulp van de in vitro 3D celcultuur en muis darmslijmvlies, beschrijven we hier eenvoudige methoden om de regulatie van de intestinale serotonine transporter (SLC6A4, SERT) te bestuderen.
De SERT transporteur regelt de extracellulaire beschikbaarheid van een belangrijke hormoon en neurotransmitter 5-hydroxytryptamine (5-HT) door het snel transporteren door een Na + / Cl - afhankelijke proces. SERT is een bekend doelwit van antidepressiva en recentelijk naar voren gekomen als een nieuw therapeutisch doelwit van maag-darmaandoeningen, zoals diarree en darmontsteking.Werkwijzen onderzoeken 5-HT opname in intestinale epitheliale cellen zijn eerder beschreven. Bijvoorbeeld zijn Caco-2-cellen gekweekt op plastic dragers of doorlatende inzetstukken aangetoond dat fluoxetine-gevoelige 3H-5-HT opname vertonen zowel apicale en basolaterale domeinen 4. De meting van SERT functie in geïsoleerde Brush membraanblaasjes (BBMVs) bereid uit menselijk orgaan donor dunne darm is ook beschreven door 5 ons. 3H-5-HT opname in humane BBVMs bleek fluoxetine-gevoelige en Na + / Cl zijn - afhankelijke en vertoonde verzadigingskinetiek met een Km van 300 nM 5. Met behulp van vergelijkbare methoden, hebben we ook eerder gemeten SERT functie als 3H-5-HT opname in de muis intestinale BBMVs 6. De bereiding van zuivere plasmamembraan vesikels vereist een grote hoeveelheid weefsel mucosa. Andere methoden, zoals radiographic visualisatie van 3H-5-HT opname plaatsen, ook eerder aangetoond in cavia en rat dunne darm 7.
De Ussingkamer een meer fysiologisch systeem voor het transport van ionen, nutriënten en geneesmiddelen in verschillende epitheliale weefsels te meten. Het belangrijkste voordeel van de Ussingkamer techniek is dat daardoor de nauwkeurige meting van de elektrische en transportparameters van intacte, gepolariseerde darmepitheel. Verder de invloed van de intrinsieke neuromusculaire systeem te minimaliseren, kan seromuscular strippen van intestinale mucosa worden uitgevoerd om de regulering van transporters onderzoeken het epitheel 8.
We laten zien dat Caco-2-cellen gekweekt in 3D op gelatineachtige eiwitten vormen een hol lumen expressie afzonderlijke apicale en basolaterale markers. Deze cellen vertonen hogere expressie van SERT dan 2D Caco-2 cellen. Werkwijzen groeien 3D cellen en perform immunokleuring of RNA en eiwit extractie beschreven. Daarnaast beschrijven we methoden om SERT functie en regulatie bestuderen door TGF-β1, een pleiotrope cytokine, in kleine darmmucosa door toepassing van een Ussingkamer techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Studie van Intestinale Transporters in een 3D-cultuur systeem van Caco-2: Groeiende 3D Caco-2 Cell Culture op een Gelatineachtig eiwitmengsel
- Dooi groeifactor verminderde gelatineuze proteïnemengsel op ijs gedurende 8 uur (of O / N) bij 4 ° C. Eenmaal ontdooid, maak 1 ml of 500 ul porties voor gebruik of op te slaan bij -20 ° C voor later gebruik.
- Op de dag van de cultuur, te koelen de kweekplaten (voor RNA en eiwit extractie) of chambered dia's (voor immunokleuring) op ijs. Voeg 30 ul van geleiachtige eiwit mengsel aan elk putje van een acht-well chambered-glasplaatje (of 120 ul per putje van een 6-wells plaat) en gelijkmatig verdelen. Zorg ervoor dat luchtbellen niet te genereren tijdens het proces.
- Plaats de objectglaasjes / platen in een cel incubator bij 37 ° C gedurende 15-30 minuten en laat het gelatineuze eiwitmengsel te stollen.
- Terwijl het gelatineuze eiwitmengsel wordt stollen, trypsinize een confluente kolf van Caco-2 cellen.
- Tel het aantalcellen en draaien ze bij 500 xg in een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cel pellet in 3D Caco-2 Medium als dat nodig is.
- Het zaad van de glazen kamer dia's bij 4.000 cellen per putje (voor borden, 20.000 per putje). Laat de cellen groeien in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. Verander medium om de 3 - 4 d.
2. Immunofluorescentie kleuring voor epitheliale Transporters in 3D Caco-2-cellen: Dag 1
- Zuig het medium en vast de cellen met 400 ul van 2% paraformaldehyde (PFA) (in PBS met pH bijgesteld tot 8,5 met NaOH) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: PFA oplossing niet bewaren langer dan 1 week bij 4 ° C, en vers gemaakte oplossing kan worden gebruikt. LET OP: PFA is zeer giftig en een mogelijke kankerverwekkende stof. omgaan altijd met de nodige voorzichtigheid in een chemische kap en het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen. - Spoel de putjes tweemaal met 1x PBS en de glijbanen bewaren bij 4 ° C in PBS (400 ul /goed). Eenmaal vastgesteld, bewaar ze bij 4 ° C gedurende maximaal een week.
- Verwarm de kamer dia's RT (dit zal de geleiachtige eiwitmengsel bed verharden en maken het gemakkelijk om aspireren tijdens het wassen stappen).
- Permeabilize de cellen met 0,5% Triton in PBS gedurende maximaal 15 minuten.
- Bereid PBS-glycinebuffer (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2PO 4 en 100 mM glycine). 3x spoelen met 1x PBS-glycine gedurende 10 min elk bij kamertemperatuur.
- Bereid immunofluorescentie buffer (IF): 130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2PO 4, 100 mM glycine, 7,7 mM NaN3, 0,1% BSA, 0,2% Triton X-100 en 0,05% Tween-20 .
- Was 3x in IF-buffer gedurende 10 minuten elk bij kamertemperatuur. Blok in 5% Normaal Geit Serum (NGS) in IF-buffer. Incubeer met primaire antilichaam verdund in IF + 1% geit serum, 200 ul / putje, gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur. Wassen met IF-buffer 3x gedurende 10 minuten elk.
- Incubate met secundaire antibody (1: 200) verdund in IF + 1% NGS, 200 ul / putje, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Wassen met IF-buffer driemaal gedurende 10 minuten elk. Houd de dia's in het donker van deze stap op. Til de plastic kamers van de glaasjes door het plaatsen van de kamer dia in een zwarte houder schuiven en een witte lifter door de houder totdat de rand contact maakt met de rand van de putjes. Trek de kamers (de houder en lifter moet komen met de cultuur dia's).
- Monteer met trage anti-fade medium en laat ze drogen gedurende 10 minuten bij RT.
- Eenmaal volledig opgedroogd, sluit de dia's met nagellak en beeld ze met confocale microscopie. Bewaar de objectglaasjes bij 4 ° C gedurende twee weken bij -20 ° C gedurende enkele maanden.
3. RNA en eiwit extractie van 3D Caco-2 cellen
- Behandel de cellen gekweekt op gelatineuze eiwitmengsel voor 12 - 14 met een testmiddel, zoals TGF- β1 (10 ng / ml, 1 h).
- Na de behandeling, was de cellen met 1x PBS. Houd de cellen op ijs gedurende 30 min om het gelatineuze proteïnemengsel vloeibaar.
- Was de putjes met gekoelde PBS en verzamelen van de cellen in de verschillende centrifugebuizen. Verzamel de cellen door lage snelheid centrifugatie bij 500 xg en 4 ° C gedurende 10 minuten. Extraheer het RNA met behulp van standaardprocedures en gebruik real time RT-PCR.
- Voor eiwitextractie lyseren van de cellen met behulp 1x cellysis buffer aangevuld met 1x protease inhibitor cocktail. Na toevoeging cellysis buffer om de pellet lyseren de cellen door sonificatie en verwijder de celresten door centrifugatie bij 7500 xg en 4 ° C gedurende 10 minuten.
4. Meting van de 5-HT opname in Mouse Ileum Gebruik makend van een Ussing Kamer: Intestinale Voorbereiding en Seromuscular Strippen
- Naar aanleiding van euthanasie, ontleden de muizen en verwijder de dunne darm (na de maag en voor de blindedarm). Verdeel de dunne darm in drie delen. Gooi het middelste derde, gebruik maken van de proximale derdeals jejunum, en gebruik maken van de distale derde als ileum. Vermijd trekken de darm van de mesenteriale gehechtheid aan beschadiging van het epitheel te voorkomen. Houd het weefsel sectie kou door te bedekken met ijskoud Krebs-Ringer bicarbonaat (KBR) buffer.
- Open de darm longitudinaal met een schaar. Incubeer vers uitgesneden intestinale secties in ijskoude, gassing KBR met 1 uM indomethacine gedurende 10 min voor het seromuscular strippen.
- Speld de intestinale sectie (~ 1 cm in lengte) mucosale naar beneden om een plaat met 7% agarose of siliconen elastomeer (0,5 cm dik).
- Strip de seromuscular lagen onder een dissectie stereomicroscoop met een bottom-verlichting. Snijd de seromuscular laag met behulp van een veer scalpel. Gebruik fijne tang om de rand van de laag langs de lengteas van de darm te verkrijgen.
LET OP: Tijdens het strippen procedure, de onderkant verlichting van de stereomicroscoop helpt om gebieden aan te wijzen en te voorkomen dat met de patch Peyer'ses. - Na de voltooiing van de seromuscular strippen, zet de mucosa voorzichtig op de pinnen van een Ussing halve kamer. Gedurende het hele proces, zorg om de gestripte mucosale weefsel te houden aan de randen om scheuren te voorkomen.
5. Evenwicht en Tissue Treatment
- Bereid Krebs oplossing: 115 mM NaCl, 25 mM NaHCO 3, 2,4 mM K 2 HPO 4, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2 en 0,4 mM KH 2PO 4 bij pH 7,4, begast met 95% O2 / 5% CO 2 bij 37 ° C. Voeg 10 mM glucose aan de serosale bad om te dienen als een energie substraat en 10 mM mannitol aan het mucosale bad om de osmotische evenwicht.
OPMERKING: Krebs oplossing wordt aangevuld met L-ascorbinezuur (100 uM) en pargyline (100 uM, monoamine oxidase inhibitor) intracellulaire 5-HT afbraak voorkomen. - Plaats de schuifknop in de kamer om zowel de apicale (lumen) si blooten de basolaterale (serosale) zijde van het weefsel Krebs oplossing.
- Na een equilibratieperiode van 10 minuten, voorbehandelen ileale weefsel met fluoxetine (10 uM) gedurende 30 min aan de apicale kant voor J ms (mucosaal naar serosaal flux).
- Behandelen van het weefsel met TGF-β1 (10 ng / ml) gedurende 1 uur op basolaterale kant en incubeer vervolgens met 3 [H] -5-HT (20 nM) gedurende 30 min aan de apicale kant.
6. Kwantificering van mucosale tot serosale Flux (J ms) en 3 [H] -5-HT accumulatie in het weefsel
- Verzamel 0,75 ml porties van de serosale reservoir (totaal 5 ml) om de radioactiviteit in een vloeistofscintillatieteller en mucosale naar serosaal (J ms) flux berekenen; fluoxetine-gevoelige flux representeert SERT-gemedieerde 3 [H] -5-HT opname.
- Om hydrostatische druk verschillen tussen het slijmvlies tijdens een flux periode te voorkomen, nemen monsters uit de sereuze kant en replaats ze met identieke volumes badmedium.
OPMERKING: De flux berekening gecorrigeerd voor de verdunning van het eindmonster (4,25 ml / 5 ml = 0,85). - Voor de kwantificering van 3 [H] -5-HT geaccumuleerd in het weefsel, demonteer de slijmvlies van de slider, was het eens met ijskoude KRB buffer, en plaats het in glascultuur buizen.
- Incubeer de mucosa in 0,5 ml 10% KOH nacht bij 37 ° C. Meet de radioactiviteit in 150 pl hoeveelheden van de lysaten (in triplo) met een vloeistofscintillatieteller.
- Gebruik aliquots (3-5 ui) van de lysaten eiwitconcentratie gemeten met de Bradford methode.
OPMERKING: 10 ml incubatiemedium met radioactieve serotonine wordt gebruikt als een standaard. 5-HT in het weefsel vastgehouden wordt uitgedrukt als pmol / mg proteïne / min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunokleuring in 3D Caco-2 cysten weergegeven in figuur 1. Een representatief beeld van een XY-vlak toont goed afgebakende lumen in de 3D cyste gekleurd met falloïdine actine is in Figuur 1A. De kant van het lumen geeft de apicale kant. Epitheelcellen gekweekt in een 3D-omgeving resulteren in een robuuste epitheliale fenotype. Verschillende Caco-2 cysten op dag 12, als actine en SERT werden samen gekleurd, worden getoond in Figuur 1B. In deze representatie van een XY-vlak (verschillend van de in figuur 1A vlak), SERT kleuring zichtbaar, overwegend luminale membraan, samen met sub-apicale kleuring. Figuur 2 toont dat SERT eiwitten is verhoogd bij 3D cysten vergeleken met Caco-2-cellen gekweekt als monolagen op de 12 ste dag postplating. Deze gegevens suggereren dat de 3D cultuur van Caco-2-cellen kunnen leiden signaleringsgebeurtenissen die nabootsen natief epitheel en resulteren in verhoogde SERT meningsuiting. Figuur 3A toont het algemene overzicht en werking van een Ussing kamersysteem en toont de gemonteerde dunne darm in de pennen van de opening. Deze techniek maakt de evaluatie van de activiteit van epitheliale transporters in de natieve darm. Het voordeel van de Ussingkamer aanpak is de mogelijkheid om de functie van transporters tot expressie gebracht op het luminale (mucosa) of basolaterale (serosaal) zijde beoordelen. Figuur 4 demonstreert verhoogde 5-HT J ms flux (A) en hogere 5-HT accumulatie in de dunne darm mucosa (B) als reactie op TGF-β. Aangezien TGF-β1 de beweging van radioactief gemerkt 5-HT steeg van de mucosale tot serosale zijde, zoals weergegeven door de J ms Deze gegevens duiden op een toename van 5-HT opname van het luminale membraan van het ileum epitheelcellen. Dit wordt verder duidelijk uit een toename van de accumulatie van radioactief gemerkt 5-HT in de cel, diewas gevoelig voor remming door fluoxetine, die de activiteit van SERT uitgedrukt op het luminale membraan.
Figuur 1: Caco-2 gekweekt op een Gelatineachtig eiwitmengsel 12 d Toont Verschillende Lumen. Red: actine. Voor immunokleuring van Caco-2 cysten gekweekt in 3D, cellen werden gekweekt in een 8-well chambered glijbaan en gekleurd met falloïdine (A), zoals eerder beschreven door Debnath et al. 9. Voor immunokleuring 3D Caco-2 kweek (B) werden cysten gefixeerd in 2% PFA gedurende 30 minuten, behandeld met PBS-glycine en gepermeabiliseerd met 0,5% Triton-X-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na blokkering werden de cysten geïncubeerd in SERT antilichaam (1: 100) gedurende de nacht bij 4 ° C. Ze werden vervolgens gewassen en geïncubeerd met fluorescentie-geconjugeerde secundaire antilichamen (1: 200) en phalloidin (1: 200)gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Tenslotte werden ze in antifade met DAPI gemonteerd. Beelden werden opgenomen met een confocale microscoop. Schaal bar: 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: SERT eiwitexpressie in Caco-2 cellen gekweekt in 2D en 3D. Lysaten van Caco-2-cellen gekweekt op een drager van kunststof en Caco-2 3D bolletjes werden gescheiden door SDS-PAGE geblot op nitrocellulose membranen en geanalyseerd met SERT antilichaam en GAPDH. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
![figuur 3]("/files/ftp_upload/55304/55304fig3.jpg")
Figuur 3: (A) De Ussingkamer en "schuif" met de pennen en diafragma toont een gemonteerde muis dunne darm. Slider apertuuroppervlak = 0,30 cm 2. De schuif past in de twee helften van de Ussingkamer, die gecompartimenteerd zijn. Elektrische parameters, zoals transepitheliale potentiaal (Vt), wordt gemeten door een potentiometer en elektroden (meestal calomel halfcellen of Ag-AgCl zijn verbonden door zoutbruggen elke kamer helft). Zoutbrug bestaan uit 3% agar smolt in de fysiologische buffer (bijv KBR) gebruikt voor het wassen van de mucosa wijzigingen in de ionische samenstelling van de oplossingen te vermijden. (B) Schematische voorstelling van het principe van de Ussing kamer. De gestripte darmslijmvlies is gemonteerd in de twee helften van de Ussingkamer scheidt de mucosale en serosale kamers. Radioactieve tracer werd aan de mucosale side; de opname werd gemeten als de hoeveelheid radioactiviteit opgenomen door het weefsel, genormaliseerd naar het totale eiwitgehalte. De flux werd geëvalueerd door meting van de radioactiviteit in de serosale kamer gedurende een tijdsperiode. De in de schema elektroden zorgen voor de gelijktijdige controle van de elektrische parameters, waaronder de stroom, spanning en weerstand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Meting van SERT Functie in Ileal Slijmvlies Ontdaan van de Seromuscular Layer. Ex vivo effecten van kortdurende TGF-β1 behandeling op SERT functie in de muis ileum, aangetoond door het meten van 3 [H] -5-HT opname en 3 [H] -5-HT fluxen via deUssing kamer. TGF-β1 behandeling (10 ng / ml, 1 h) van de basolaterale kant aanzienlijk toegenomen SERT functie, zoals blijkt uit de toename van Na + -gevoelige mucosaal naar serosaal flux (J ms) (A) en 3 [H] - 5-HT opname (B). Fluoxetine behandeling van de dunne weefsel geremd-TGF-β1 gestimuleerd 5-HT opname. Fluoxetine-gevoelige opname werd verhoogd 2,5-voudig door TGF-β1 vergelijking met de controle. Resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Een eenzijdige ANOVA Tukey test werd gebruikt voor statistische analyse. Berekening van J ms flux: [(CPM e - CPM s) x Verdunningsfactor] / [(. V std x conc van substraat) CPM std / xtxa]. CPM e: tellingen per minuut aan het einde van de flux meting; CPM s: tellingen per minuut aan het begin van de flux meting; CPM std: tellingen per min standaard (overgenomen uit het mucosale reservoir); V std: volume of de CPM std; t: tijd van de flux in h; a: gebied van de opening (0,3 cm 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Volledig gedifferentieerde Caco-2-celmonolagen werden uitgebreid gebruikt als gepolariseerde epitheliale monolagen intestinale transport 10, 11, 12, 13, 14, 15 bestuderen. Echter, de fysiologische organisatie van darmepitheelcellen na te bootsen, is er aanzienlijke belangstelling voor de ontwikkeling van een Caco-2 cultuur in 3D geweest. Een aantal 3D celkweek modellen voor intestinale epitheelcellen zijn recentelijk ontwikkeld dat natieve cel-cel en cel-extracellulaire matrix (ECM) interacties met meer fysiologisch relevante dan 2D systemen 16 nabootsen. Derhalve zijn ECM gebaseerde natuurlijke hydrogels met gemeenschappelijke componenten (zoals laminine, collageen IV, en heparine sulfaat proteoglycan) uitgebreid gebruikt voor het genereren van 3D celculturen 16.
De hier beschreven protocol toont de geschiktheid van 3D Caco-2-cellen gekweekt in geleiachtige eiwitmengsel (een op ECM gebaseerde natuurlijke hydrogel gewonnen uit Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis tumoren) voor epitheliale transport onderzoek. Binnen 10 dagen, de cellen beginnen met een hol lumen omgeven door een laag cellen en tonen polariteit, met duidelijke apicale en basolaterale domeinen vormen. De celdichtheid op het moment van enten op een gelatineus eiwitmengsel is essentieel voor de vorming van reguliere cysten met centrale lumen. Voor kleuring experimenten, we 4.000 cellen / putje van een 8-kamer slide (: 0,7 cm 2 en oppervlakte) toegevoegd. Zaaien cellen bij een hogere dichtheid leidt tot onregelmatige sferen. De 3D Caco-2 cysten bij 10 - 12 dagen tonen polariteit en differentiatie dan 2D Caco-2-cellen gekweekt op 17 transwells (ongepubliceerde waarnemingen). We toonden een duidelijke toename in de expressie van SERT mRNA en eiwitniveaus als compingared volledig gedifferentieerde 2D monolagen. Ook het gebruik van deze methode, hebben we aangetoond dat TGF-TGF-β1 vergroot het oppervlak niveau van SERT, zoals getoond door immunofluorescentie kleuring 15.
Interessant is dat recente studies aangetoond dat 3D Caco-2 cellen zijn gevoeliger voor pathofysiologische stimuli door de aanwezigheid van kritische signaleringscomponenten zoals TNF receptor 2 en MyD88 en een beter model dan de conventionele 2D-systeem 17 vertegenwoordigt. Echter, een probleem dat het gebruik van 3D Caco-2 in epitheliale vervoeronderzoek beperkt is het ontbreken van de verschillende celtypes en de complexiteit die zijn gevonden in de natieve darm. In dit verband intestinale organoids (ook bekend als enteroids / colonoids) van humane of muis oorsprong vormen een state-of-the-art model met alle verschillende celtypen inheemse epitheel aan het transport van ionen, nutriënten of drugs bestuderen. In vergelijking met organoids, goed3D gedifferentieerde Caco-2 cysten vertegenwoordigen een type epitheelcellen (dwz absorberend enterocyten) en zijn zeker geschikt voor studies gericht op de cellulaire en moleculaire mechanismen die intestinale transporters. Dit komt omdat de 3D Caco-2 cellen zijn gemakkelijk te hanteren, kosteneffectief en eenvoudig te manipuleren, zoals transfecties van plasmide-DNA en siRNA's. Een andere beperking van 3D Caco-2-cellen in epitheliale transport onderzoek is de moeilijkheid bij de toegang tot het lumen. Middelen die binden aan membraanreceptoren of infectieuze agentia die het epitheel openen vanuit het luminale zijde luminale uitdaging kan zijn voor een studie in dit systeem. Deze beperking kan worden overwonnen door microinjecting makelaars in het lumen, zoals eerder in gevallen van menselijke intestinale organoïde kweek voor C. difficile infecties 18 geschreven. Het is echter belangrijk dat studies in vitro celcultuur modellen worden gevalideerd in de natieve intestine gebruik in vivo of ex vivo technieken.
In de afgelopen decennia is de Ussingkamer sterk bijgedragen aan de erkenning van de functionele of regulerende eigenschappen van de vele epitheliale vervoerders 19. Hier tonen we de geschiktheid van de Ussingkamer benadering 5-HT flux en 5-HT opname in muizen darmslijmvlies zonder de seromuscular laag 15 te meten. TGF-β1 behandeling van de dunne slijmvlies aan de basolaterale zijde (10 ng / ml, 1 h) aanzienlijk toegenomen SERT-functie, zoals aangetoond door de toegenomen Na + -gevoelige mucosaal naar serosaal flux (J ms) en 3H-5- HT opname. Fluoxetine behandeling van de dunne weefsel remde de TGF-β1-gemedieerde stimulatie van 5-HT opname.
Kritische stappen van deze techniek omvatten het monteren van het weefsel op de dia diafragma als intact laag (zonder scheuren) teneinde achie ve nauwkeurige metingen. Geschikte chirurgische instrumenten, zoals bal schaar, thin-tip pincet, en veren chirurgische messen, zijn belangrijk voor de juiste behandeling en het strippen van het weefsel.
Deze methode is toepasbaar voor de functie van andere epitheliale transporteurs, zoals elektrolyt transporteurs (chloride transporters, Na + / H + warmtewisselaars, voedingsmiddel transporteurs, enz.) Te bestuderen. Gespecialiseerde gebruik van de Ussing kamer-zoals de pH stat techniek om transepitheliaal bicarbonaat afscheiding, en de isotopische flux methode te meten, om de netto uitscheiding of absorptie van het meten van substraten-zijn uitvoerig beoordeeld door Dr. Clarke et al. 8. Zij uitvoerig de toepassing van Ussing kamers aan de studie van nutriënten transport 19 beoordeeld. Mini Ussing kamers zijn ook gebruikt in klinisch relevante situaties zoals te functioneren vervoer biopsie monsters te metenref "> 20. Het grote voordeel van de Ussingkamer techniek via gekeerde zak methode is de mogelijkheid om gelijktijdig de elektrische en transportparameters van intacte, gepolariseerde darmepitheel meten.
Een zorg met de Ussingkamer methode is de beperkte levensvatbaarheid en de optimale werking van een ex vivo darm voorbereiding. Na verwijdering van het dier, kan de ex vivo darm voorbereiding slechts duren tot 3 uur in een Ussing kamer 19. Zo kan deze werkwijze beperkingen bij het testen van het effect van middelen voor langere perioden. In dergelijke gevallen kan de behandeling worden uitgevoerd in vivo en daarna geïsoleerd ingewanden van controle- en behandelingsgroepen kan gebruikt worden om het transport met als Ussing methode gemeten. In alle gevallen kan de grootte van de G t (of Rt) een real-time indicator voor de levensvatbaarheid en kan nuttig zijn bij het onderscheiden tussen despecifieke en niet-specifieke effecten van geteste reagentia.
Samengevat kunnen de hier beschreven werkwijzen ons begrip van de cellulaire en moleculaire mechanismen die de functie en regulatie van epitheliale transporters in gezonde en zieke condities zoals darmontsteking, infectueuze diarree, malabsorptie of metabole stoornissen vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10x PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95% O2- 5% CO2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa Fluor Phalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| Caco-2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1 Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (NGS, 10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).
- Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
- Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
- Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
- Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
- Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
- Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
- Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
- Chase, A. O. Acyclovir for shingles. Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).
- Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
- Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
- McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
- Chatterjee, I. shita, K, A., Gill, R. avinder K., Alrefai, W. addah A., Dudeja, P. radeep K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).
- Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
- Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
