Summary
אנו מתארים שיטות פשוטות כדי ללמוד את הרגולציה של טרנספורטר הסרוטונין במעיים (בהלבשה) פונקציה וביטוי באמצעות מודל תרבית תאים במבחנה של תאי קאקו-2 גדל ב -3 D ו מודל vivo לשעבר של מעי עכבר. שיטות אלו חלות על המחקר של מובילי אפיתל אחרים.
Abstract
אפיתל המעי יש פונקציות תחבורת מחסום חשובות לשחק תפקיד מפתח פונקציות פיסיולוגיות של הגוף תוך מתן מחסום חלקיקים זרים. תחבורת אפיתל פגומה (יון, מזין, או תרופות) נמצאת קשורה למחלות רבות ויכולה להיות שלכות מרחיבות מעבר הפונקציות הפיזיולוגיות של מובילים, כגון באמצעות השפעה על שלמות אפיתל ואת Microbiome הבטן. הבנת הפונקציה והרגולציה של חלבוני תחבורה היא קריטית להתפתחות של התערבויות טיפוליות השתפרו. האתגר הגדול ביותר בחקר תחבורת אפיתל מפתחת מערכת מודל מתאימה כי משחזרת תכונות חשובות של תאי האפיתל במעי הילידים. כמה במבחנה מודלים תרבית תאים, כגון קאקו-2, T-84, ותאי HT-29-Cl.19A משמשים בדרך כלל במחקר תחבורה אפיתל. שורות תאים אלה מייצגות גישת רדוקציוני דוגמנות הדוארpithelium שמש במחקרים מכניסטית רבים, כולל ובדיקתם של אינטראקציות אפיתל-מיקרוביאלי. עם זאת, monolayers התא אינו משקף במדויק תאי תאי אינטראקציות ואת microenvironment vivo. תאים שגודלו 3D הראו להיות מבטיח מודלים ללימודי חדירות התרופה. אנו מראים כי תאי קאקו-2 ב -3 D יכול לשמש כדי לחקור מובילי אפיתל. כמו כן, חשוב כי מחקרים בתאי קאקו-2 הם השלימו עם מודלים אחרים כדי לשלול תופעות תא ספציפיות לקחת בחשבון את המורכבות של מעי הילידים. כמה שיטות שמשו בעבר על מנת להעריך את הפונקציונליות של מובילים, כגון צק ספיג כלפי חוץ בתאי אפיתל מבודדים או שלפוחית הממברנה מבודדת. אם ניקח בחשבון את האתגרים בתחום ביחס למודלים ומדידת פונקציה תחבורה, אנחנו מדגימים כאן פרוטוקול לגדל תאים קאקו-2 ב 3D ולתאר את השימוש בתא Ussing כקובץגישה יעילה למדידת תחבורה סרוטונין, כגון ב epithelia מעיים שלם מקוטב.
Introduction
אפיתל המעי מצויד חלבוני תחבורה שונים (ערוצים, ATPases, שיתוף מובילי מחליפים) המבצעים פונקציות רבות, החל קליטת חומרים מזינות, אלקטרוליטים, ותרופות הפרשת הנוזלים ויוני לומן. חלבונים התחבורה ליצור הדרגתיים אלקטרוכימיים לאפשר תנועה של יונים או מולקולות באופן וקטורי. זו מושגת על ידי החלוקה הסימטרית של מערכות התחבורה בממברנות הפסגה ו basolateral של תאי אפיתל מקוטבים. בנוסף, צומת הדוקים, אשר לקשור תאי אפיתל סמוכים, ממלא תפקיד חשוב בתהליך זה על ידי המשרת כמחסום דיפוזיה intramembrane של רכיבים בין תחומי קרום apical ו basolateral. מערכות דגם מתאימות מחקו תכונות אופייניות הבאות של מעי הילידים (קוטבי כלומר, בידול, ויושרת צומת חזקה) הם קריטיות עבור המחקר של functionality של מערכות תחבורה אפיתל.
בנוגע למודלים, שורות התאים האופייניות בשימוש כיום במחקר תחבורת האפיתל במעי הם קאקו-2, מודל של בדיל באופן מלא, קליטה תא אפיתל מעי דק; ותאי T-84 או HT-29 subclones, מודלים של תאים אפיתל במעי גדול הנגזרות הקריפטה 1. כמקובל, שורות תאים אלה גדלים כמו monolayers ב משטחי פלסטיק או מוסיף transwell מצופה. חוצה גם תרבית תאים מוסיף במידה מסוימת דומה בסביבה vivo בכך שהוא מאפשר לתאים מקוטבים להאכיל basolaterally. עם זאת, מגבלת מערכות תרבות 2D המקובלות היא כי התאים נאלצים להסתגל משטח מלאכותי, שטוח, ונוקשה. לפיכך, את המורכבות הפיזיולוגיות של האפיטל היליד אינה משתקפות במדויק מערכת 2D. מגבלה זו כבר להתגבר על ידי שיטות לגדל תאי 3D בתוך המיקרו-סביבה ספציפית, כגון mixtur חלבון הדביקדואר, המכיל מגוון של רכיבים התאים מטריקס 2, 3. אף על פי כן, התרבויות במבחנה לא יכול לדמות את המורכבות של האפיתל במעי, אשר יש סוגי תאים מרובים ואדריכלות המיועד לאזור ספציפי במעי. לפיכך, המחקרים באמצעות מודלי תרבית תאים דורשים אימות נוספת במעי הילידים. באמצעות תרבית תאי 3D במבחנה רירית מעי עכבר, אנו מתארים כאן שיטות פשוטות כדי ללמוד את הרגולציה של טרנספורטר הסרוטונין במעיים (SLC6A4, בהלבשה).
טרנספורטר בהלבשה מסדיר את הזמינויות התאיות של הורמון חשוב הנוירוטרנסמיטר, 5 hydroxytryptamine (5-HT), על ידי במהירות והובלתו באמצעות Na + / Cl - תהליך תלוי. בהלבשה היא מטרה ידועה של תרופות נגד דיכאון, התפתחה לאחרונה כמטרה טיפולית חדשנית של הפרעות במערכת עיכול, כמו שלשול ודלקת מעיים.שיטות לחקור ספיגת 5-HT בתאי האפיתל במעי תוארה בעבר. לדוגמא, תאי קאקו-2 גדלו על תומך פלסטיק או מוסיף חדיר הוכחו להפגין fluoxetine רגיש 3 H-5-HT ספיג הן תחומי פסגה ו basolateral 4. מדידת התפקוד בהלבשה ב מבודד מברשת גבול ממברנה שלפוחית (BBMVs) שהוכנה במעי דק תורם אנושי איבר אף תוארה על ידינו 5. ספיג 3 H-5-HT ב BBVMs האנושי הוצג להיות fluoxetine רגיש Na + / Cl - תלוי, וזה הציג קינטיקה רווי עם K m של 300 ננומטר 5. ניצול בשיטות דומות, אנחנו גם נמדדנו קודם לכן פונקציה בהלבשה כמו 3 ספיגת H-5-HT ב BBMVs עכבר מעי 6. עם זאת, הכנת שלפוחית קרום פלזמה טהורה דורשת כמות גדולה של רירית רקמות. שיטות אחרות, כגון radiogלהדמית raphic של 3 אתרים ספיגים H-5-HT, גם הוכחה בעבר שרקן ומעי עכברוש קטנים 7.
תא Ussing מספק מערכת פיזיולוגית יותר למדוד את התחבורה של יונים, חומרים מזינים, וסמים פני רקמות שונות אפיתל. היתרון העיקרי של הטכניקה קאמרית Ussing הוא שהיא מאפשרת מדידה מדויקת של פרמטרים חשמליים והובלה של שלם, אפיתל המעי מקוטב. יתר על כן, כדי למזער את ההשפעה של מערכת עצבית-שרירית מהותי, הפשטה seromuscular של רירית המעי ניתן לבצע כדי לחקור את הרגולציה של מובילי באפיתל 8.
אנו מראים כי קאקו-2 תאים שגודלו ב -3 D על חלבון דביק יוצרים לומן חלול להביע סמני פסגה ו basolateral ברורים. תאים אלו מראים ביטוי גבוה של בהלבשה מאשר תאי 2D קאקו-2. שיטות לגדל תאי 3D וכדי peimmunostaining rform או מיצוי RNA והחלבון מתואר. בנוסף, אנו מתארים שיטות ללמוד לתפקד בהלבשה וויסות TGF-β1, ציטוקין pleiotropic, ב רירית המעי הדק בעזרת ניצול טכניקה קאמרית Ussing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר 1. של מסועי מעיים בתוך מערכת תרבות 3D של קאקו-2: קאקו-2 3D גידול תרבית תאים על תערובת חלבון דביקה
- גורם גדילת הפשרה מופחת תערובת חלבונים דביקה על קרח למשך 8 שעות (או O / N) בשעה 4 מעלות צלזיוס. לאחר מופשר, להפוך 1 מ"ל או 500 aliquots μL לשימוש או בחנות ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
- ביום התרבות, precool צלחות התרבות (להפקת RNA וחלבון) או שקופיות תאיות (עבור immunostaining) על קרח. הוסף 30 μL של תערובת חלבונים דביקה היטב בכל שקופית שמונה גם מחולקת לתאים-זכוכית (או 120 μL לכל טוב של צלחת 6-היטב) להתפשט באופן שווה. יש להיזהר שלא ליצור בועות אוויר תוך כדי התהליך.
- מניחים את השקופיות / צלחות בתוך תרבית תאים חממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 - 30 דקות ולאפשר לתערובת חלבון דביקות כדי לחזק.
- בעוד תערובת החלבונים הדביקה היא לחיזוק, trypsinize בקבוק ומחוברות של תאי קאקו-2.
- הספירהשל תאים ומסובב אותם ב XG 500 בצנטריפוגה השולחן במשך 5 דקות. Re- להשעות את התא גלולה ב 3D קאקו-2 בינוני לפי הצורך.
- זרעי השקופיות קאמרי זכוכית ב 4000 תאים לכל טוב (צלחות, 20,000 לכל טוב). אפשר התאים לגדול בתוך חממה humidified 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. שנה בינונית כל 3 - ד 4.
2. Immunofluorescence מכתים עבור מסועים אפיתל בתוך תאים 3D קאקו-2: יום 1
- לשאוב הבינוני לתקן את התאים עם 400 μL של 2% paraformaldehyde (PFA) (ב PBS עם pH מותאם 8.5 עם NaOH) למשך 30 דקות ב RT.
הערה: פתרון PFA לא צריך להיות מאוחסן במשך יותר מ -1 שבוע ב 4 ° C, ואת הפתרון יכול לשמש טרי. זהירות: PFA היא רעילה ביותר ו קרצינוגן פוטנציאלי. תמיד טפל בו בזהירות במנדף כימי ושימוש בציוד מגן אישי. - יש לשטוף את הבארות פעמיים עם PBS 1x ולאחסן את השקופיות ב 4 ° C ב PBS (400 μL /טוֹב). לאחר קבוע, ולאחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
- מומלץ לחמם את השקופיות הקאמריות כדי RT (זה יקשיח מיטת תערובת חלבונים הדביקה ולהפוך אותו קל לשאוב במהלך שלבי הכביסה).
- Permeabilize את התאים עם 0.5% טריטון ב PBS לא יותר מ -15 דקות.
- הכן חיץ PBS-גליצין (130 mM NaCl, 7 מ"מ Na 2 4 HPO, 3.5 מ"מ לאא 2 PO 4, ו -100 מ"מ גליצין). לשטוף 3x עם 1x PBS-גליצין במשך 10 דקות כל אחד ב RT.
- הכן חיץ immunofluorescence (IF): 130 מ"מ NaCl, 7 מ"מ Na 2 4 HPO, 3.5 מ"מ לאא 2 PO 4, 100 מ"מ גליצין, 7.7 מ"מ NaN 3, 0.1% BSA, 0.2% TritonX-100, ו 0.05% Tween-20 .
- 3x לשטוף IF חיץ במשך 10 דקות כל אחד ב RT. בלוק 5% סרום עיזים רגיל (NGS) במאגר IF. דגירה עם נוגדן ראשוני מדולל סרום עיזים IF + 1%, 200 μL / גם עבור 1 - 2 שעות ב RT. לשטוף עם 3x חיץ IF במשך 10 דקות כל אחד.
- דגירה עם אנטי משניהגוף (1: 200) מדולל IF + 1% NGS, 200 μL / היטב, עבור 1 ש 'ב RT.
- לשטוף עם חיץ IF שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. שמור את השקופיות בחושך משלב זה על. הרם את תאי הפלסטיק מן שקופיות זכוכית על ידי צבת את השקופית הקאמרית בפומית שחורה והחלקת מרים לבן דרך מחזיק עד מגעי הקצה שלה לקץ הבארות. משכו בעדינות את התאים (מחזיק המרים צריך לבוא עם מגלשות התרבות).
- הר עם מדיום אנטי לדעוך לאט ולאפשר לו להתייבש במשך 10 דקות ב RT.
- מיובש פעם לגמרי, לאטום את השקופיות עם לק ותמונה אותם עם מיקרוסקופ confocal. אחסן את השקופיות ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים או ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
3. רנ"א מיצוי חלבון מתאי 3D קאקו-2
- פנקו את התאים בתרבית על תערובת חלבונים דביקות עבור 12 - 14 ד עם סוכן הבדיקה, כגון β1 TGF- (10 ng / mL, 1 ח).
- לאחר הטיפול, לשטוף את התאים עם 1x PBS. שמור את התאים על קרח למשך 30 דקות כדי למוסס את תערובת חלבונים הדביקה.
- לשטוף את הבארות עם PBS הצונן לאסוף את תאי צינורות צנטריפוגות בודדים. אוספים את התאים באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה ב XG 500 ו -4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. חלץ את RNA באמצעות הליכים סטנדרטיים להשתמש בזמן אמת RT-PCR.
- להפקת חלבון, lyse התאים באמצעות חיץ תמוגה התא 1x השלימו עם מעכב פרוטאז קוקטייל 1x. לאחר הוספת חיץ תמוגה התא גלולה, lyse התאים על ידי sonication ולהסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 7500 XG ו -4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. מדידה של 5-HT ספיגת עכבר מעי ניצול לשכת Ussing: הכנת מעיים ו Seromuscular שלילת
- בעקבות המתת חסד, לנתח העכברים ולהסיר את המעי הדק (אחרי הקיבה לפני cecum). מחלק את המעי הדק לשלושה חלקים. מחק את השליש האמצעי, השתמש השלישי הפרוקסימליכמו מְעִי צָם, ולהשתמש השלישי דיסטלי כמו מעי. הימנע משיכת המעי מעיקול mesenteric שלה כדי למנוע נזק האפיתל. לשמור על קור קטע רקמה על ידי כיסוי אותו עם חיץ קר כקרח קרבס-רינגר ביקרבונט (KBR).
- פתח את המעי longitudinally באמצעות מספריים. דגירת סעיפים במעי ניכרו טרי קר כקרח, בגז KBR המכיל אינדומטצין 1 מיקרומטר במשך 10 דקות לפני seromuscular ההפשטה.
- הצמד את סעיף מעיים (~ 1 ס"מ אורך) הרירית בצד למטה לצלחת המכיל agarose 7% או אלסטומר סיליקון נרפא (0.5 ס"מ עובי).
- להפשיט את שכבות seromuscular תחת סטראו דיסקציה עם תאורה תחתית. חותכים את שכבת seromuscular באמצעות סכין אזמל נוצה. שימוש במלקחיים בסדר להשיג קצה השכבה לאורך ציר האורך של המעי.
הערה: במהלך הליך ההפשטה, התאורה התחתונה של סטראו עוזרת לזהות ולהימנע אזורים עם התיקון של Peyeres. - לאחר השלים הפשטת seromuscular, הר הרירי בקפידה על הפינים של חץ תא Ussing. במהלך כל התהליך, לטפל להחזיק את הרקמה הרירית כיסחה בקצותיו מבלי לקרוע אותו.
5. איזון וטיפול רקמות
- הכן פתרון של Kreb: 115 מ"מ NaCl, 25 מ"מ 3 NaHCO, 2.4 מ"מ K 2 4 HPO, 1.2 מ"מ CaCl 2, 1.2 מ"מ MgCl 2, ו -0.4 מ"מ KH 2 PO 4 ב- pH 7.4, בגז עם 95% O 2/5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. הוסף 10 מ"מ גלוקוז לאמבטיה serosal כדי לשמש מצע אנרגיה ו -10 מ"מ מניטול לאמבטיה הרירית כדי לשמור על האיזון האוסמוטי.
הערה: הפתרון של Kreb הוא השלים עם חומצת L-אסקורבית (100 מיקרומטר) pargyline (100 מיקרומטר, מעכב מונואמין אוקסידאז) כדי למנוע שפלה תאית 5-HT. - הכנס את המחוון לתוך התא לחשוף הוא את סי הפסגה (לומינל)דה והצד (serosal) basolateral של הרקמה כדי פתרון של Kreb.
- לאחר תקופת איזון של 10 דקות, pretreat רקמת ileal עם fluoxetine (10 מיקרומטר) למשך 30 דקות בצד הפסגה עבור MS J (רירית אל serosal שטף).
- פנקו את הרקמה עם-β1 TGF (10 ng / mL) במשך שעה 1 בצד basolateral ואז דגירה אותו עם 3 [ח] -5-HT (20 ננומטר) למשך 30 דקות בצד הפסגה.
6. כימות רירית כדי Serosal Flux (ms J) ו -3 [ח] הצטברות -5-HT ברקמה
- אסוף 0.75 aliquots מיליליטר ממאגר serosal (סה"כ 5 מיליליטר) כדי למדוד את הרדיואקטיביות מונה נצנץ נוזלי לחשב רירית אל serosal (ms J) מחירי שטף; fluoxetine רגיש שטף מייצג בהלבשה בתיווך 3 [ח] ספיגה -5-HT.
- כדי למנוע הבדלי לחץ ההידרוסטטי פני הרירי במהלך תקופת שטף, לקחת דגימות מצד serosal מחדשלמקם אותם עם כמויות זהות של מדיום אמבטיה.
הערה: החישוב השטף מתקנת עבור דילול של המדגם סוף (4.25 מ"ל / 5 מ"ל = 0.85). - עבור כימות של 3 [ח] -5-HT שנצבר בתוך הרקמה, לרדת רירית מן המחוון, לשטוף אותו פעם עם חיץ KRB קר כקרח, ולמקם אותו צינורות תרבות זכוכית.
- דגירה רירית ב 0.5 מ"ל של 10% KOH לילה בשעה 37 ° C. מדוד את הרדיואקטיביות ב 150 aliquots μL של lysates (ב triplicates) בעזרת מונה נצנץ נוזלי.
- השתמש aliquots (3 - 5 μL) של lysates למדוד ריכוז החלבון בשיטת ברדפורד.
הערה: 10 מ"ל של מדיום הדגירה המכילים סרוטונין רדיואקטיבי משמש כסטנדרט. 5-HT שמר ברקמת מבוטא pmol / מ"ג חלבון / min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunostaining ציסטות 3D קאקו-2 מוצג באיור 1. תמונה מייצגת של מטוס- XY מראה לומן היטב תחום של ציסטה 3D מוכתמת יקטין phalloidin מתוארת באיור 1 א. הצד הפונה לומן מציין את צד הפסגה. תאי אפיתל בתרבית מכך סביבת 3D ב פנוטיפ אפיתל חזק. קאקו-2 ציסטות שונים ביום 12, כאשר יקטינו בהלבשה הייתה שיתוף מוכתם, מוצגים באיור 1B. בייצוג זה של מטוס XY (שונה מהמטוס שמוצג באיור 1 א), מכתים בהלבשה גלוי, בעיקר בקרום לומינל, יחד עם מכתים תת-פסגה. איור 2 מראה כי רמות החלבון בהלבשה גבוהות יותר ציסטות 3D לעומת קאקו-2 תאים שגודלו כמו monolayers על 12 postplating יום ה. נתונים אלה מראים כי תרבות 3D של תאי קאקו-2 יכולה להפעיל אירועי איתות מחקי נהtive epithelia ולגרום ביטוי בהלבשה מוגברת. 3A איור המתאר את הסקירה הכללית ותפעול של מערכת תא Ussing ומראה את המעי הדק רכוב הסיכות של הצמצם. טכניקה זו מאפשרת הערכה של פעילות של מובילי אפיתל במעי הילידים. היתרון של הגישה לתא Ussing היא היכולת להעריך את הפונקציה של מובילי ביטוי על לומינל (רירית) או basolateral (serosal) בצד. איור 4 מדגים עלה 5-HT J השטף ms (א) והגדילה הצטברות 5-HT ברירית ileal (B) בתגובה TGF-β. מאז TGF-β1 הגדילו את תנועת radiolabeled 5-HT מן הרירית לצד serosal, כפי שהוא מיוצג על ידי ms J, נתונים אלה מצביעים על עלייה ספיגת 5-HT מן הקרום luminal של תאי אפיתל ileal. זה עוד עולה מגידול ההצטברות של radiolabeled 5-HT בתא, אשרהיה רגיש עיכוב ידי פלואוקסטין, המשקף את הפעילות בהלבשה הביע על הממברנה לומינל.
איור 1: קאקו-2 גדלו על תערובת חלבונים דביקה לאחר 12 ד מציג לומן ברור. אדום: תקטין. עבור immunostaining של ציסטות קאקו-2 גדל ב -3 D, התאים היו בתרבית שקופית 8-היטב תאיים ומוכתם phalloidin (א), כפי שתואר לעיל על ידי Debnath et al. 9. עבור immunostaining התרבות 3D קאקו-2 (ב), ציסטות היו קבועים 2% PFA למשך 30 דקות, שטופלו PBS-גליצין permeabilized עם 0.5% Triton-X-100 במשך 15 דקות ב RT. לאחר חסימה, ציסטות הודגרו נוגדן בהלבשה (1: 100) הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הם נשטפו וטופחו עם נוגדנים משני מצומדות קרינה (1: 200) ו phalloidin (1: 200)במשך 45 דקות ב RT. לבסוף, הם היו קבועים antifade המכיל DAPI. תמונות נתפסו באמצעות מיקרוסקופ confocal. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ביטוי חלבון בהלבשה ב קאקו-2 תאים שגודלו ב 2 ד ו 3D. Lysates מ קאקו-2 תאים בתרבית על תמיכת פלסטיק קאקו-2 3D תחומים נפתרו על ידי SDS-PAGE מוחקים על ממברנות nitrocellulose ונותחו עם הנוגדן בהלבשה ו GAPDH. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
![איור 3]("/files/ftp_upload/55304/55304fig3.jpg")
איור 3: (א) תא Ussing ו "המחוון" עם סיכות הצמצם מראות מעי דק עכבר רכוב. מחוון אזור הצמצם = 0.30 ס"מ 2. המחוון משתלב שני חצי של חדר Ussing, שהן ממודרות. פרמטרים חשמליים, כגון פוטנציאל מתח transepithelial (V T), נמדדו על ידי פוטנציומטר ואלקטרודות (בדרך כלל קאלומל חצי תאים או Ag-AgCl מחובר באמצעות גשרים מלחים לכל חצי קאמרי). גשרי מלח מורכבים אגר 3% נמסו למאגר הפיזיולוגי (למשל, KBR) שאינו משמש לאסלות הריריות להימנע שינויים בהרכב היוני של הפתרונים. (ב) סכמטי של העיקרון קאמרי Ussing. רירית המעי הפשיטה הוצבה בשני החצאים של חדר Ussing הפרדת תאי רירית serosal. נותב רדיואקטיבית נוסף רירית sidדואר; הספיגה נמדדה כסכום של רדיואקטיביות שולב על ידי הרקמה, מנורמל ל תכולת החלבון הכוללת. השטף הוערך על ידי מדידת הרדיואקטיביות בתא serosal על פני תקופה של זמן. האלקטרודות מוצג בסכימה לאפשר ניטור סימולטני של פרמטרים חשמליים, הזרם כולל, מתח והתנגדות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: מדידה של תפקוד בהלבשה ב ileal הרירית Stripped של שכבת Seromuscular. Ex vivo השפעות של טיפול TGF-β1 לטווח קצר על תפקוד בהלבשה ב מעי עכבר, הפגינו דרך המדידה של 3 [ח] ספיגת -5-HT ו [ח] 3 -5-HT והנתיבים באמצעותUssing קאמרית. טיפול TGF-β1 (10 ng / mL, 1 ח) בצד basolateral הגדילה באופן ניכר את התפקוד בהלבשה, כפי שמעידים Na מוגברת + -sensitive הרירית אל serosal השטף (J ms) (א) ו -3 [ח] - ספיגת 5-HT (B). הטיפול פלואוקסטין של הרקמה ileal עכבות TGF-מגורה-β1 ספיגת 5-HT. ספיגת Fluoxetine הרגיש הוגדלה פי 2.5 על ידי TGF-β1 לעומת השליטה. תוצאות מיוצגות כממוצע SEM. המבחן של חד סטרי ANOVA Tukey שמש לניתוח הסטטיסטי. חישוב ms השטף J: [(ה CPM - ים CPM) x דילול גורם] / [(. V std x קונצרט כלשהו של המצע) CPM סטנדרטי / xtxa]. דואר CPM: ספירה לדקה בסוף מדידת השטף; CPM ים: ספירה לדקה בתחילת מדידת השטף; Std CPM: ספירה לדקה לסטנדרטים (נלקח מהמאגר הרירי); V std: נפח o.ו std CPM; t: זמן של שטף h; a: אזור של הצמצם (0.3 ס"מ 2). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לגמרי תא בדיל קאקו-2 monolayers נעשה שימוש נרחב כמו מקוטב monolayers אפיתל ללמוד תחבורת מעיים 10, 11, 12, 13, 14, 15. עם זאת, כדי לחקות את הארגון הפיזיולוגי של תאי אפיתל במעי, חלה התעניינות רבה בפיתוח תרבות קאקו-2 ב 3D. מספר מודלי תרבית תאי 3D עבור תאי האפיתל במעי פותח לאחרונה מחקי מטריקס תאי תאים והתא-תאיים ילידים (ECM) אינטראקציות עם הרלוונטיות פיסיולוגיות רבות יותר ממערכות 2D 16. לפיכך, הידרוג טבעי מבוסס ECM המכיל מרכיבים משותפים (כגון laminin, קולגן IV, ו proteoglycan סולפט הפרין) נמצא בשימוש נרחב עבור הדור של תרביות תאי 3D 16.
הפרוטוקול המתואר כאן מדגים את התאמתו של 3D קאקו-2 תאים שגודלו תערובת חלבונים דביקה (הידרוג'ל טבעי ECM המבוסס מופק Engelbreth-ההולם-הנחיל (EHS גידולי עכבר)) למחקר תחבורת אפיתל. בתוך 10 ימים, התאים מתחילים לגבש לומן חלול מוקפים בשכבת תאים כמוצג, עם תחומי פסגה ו basolateral ברורים. צפיפות התאים בזמן זריעה על תערובת חלבון דביקות היא קריטית ליצירת ציסטות רגילה עם לומן מרכזי. בניסויים מכתימים, הוספנו 4,000 תאים / היטב של (שטח פנים היטב: 0.7 סנטימטר 2) 8-קאמרי שקופיות. זריעת תאים בכל תוצאות צפיפות גבוהות בתחומים סדירים. ציסטות 3D קאקו-2 ב 10 - 12 ימים להראות קוטביות ועוד בידול מאשר תאים 2D קאקו-2 גדל על transwells 17 (תצפיות לא פורסם). הראינו עלייה ניכרת בביטוי של mRNA בהלבשה ורמות חלבון כמו compared כדי monolayers 2D הבדיל באופן מלא. כמו כן, משתמשים בשיטות אלה, הראינו כי TGF-TGF-β1 מגביר את רמות השטח של סרט, כפי שמוצג על ידי immunofluorescence מכתים 15.
מעניין לציין, כי מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי 3D קאקו-2 תאים הם יותר מגיבים לגירויי pathophysiological בגלל הנוכחות של רכיבי איתות קריטיים, כגון TNF receptor 2 ו MyD88, והם מייצגים מודל טוב יותר מאשר מערכת 2D הקונבנציונלית 17. עם זאת, נושא אחד מגביל את השימוש של 3D קאקו-2 במחקר תחבורה אפיתל היא חוסר של תאים מסוגים שונים והן במורכבות נמצאים במעי הילידים. בהקשר זה, organoids מעיים (הידוע גם בשם enteroids / colonoids) של אדם או מצא עכבר מייצג מודל המדינה- of-the-art המכיל את כל סוגי התאים השונים של האפיתל ילידים ללמוד את התחבורה של יונים, חומרים מזינים, או תרופות. לעומת organoids, היטבבדיל 3D קאקו-2 ציסטות מייצגים סוג אחד של תאי אפיתל (enterocytes קליטה כלומר) והם בהחלט מתאימים מחקרי התמקדות המנגנונים התאיים ומולקולריים המסדירים מובילי מעיים. הסיבה לכך היא כי תאי 3D קאקו-2 הם נוחים לטפל, חסכוניים, והם קלים לתמרן, כגון עבור transfections של DNA פלסמיד siRNAs. מגבלה נוספת של תאי 3D קאקו-2 במחקר התחבורה אפיתל היא הקושי בגישת לומן. סוכנים אשר נקלטים על ידי רצפטורים לומינל קרום או למזהמי ניגשים האפיתל מהצד לומינל עשויים להיות מאתגרים ללמוד במערכת זו. מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי microinjecting סוכני לומן, כפי שנעשה בעבר במקרים של תרבות organoid אדם מעיים לזיהומי C. difficile 18. היא, לעומת זאת, חשוב כי מחקרים במודלים תרבית תאים במבחנה הן תוקף של i הילידיםntestine באמצעות in vivo או vivo לשעבר גישות.
במהלך העשורים האחרונים, תא Ussing תרם רב להכרה של תכונות פעילות או רגולטורית של מובילי רבי אפיתל 19. כאן, אנו מציגים את התאמתו של הגישה לתא Ussing למדוד שטף 5-HT ספיג 5-HT ב רירית עכבר מעיים נטולת שכבת seromuscular 15. טיפול TGF-β1 של רירית ileal בצד basolateral (10 ng / mL, 1 h) עלה באופן ניכר את התפקוד בהלבשה, כפי שמעידים Na מוגברת + -sensitive הרירית אל serosal השטף (ms J) ו -3 H-5- ספיגת HT. הטיפול פלואוקסטין של הרקמה ileal עכבות גירוי בתיווך TGF-β1 של ספיגת 5-HT.
צעדים קריטיים של טכניקה זו כוללים הרכבת הרקמה על צמצם השקופיות כנדבך שלם (ללא קריעה) כדי achie ve מדידות מדויקות. כלי כירורגיים מתאימים, כגון מספרי כדור, מלקחיים דק קצה, ו סכין כירורגית נוצה, חשובים לטיפול המתאים הפשטה של רקמות.
שיטה זו ישימה ללמוד את הפונקציה של מובילי אפיתל אחרים, כגון מובילי אלקטרוליטים (מובילי כלוריד, Na + / H + מחליף, מובילי מזין, וכו '). שימושים מיוחדים של Ussing קאמרית-כגון טכניקת stat pH, למדוד הפרשה ביקרבונט transepithelial, ושיטת שטף איזוטופי, למדוד הפרשה או קליטת נטו של מצעים נבדקו באופן מקיף על ידי ד"ר קלארק et al. 8. הם בהרחבה ביקורת על יישום של Ussing תאי לחקר תחבורה מזין 19. תאי המיני Ussing גם שמשו במצבים רלוונטיים קליני, כגון כדי למדוד את תפקוד תחבורה בדגימות ביופסיהנ"צ "> 20. היתרון העיקרי של הטכניקה הקאמרית Ussing פני שיטת השק כלפי חוץ הוא היכולת בו זמנית למדוד את הפרמטרים החשמליים והובלה של שלם, אפיתל מעי מקוטב.
דאגה אחת עם השיטה הקאמרית Ussing היא הכדאיות המוגבלת ותפקוד מיטבים של הכנת vivo לשעבר מעיים. לאחר הסרת מבעל החיים, הכנת vivo לשעבר המעיים עלולה רק להימשך עד 3 שעות בתא Ussing 19. לכן, שיטה זו ייתכנו הגבלות בבדיקת השפעת הסוכנים עבור תקופות זמן ארוכות. במקרים כאלה, טיפול יכול להתבצע in vivo ואז מעיים מבודדים מקבוצות מלאות טיפול יכול לשמש כדי למדוד את פרמטרי תחבורה עם שיטת Ussing. בכל המקרים, את סדר הגודל של ה- G t (או t R) יכול להיות אינדיקטור בזמן אמת ויכולת הקיום של יכול להיות שימושי להפלות ביןהשפעות ספציפיות ולא ספציפיות של ריאגנטים נבדקו.
לסיכום, השיטות שתוארו כאן יכולות להקל על ההבנה שלנו של המנגנונים התאיים ומולקולריים המסדירים את הפונקציה ורגולציה של מובילי אפיתל בתנאים בריאים וחולים, כגון דלקת מעיים, שלשול זיהומיות, ספיג, או הפרעות מטבוליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10x PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95% O2- 5% CO2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa Fluor Phalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| Caco-2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1 Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (NGS, 10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).
- Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
- Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
- Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
- Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
- Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
- Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
- Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
- Chase, A. O. Acyclovir for shingles. Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).
- Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
- Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
- McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
- Chatterjee, I. shita, K, A., Gill, R. avinder K., Alrefai, W. addah A., Dudeja, P. radeep K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).
- Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
- Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
