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Biology

तरीके उपकला परिवहन प्रोटीन समारोह और अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए मूल निवासी आंत और Caco-2 कोशिकाओं में 3 डी में बढ़ी

Published: March 16, 2017 doi: 10.3791/55304
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1,2, 1
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

हम इन विट्रो सेल संस्कृति Caco-2 कोशिकाओं के 3 डी में उगाई मॉडल और माउस आंतों के एक पूर्व vivo मॉडल का उपयोग आंतों सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर (SERT) समारोह और अभिव्यक्ति के नियमन का अध्ययन करने के लिए सरल विधियों का वर्णन। इन विधियों अन्य उपकला ट्रांसपोर्टरों के अध्ययन के लिए लागू कर रहे हैं।

Abstract

आंतों उपकला महत्वपूर्ण परिवहन और बाधा कार्य करता है कि शरीर के सामान्य शारीरिक कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जबकि विदेशी कणों के लिए एक बाधा प्रदान करते हैं। बिगड़ा उपकला परिवहन (आयन, पोषक तत्व, या ड्रग्स) कई रोगों के साथ संबद्ध किया गया है और परिणाम है कि उपकला अखंडता और पेट Microbiome को प्रभावित करने से इस तरह के रूप ट्रांसपोर्टरों, के सामान्य शारीरिक कार्यों से परे का विस्तार हो सकता है। समारोह और परिवहन प्रोटीन के विनियमन को समझना उपचारात्मक उपायों में सुधार के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। उपकला परिवहन के अध्ययन में सबसे बड़ी चुनौती एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली है कि देशी आंतों उपकला कोशिकाओं की महत्वपूर्ण सुविधाओं का स्मरण दिलाता है विकसित कर रहा है। ऐसे Caco -2, टी -84 और HT-29-Cl.19A कोशिकाओं के रूप में कई इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल, आम तौर पर उपकला परिवहन अनुसंधान के क्षेत्र में उपयोग किया जाता है। ये सेल लाइनों ई मॉडलिंग करने के लिए एक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व न्यूनीकारकpithelium और उपकला माइक्रोबियल बातचीत की उनकी परीक्षा सहित कई यंत्रवत अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, सेल monolayers सही सेल सेल बातचीत और इन विवो microenvironment को प्रतिबिंबित नहीं करते। 3 डी में विकसित कोशिकाओं दवा पारगम्यता अध्ययन के लिए मॉडल का वादा किया जा करने के लिए दिखाया गया है। हम बताते हैं कि 3 डी में Caco-2 कोशिकाओं उपकला ट्रांसपोर्टरों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह भी महत्वपूर्ण है कि Caco-2 कोशिकाओं में अध्ययन के अन्य मॉडलों के साथ पूरित कर रहे हैं सेल विशिष्ट प्रभाव बाहर शासन करने के लिए और खाते में मूल निवासी आंत की जटिलता लेने के लिए। कई तरीकों पहले ऐसे everted थैली और पृथक उपकला कोशिकाओं में या अलग-थलग प्लाज्मा झिल्ली पुटिकाओं में तेज के रूप में ट्रांसपोर्टरों, की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। मॉडल के लिए सम्मान और परिवहन समारोह की माप के साथ क्षेत्र में चुनौतियों को ध्यान में ले रहा है, हम यहाँ एक प्रोटोकॉल 3 डी में Caco -2 कोशिकाओं के विकास और एक के रूप में एक ussing चैम्बर के उपयोग का वर्णन करने के लिए प्रदर्शनप्रभावी दृष्टिकोण ऐसे बरकरार ध्रुवीकृत आंतों epithelia में के रूप में सेरोटोनिन परिवहन, मापने के लिए।

Introduction

आंतों उपकला लुमेन में तरल पदार्थ का स्राव और आयनों के लिए विभिन्न परिवहन प्रोटीन (चैनलों, ATPases, सह-ट्रांसपोर्टरों और एक्सचेंजर्स) है कि पोषक तत्वों, इलेक्ट्रोलाइट्स के अवशोषण से लेकर कई कार्य करते हैं, और दवाओं के साथ सुसज्जित है। परिवहन प्रोटीन विद्युत ढ़ाल कि एक vectorial ढंग से आयनों या अणुओं के आंदोलन की अनुमति उत्पन्न करते हैं। यह ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाओं के शिखर और basolateral झिल्ली में परिवहन व्यवस्था की विषम वितरण द्वारा हासिल की है। इसके अलावा, तंग जंक्शनों, जो आसन्न उपकला कोशिकाओं तार, शिखर और basolateral झिल्ली डोमेन के बीच घटकों के intramembrane प्रसार के लिए एक बाधा के रूप में सेवारत द्वारा इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उपयुक्त मॉडल सिस्टम मूल निवासी आंत के लिए इन विशिष्ट सुविधाओं नकल उतार (यानी polarity, भेदभाव, और तंग जंक्शन अखंडता) समारोह के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैंउपकला परिवहन व्यवस्था की nality।

मॉडल के लिए सम्मान के साथ, ठेठ सेल आंतों उपकला परिवहन अनुसंधान के क्षेत्र में वर्तमान में इस्तेमाल किया लाइनों, Caco -2, पूरी तरह से विभेदित की एक मॉडल हैं छोटे आंतों उपकला कोशिकाओं अवशोषण; और T84 कोशिकाओं या HT-29 subclones, तहखाना व्युत्पन्न बड़ी आंतों उपकला कोशिकाओं 1 की मॉडल। पारंपरिक, इन सेल लाइनों प्लास्टिक की सतहों में monolayers के रूप में या लेपित transwell सम्मिलित में बड़े हो रहे हैं। ट्रांस-अच्छी तरह से कुछ हद तक सेल संस्कृति सम्मिलित ध्रुवीकृत कोशिकाओं basolaterally को खिलाने के लिए अनुमति देकर इन विवो पर्यावरण जैसे लगते हैं। हालांकि, पारंपरिक 2 डी संस्कृति प्रणालियों में एक सीमा है कि कोशिकाओं को एक, कृत्रिम फ्लैट, और कठोर सतह के लिए अनुकूल करने के लिए मजबूर हैं। इस प्रकार, देशी epithelia के शारीरिक जटिलता सही रूप में एक 2 डी प्रणाली में परिलक्षित नहीं है। यह सीमा एक विशिष्ट microenvironment में 3 डी में कोशिकाओं को विकसित करने के तरीकों, इस तरह पतला प्रोटीन mixtur रूप से पार कर दिया गया हैई, बाह्य मैट्रिक्स घटकों 2, 3 की एक किस्म से युक्त। फिर भी, इन विट्रो संस्कृतियों आंतों उपकला, जो अनेक प्रकार की कोशिकाओं और आंत में क्षेत्र विशेष वास्तुकला है की जटिलता अनुकरण नहीं कर सकते। इस प्रकार, सेल संस्कृति मॉडल का उपयोग अध्ययन मूल निवासी आंत में आगे सत्यापन की आवश्यकता है। इन विट्रो 3 डी सेल संस्कृति और माउस आंत्र म्यूकोसा का उपयोग करना, हम यहाँ आंतों सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर (SLC6A4, SERT) के विनियमन का अध्ययन करने के लिए सरल विधियों का वर्णन।

निर्भर प्रक्रिया - SERT ट्रांसपोर्टर तेजी से एक ना + / सीएल के माध्यम से यह परिवहन के द्वारा, एक महत्वपूर्ण हार्मोन और न्यूरोट्रांसमीटर, 5 hydroxytryptamine (5 हिंदुस्तान टाइम्स) के बाह्य उपलब्धता को नियंत्रित करता है। SERT विरोधी अवसाद का एक ज्ञात लक्ष्य है और हाल ही में ऐसे दस्त और आंतों में सूजन के रूप में सैनिक विकारों, के एक उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में उभरा है।तरीके आंतों उपकला कोशिकाओं में 5 हिंदुस्तान टाइम्स तेज पहले से वर्णित किया गया है जांच करने के लिए। उदाहरण के लिए, Caco-2 कोशिकाओं प्लास्टिक का समर्थन करता है या पारगम्य सम्मिलित करता है पर हो दोनों शिखर और basolateral डोमेन 4 में Fluoxetine के प्रति संवेदनशील 3 एच-5-एचटी तेज प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है। मानव अंग दाता छोटी आंतों से तैयार पृथक ब्रश सीमा झिल्ली पुटिकाओं (BBMVs) में SERT समारोह का माप भी हमें 5 से वर्णित किया गया है। 3 मानव BBVMs में एच-5-HT तेज Fluoxetine के प्रति संवेदनशील हैं और ना + / सीएल होना दिखाया गया था - निर्भर है, और यह 300 के एक कश्मीर मीटर एनएम 5 के साथ संतृप्ति कैनेटीक्स प्रदर्शन किया। इसी तरह के तरीकों का उपयोग, हम भी पहले से SERT समारोह माउस आंतों BBMVs 6 में 3 एच-5-एचटी तेज के रूप में मापा जाता है। हालांकि, शुद्ध प्लाज्मा झिल्ली पुटिकाओं की तैयारी ऊतक म्यूकोसा की एक बड़ी राशि की आवश्यकता है। ऐसे radiog के रूप में अन्य तरीकों,3 एच-5-एचटी तेज साइटों की raphic दृश्य, भी गिनी पिग और चूहे छोटी आंतों 7 में पहले से दिखाया गया है।

Ussing चैम्बर आयनों, पोषक तत्वों, और विभिन्न उपकला ऊतकों भर में दवाओं के परिवहन को मापने के लिए एक अधिक शारीरिक प्रणाली प्रदान करता है। Ussing चैम्बर तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि इसे बरकरार, ध्रुवीकृत आंतों उपकला की बिजली और परिवहन मानकों के सटीक माप के लिए सक्षम बनाता है। इसके अलावा, आंतरिक neuromuscular प्रणाली के प्रभाव को कम करने के लिए, आंत्र mucosa की seromuscular स्ट्रिपिंग उपकला 8 में ट्रांसपोर्टरों के विनियमन की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

हम जानते हैं कि Caco-2 कोशिकाओं पतला प्रोटीन पर 3 डी में उगाई अलग शिखर और basolateral मार्करों व्यक्त एक खोखले लुमेन फार्म का प्रदर्शन। इन कोशिकाओं को 2 डी Caco -2 कोशिकाओं की तुलना में SERT की उच्च अभिव्यक्ति दिखा। 3 डी तरीके कोशिकाओं को विकसित करने के लिए और पीई के लिएrform immunostaining या शाही सेना और प्रोटीन निकासी वर्णित हैं। इसके अलावा, हम एक ussing चैम्बर तकनीक का उपयोग करके छोटे आंत्र mucosa में TGF-β1, एक pleiotropic साइटोकाइन, द्वारा SERT समारोह और विनियमन का अध्ययन करने के तरीकों का वर्णन है।

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Protocol

एक पतला प्रोटीन मिश्रण पर बढ़ रहा है 3 डी Caco-2 सेल संस्कृति: Caco -2 के एक 3 डी संस्कृति प्रणाली में आंतों ट्रांसपोर्टरों के 1. अध्ययन

  1. पिघलना वृद्धि कारक (या हे / एन) 8 घंटे के लिए बर्फ पर कम पतला प्रोटीन मिश्रण 4 डिग्री सेल्सियस पर। एक बार thawed, 1 मिलीलीटर या बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग या दुकान के लिए 500 μL aliquots बनाते हैं।
  2. संस्कृति के दिन, (आरएनए और प्रोटीन निकासी के लिए) बर्फ पर संस्कृति प्लेटों या संभाग स्लाइड (immunostaining के लिए) precool। पतला प्रोटीन मिश्रण के 30 μL एक आठ अच्छी तरह से संभाग-गिलास स्लाइड (या 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 120 μL) में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ सकते हैं और समान रूप से फैला। प्रक्रिया के दौरान हवा के बुलबुले उत्पन्न करने के लिए नहीं ख्याल रखना।
  3. 15 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर अंदर स्लाइड / प्लेटें प्लेस - 30 मिनट और पतला प्रोटीन मिश्रण जमना करने की अनुमति।
  4. पतला प्रोटीन मिश्रण solidifying है, वहीं Caco -2 कोशिकाओं का एक मिला हुआ फ्लास्क trypsinize।
  5. संख्या की गणनाकोशिकाओं के और 5 मिनट के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र में 500 XG पर उन्हें स्पिन। जरूरत के रूप में 3 डी Caco-2 मध्यम में सेल गोली फिर से निलंबित।
  6. (प्लेटों के लिए, अच्छी तरह से प्रति 20,000) अच्छी तरह से प्रति 4,000 कोशिकाओं पर कांच कक्ष स्लाइड बीज। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में विकसित करने के लिए अनुमति दें। मध्यम बदलें हर 3 - 4 घ।

2. 3 डी Caco-2 कोशिकाओं में उपकला ट्रांसपोर्टर के लिए immunofluorescence धुंधला: दिन 1

  1. मध्यम Aspirate और आरटी पर 30 मिनट के लिए (पीएच NaOH के साथ 8.5 करने के लिए समायोजित के साथ पीबीएस में) 2% paraformaldehyde के 400 μL (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक।
    नोट: पीएफए ​​समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिक से अधिक 1 सप्ताह के लिए भंडारित नहीं किया जाना चाहिए, और ताजा बना समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चेतावनी: पीएफए बेहद जहरीला है और एक संभावित कैसरजन है। हमेशा के लिए एक रासायनिक हुड में सावधानी और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग कर के साथ इसे संभाल।
  2. 1x पीबीएस के साथ दो बार कुओं कुल्ला और पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर (400 μL /कुंआ)। एक बार तय, अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान।
  3. आरटी के लिए कक्ष स्लाइड (इस पतला प्रोटीन मिश्रण बिस्तर कठोर और वाशिंग चरणों के दौरान यह महाप्राण करने के लिए आसान कर देगा) गर्म।
  4. अब से 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.5% ट्राइटन के साथ कोशिकाओं permeabilize।
  5. पीबीएस ग्लाइसिन बफर (130 मिमी NaCl, 7 मिमी ना 2 HPO 4, 3.5 मिमी नः 2 4 पीओ, और 100 मिमी ग्लाइसिन) तैयार करें। आरटी पर प्रत्येक 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस ग्लाइसिन के साथ 3x कुल्ला।
  6. इम्यूनोफ्लोरेसेंस बफर (यदि) तैयार: 130 मिमी NaCl, 7 मिमी ना 2 HPO 4, 3.5 मिमी नः 2 पीओ 4, 100 मिमी ग्लाइसिन, 7.7 मिमी NaN 3, 0.1% बीएसए, 0.2% TritonX-100, और 0.05% बीच 20 ।
  7. अगर में धो 3x आरटी पर प्रत्येक 10 मिनट के लिए बफर। 5% में ब्लॉक अगर बफर में सामान्य बकरी सीरम (NGS)। प्राथमिक एंटीबॉडी तो + 1% बकरी सीरम में पतला, 200 μL के साथ सेते हैं / खैर, 1 के लिए - आरटी पर 2 घंटे। 10 मिनट प्रत्येक के लिए यदि बफर 3x के साथ धोएं।
  8. माध्यमिक विरोधी के साथ सेतेशरीर (1: 200) तो + 1% NGS, 200 μL / अच्छी तरह से में पतला, आरटी पर 1 घंटे के लिए।
  9. 10 मिनट प्रत्येक के लिए यदि बफर के साथ तीन बार धो। पर इस कदम से अंधेरे में स्लाइड रखें। इसके किनारे संपर्कों के कुओं के किनारे तक धारक के माध्यम से एक काले रंग की धारक में चैम्बर स्लाइड रखने और एक सफेद चोर फिसलने से गिलास स्लाइड से प्लास्टिक कक्षों लिफ्ट। धीरे कक्षों (धारक और चोर संस्कृति स्लाइड के साथ आना चाहिए) तक खींच।
  10. धीमी गति से विरोधी फीका माध्यम के साथ माउंट और यह आरटी पर 10 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति।
  11. एक बार पूरी तरह से सूख, नेल पॉलिश और उन्हें confocal माइक्रोस्कोपी के साथ छवि के साथ स्लाइड सील। दो सप्ताह के लिए या कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर।

3. शाही सेना और 3 डी Caco-2 कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण

  1. ऐसे TGF- β1 के रूप में एक परीक्षण एजेंट के साथ 14 डी, (10 एनजी / एमएल, 1 एच) - कोशिकाओं के लिए 12 पतला प्रोटीन मिश्रण पर संवर्धित समझो।
  2. उपचार के बाद, 1 के साथ कोशिकाओं को धोनेएक्स पीबीएस। 30 मिनट पतला प्रोटीन मिश्रण दव्र करने के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
  3. ठंडा पीबीएस के साथ कुओं धो और व्यक्तिगत सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में कोशिकाओं को इकट्ठा। 500 XG और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कम गति centrifugation का उपयोग कोशिकाओं को ले लीजिए। शाही सेना निकालें मानक प्रक्रियाओं का उपयोग और उपयोग करने के वास्तविक समय आरटी पीसीआर।
  4. प्रोटीन निकासी के लिए, 1x सेल बफर 1x प्रोटीज कॉकटेल अवरोध के साथ पूरक का उपयोग कोशिकाओं lyse। गोली सेल बफर जोड़ने के बाद, sonication द्वारा कोशिकाओं lyse और 7,500 XG और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifugation द्वारा सेल मलबे को हटा दें।

4. माउस Ileum उपयोग एक ussing चैंबर में 5 हिंदुस्तान टाइम्स तेज की माप: पेट की तैयारी और Seromuscular स्ट्रिपिंग

  1. इच्छामृत्यु के बाद, चूहों काटना और (पेट के बाद और अंधान्त्र से पहले) छोटी आंतों को हटा दें। तीन भागों में छोटी आंत फूट डालो। बीच तीसरे त्यागें, समीपस्थ तीसरे का उपयोगसूखेपन के रूप में, और लघ्वान्त्र के रूप में बाहर का तीसरे का उपयोग करें। इसकी mesenteric लगाव से आंत खींच उपकला को होने वाले नुकसान को रोकने के लिए करने से बचें। बर्फ ठंड क्रेब्स-घंटी बिकारबोनिट (KBR) बफर के साथ इसे कवर द्वारा ऊतक अनुभाग ठंडा रखें।
  2. आंत longitudinally कैंची का उपयोग खोलें। बर्फ ठंड में हौसले से excised आंतों वर्गों सेते हैं, बक KBR seromuscular अलग करना पहले 10 मिनट के लिए युक्त 1 माइक्रोन इंडोमिथैसिन।
  3. एक थाली 7% agarose या ठीक हो सिलिकॉन elastomer (0.5 सेमी मोटी) युक्त करने के लिए आंतों की धारा (1 ~ लंबाई में सेमी) श्लैष्मिक साइड नीचे पिन।
  4. नीचे रोशनी के साथ एक विच्छेदन stereomicroscope के तहत seromuscular परतों पट्टी। seromuscular परत एक पंख स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर काट। आंत के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ परत के किनारे प्राप्त करने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें।
    नोट: अलग करना प्रक्रिया के दौरान, stereomicroscope के नीचे प्रकाश Peyer के पैच के साथ की पहचान करने और क्षेत्रों से बचने में मदद करता हैतों।
  5. seromuscular स्ट्रिपिंग के पूरा होने के बाद, एक ussing आधा चैम्बर के पिन पर ध्यान म्यूकोसा माउंट। पूरी प्रक्रिया के दौरान, किनारों से छीन लिया श्लैष्मिक ऊतक पकड़ करने के लिए इसे फाड़ से बचने के लिए ध्यान रखना।

5. संतुलन और ऊतक उपचार

  1. क्रेब के समाधान तैयार: 115 मिमी NaCl, 25 मिमी NaHCO 3, 2.4 मिमी कश्मीर 2 HPO 4, 1.2 मिमी 2 CaCl, 1.2 मिमी 2 MgCl, और 0.4 मिमी के.एच. 2 4 पीओ पीएच 7.4 पर, 95% 2 हे / 5% के साथ मार डाला 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2। serosal स्नान के लिए 10 मिमी ग्लूकोज जोड़े एक ऊर्जा सब्सट्रेट और श्लैष्मिक स्नान के लिए 10 मिमी mannitol आसमाटिक संतुलन बनाए रखने के लिए के रूप में काम करने के लिए।
    नोट: क्रेब के समाधान एल ascorbic एसिड (100 सुक्ष्ममापी) और pargyline (100 सुक्ष्ममापी, monoamine oxidase अवरोध) intracellular 5 हिंदुस्तान टाइम्स गिरावट को रोकने के साथ पूरक है।
  2. दोनों शिखर (ल्यूमिनल) si को बेनकाब करने के चेंबर में स्लाइडर डालेंडे और क्रेब के समाधान के लिए ऊतक के basolateral (serosal) की ओर।
  3. 10 मिनट की एक संतुलन अवधि के बाद, जम्मू एमएस (श्लैष्मिक करने वाली serosal प्रवाह) के लिए शिखर की ओर 30 मिनट के लिए Fluoxetine (10 माइक्रोन) के साथ ileal ऊतक pretreat।
  4. Basolateral पक्ष पर 1 घंटे के लिए TGF-β1 (10 एनजी / एमएल) के साथ ऊतक को समझो और फिर शिखर पक्ष पर 30 मिनट के लिए 3 [एच] -5 हिंदुस्तान टाइम्स (20 एनएम) के साथ सेते हैं।

Serosal फ्लक्स (जे एम एस) और 3 [एच] ऊतक में -5 हिंदुस्तान टाइम्स संचय के लिए श्लैष्मिक की मात्रा 6.

  1. Serosal जलाशय (5 एमएल की कुल) से 0.75 एमएल aliquots लीजिए एक तरल जगमगाहट काउंटर में रेडियोधर्मिता मापने के लिए और श्लैष्मिक करने वाली serosal (जे एम एस) प्रवाह दरों की गणना करने के लिए; Fluoxetine के प्रति संवेदनशील प्रवाह SERT की मध्यस्थता 3 [एच] -5 हिंदुस्तान टाइम्स तेज प्रतिनिधित्व करता है।
  2. एक प्रवाह की अवधि के दौरान म्यूकोसा भर हीड्रास्टाटिक दबाव मतभेद से बचने के लिए, serosal पक्ष और फिर से नमूने लेनेउन्हें स्नान माध्यम की समान मात्रा के साथ जगह है।
    नोट: प्रवाह गणना के अंत नमूना (4.25 एमएल / 5 एमएल = 0.85) के कमजोर पड़ने के लिए सही।
  3. के 3 [एच] -5 हिंदुस्तान टाइम्स के ऊतकों में जमा मात्रा का ठहराव के लिए, स्लाइडर से म्यूकोसा उतरना ठंडा KRB बफर के साथ एक बार इसे धोने, और कांच संस्कृति नलियों में जगह है।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 10% KOH के 0.5 एमएल में म्यूकोसा सेते हैं। lysates (triplicates में) के 150 μL aliquots में रेडियोधर्मिता एक तरल जगमगाहट काउंटर का उपयोग उपाय।
  5. aliquots का प्रयोग करें - lysates के (3 से 5 μL) ब्रैडफोर्ड विधि का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए।
    नोट: ऊष्मायन रेडियोधर्मी सेरोटोनिन युक्त मध्यम के 10 एमएल एक मानक के रूप में प्रयोग किया जाता है। 5 हिंदुस्तान टाइम्स ऊतक pmol / मिलीग्राम प्रोटीन / मिनट के रूप में व्यक्त किया जाता है में बनाए रखा।

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Representative Results

3 डी Caco -2 अल्सर में Immunostaining चित्र 1 में दिखाया गया है। 3 डी पुटी phalloidin actin के साथ दाग में अच्छी तरह से सीमांकन लुमेन दिखा एक XY विमान के एक प्रतिनिधि छवि चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। पक्ष लुमेन का सामना करना पड़ शिखर की ओर इंगित करती है। उपकला एक मजबूत उपकला phenotype में एक 3 डी वातावरण परिणाम में संवर्धित कोशिकाओं। 12 दिन, जब actin और SERT सह दाग थे पर विभिन्न Caco -2 अल्सर, चित्रा 1 बी में दिखाया जाता है। एक XY-विमान (हवाई जहाज चित्रा 1 ए में दिखाया गया है से अलग है) के इस प्रतिनिधित्व में, SERT धुंधला हो जाना, दिखाई दे रहा है, उप शिखर धुंधला के साथ-साथ मुख्य रूप से ल्यूमिनल झिल्ली में। चित्रा 2 से पता चलता SERT प्रोटीन का स्तर 3 डी अल्सर में उच्च रहे हैं कि 12 वें दिन postplating पर monolayers के रूप में हो Caco-2 कोशिकाओं की तुलना में। ये आंकड़े बताते हैं कि Caco-2 कोशिकाओं के 3 डी संस्कृति संकेत घटनाओं है कि na नकल गति प्रदान कर सकतेepithelia सक्रिय और वृद्धि हुई SERT अभिव्यक्ति में परिणाम। चित्रा 3A सामान्य अवलोकन और एक ussing चैम्बर प्रणाली के संचालन को दर्शाया गया है और एपर्चर के पिन में मुहिम शुरू की छोटी आंत से पता चलता है। इस तकनीक मूल निवासी आंत में उपकला ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। Ussing चैम्बर दृष्टिकोण का लाभ ल्यूमिनल (म्यूकोसा) या basolateral (serosal) की ओर से व्यक्त ट्रांसपोर्टरों के समारोह का आकलन करने की क्षमता है। चित्रा 4 5 हिंदुस्तान टाइम्स जम्मू एमएस प्रवाह (ए) में वृद्धि हुई और TGF-β के जवाब में ileal म्यूकोसा (बी) में वृद्धि हुई 5 हिंदुस्तान टाइम्स संचय दर्शाता है। चूंकि TGF-β1 radiolabeled 5 हिंदुस्तान टाइम्स के आंदोलन श्लैष्मिक से serosal ओर करने के लिए, के रूप में जे एम एस द्वारा प्रतिनिधित्व में वृद्धि हुई है, इन आंकड़ों ileal उपकला कोशिकाओं की झिल्ली ल्यूमिनल से 5 हिंदुस्तान टाइम्स तेज में वृद्धि के संकेत हैं। इस सेल में radiolabeled 5 हिंदुस्तान टाइम्स के संचय में वृद्धि हुई है, और आगे से स्पष्ट है जोFluoxetine द्वारा निषेध के प्रति संवेदनशील था, SERT की गतिविधि को दर्शाती ल्यूमिनल झिल्ली पर व्यक्त की है।

आकृति 1
चित्रा 1: Caco-2 12 डी अलग लुमेन दिखाने पर एक पतला प्रोटीन मिश्रण पर हो। लाल: actin। 3 डी में उगाई Caco -2 अल्सर के immunostaining के लिए, कोशिकाओं के रूप में देबनाथ एट अल द्वारा पहले से वर्णित है, एक 8 अच्छी तरह से संभाग स्लाइड में सुसंस्कृत और phalloidin (ए) के साथ दाग रहे थे। 9। 3 डी Caco -2 संस्कृति (बी) के immunostaining के लिए, अल्सर 30 मिनट के लिए 2% पीएफए में तय किया गया, पीबीएस ग्लाइसिन के साथ इलाज किया, और आरटी पर 15 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन X-100 के साथ permeabilized। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर: अवरुद्ध करने के बाद, अल्सर SERT एंटीबॉडी (100 1) में incubated रहे थे। वे तो धोया गया और प्रतिदीप्ति संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 200) के साथ incubated और phalloidin (1: 200)आरटी पर 45 मिनट के लिए। अंत में, वे antifade युक्त DAPI में घुड़सवार थे। छवियाँ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कब्जा कर लिया गया। स्केल पट्टी: 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Caco -2 2 डी और 3 डी में विकसित कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति SERT। Caco -2 कोशिकाओं से lysates एक प्लास्टिक के समर्थन पर सुसंस्कृत और Caco -2 3 डी क्षेत्रों एसडीएस पृष्ठ से सुलझाया गया nitrocellulose झिल्ली पर मिट और SERT एंटीबॉडी और GAPDH के साथ विश्लेषण किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन चित्रा 3: (ए) ussing कक्ष और "स्लाइडर" पिन और एपर्चर एक घुड़सवार माउस छोटी आंत दिखाने के साथ। स्लाइडर एपर्चर क्षेत्र = 0.30 सेमी 2। स्लाइडर ussing चैम्बर के दो हिस्सों, जो बंटे हैं में फिट बैठता है। ऐसे transepithelial वोल्टेज क्षमता (वी टी) के रूप में बिजली के मानकों, एक नापने और इलेक्ट्रोड (आमतौर पर आधे कोशिकाओं रस कपूर या एजी-AgCl प्रत्येक कक्ष में आधे के लिए नमक पुलों से जुड़े हुए हैं) द्वारा मापा जाता है। साल्ट पुलों 3% अगर शारीरिक बफर में पिघल (जैसे, KBR) म्यूकोसा स्नान के समाधान के ईओण संरचना में परिवर्तन से बचने के लिए के लिए इस्तेमाल से बना रहे हैं। (बी) ussing चैम्बर के सिद्धांत के योजनाबद्ध। छीन आंत्र म्यूकोसा ussing चैम्बर श्लैष्मिक और serosal कक्षों को अलग करने के दो हिस्सों में रखा गया था। रेडियोधर्मी अनुरेखक श्लैष्मिक सिड को जोड़ा गया हैई; तेज रेडियोधर्मिता की राशि ऊतक द्वारा शामिल किया, कुल प्रोटीन सामग्री के लिए सामान्यीकृत के रूप में मापा गया था। प्रवाह समय की अवधि में serosal कक्ष में रेडियोधर्मिता मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था। योजनाबद्ध में दिखाया गया इलेक्ट्रोड बिजली के मानकों, वर्तमान सहित, वोल्टेज, और प्रतिरोध का एक साथ निगरानी के लिए अनुमति देते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: Ileal mucosa में SERT समारोह का मापन Seromuscular लेयर छीन लिया। माउस लघ्वान्त्र में SERT समारोह पर अल्पकालिक TGF-β1 उपचार के पूर्व vivo प्रभाव, के 3 [एच] -5 हिंदुस्तान टाइम्स तेज और 3 [एच] -5 हिंदुस्तान टाइम्स का उपयोग कर फलाक्सेस माप के माध्यम से प्रदर्शनचैम्बर ussing। TGF-β1 उपचार (10 एनजी / एमएल, 1 ज) basolateral तरफ काफी SERT समारोह, के रूप में वृद्धि हुई ना इसका सबूत वृद्धि हुई + संवेदनशील श्लैष्मिक करने वाली serosal प्रवाह (जे एम एस) (ए) और 3 [एच] - 5 हिंदुस्तान टाइम्स तेज (बी)। ileal ऊतक के Fluoxetine उपचार TGF-β1 उत्तेजित 5 हिंदुस्तान टाइम्स तेज हिचकते हैं। Fluoxetine के प्रति संवेदनशील तेज TGF-β1 से 2.5 गुना वृद्धि की गई थी नियंत्रण की तुलना में। परिणाम मतलब SEM के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। एक एक तरह से एनोवा Tukey के टेस्ट सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। जम्मू एमएस प्रवाह की गणना: [(सीपीएम ई - सीपीएम रों) एक्स कमजोर पड़ने कारक] / [(। वी वीं कक्षा सान्द्र सब्सट्रेट) सीपीएम एसटीडी / xtxa]। सीपीएम ई: प्रवाह माप के अंत में प्रति मिनट मायने रखता है; सीपीएम एस: प्रवाह माप के शुरू में प्रति मिनट मायने रखता है; सीपीएम एसटीडी: मानक के प्रति मिनट मायने रखता है (श्लैष्मिक जलाशय से लिया); वी एसटीडी: मात्रा ओसीपीएम एसटीडी च; टी: एच में प्रवाह के समय; एक: एपर्चर (0.3 सेमी 2) के क्षेत्र। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पूरी तरह से विभेदित Caco -2 सेल monolayers बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है उपकला monolayers ध्रुवीकरण के रूप में आंतों परिवहन 10, 11, 12, 13, 14, 15 अध्ययन करने के लिए। हालांकि, आंतों उपकला कोशिकाओं के शारीरिक संगठन की नकल करने के लिए, वहाँ 3 डी में एक Caco -2 संस्कृति के विकास में काफी रुचि रही है। आंतों उपकला कोशिकाओं के लिए 3 डी सेल संस्कृति मॉडल की एक संख्या हाल ही में विकसित किया गया है कि नकल मूल निवासी सेल सेल और सेल बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 2 डी सिस्टम 16 से अधिक शारीरिक प्रासंगिकता के साथ बातचीत। इस प्रकार, ईसीएम आधारित प्राकृतिक (जैसे laminin, कोलेजन चतुर्थ, और हेपरिन सल्फेट proteoglycan के रूप में) आम घटकों से युक्त हाइड्रोजेल बड़े पैमाने पर 3 डी सेल संस्कृतियों 1 की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं6।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल 3 डी Caco -2 पतला प्रोटीन मिश्रण में विकसित कोशिकाओं की उपयुक्तता उपकला परिवहन अनुसंधान के लिए (एक ईसीएम आधारित प्राकृतिक हाइड्रोजेल Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) माउस ट्यूमर से निकाले) को दर्शाता है। 10 दिनों के भीतर कोशिकाओं को अलग शिखर और basolateral डोमेन के साथ, कोशिकाओं और शो polarity की एक परत से घिरा हुआ एक खोखला लुमेन फार्म के लिए शुरू करते हैं। एक पतला प्रोटीन मिश्रण पर बोने के समय में सेल घनत्व केंद्रीय लुमेन के साथ नियमित रूप से अल्सर के गठन के लिए महत्वपूर्ण है। धुंधला प्रयोगों के लिए, हम 4000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक 8 चैम्बर स्लाइड (0.7 सेमी 2 अच्छी तरह से सतह क्षेत्र) जोड़ा गया। अनियमित क्षेत्रों में एक उच्च घनत्व परिणामों पर कोशिकाओं सीडिंग। 10 पर 3 डी Caco -2 अल्सर - 12 दिन 2 डी Caco -2 transwells 17 (अप्रकाशित टिप्पणियों) पर विकसित कोशिकाओं की तुलना में polarity और अधिक भेदभाव दिखा। हम COMP के रूप में SERT mRNA की अभिव्यक्ति में एक उल्लेखनीय वृद्धि और प्रोटीन के स्तर से पता चला हैपूरी तरह से अलग-अलग 2 डी monolayers को ared। इसके अलावा, इन तरीकों का उपयोग, हम पता चला है कि TGF-TGF-β1 SERT की सतह के स्तर के रूप immunofluorescence धुंधला 15 के द्वारा दिखाया बढ़ जाती है, है।

दिलचस्प है, हाल के अध्ययनों से दिखा दिया है कि 3 डी Caco -2 कोशिकाओं TNF रिसेप्टर 2 और MyD88 के रूप में महत्वपूर्ण संकेत घटकों, की उपस्थिति की वजह से pathophysiological उत्तेजनाओं को अधिक उत्तरदायी हैं, और पारंपरिक 2D प्रणाली 17 की तुलना में एक बेहतर मॉडल प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, एक मुद्दा है कि उपकला परिवहन अनुसंधान के क्षेत्र में 3 डी Caco -2 के उपयोग की सीमा विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की कमी और जटिलता है कि देशी आंत में पाए जाते हैं। इस संबंध में मानव या माउस मूल की आंतों organoids (भी रूप में enteroids / colonoids जाना जाता है) आयनों, पोषक तत्वों, या दवाओं के परिवहन का अध्ययन करने के लिए देशी उपकला के सभी विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से युक्त एक राज्य के अत्याधुनिक मॉडल प्रतिनिधित्व करते हैं। organoids की तुलना में, अच्छी तरह सेअलग-अलग 3 डी Caco -2 अल्सर उपकला कोशिकाओं का एक प्रकार है (यानी अवशोषण एन्तेरोच्य्तेस) का प्रतिनिधित्व करते हैं और निश्चित रूप से आंतों ट्रांसपोर्टरों गवर्निंग सेलुलर और आणविक तंत्र पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं। इसका कारण यह है 3 डी Caco-2 कोशिकाओं को संभालने के लिए सुविधाजनक हैं लागत प्रभावी रहे हैं, और इस तरह के डीएनए और siRNAs की transfections के लिए के रूप में हेरफेर करने के लिए आसान है, कर रहे हैं। उपकला परिवहन अनुसंधान के क्षेत्र में 3 डी Caco-2 कोशिकाओं की एक और सीमा लुमेन तक पहुँचने में कठिनाई है। एजेंटों कि झिल्ली रिसेप्टर्स या कि ल्यूमिनल तरफ से उपकला का उपयोग संक्रामक एजेंटों के लिए लुमिनल करने के लिए बाध्य इस प्रणाली में अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस सीमा, लुमेन में एजेंटों microinjecting से दूर किया जा सकता है, क्योंकि सी बेलगाम संक्रमण के 18 के लिए मानव आंतों organoid संस्कृति के मामलों में पहले से ही किया गया है। लेकिन उसे यह भी है, महत्वपूर्ण यह है कि इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल में अध्ययन के मूल निवासी मैं पुष्टि कर रहे हैंntestine विवो या पूर्व vivo दृष्टिकोण में इस्तेमाल करते हैं।

पिछले कई दशकों में, ussing चैम्बर कई उपकला ट्रांसपोर्टरों 19 के कार्यात्मक या नियामक संपत्तियों की पहचान करने के लिए बहुत योगदान दिया। यहाँ, हम 5 हिंदुस्तान टाइम्स प्रवाह और माउस आंत्र म्यूकोसा seromuscular परत 15 से रहित में 5 हिंदुस्तान टाइम्स तेज मापने के लिए ussing चैम्बर दृष्टिकोण की उपयुक्तता दिखा। Basolateral पक्ष (10 एनजी / एमएल, 1 घंटे) में काफी वृद्धि हुई SERT समारोह के रूप में वृद्धि हुई ना इसका सबूत पर ileal म्यूकोसा की TGF-β1 ट्रीटमेंट + संवेदनशील श्लैष्मिक करने वाली serosal प्रवाह (जे एम एस) और 3 एच-5- एचटी तेज। ileal ऊतक के Fluoxetine उपचार 5 हिंदुस्तान टाइम्स तेज की TGF-β1 की मध्यस्थता उत्तेजना हिचकते हैं।

इस तकनीक का महत्वपूर्ण कदम एक अक्षुण्ण परत के रूप में स्लाइड एपर्चर पर ऊतक (किसी भी फाड़ के बिना) बढ़ते क्रम में शामिल करने के लिए achie सटीक मापन किया है। ऐसी गेंद कैंची, पतली-टिप संदंश, और पंख सर्जिकल ब्लेड के रूप में उपयुक्त सर्जिकल उपकरण, उपयुक्त से निपटने के लिए महत्वपूर्ण है और ऊतकों की अलग करना हैं।

इस विधि में इस तरह के इलेक्ट्रोलाइट ट्रांसपोर्टरों के रूप में अन्य उपकला ट्रांसपोर्टरों, (क्लोराइड ट्रांसपोर्टरों, ना + / एच + एक्सचेंजर्स, पोषक तत्व ट्रांसपोर्टरों, आदि) के समारोह में अध्ययन करने के लिए लागू है। पीएच स्टेट तकनीक के रूप में ussing चैम्बर-तरह के विशेष उपयोग करता है, transepithelial बिकारबोनिट स्राव, और समस्थानिक प्रवाह विधि को मापने के लिए, शुद्ध स्राव या के अवशोषण को मापने के लिए substrates-यूजर्स डॉ क्लार्क एट अल द्वारा व्यापक समीक्षा की गई। 8। वे बड़े पैमाने पर पोषक तत्व परिवहन 19 के अध्ययन के लिए कक्षों ussing के आवेदन की समीक्षा की। मिनी ussing कक्षों भी चिकित्सकीय प्रासंगिक स्थितियों में इस्तेमाल किया गया है, इस तरह के रूप में बायोप्सी के नमूनों में परिवहन समारोह को मापने के लिएरेफरी "> 20। everted थैली पद्धति पर ussing चैम्बर तकनीक का प्रमुख लाभ एक साथ बरकरार, ध्रुवीकृत आंतों उपकला की बिजली और परिवहन मानकों को मापने की क्षमता है।

Ussing चैम्बर विधि के साथ एक चिंता का विषय सीमित व्यवहार्यता और एक पूर्व vivo आंतों तैयारी का इष्टतम समारोह है। पशु से हटाने पर, पूर्व vivo आंतों तैयारी केवल एक ussing कक्ष 19 में 3 घंटे के लिए पिछले सकता है। इस प्रकार, इस विधि अब समय अवधि के लिए एजेंट के प्रभाव का परीक्षण में सीमाओं हो सकता है। ऐसे मामलों में, उपचार विवो में प्रदर्शन किया जा सकता है और फिर अलग-थलग नियंत्रण और उपचार समूहों से आंतों ussing विधि के साथ परिवहन मानकों को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सभी मामलों में, जी टी (या आर टी) की भयावहता व्यवहार्यता का एक वास्तविक समय सूचक हो सकता है और के बीच भेदभाव करने में उपयोगी हो सकता हैपरीक्षण किया अभिकर्मकों के विशिष्ट और अविशिष्ट प्रभाव।

सारांश में, यहाँ वर्णित विधियों ऐसे आंतों में सूजन, संक्रामक दस्त, malabsorption, या चयापचय विकारों के रूप में स्वस्थ और रोगग्रस्त की स्थिति में समारोह और उपकला ट्रांसपोर्टरों के नियमन के शासी सेलुलर और आणविक तंत्र के बारे में हमारी समझ की सुविधा कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS ATCC ATCC® HTB­37™ Cells
10x PBS Carl Zeiss Microsope for confocal Imaging
3[H]-5-HT  LabtekII 152453 Culturing cells for microscopy
5-HT  Gibco 70013-032 Not a hazardous substance
95% O2- 5% CO2 cylinder KPL 71-00-27 Not a hazardous substance
Agar (for Agar plates) Fischer BP151-100 Acute toxicity, Ora
Agar (for electrode) Sigma G7126-1KG Not a hazardous substance
Alexa Fluor Phalloidin Sigma C3867-1VL Not a hazardous substance
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma P6148-500G Harmful if swallowed or if inhaled
CaCl2 LifeTechnologies A12380 Not a hazardous substance
Caco-2 Cells Sigma A8806-5G Not a hazardous substance
Cell lysis Buffer Fischer BP337-100 Not a hazardous substance
Chabered slides Sigma S5886-1KG Not a hazardous substance
Collagen Type-1 Solution Sigma S8045-500G
Electrodes Sigma S-0876
EMEM Gibco by Life Technologies 25200-056
Fetal bovine serum (FBS) Corning 356234 Used as Extracellular matrix
Fluoxetine Qiagen 74104
Gentamicin ATCC 30-2003 Cell culture Media
Glycin Cell Signaling, Danvers, MA
Hepes  Roche 11836145001
Indomethacin Gibco by Life Technologies 15070-063
K2HPO4 Gibco by Life Technologies 15710-064
KOH Gibco by Life Technologies 15630-080
L-ascorbic acid  Gibco by Life Technologies 10082147
Liquid scintillation counter  Gibco by Life Technologies 70013--032
LSM710 Meta Physiologic Instruments, San Diego, CA  EM-CSYS-8
Mannitol Physiologic Instruments, San Diego, CA  P2304
Matrigel Physiologic Instruments, San Diego, CA  VCC MC8
MgCl2 Physiologic Instruments, San Diego, CA  DM MC6
Multichannel Voltage/current Clamp Physiologic Instruments, San Diego, CA  P2300
NaCl Physiologic Instruments, San Diego, CA  P2023-100
NaCl Fisher Scientific, Hampton, NH BP1423
NaHCO3 Sigma-Aldrich, St Louis, MO S5886
Normal Goat Serum (NGS, 10%) Fisher Scientific, Hampton, NH S233
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, St Louis, MO P288
Pen-Strp Sigma-Aldrich, St Louis, MO C3881
Protein assay reagent Sigma-Aldrich, St Louis, MO 10420
Proteinase Inhibitor Cocktail MEDOX, Chicago, IL  style G- 12300
RNA easy Mini kit Sigma-Aldrich, St Louis, MO M4125
Single Channel Electrode Input Module  Sigma-Aldrich, St Louis, MO A92902
Sliders for snapwell Chambers Sigma-Aldrich, St Louis, MO H9523
Sodium Phosphate (Na2HPO4) Sigma-Aldrich, St Louis, MO F132
Sodium-Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich, St Louis, MO T7039
TGF-β1 Perkin-Elmer,Waltham, MA NFT1167250UC
Triton X-100 Packard Instruments, Downers Grove, IL B1600
Trypsin EDTA Sigma-Aldrich, St Louis, MO 221473
Tween-20 Bio Rad Laboratories, Hercules, CA 5000006
Ussing Chamber (chamber only) Sigma-Aldrich, St Louis, MO I7378
Ussing Chamber Systems Sigma-Aldrich, St Louis, MO A1296

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 121 परिवहन समारोह अलग करना म्यूकोसा ussing चैंबर 3 डी Caco-2 3 डी कोशिकाओं के धुंधला हो जाना सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर SERT
तरीके उपकला परिवहन प्रोटीन समारोह और अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए मूल निवासी आंत और Caco-2 कोशिकाओं में 3 डी में बढ़ी
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Anabazhagan, A. N., Chatterjee, I.,… More

Anabazhagan, A. N., Chatterjee, I., Priyamvada, S., Kumar, A., Tyagi, S., Saksena, S., Alrefai, W. A., Dudeja, P. K., Gill, R. K. Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D. J. Vis. Exp. (121), e55304, doi:10.3791/55304 (2017).

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