Summary
Se describen métodos sencillos para estudiar la regulación de la función intestinal transportador de serotonina (SERT) y la expresión utilizando una célula in vitro modelo de cultivo de las células Caco-2 crecido en 3D y un modelo ex vivo de los intestinos de ratones. Estos métodos son aplicables al estudio de otros transportadores epiteliales.
Abstract
El epitelio intestinal tiene importantes funciones de transporte y de barrera que juegan un papel clave en las funciones fisiológicas normales del cuerpo al tiempo que proporciona una barrera para las partículas extrañas. el transporte epitelial alterada (iones, nutrientes o medicamentos) se ha asociado con muchas enfermedades y puede tener consecuencias que van más allá de las funciones fisiológicas normales de los transportistas, como por influir en la integridad epitelial y el microbioma intestinal. La comprensión de la función y regulación de las proteínas de transporte es fundamental para el desarrollo de mejores intervenciones terapéuticas. El mayor desafío en el estudio del transporte epitelial está desarrollando un sistema modelo adecuado que recapitula las características importantes de las células epiteliales intestinales nativas. Varios modelos de cultivo celular in vitro, como las células HT-29-Cl.19A Caco-2, T-84, y se utilizan típicamente en la investigación del transporte epitelial. Estas líneas celulares representan un enfoque reduccionista de la modelización del correopithelium y se han utilizado en muchos estudios mecanísticos, incluyendo su examen de las interacciones epitelio-microbiana. Sin embargo, las monocapas de células no reflejan con exactitud las interacciones célula-célula y el microentorno in vivo. Las células cultivadas en 3D han demostrado ser prometedores modelos para estudios de permeabilidad del fármaco. Mostramos que células Caco-2 en 3D se pueden utilizar para estudiar los transportadores epiteliales. También es importante que los estudios en células Caco-2 se complementan con otros modelos para descartar efectos específicos de células y para tener en cuenta la complejidad del intestino nativo. Varios métodos han sido utilizados previamente para evaluar la funcionalidad de los transportadores, tales como saco evertido y la absorción en las células epiteliales aisladas o en vesículas de membrana aisladas plasma. Teniendo en cuenta los desafíos en el campo con respecto a los modelos y la medición de la función de transporte, se demuestra aquí un protocolo para crecer células Caco-2 en 3D y describir el uso de una cámara de Ussing como unaenfoque eficaz para medir el transporte de serotonina, como en el epitelio intestinal polarizadas intactas.
Introduction
El epitelio intestinal está equipado con varias proteínas de transporte (canales, ATPasas, co-transportadores e intercambiadores) que realizan numerosas funciones que van desde la absorción de nutrientes, electrolitos y fármacos para la secreción de fluido y los iones en el lumen. Las proteínas de transporte generan gradientes electroquímicos que permiten el movimiento de los iones o moléculas de un modo vectorial. Esto se consigue mediante las distribuciones asimétricas de los sistemas de transporte en las membranas apical y basolateral de las células epiteliales polarizadas. Además, las uniones estrechas, que atan las células epiteliales adyacentes, juegan un papel importante en este proceso, al servir como una barrera a la difusión intramembrane de componentes entre los dominios de la membrana apical y basolateral. Sistemas modelo apropiado que imitan estos rasgos característicos del intestino nativo (es decir, la polaridad, la diferenciación, y la integridad unión estrecha) son críticos para el estudio de la functionalidad de sistemas de transporte epiteliales.
Con respecto a los modelos, las líneas celulares típicos utilizados actualmente en la investigación del transporte epitelial intestinal son células Caco-2, un modelo de completamente diferenciada, absortivas pequeñas células epiteliales intestinales; y las células T84 o HT-29 subclones, modelos de grandes células epiteliales intestinales de las criptas derivado 1. Convencionalmente, estas líneas celulares se cultivan como monocapas en superficies de plástico o en insertos transwell recubiertos. Trans-así insertos de cultivo celular, en cierta medida se asemejan el medio ambiente in vivo al permitir que las células polarizadas para alimentar hacia la membrana basolateral. Sin embargo, una limitación en sistemas de cultivo 2D convencionales es que las células se ven obligadas a adaptarse a una superficie artificial, plana y rígida. Así, la complejidad fisiológica del epitelio nativo no se refleja con precisión en un sistema 2D. Esta limitación se ha superado por métodos para hacer crecer las células en 3D en un microambiente específico, como Mixtur proteína gelatinosae, que contiene una variedad de componentes de la matriz extracelular 2, 3. Sin embargo, los cultivos in vitro no pueden simular la complejidad del epitelio intestinal, que tiene múltiples tipos de células y la arquitectura específica de la región en el intestino. Por lo tanto, los estudios que utilizan modelos de cultivos celulares requieren una validación adicional en el intestino nativa. Utilizando el cultivo celular in vitro 3D y la mucosa intestinal del ratón, como se describe aquí métodos sencillos para estudiar la regulación del transportador de serotonina intestinal (SLC6A4, SERT).
El transportador SERT regula la disponibilidad extracelular de una importante hormona y neurotransmisor, 5-hidroxitriptamina (5-HT), mediante el transporte rápidamente a través de un Na + / Cl - proceso dependiente. SERT es una diana conocida de antidepresivos y ha surgido recientemente como una nueva diana terapéutica de trastornos gastrointestinales, como la diarrea y la inflamación intestinal.Métodos para investigar la captación de 5-HT en las células epiteliales intestinales se han descrito anteriormente. Por ejemplo, se ha demostrado Caco-2 células cultivadas en soportes de plástico o insertos permeables a exhibir fluoxetina sensibles a la captación de 3H-5-HT en ambos dominios apical y basolateral 4. La medición de la función SERT en aislado de borde en cepillo vesículas de membrana (BBMVs) preparado a partir de donantes de órganos humanos intestino delgado también ha sido descrito por 5 nosotros. Captación de 3H-5-HT en BBVMs humanos se demostró que la fluoxetina-sensible y Na + / Cl - dependiente, y que exhibe cinética de saturación con una K m de 300 nM 5. Utilizando métodos similares, también medido con anterioridad función de SERT como la captación de 3H-5-HT en ratones BBMVs intestinales 6. Sin embargo, la preparación de vesículas de membrana de plasma puro requiere una gran cantidad de mucosa de tejido. Otros métodos, tales como la radiographic la visualización de 3 sitios de captación de H-5-HT, también se han mostrado anteriormente en conejillo de indias y rata intestino delgado 7.
La cámara de Ussing proporciona un sistema más fisiológico para medir el transporte de iones, nutrientes, y medicamentos a través de diversos tejidos epiteliales. La ventaja principal de la técnica de la cámara Ussing es que permite la medición precisa de los parámetros eléctricos y de transporte de intacta epitelio intestinal, polarizada. Además, para minimizar la influencia del sistema neuromuscular intrínseca, el decapado seromuscular de mucosa intestinal se puede realizar para investigar la regulación de los transportadores en el epitelio 8.
Se demuestra que las células Caco-2 cultivadas en 3D en proteína gelatinosa forman un lumen de huecos que expresan marcadores apical y basolateral distintas. Estas células muestran una mayor expresión de SERT que las células 2D Caco-2. Los métodos para hacer crecer células en 3D y con PEse describen inmunotinción rforma o ARN y la proteína de extracción. Además, se describen los métodos para estudiar la función SERT y la regulación por el TGF-β1, una citoquina pleiotrópica, en la pequeña mucosa intestinal mediante la utilización de una técnica de cámara de Ussing.
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Protocol
1. Estudio de Transporte intestinal en un sistema de cultivo en 3D de células Caco-2: Crecimiento 3D Caco-2 Cultivo de células en una mezcla de proteínas gelatinoso
- factor de crecimiento de deshielo redujo mezcla de proteína gelatinosa en hielo durante 8 h (o O / N) a 4 ° C. Una vez descongelado, hacer 1 ml o 500 alícuotas de uso o almacenar a -20 ° C para su uso posterior.
- En el día de la cultura, preenfriar las placas de cultivo (por ARN y proteínas de extracción) o portaobjetos con cámaras (por inmunotinción) en hielo. Añadir 30 l de mezcla de proteína gelatinosa a cada pocillo de un porta de vidrio cámaras ocho pocillos (o 120 l por pocillo de una placa de 6 pocillos) y se extendió uniformemente. Tenga cuidado de no generar burbujas de aire durante el proceso.
- Colocar los portaobjetos / placas dentro de una incubadora de cultivo celular a 37 ° C durante 15 - 30 min y permita que la mezcla de proteína gelatinosa se solidifique.
- Mientras que la mezcla de proteína gelatinosa está solidificando, trypsinize un matraz confluente de células Caco-2.
- Contar el número dede las células y hacerlas girar a 500 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min. Vuelva a suspender el sedimento celular en 3D Caco-2 Medio, según sea necesario.
- Sembrar los portaobjetos de cámara de vidrio a 4.000 células por pocillo (para placas, 20.000 por pocillo). Permiten a las células crecer en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 ° C. Cambiar el medio cada 3 - 4 d.
2. La tinción de inmunofluorescencia para epitelial Transportadores en 3D células Caco-2: Día 1
- Aspirar el medio y fijar las células con 400 l de 2% de paraformaldehído (PFA) (en PBS con el pH ajustado a 8,5 con NaOH) durante 30 min a RT.
NOTA: La solución de PFA no se debe almacenar durante más de 1 semana a 4 ° C, y la solución recién hecha se puede utilizar. PRECAUCIÓN: PFA es altamente tóxico y carcinógeno potencial. Siempre maneje con precaución en una campana química y el uso de equipo de protección personal. - Lavar los pocillos dos veces con PBS 1x y almacenar las diapositivas a 4 ° C en PBS (400 l /bien). Una vez fijado, almacenarlos a 4 ° C durante un máximo de una semana.
- Calentar los portaobjetos de cámara a temperatura ambiente (esto va a endurecer la cama mezcla de proteína gelatinosa y que sea fácil para aspirar durante las etapas de lavado).
- Permeabilizar las células con 0,5% Triton en PBS durante no más de 15 min.
- Preparar tampón PBS-glicina (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2 PO 4, y glicina 100 mM). Enjuagar 3 veces con 1x PBS-glicina durante 10 minutos cada uno a TA.
- Preparar tampón de inmunofluorescencia (IF): NaCl 130 mM, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2 PO 4, mM Glicina 100, 7,7 mM NaN 3, 0,1% de BSA, 0,2% Triton X-100, y 0,05% de Tween-20 .
- Lavar 3 veces en tampón IF durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. Bloque en el 5% de suero normal de cabra (NGS) en el tampón IF. Incubar con el anticuerpo primario diluido en suero de cabra SI + 1%, 200 l / pocillo, durante 1 - 2 horas a temperatura ambiente. Lavar con SI 3x tampón durante 10 minutos cada uno.
- Incubar con anti secundariacuerpo (1: 200) diluido en IF + 1% de NGS, 200 l / pocillo, durante 1 h a TA.
- Se lava con tampón IF tres veces durante 10 minutos cada uno. Mantenga las diapositivas de la oscuridad de este paso adelante. Levante las cámaras de plástico de las placas de vidrio mediante la colocación de la corredera de cámara en un soporte negro y arrastrando un levantador de blanco a través del soporte hasta que su borde contacto con el borde de los pozos. tire suavemente hacia arriba las cámaras (el titular y el levantador debe venir con las portas de cultivo).
- Montaje con medio anti-desvanecimiento lento y deje que se seque durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Una vez secado por completo, selle las diapositivas con esmalte de uñas y les imagen con microscopía confocal. Almacenar las diapositivas a 4 ° C durante dos semanas oa -20 ° C durante varios meses.
3. ARN y extracción de proteínas a partir de 3D células Caco-2
- Tratar las células cultivadas en mezcla de proteína gelatinosa para 12 - 14 d con un agente de ensayo, tales como TGF-β1 (10 ng / ml, 1 h).
- Después del tratamiento, se lavan las células con 1x PBS. Mantener las células en hielo durante 30 min para licuar la mezcla de proteína gelatinosa.
- Lavar los pocillos con PBS enfriado y recoger las células en tubos de centrífuga individuales. Recoger las células mediante centrifugación a baja velocidad a 500 x g y 4 ° C durante 10 minutos. Se extrae el ARN utilizando procedimientos estándar y utilizar el tiempo real de RT-PCR.
- Para la extracción de proteínas, lisar las células por medio de 1x tampón de lisis celular suplementado con cóctel inhibidor de proteasa 1x. Después de la adición de tampón de lisis celular al sedimento, lisar las células por sonicación y eliminar los restos celulares por centrifugación a 7500 xg y 4 ° C durante 10 min.
4. La medición de la captación de 5-HT en el íleon ratón Utilizando una cámara de Ussing: Preparación Intestinal y seromuscular de desmontaje
- Después de la eutanasia, diseccionar los ratones y quitar el intestino delgado (después del estómago y antes de que el ciego). Se divide el intestino delgado en tres partes. Desechar el tercio medio, utilice el tercio proximalcomo yeyuno, y utilizar el tercio distal como íleon. Evitar tirar el intestino de su unión mesentérica para evitar daños en el epitelio. Mantenga la sección de tejido frío cubriéndolo con tampón enfriado con hielo de bicarbonato de Krebs-Ringer (KBR).
- Abra el intestino longitudinalmente con unas tijeras. Incubar las secciones intestinales recién extirpadas en helado, gaseado KBR que contiene indometacina 1 M durante 10 min antes de la seromuscular de extracción.
- Pin de la sección intestinal (~ 1 cm de longitud) del lado de la mucosa hacia abajo a una placa que contiene 7% de agarosa o elastómero de silicona curado (0,5 cm de espesor).
- Pelar las capas seromusculares bajo un microscopio estereoscópico de disección con iluminación de fondo. Cortar la capa seromuscular utilizando una hoja de bisturí pluma. Utilice unas pinzas finas para obtener el borde de la capa a lo largo del eje longitudinal del intestino.
NOTA: Durante el proceso de extracción, la iluminación de la parte inferior del microscopio estereoscópico ayuda a identificar y evitar las zonas con placas de PeyerES. - Después de la finalización de la Stripping seromuscular, montar la mucosa cuidadosamente sobre los pasadores de un medio de la cámara de Ussing. Durante todo el proceso, tenga cuidado para mantener el tejido de la mucosa despojado por los bordes para evitar que se rompa.
5. La equilibración y de tratamiento de tejido
- Preparar la solución de Krebs: NaCl 115 mM, NaHCO3 25 mM, 2,4 mM de K 2 HPO 4, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM de MgCl 2, y 0,4 mM KH 2 PO 4 a pH 7.4, gaseado con un 95% de O2 / 5% de CO2 a 37 ° C. Añadir glucosa 10 mM al baño seroso para servir como sustrato energético y manitol 10 mM al baño de la mucosa para mantener el equilibrio osmótico.
NOTA: la solución de Krebs se complementa con ácido L-ascórbico (100 M) y pargilina (100 mM, inhibidor de monoamina oxidasa) para evitar la degradación intracelular 5-HT. - Insertar el control deslizante en la cámara para exponer tanto el Si (luminal) apicalde y el lado basolateral (seroso) del tejido a la solución de Kreb.
- Después de un periodo de equilibrio de 10 min, el tratamiento previo del tejido ileal con fluoxetina (10 M) durante 30 min en el lado apical de J ms (de flujo de la mucosa a la serosa).
- Tratar el tejido con TGF-β1 (10 ng / ml) durante 1 h en el lado basolateral y luego incubar con 3 [H] -5-HT (20 nM) durante 30 min en el lado apical.
6. Cuantificación de las mucosas de Serosal Flux (J m) y 3 [H] -5-HT La acumulación en el tejido
- Recoger 0,75 ml de alícuotas de la serosa depósito (total de 5 ml) para medir la radiactividad en un contador de centelleo líquido y para calcular mucosal a serosal (J ms) velocidades de flujo; fluoxetina sensible flujo representa SERT mediada por la captación de 3 [H] -5-HT.
- Para evitar diferencias de presión hidrostática a través de la mucosa durante un período de flujo, tomar muestras de lado seroso y recolocarlos con volúmenes iguales de medio de baño.
NOTA: El cálculo de flujo corrige para la dilución de la muestra final (4,25 ml / 5 ml = 0,85). - Para la cuantificación de 3 [H] -5-HT acumulado en el tejido, desmontar la mucosa de la corredera, se lava una vez con tampón KRB enfriado con hielo, y lo coloca en tubos de cultivo de vidrio.
- Incubar la mucosa en 0,5 ml de KOH al 10% durante la noche a 37 ° C. Medir la radioactividad en alícuotas de 150 l de los lisados (por triplicado) utilizando un contador de centelleo líquido.
- Use alícuotas (3-5 mu l) de los lisados para medir la concentración de proteínas utilizando el método de Bradford.
NOTA: 10 ml de medio de incubación que contiene la serotonina radiactivo se utiliza como un estándar. 5-HT retenido en el tejido se expresa como pmol / mg de proteína / min.
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Representative Results
La inmunotinción en 3D Caco-2 quistes se muestra en la Figura 1. Una imagen representativa de un plano XY que muestra lumen bien delimitadas en el quiste 3D teñidas con faloidina actina se representa en la Figura 1A. El lado que da al lumen denota el lado apical. Las células epiteliales cultivadas en un entorno 3D resultado en un fenotipo epitelial robusto. Diferentes Caco-2 quistes en día 12, cuando la actina y SERT fueron co-manchado, se muestran en la Figura 1B. En esta representación de un plano XY (diferente del plano mostrado en la Figura 1A), la tinción de SERT es visible, predominantemente en la membrana luminal, junto con la tinción de sub-apical. Figura 2 muestra que los niveles de proteína SERT son más altos en los quistes 3D en comparación con células Caco-2 cultivadas como monocapas en la postplating día TH 12. Estos datos sugieren que la cultura 3D de células Caco-2 puede desencadenar sucesos de señalización que imitan naTIVE epitelios y dar lugar a una mayor expresión de SERT. La figura 3A representa la visión general y el funcionamiento de un sistema de cámara de Ussing y muestra el intestino delgado montado en los pasadores de la abertura. Esta técnica permite la evaluación de la actividad de los transportadores epiteliales en el intestino nativo. La ventaja del enfoque de la cámara de Ussing es la capacidad para evaluar la función de los transportadores expresados en la luminal (mucosa) o en el lado basolateral (seroso). La Figura 4 demuestra el aumento de 5-HT flujo ms J (A) y el aumento de la acumulación de 5-HT en la mucosa ileal (B) en respuesta a TGF-β. Desde TGF-β1 aumentó el movimiento de radiomarcado 5-HT de la mucosa a lado serosal, como se representa por las ms J, estos datos son indicativos de un aumento en la captación de 5-HT de la membrana luminal de las células epiteliales ileales. Esto es aún más evidente a partir de un aumento en la acumulación de radiomarcado 5-HT en la célula, queera sensible a la inhibición por la fluoxetina, que refleja la actividad de SERT expresados en la membrana luminal.
Figura 1: Caco-2 cultivadas en una mezcla de proteínas gelatinoso a las 12 d Mostrando Distinto Lumen. Red: actina. Para la inmunotinción de Caco-2 quistes crecido en 3D, las células se cultivaron en una corredera 8 pocillos cámaras y se tiñeron con faloidina (A), como se describe anteriormente por Debnath et al. 9. Para la inmunotinción la cultura 3D Caco-2 (B), los quistes se fijaron en 2% PFA durante 30 min, se trató con PBS-glicina, y se permeabilizaron con 0,5% Triton-X-100 durante 15 min a RT. Después del bloqueo, los quistes se incubaron en anticuerpo SERT (1: 100) durante la noche a 4 ° C. Después se lavaron y se incubaron con anticuerpos de fluorescencia secundario conjugado (1: 200) y faloidina (1: 200)durante 45 minutos a RT. Finalmente, se montaron en antifade DAPI que contiene. Las imágenes fueron capturadas usando un microscopio confocal. Barra de escala: 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: SERT Expresión de proteínas en células Caco-2 cultivadas en 2D y 3D. Los lisados de células Caco-2 cultivadas en un soporte de plástico y Caco-2 3D esferas fueron resueltas por SDS-PAGE se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se analizaron con el anticuerpo SERT y GAPDH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
![figura 3]("/files/ftp_upload/55304/55304fig3.jpg")
Figura 3: (A) La cámara de Ussing y "deslizante" con los pasadores y apertura que muestran un ratón montado en el intestino delgado. Área de apertura deslizador = 0,30 cm2. El control deslizante encaja en las dos mitades de la cámara de Ussing, que son compartimentada. Parámetros eléctricos, tales como potencial de voltaje transepitelial (V t), se mide por un potenciómetro y electrodos (típicamente de calomelanos semicélulas o Ag-AgCl están conectadas por puentes de sal a cada media cámara). Puentes de sal se componen de agar 3% derretido en el tampón fisiológico (por ejemplo, KBR) utilizado para bañar la mucosa para evitar alteraciones en la composición iónica de las soluciones. (B) Esquema del principio de la cámara de Ussing. La mucosa intestinal despojado se montó en las dos mitades de la cámara de Ussing que separa las cámaras de la mucosa y serosa. trazador radiactivo se añadió a la mucosa sidmi; la absorción se midió como la cantidad de radiactividad incorporada por el tejido, normalizado al contenido total de proteínas. El flujo se evaluó mediante la medición de la radiactividad en la cámara de serosa durante un período de tiempo. Los electrodos que se muestran en el esquema permiten la monitorización simultánea de los parámetros eléctricos, la que incluye corriente, tensión, y resistencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Medición de la Función SERT en la mucosa ileal Despojado de la Capa de seromuscular. Ex vivo efectos del tratamiento con TGF-β1 a corto plazo sobre la función de SERT en el íleo del ratón, se manifestaron a través de la medición de 3 [H] -5-HT captación y 3 [H] -5-HT flujos utilizando laUssing cámara. Tratamiento TGF-β1 (10 ng / ml, 1 h) en el lado basolateral aumentó significativamente la función SERT, como se evidencia por el aumento de Na + -sensible mucosal a serosal flujo (J ms) (A) y 3 [H] - la absorción de 5-HT (B). tratamiento con fluoxetina del tejido ileal inhibe la absorción de 5-HT TGF-β1 estimulada. captación Fluoxetine sensible se incrementó 2,5 veces por el TGF-β1 en comparación con el control. Los resultados se representan como la media SEM. Ensayo A de una sola vía de ANOVA Tukey se utilizó para el análisis estadístico. Cálculo del flujo ms J: [(CPM e - CPM s) x factor de dilución] / [(V. Std x concentrado de sustrato) CPM std / xtxa]. CPM e: recuentos por min al final de la medición de flujo; CPM s: recuentos por min en el inicio de la medición de flujo; CPM std: recuentos por minuto de la norma (tomada desde el depósito de la mucosa); V std: volumen of std el CPM; t: tiempo de flujo en h; A: área de la abertura (0,3 cm2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Monocapas de Caco-2 de células completamente diferenciadas se han utilizado ampliamente como polarizado monocapas epiteliales para estudiar el transporte intestinal 10, 11, 12, 13, 14, 15. Sin embargo, para imitar la organización fisiológica de las células epiteliales intestinales, ha habido un considerable interés en el desarrollo de un cultivo Caco-2 en 3D. Un número de modelos de cultivo celular 3D para las células epiteliales intestinales se han desarrollado recientemente que imitan matriz de célula-célula y célula-extracelular nativa (ECM) interacciones con mayor relevancia fisiológica de los sistemas 2D 16. Por lo tanto, los hidrogeles naturales a base de ECM que contienen componentes comunes (tales como laminina, colágeno IV y proteoglicano de sulfato de heparina) se utilizan ampliamente para la generación de cultivos de células 3D 16.
El protocolo descrito aquí demuestra la idoneidad de las células Caco-2 3D cultivadas en mezcla de proteína gelatinosa (un hidrogel naturales basados en la ECM extraído de los tumores de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)) para la investigación del transporte epitelial. Dentro de los 10 días, las células comienzan a formar un lumen de huecos rodeados por una capa de células y muestran polaridad, con dominios apical y basolateral distintas. La densidad celular en el momento de la siembra en una mezcla de proteína gelatinosa es crítica para la formación de quistes regulares con lumen central. Para los experimentos de tinción, hemos añadido 4.000 células / pocillo de un porta (bien Superficie: 0,7 cm 2) 8-cámara. La siembra de células en Cuanto mayor sea la densidad en esferas irregulares. Las 3D Caco-2 quistes en 10 - 12 días muestran polaridad y una mayor diferenciación de células Caco-2 2D cultivadas en cultivos polarizados 17 (observaciones no publicadas). Hemos demostrado un marcado incremento en la expresión de SERT ARNm y los niveles de proteína como losared a monocapas 2D completamente diferenciadas. Además, la utilización de estos métodos, hemos demostrado que el TGF-TGF-β1 aumenta los niveles superficiales de SERT, como se muestra por la tinción de inmunofluorescencia 15.
Curiosamente, los estudios recientes han demostrado que 3D células Caco-2 son más sensibles a los estímulos patofisiológicos debido a la presencia de componentes de señalización críticos, tales como el receptor de TNF y 2 MyD88, y representan un modelo mejor que el sistema 2D convencional 17. Sin embargo, un problema que limita el uso de 3D Caco-2 en la investigación del transporte epitelial es la falta de los diferentes tipos de células y de la complejidad que se encuentran en el intestino nativo. En este sentido, organoides intestinales (también conocidos como enteroids / colonoids) de origen humano o de ratón representan un modelo del estado de la técnica que contiene todos los diferentes tipos de células de epitelio natal para estudiar el transporte de iones, nutrientes o medicamentos. En comparación con organoides, biendiferenciada 3D Caco-2 quistes representan un tipo de células epiteliales (es decir, los enterocitos absorbentes) y son sin duda adecuado para estudios centrados en los mecanismos celulares y moleculares que regulan los transportadores intestinales. Esto se debe a las células Caco-2 3D son convenientes de manejar, son rentables, y son fáciles de manipular, tales como, por transfecciones de ADN plásmido y siRNAs. Otra limitación de las células Caco-2 en 3D en la investigación del transporte epitelial es la dificultad en el acceso al lumen. Los agentes que se unen a receptores de la membrana luminal o a los agentes infecciosos que tienen acceso al epitelio desde el lado luminal puede ser difícil de estudiar en este sistema. Esta limitación se puede superar mediante la microinyección de los agentes en el lumen, como se ha hecho anteriormente en los casos de la cultura organoide intestinal humana para las infecciones de C. difficile 18. Es, sin embargo, importante que los estudios en modelos de cultivo celular in vitro son validados en el i nativantestine utilizando métodos in vivo o ex vivo.
Durante las últimas décadas, la cámara de Ussing ha contribuido en gran medida al reconocimiento de las propiedades funcionales o reguladoras de muchos transportistas epiteliales 19. Aquí, se muestra la idoneidad del enfoque de la cámara de Ussing para medir el flujo 5-HT y la captación de 5-HT en el ratón mucosa intestinal desprovisto de la capa seromuscular 15. Tratamiento TGF-β1 de la mucosa ileal en el lado basolateral (10 ng / ml, 1 h) aumentó significativamente la función SERT, como se evidencia por el aumento de Na + -sensible mucosal a serosal flujo (J ms) y 3 H-5- captación HT. tratamiento con fluoxetina del tejido ileal inhibió la estimulación mediada por TGF-β1 de la captación de 5-HT.
Los pasos críticos de esta técnica incluyen el montaje del tejido en la abertura de diapositivas como una capa intacta (sin ningún desgarro) con el fin de Achie cinco mediciones precisas. herramientas quirúrgicas apropiadas, tales como tijeras, pinzas de bolas de punta fina, y sus hojas quirúrgicas de plumas, son importantes para el manejo apropiado y extracción de tejido.
Este método es aplicable para estudiar la función de otros transportadores epiteliales, tales como transportadores de electrolitos (cloruro, transportadores de Na + / H + intercambiadores, transportadores de nutrientes, etc.). Usos especializados de las Ussing cámara, tales como la técnica de stat pH, para medir la secreción de bicarbonato transepitelial, y el método de flujo isotópico, para medir la secreción neta o la absorción de sustratos han sido revisados exhaustivamente por el Dr. Clarke et al. 8. Se revisaron exhaustivamente la aplicación de cámaras Ussing al estudio de transporte de nutrientes 19. cámaras Ussing Mini también se han utilizado en situaciones clínicamente relevantes, tal como para medir la actividad de transporte de muestras de biopsiaref "> 20. La principal ventaja de la técnica de la cámara Ussing sobre el método del saco evertido es la capacidad de medir simultáneamente los parámetros eléctricos y de transporte de intacta epitelio intestinal, polarizada.
Una preocupación con el método de la cámara Ussing es la viabilidad limitada y la función óptima de una preparación ex vivo intestinal. Tras la retirada del animal, la preparación ex vivo intestinal puede durar sólo hasta 3 h en una cámara de Ussing 19. Por lo tanto, este método puede tener limitaciones en la prueba del efecto de los agentes durante períodos de tiempo más largos. En tales casos, el tratamiento se puede realizar in vivo y, a continuación aislado intestinos de los grupos control y de tratamiento se puede utilizar para medir los parámetros de transporte con el método de Ussing. En todos los casos, la magnitud de la G t (o R t) puede ser un indicador de tiempo real de la viabilidad y puede ser útil en la discriminación entre elefectos específicos y no específicos de reactivos probados.
En resumen, los métodos descritos aquí pueden facilitar la comprensión de los mecanismos celulares y moleculares que regulan la función y regulación de los transportadores epiteliales en condiciones sanas y enfermas, tales como la inflamación intestinal, diarrea infecciosa, malabsorción, o trastornos metabólicos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10x PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95% O2- 5% CO2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa Fluor Phalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| Caco-2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1 Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (NGS, 10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
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