Summary
3 boyutlu yetiştirilen Caco-2 hücreleri bir in vitro hücre kültürü modeli ve fare bağırsak bir ex vivo modeli kullanılarak bağırsak serotonin taşıyıcısı (SERT) fonksiyonu ve ifadesinin düzenlenmesi çalışma basit bir yöntem tarif eder. Bu yöntemler, diğer epitelyal taşıyıcılar çalışma için de geçerlidir.
Abstract
bağırsak epiteli yabancı parçacıklara bir bariyer sağlarken vücudun normal fizyolojik fonksiyonlarında önemli rol oynayan önemli ulaşım ve bariyer fonksiyonları vardır. Bozulmuş epitel taşımacılığı (iyon, besin veya ilaç) birçok hastalıkla ilişkili bulunmuştur ve epitel bütünlüğünü ve bağırsak mikrobiyomları etkileyerek gibi taşıyıcılar, normal fizyolojik fonksiyonları ötesine sonuçlar doğurabilir. fonksiyonu ve transport proteinleri düzenlenmesini anlamak geliştirilmiş terapötik girişimlerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. epitel taşıma çalışmada büyük zorluk yerli bağırsak epitel hücrelerinin önemli özelliklerini özetlediği uygun bir model sistemi geliştiriyor. Bu Caco-2, T-84 ve HT-29-Cl.19A hücreleri gibi çeşitli in vitro hücre kültürü modelleri, tipik olarak epitel taşıma araştırmalarında kullanılmıştır. Bu hücre hatları e modelleme için bir indirgemeci yaklaşımı temsilpithelium ve epitel-mikrobiyal etkileşimleri bunların incelenmesi de dahil olmak üzere pek çok mekanik çalışmalar, kullanılmıştır. Ancak, hücre mono tabakaları doğru hücre-hücre etkileşimleri hem de in vivo mikro-yansıtmamaktadır. 3D yetiştirilen hücreler, ilaç geçirgenliği çalışmaları için modeller umut verici olduğu gösterilmiştir. Bu 3D Caco-2 hücreleri, epitel taşıyıcıları incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Caco-2 hücrelerinde yapılan çalışmalar, hücre spesifik etkileri ekarte etmek ve dikkate yerli bağırsağın karmaşıklığı almak için diğer modelleri ile tamamlanmaktadır olması da önemlidir. Çeşitli yöntemler, daha önce bu izole epitel hücrelerinde veya izole edilmiş plazma zar veziküllerinde dışa eğik kesesi ve emme olarak taşıyıcılar, işlevselliğini değerlendirmek için kullanılmıştır. modellerine saygı ve taşıma fonksiyonu ölçümü ile dikkate alan zorlukları alırsak, biz burada 3D Caco-2 hücreleri büyümek ve bir gibi bir Ussing odasının kullanımını tanımlamak için bir protokol göstermektediretkin bir yaklaşım gibi sağlam polarize bağırsak epitel olarak serotonin naklini ölçmek için.
Introduction
bağırsak epitel lümeninde sıvı salgılanması ve iyonların çeşitli taşıyıcı proteinler (kanalları, ATPazların, ko-nakliyeciler ve değiştiriciler) besin, elektrolit emilimi kadar sayısız fonksiyonları yerine, ve uyuşturucu ile donatılmıştır. Transport proteinleri vektörel bir şekilde iyonlar veya moleküller hareketine olanak elektrokimyasal eğimler oluşturur. Bu polarize epitel hücrelerinin en üst ve taban zarlarında taşıma sistemleri asimetrik dağılımları ile elde edilir. Buna ek olarak, bitişik epitel hücreleri urgan sıkı bağlantıları, en üst ve taban membran alanları arasında bileşenlerin zar içi difüzyon karşı bir engel olarak hizmet eden bu süreçte önemli bir rol oynar. Yerli bağırsak bu karakteristik özelliklerini taklit uygun model sistemler (örneğin polarizasyon, farklılaşma ve sıkı kavşak bütünlüğü) functio çalışma için kritikepitel taşıma sistemlerinin tesi.
modelleri ile ilgili olarak, intestinal epitel taşıma araştırmalarında anda kullanılan tipik hücre çizgileri, Caco-2, tam olarak farklılaşmış bir modeli olan küçük bağırsak epitel hücreleri absorbe; ve T84 hücreleri veya HT-29 alt klonlar, kript kaynaklı kalın bağırsak epitel hücreleri 1 modeller. Geleneksel olarak, bu hücre hatları plastik yüzeyler içinde mono-tabaka olarak veya kaplanmış Transwell yetiştirilir. Bir dereceye kadar trans-iyi hücre kültür ekleri polarize hücreleri basolaterally beslemeye izin vererek in vivo ortamda benzer. Bununla birlikte, geleneksel 2B kültür sistemlerinde bir sınırlama hücreleri, suni düz ve katı bir yüzeye uyum sağlamak zorunda olmasıdır. Böylece, yerli epitel fizyolojik karmaşıklığı doğru bir 2D sisteminde yansıtılmaz. Bu sınırlama, bu jelatinimsi proteini MIXTUR'a gibi belirli bir mikro-3D hücrelerin büyümesini yöntemler ile aşılmıştırE, hücre dışı matris bileşenleri, 2, 3, çeşitli ihtiva etmektedir. Bununla birlikte, in vitro kültürleri birden hücre tiplerini ve bağırsakta bölgeye özgü bir mimariye sahiptir bağırsak epiteli, karmaşıklığı taklit edemez. Bu nedenle, hücre kültürü modelleri kullanılarak çalışmalar, ana bağırsakta daha fazla değeri gerektirir. In vitro 3D hücre kültürü ve fare bağırsak mukozasını kullanarak, bağırsak serotonin transporter (SLC6A4, SERT) düzenlenmesi incelemek için buraya basit yöntemler açıklanmaktadır.
Bağımlı işlemi - SERT taşıyıcı hızla Na + / Cl üzerinden taşındığında, önemli bir hormon ve nörotransmitter, 5-hidroksitriptamin (5-HT) hücre dışı durumu düzenler. SERT, anti-depresanlar, bilinen bir hedef ve en son, ishal ve bağırsak iltihabı gibi GI bozukluklarının, yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmıştır.Yöntem bağırsak epitelial hücrelerinde 5-HT alım daha önce tarif edilmiştir araştırmak. Örneğin, plastik destek ya da geçirgen eklerde yetiştirilen Caco-2 hücreleri, üst ve taban üzerindeki etki 4 hem de fluoksetin duyarlı 3H-5-HT geri alımını sergiledikleri gösterilmiştir. Insan organ donörü ince bağırsaklarda hazırlanan izole fırça kenar zar vezikülleri (BBMVs) SERT fonksiyonunun ölçülmesi de bizim 5 tarafından tarif edilmiştir. İnsan BBVMs 3 H-5-HT alım fluoksetin duyarlı Na + / Cl olduğu gösterilmiştir - bağımlı ve 300 K m nM 5 doygunluk kinetiği göstermiştir. Benzer yöntemler kullanarak, aynı zamanda, daha önce, fare bağırsak BBMVs 6, 3H-5-HT alımı, SERT fonksiyonu ölçülen. Bununla birlikte, temiz plazma zar veziküllerinin hazırlanması doku mukozanın gerektirir. Bu radiog gibi diğer yöntemler,3H-5-HT alım siteleri sonuçlarda be- lirgin görselleştirme da gine domuzu ve sıçan ince bağırsak 7 daha önce gösterilmiştir.
Ussing odası çeşitli epitel doku iyonların, besin ve ilaç taşıma ölçmek için daha fizyolojik bir sistem sağlar. Ussing odası tekniğin önemli avantajı, sağlam, polarize bağırsak epiteli elektriksel ve nakil parametrelerinin hassas ölçüm mümkün kılmasıdır. Dahası, içsel nöromüsküler sistemin etkisini en aza indirmek için, bağırsak mukozasının seromusküler sıyırma epiteli 8 taşıyıcılar düzenlenmesini araştırmak için yapılabilir.
Bu jelatinimsi protein üzerinde 3D yetiştirilen Caco-2 hücreleri, farklı üst ve taban üzerindeki işaretleri ifade eden bir içi boş lümen olduğu belirlenmiştir. Bu hücreler, 2D Caco-2 hücreleri daha SERT yüksek ifadesini gösterir. Yöntemler 3D hücreleri büyümek ve perform immün veya RNA ve protein çıkarma açıklanmıştır. Buna ek olarak, bir Ussing odası tekniği kullanılarak ince bağırsak mukozasında, TGF-ß1 bir pleiotropik sitokin tarafından SERT fonksiyonu ve düzenleme çalışma yöntemleri tarif eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
jelatinli protein karışımı ile ilgili artan 3D Caco-2 hücre kültürü: Caco-2 3D kültür sisteminde bağırsak taşıyıcılar 1. Çalışma
- Çözülme büyüme faktörü 8 saat boyunca buz üzerinde, jelatinimsi bir protein karışımı düşük (ya da O / N), 4 ° C'de ilave edildi. Bir kez 1 mL veya daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de kullanıma veya deposu için 500 uL alikot yapmak çözülmüş.
- kültür gününde, buz üzerinde kültürü (RNA ve protein ekstraksiyonu için) plakaları ya da (immün) odacıklı slaytlar ön soğutma. Sekiz oyuklu bölmeli-cam slayt (ya da 6-plaka oyuk başına 120 uL) her bir oyuğuna, jelatinimsi protein karışımı 30 ul ekleyin ve yayılır. sürecinde hava kabarcığı oluşturmak için özen gösterin.
- 15, 37 ° C'de bir hücre kültür inkübatörü içinde kayar ve / tabak koyun - 30 dakika ve jelatinli protein karışımı, katılaşmaya sağlar.
- jelatinimsi bir protein karışımı, katılaşan iken, Caco-2 hücrelerinin konfluent balon trypsinize.
- sayısını sayınve hücrelerin 5 dakika boyunca masa üstü santrifüjde 500 xg'de bunları dönerler. gerektiği gibi 3D Caco-2 Orta hücre pelet yeniden askıya.
- (Plakalar için kuyu başına 20.000) kuyu başına 4,000 hücre cam haznesi slaytlar Tohum. Hücreler 37 ° C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde büyümeye olanak sağlar. 4 d - orta her 3 değiştirin.
3D Caco-2 hücrelerinde Epitel Taşıyıcılar 2. İmmünofloresan Boyama: 1. Gün
- orta aspire ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (NaOH ile 8.5'a ayarlanmıştır pH PBS)% 2 paraformaldehit 400 uL (PFA) ile hücrelerin tespit.
Not: PFA Çözelti 4 ° C 'de en fazla 1 hafta saklanmamalıdır ve taze çözelti kullanılabilir. DİKKAT: PFA son derece zehirlidir ve potansiyel kanserojendir. Her zaman kimyasal kaput dikkatli ve kişisel koruyucu ekipman kullanarak başa. - (1 x PBS ile iki kez kuyu durulayın ve PBS içinde 4 ° C'de slaytlar depolamak 400 uL /iyi). Bir kez, sabit bir haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edin.
- RT'ye odası slaytlar (bu jelatinimsi protein karışımı yatak sertleşmesine ve yıkama adımları sırasında aspirasyon için kolay hale getirecek) ısıtın.
- Artık daha 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 Triton ile hücrelerin geçirgenliği.
- PBS-glisin tamponu (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3.5 mM NaH 2 PO 4, 100 mM glisin) hazırlayın. Oda sıcaklığında 10 dakika her biri için 1 x PBS-glisin ile 3 kez yıkayın.
- Immünofloresan tamponu (IF) hazırlanması: 130 mM NaCI, 7 mM Na 2 HPO 4, 3.5 mM NaH 2 PO 4, 100 mM glisin, 7.7 mM NaN3,% 0.1 BSA,% 0.2 Triton X-100 ve% 0.05 Tween-20 .
- IF yıkayın 3x oda sıcaklığında 10 dakika her biri için tampon. % 5 blok IF tamponu Normal Keçi Serum (NGS). IF +% 1 keçi serumu içinde seyreltilmiş birincil antikor, 200 uL inkübe / oyuk, 1 - oda sıcaklığında 2 saat. 10 dakika her biri için IF tampon 3x ile yıkayın.
- İkincil anti-ile inkübegövde (1: 200), oda sıcaklığında 1 saat, eğer +% 1 NGS, 200 uL / oyuk içinde seyreltilmiş.
- 10 dakika her biri için bir IF tamponu ile üç kez yıkanır. Bu aşamada karanlıkta slaytlar tutun. onun kenar temas kuyuların kenarına kadar tutucu sayesinde beyaz bir kaldırıcı bir siyah tutucu bölme slayt yerleştirerek ve sürgülü cam slaytlar plastik odaları kaldırın. Yavaşça odaları (tutucu ve kaldırıcı kültür slaytlar ile gelmelidir) yukarı çekin.
- Yavaş, anti-solma ortamı ile monte ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kurumaya bırakılır.
- Tamamen kurumuş sonra, oje ve konfokal mikroskobu ile görüntü onlara olan slaytlar mühür. iki hafta ya da daha fazla ay -20 ° C 'de 4 ° C' de slaytlar saklayın.
3D Caco-2 hücreleri, 3. RNA ve protein çıkarımı
- TGF-p ß1 bir test maddesi ile 14 D (10 ng / ml, 1 H), - 12 jelatinimsi protein karışımı ile kültürlenen hücrelerin tedavi edin.
- Tedaviden sonra, 1 hücreleri yıkayınX PBS ile yıkandı. 30 dakika jelatinli protein karışımı sıvılaştırılması için buz üzerinde hücreleri tutun.
- soğutulmuş PBS ile kuyu yıkayın ve bireysel santrifüj tüplerine hücreleri toplamak. 500 xg ile 10 dakika boyunca 4 ° C 'de düşük hızda santrifüjleme kullanılarak hücreler toplanır. Standart prosedürler kullanılarak RNA ekstrakte ve gerçek zamanlı RT-PCR kullanımı.
- Protein ekstre için, 1 x proteaz kokteyli inhibitörü ile desteklenmiş 1 x hücre parçalama tamponu kullanılarak hücrelerin lize. pelet hücre parçalama tamponu ilave edildikten sonra, sonikasyon ile hücreler lize edildi ve 7,500 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj ile hücre debrisini uzaklaştırmak.
Bir Ussing Odası kullanılması Fare ileumda 5-HT Alımına 4. Ölçümü: Bağırsak Hazırlık seromusküler Sıyırma
- Ötenazi ardından, fareler incelemek ve (mide sonra çekum öncesi) küçük bağırsak kaldırın. üç bölüme ince bağırsak bölün. Orta üçüncü atın proksimal üçte kullanmakjejunum olarak ve ileum olarak uzak üçte kullanın. epiteline zarar görmesini önlemek için kendi mezenterik eki bağırsak çekerek kaçının. buz gibi soğuk Krebs-Ringer bikarbonat (KBR) tampon ile kaplayıp doku bölümü soğuk tutmak.
- uzunlamasına makas kullanılarak bağırsak açın. KBR seromüsküler sıyırma önce 10 dakika boyunca 1 uM indometasin ihtiva eden gazla, buz gibi soğuk taze kesilmiş bağırsak bölümlerinde inkübe edin.
- % 7 agaroz veya tedavi silikon elastomer (0.5 cm kalınlığında) içeren bir plaka aşağı bağırsak bölümü (uzunluğu ~ 1 cm) mukozal tarafı sabitleyin.
- alt aydınlatma ile bir diseksiyon stereomikroskop altında seromusküler katmanları soyun. Bir tüy neşter bıçak kullanarak seromusküler katman kesti. bağırsak uzunlamasına ekseni boyunca tabakanın kenar elde etmek için ince forseps kullanın.
NOT: sıyırma işlemi sırasında, stereomicroscope alt aydınlatma Peyer yama ile alanları belirlemek ve önlemek için yardımcı olures. - seromüsküler sıyırma tamamlanmasından sonra, Ussing yarı bölmenin pimlerin üzerine dikkatli bir şekilde mukozayı monte edin. Tüm süreç boyunca, yırtılmasını önlemek için kenarlarından elimden mukozal doku tutmaya özen gösterin.
5. Dengeleme ve Doku Tedavisi
- Krebs çözeltisi hazırlayın: 115 mM NaCI, 25 mM NaHCO 3, 2,4 mM K 2 HPO 4, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, ve% 95 O 2/5 ile% gazlı pH 7.4'te 0.4 mM KH 2 PO 4, 37 ° C'de CO2. ozmotik dengesini korumak için mukozal banyosuna bir enerji substrat ve 10 mM mannitol olarak hizmet serozal banyosuna 10 mM glukoz ekleyin.
Not: Krebs solüsyonu, hücre içi, 5-HT bozulmasını önlemek için, L-askorbik asit (100 uM) ve pargilin (100 uM, monoamin oksidaz inhibitörü) ile takviye edilmektedir. - apikal (lümen) si, hem maruz odasına kaydırıcıyı yerleştirinde ve Krebs solüsyonu doku bazolateral (serozal) yan.
- 10 dakikalık bir dengeleme döneminden sonra, J ms (mukozal-To-serozal akışı) apikal tarafında, 30 dakika için fluoksetin (10 uM) ile ön işleme tabi ileal doku.
- Bazolateral tarafında, 1 saat boyunca, TGF-ß1 (10 ng / ml) ile doku tedavi ve apikal taraftan 30 dakika boyunca 3 [H] -5-HT (20 nM) ile inkübe edin.
Serozal Flux (J ms) ve 3 [H] Doku -5-HT Birikim mukozal 6. sayısallaştırılması
- Bir sıvı sintilasyon sayacında radyoaktivite ölçmek ve mukozal-to-serozal (J MS) akış oranı hesaplamak için (toplam 5 mL) serozal haznesinden 0.75 mL alikotları toplamak; Fluoksetin duyarlı akı 3 [H] -5-HT alımını SERT aracılı temsil eder.
- serozal tarafında ve yeniden numune almak, bir akı dönemde mukoza boyunca hidrostatik basınç farklılıkları önlemek içinBanyo ortamının eşit hacimleri ile koyun.
NOT: akı hesaplama ucu numune (4.25 ml / 5 ml = 0.85) seyreltilmesi için düzeltir. - 3 [H] doku biriken -5-HT ölçümü için, sürgü mukoza çıkarmak buz soğukluğunda KRB tamponu ile bir kez yıkanır, camdan yapılmış bir kültür tüpleri içine yerleştirin.
- gece boyunca 37 ° C'de% 10 KOH 0.5 mL mukoza inkübe edin. bir sıvı ışıma sayacı kullanılarak (üçlü olarak) lizatlarının 150 uL alikotları radyoaktivite ölçülür.
- Bradford metodu kullanılarak protein konsantrasyonunu ölçmek için lizatlarının - (5 uL 3) alikotları kullanın.
Not: Radyoaktif serotonin içeren kuluçka ortamı 10 ml, bir standart olarak kullanılır. 5-HT pmol / mg protein / dakika olarak ifade edilir doku içinde muhafaza.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3B, Caco-2 kisti immün, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Phalloidin aktin ile boyandı 3D kist iyi sınırlı lümen gösteren bir XY düzleminde bir temsilcisi görüntü Şekil 1A gösterilmiştir. lümen bakan tarafı apikal tarafı gösterir. Sağlam epitel fenotip bir 3D ortamda sonucunda kültüre epitel hücreleri. Aktin ve SERT eş lekeli gün 12, Farklı Caco-2 kistleri, Şekil 1B'de gösterilmiştir. Bir XY düzlemine (Şekil 1A'da gösterilen düzlemden farklı) bu gösterimde, SERT boyama alt apikal boyama ile birlikte, esas olarak luminal membranında, görülebilir. Şekil 2, 12. günde postplating tek katmanlar olarak yetiştirilen Caco-2 hücreleri ile kıyaslandığında SERT protein seviyesi 3D kist yüksek olduğunu göstermektedir. Bu veriler Caco-2 hücrelerinin 3D kültür na taklit sinyal olayları tetikleyebilir olabileceğini düşündürmektedirepitel tive ve artan SERT tanımına neden olur. Şekil 3A, bir Ussing odası sisteminin genel bir bakış ve işleyişini gösteriyor ve açıklık pimleri monte ince bağırsağa gösterir. Bu teknik, yerli bağırsak epitel taşıyıcılar etkinliğinin değerlendirilmesini sağlar. Ussing odası yaklaşımın avantajı luminal (mukoza) ya da bazolateral (serozal) tarafında ifade taşıyıcılar fonksiyonunu değerlendirmek için yeteneğidir. Şekil 4, 5-HT, J MS akışı (A) artan ve TGF-p yanıt olarak ileum mukozasından (B), 5-HT birikimi artmıştır gösterir. J MS ile temsil edildiği gibi, TGF-β1, serozal tarafına mukoza gelen radyo-etiketli 5-HT hareketlerini artması nedeniyle, bu veriler, ileal epitel hücrelerinin lüminal zardan 5-HT alımının artış göstergesidir. Bu hücrede radyo etiketli 5-HT birikmesinde bir artış, daha ileri belirgin olanSERT aktivitesini yansıtan fluoksetin inhibisyona karşı duyarlı olduğu lümen membranı üzerinde ifade edilmiştir.
Şekil 1: Caco-2 Farklı Lumen Gösterilen 12 d bir jelatinöz Protein Karışımı Yetiştirilen. Kırmızı: aktin. Debnath ve arkadaşları tarafından, daha önce tarif edildiği gibi 3D yetiştirilen Caco-2 kist immün için, hücreler, 8 oyuklu odacıklı slayt kültürlenmiş ve phalloidin (A) ile boyanmıştır. 9. 3D Caco-2 kültürü (B) immün için, kistler, 30 dakika boyunca% 2 PFA içinde sabitlendi, PBS-glisin ile muamele edilmiş ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 0.5 Triton-X-100 ^ ile geçirgenleştirildi. gece boyunca 4 ° C'de: Bloke edildikten sonra, kistler SERT antikoru (1: 100) inkübe edildi. Bunlar daha sonra yıkandı ve floresan-konjuge sekonder antikor (1: 200) ile inkübe edildi ve Phalloidin (1: 200)Oda sıcaklığında, 45 dakika karıştırıldı. Son olarak, antifade içeren DAPI monte edilmiştir. Görüntüler konfokal mikroskop kullanılarak ele geçirildi. Ölçek çubuğu: 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: 2D ve 3D Yetiştirilen Caco-2 hücrelerinde SERT Protein Ekspresyonu. SDS-PAGE ile rezolve edilmiş, bir plastik destek üzerinde kültürlenmiş Caco-2 hücreleri gelen lizatlar ve Caco-2 3D küre nitroselüloz membranlar üzerine lekelendi ve SERT antikoru ve GAPDH ile analiz edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
![Şekil 3,]("/files/ftp_upload/55304/55304fig3.jpg")
Şekil 3: (A) monte fare ince bağırsak gösteren pimleri ve diyafram ile Ussing odası ve "kaymak". Sürgü Boşluk alanı, = 0.30 cm-2. kaymak bölümlere olan Ussing odasının iki yarısı, sığar. Bu transepitelyal voltaj potansiyeli (V t) halinde elektrik parametreleri, bir potansiyometre ve elektrotların (tipik olarak yarı hücreleri kalomel veya Ag-AgCI her bir hücre devre tuz köprüleri ile bağlı olan) ile ölçülür. Tuz köprüler çözeltilerinin iyonik kompozisyon değişiklikleri önlemek için mukoza banyo için kullanılan fizyolojik tampon maddesi içinde (örneğin, KBr) erimiş% 3 ağar oluşmaktadır. Ussing haznenin ana (B) şematik. sıyrılmış intestinal mukoza mukozal serozal bölmesini ayıran Ussing odasının iki yarısı monte edilmiştir. Radyoaktif izleyici mukozal sid eklendie; emme, toplam protein muhtevasına göre normalize doku olarak dahil edilen radyoaktivite miktarı olarak ölçülmüştür. akış süresi daha uzun bir sürede serozal odası içinde radyoaktivitenin ölçülmesiyle değerlendirildi. şemada gösterilen elektrotlar elektriksel parametrelerin dahil olmak üzere akım, gerilim ve direnç eşzamanlı izlenmesi için izin verir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: seromusküler Katman Stripped İleal Mukozasına SERT Fonksiyon Ölçümü. 3 [H] -5-HT alımı ve 3 [H] -5-HT ile akılarının ölçümü yoluyla gösterilen bir fare ileumda SERT fonksiyonu üzerindeki kısa vadeli TGF-β1 tedavi ex vivo etkileri,odasına Ussing. TGF-β1 tedavi artan Na ile kanıtlandığı gibi (10 ng / ml, 1 H), bazolateral tarafında önemli ölçüde SERT fonksiyonu artış + -duyarlı mukoza-To-serozal akımı (J MS) (A) ve 3 [H] - 5-HT alımı (B). ileum doku fluoksetin TGF-β1 ile uyarılmış 5-HT geri alımını inhibe etti. Fluoksetin duyarlı alım kontrol ile karşılaştırıldığında, TGF-ß1 2.5-kat artmıştır. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilir. Bir tek yönlü ANOVA Tukey Testi istatistiksel analizler için kullanılmıştır. J ms akı hesaplanması: [(CPM e - CPM ler) x Sulandırma faktörü] / [(. V std x kons substratın) CPM std / xtxa]. CPM e: akı ölçüm sonunda dakikada başına sayım; CPM s: akı ölçüm başlangıcında dakika başına sayım; CPM std standardın dakika başına sayım (mukozal depodan alınan); V std hacim oCPM std f; t: h akı zamanı; a: diyafram (0.3 cm 2) alanı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bağırsak taşıma 10, 11, 12, 13, 14, 15 okumak için epitel mono tabakaları polarize tam olarak farklılaşmış Caco-2 hücre mono tabakaları yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, bağırsak epitel hücrelerinin fizyolojik organizasyonunu taklit etmek için, 3D bir Caco-2 kültürün gelişmesinde önemli bir ilgi olmuştur. Bağırsak epitelial hücreler için 3 boyutlu hücre kültürü modelleri arasında bir sayı en son ana hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matris (ECM) 2D sistemleri 16 den daha fazla fizyolojik ile ilintili etkileşimlere taklit geliştirilmiştir. Bu durumda, (örneğin, laminin, kollajen IV ve heparin sülfat proteoglikan gibi) ortak bileşenleri ihtiva eden ECM bazlı, doğal hidrojeller yoğun 3D hücre kültürlerinde 1 üretimi için kullanılır6.
Burada açıklanan protokol jelatinimsi protein karışımı yetiştirilen 3D Caco-2 hücreleri uygunluğunu epitelyal taşıma araştırma (Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare tümörlerinden ekstre bir ECM bazlı, doğal hidrojel) göstermektedir. 10 gün içinde, hücreler farklı üst ve taban üzerindeki etki ile birlikte, hücreler ve göster polarite bir tabaka ile çevrelenmiş içi boş bir lümen oluşturmaya başlar. jelatinli protein karışımı ile tohumlama zamanda hücre yoğunluğu, merkez lümenin düzenli kist oluşumuna için kritiktir. Boyama deneyleri için, 4,000 hücre / oyuk bir 8 bölmeli sürgünün (: 0.7 cm 2 iyi bir yüzey alanı) ilave edildi. düzensiz alanlarda daha yüksek bir yoğunluk sonuçlarına hücrelerin ekim. 10. 3D Caco-2 kistleri - 12 gün transwells 17 (yayınlanmamış gözlemler) üzerinde büyümüş 2D Caco-2 hücreleri daha polarite ve fazla farklılık gösterir. Bu zorunlu olarak belirgin bir SERT mRNA ekspresyonunda bir artış ve protein düzeyleri göstermiştirTamamen farklılaşmış 2D mono tabakaları için ared. Ayrıca, bu yöntem kullanılarak, biz immünofloresan boyama 15 ile gösterildiği gibi, TGF-TGF-β1, SERT yüzey seviyelerini arttırdığını göstermiştir.
İlginç bir şekilde, son çalışmalar 3D Caco-2 hücreleri için TNF reseptör 2 ve MyD88 gibi kritik sinyal bileşenlerinin mevcudiyetinde patofizyolojik uyaranlara karşı daha duyarlı olduğunu göstermiştir, ve konvansiyonel 2D sistemi 17 daha iyi bir modeli temsil var. Bununla birlikte epitelial taşıma araştırma 3D Caco-2 kullanımını sınırlamaktadır bir sayısı farklı hücre tipleri olmaması ve yerli bağırsakta bulunan karmaşıklığıdır. Bu bağlamda, insan ya da fare kökenli (ayrıca enteroids / colonoids olarak da bilinir), bağırsak organoids iyonları, besin ya da ilaçların taşınması çalışma yerel epitel farklı hücre tipleri içeren bir state-of-the-art modelini temsil etmektedir. organoids karşılaştırıldığında, iyi-farklılaştırılmış 3D Caco-2 kistleri epitel hücrelerinin bir tür (örneğin emme enterositler) temsil eder ve kesinlikle bağırsak taşıyıcılar düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaların ilgili çalışma için uygundur. 3D Caco-2 hücreleri, işlemek için uygundur uygun maliyetli ve bu plazmid DNA ve siRNA'lar transfeksiyonlar için olduğu gibi, idare edilmesi kolay olmasıdır. epitel taşıma araştırma 3D Caco-2 hücrelerinin başka sınırlama lümen erişimde zorluk. Membran reseptörleri veya luminal taraftan epitel erişmek enfeksiyöz ajanlara lümen bağlanan ajanlar bu sistemde çalışmak için zor olabilir. C. difficile enfeksiyon için 18 insan intestinal organoid kültür durumlarında daha önce yapıldığı gibi bu sınırlama, lümen ajanları microinjecting aşılabilir. In vitro hücre kültürü modelleri üzerindeki çalışmalar da nativ I doğrulanma Ancak önemli olanntestine in vivo ya da ex vivo yaklaşımlar kullanılmıştır.
Son birkaç yıldır, Ussing odası birçok epitel taşıyıcıların 19 fonksiyonel veya düzenleyici özelliklerinin tanınması büyük ölçüde katkıda bulunmuştur. Burada, seromüsküler tabaka 15 içermeyen fare bağırsak mukozasında, 5-HT akışı ve 5-HT geri alımını ölçmek için Ussing odası yaklaşım uygunluğunu göstermektedir. Artan Na ile kanıtlandığı gibi belirgin, SERT fonksiyonu artan bazolateral taraf (10 ng / ml, 1 h) ileum mukozasından TGF-β1 tedavisi + -duyarlı akımı (J ms) mukozal seröz-ve 3H-5- HT alım. ileum doku fluoksetin 5-HT alımının TGF-β1 kaynaklı uyarımını inhibe etti.
Bu tekniğin kritik adımlar achie amacıyla (herhangi bir yırtılma olmadan) bozulmamış bir katman olarak slayt diyafram üzerinde doku montaj dahil doğru ölçüm ettik. Böyle top makas, ince uçlu forseps ve tüy cerrahi bıçaklar gibi uygun cerrahi aletler, uygun taşıma için önemli ve doku sıyırma vardır.
Bu yöntem, diğer epitel gibi elektrolit taşıyıcıları olarak taşıyıcıların (klorür taşıyıcılar, Na + / H + değiştirici, besin taşıyıcılar, vb) işlevini incelemek için geçerlidir. PH, stat tekniği olarak Ussing odası-böyle İhtisas kullanımları net salgılanmasını veya emilimini ölçmek için, transepitelyal bikarbonat salgılanmasını ve izotopik akı yöntemi ölçmek için yüzeylere-var Dr Clarke ve ark kapsamlı gözden geçirilmiştir. 8. Onlar yoğun besin taşıma 19 çalışmaya odaları Ussing uygulanmasını gözden geçirilmiştir. Kısa Ussing odaları da biyopsi örneklerinde taşıma fonksiyonu ölçmek için örneğin, klinik olarak ilgili durumlarda kullanılmaktadırref "> 20. everte kese yöntemi üzerinde Ussing odası tekniğin en önemli avantajı aynı anda bozulmamış, polarize bağırsak epiteli elektrik ve ulaşım parametreleri ölçmek için yeteneğidir.
Ussing odası yöntemi ile bir endişe sınırlı canlılığı ve ex vivo bağırsak hazırlık optimal fonksiyonudur. Hayvandan çıkarılması üzerine, ex vivo olarak, bağırsak preparat yalnızca Ussing bölme 19 kadar 3 saat boyunca devam edebilir. Bu nedenle, bu yöntem, uzun süreler için maddelerin etkisini test etmek sınırlamalar olabilir. Bu durumda, tedavi, in vivo olarak gerçekleştirildi ve daha sonra Ussing yöntemi ile taşıma parametrelerini ölçmek için kullanılabilen kontrol ve tedavi gruplarından bağırsak izole edilebilir. Tüm durumlarda, G T (ya da R t) büyüklüğü canlılığının gerçek zaman göstergesi olabilir ve ayırt yararlı olabilirTest edilen reaktiflerin spesifik ve spesifik olmayan etkiler.
Özetle, burada açıklanan yöntemler, bağırsak iltihabı, bulaşıcı ishal, malabsorbsiyon veya metabolik bozukluklar gibi sağlıklı ve hastalıklı koşullarda, işlev ve epitel taşıyıcıların düzenleme düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaları anlayışımız kolaylaştırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10x PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95% O2- 5% CO2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa Fluor Phalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| Caco-2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1 Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (NGS, 10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).
- Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
- Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
- Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
- Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
- Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
- Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
- Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
- Chase, A. O. Acyclovir for shingles. Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).
- Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
- Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
- McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
- Chatterjee, I. shita, K, A., Gill, R. avinder K., Alrefai, W. addah A., Dudeja, P. radeep K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).
- Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
- Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
