تحديد أسلاف ريدثروميلويد وذريتهم في الجنين الماوس عن طريق التدفق الخلوي

Summary

في حين يتم تجنيد البلاعم تسلل باستمرار إلى أنسجة الكبار من السلائف تعميم، والبذور المقيمين البذور الأنسجة أثناء التنمية، حيث يتم الحفاظ عليها دون مزيد من المدخلات من الأسلاف. تم تحديد الأسلاف للبلاعم المقيمين مؤخرا. هنا، نقدم أساليب لتخطيط مصير الجينات من الأسلاف بلعم المقيمين.

Abstract

البلاعم هي البالعات المهنية من الذراع الفطرية للجهاز المناعي. في حالة مستقرة، وجدت الضامة سيسيل في الأنسجة الكبار حيث أنها بمثابة الحرس خط الجبهة من العدوى والتلف الأنسجة. في حين يتم تجديد الخلايا المناعية الأخرى باستمرار من الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف (هسك) الموجودة في نخاع العظام، وقد ثبت أن النسب من الضامة، والمعروفة باسم الضامة المقيمين، أن تكون ذاتي الصيانة في الأنسجة دون مدخلات من هسكس نخاع العظم. ويتمثل هذا النسب من قبل الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ، وخلايا كوبفر في الكبد وخلايا لانجرهانز في البشرة وغيرها. الأمعاء والقولون الصفيحة بروبريا هي أنسجة الكبار فقط خالية من هس مستقلة البلاعم المقيمين. وقد كشفت التحقيقات التي أجريت مؤخرا أن الضامة المقيمين تنشأ من خارج الجنينية كيس المحار الدم من السلف (ق) متميزة عن الخلايا الجذعية المكونة للدم الجنين (هسك). بين الكيس المحي نهائي تكون الدم، هأسلاف ثرومرويلويد (إمب) تؤدي إلى كل من خلايا الدم الحمراء والخلايا النخاعية، ولا سيما الضامة المقيم. يتم توليد إمب فقط داخل كيس المحار بين E8.5 و E10.5 أيام من التطور، وأنها تهاجر إلى الكبد الجنين في وقت مبكر من توصيل الدورة الدموية، حيث أنها توسيع والتمييز حتى E16.5 على الأقل. وتشمل سلالاتهم كريات الدم الحمراء، الضامة، العدلات والخلايا البدينة ولكن فقط الضامة المستمدة من إمب تستمر حتى سن البلوغ في الأنسجة. طبيعة عابرة من ظهور إمب والتداخل الزمني مع الجيل هسك يجعل من الصعب تحليل هذه الأسلاف. أنشأنا بروتوكول خرائط مصير تاموكسيفين محرض على أساس التعبير عن مستقبلات سيتوكين بلعم Csf1r المروج لتوصيف إمب والخلايا المستمدة إمب في الجسم الحي عن طريق التدفق الخلوي.

Introduction

هناك عدة موجات متتالية ولكنها متداخلة من الأسلاف المكونة للدم أثناء التنمية التي لا تزال نسلها النخاعي في مرحلة البلوغ. أولا، تظهر الأسلاف "البدائية" غير المحايدة في كيس صفار الماوس ^{1 ، 2} بين E7.5-E8.25 وتؤدي إلى الضامة الجنينية دون أي وسيط أحادي. ما إذا كانت البلاعم المستمدة من الأسلاف البدائية تستمر في الدماغ البالغ كما تبقى الخلايا الدبقية الصغيرة موضوعا للتحقيق النشط. ثانيا، تنشأ السلائف الحمراء والنخاعية (إمبس) في كيس المحي في E8.5، أدخل مجرى الدم واستعمار الجنين. إمبس تخرج من كيس الصفار هيموجينيك إندوثيليوم في الانتقال البطانية إلى أن تكون المكونة لل رونكس 1 - ^{4 ، 3} . في حين يمكن إمب التفريق في الضامة داخل كيس الصفار، فإنها أيضا استعمار الكبد الجنين من يوم الجنينية (E) 9 ⁵ و ديفيرنالتورم في كرات الدم الحمراء، الضخامة، الضامة، وحيدات الخلايا المحببة والخلايا البدينة ⁶ . الضامة التي تستمد من إمبس تحمل القدرة التكاثري في الأنسجة التنموية والكبار. ما إذا كانت الضامة المستمدة من إمب تجاوز مرحلة الوحيدات من التمايز لا تزال مثيرة للجدل كما هو معروف القليل جدا عن مسار التمايز ^{7 ، 8} . وأخيرا، تظهر الخلايا الجذعية المكونة للدم (هسس) في E10.5 داخل الجنين السليم من منطقة الشريان الأورطي-ميسونيفروس والهجرة إلى الكبد الجنين. يتم الكشف عن هسس مع القدرة على إعادة الإنتاج على المدى الطويل فقط بعد E11 (في 42 زوج مرحلة سوميت) ⁹ . هناك، فإنها توسع والتمييز من E12.5 حتى يبدأ تكون الدم النهائي للتحول إلى نخاع العظام، والذي يصبح الموقع السائد لإنتاج خلايا الدم لمدة حياة ما بعد الولادة ¹⁰ .

ليرة سوريةوالتداخل الأسمى والزماني في الظهور، فضلا عن علامات المناعية المظهرية المشتركة قد عرقلت حتى الآن قدرتنا على التمييز بين المساهمات المحددة لهذه الموجات من الأسلاف المكونة للدم الجنينية. في حين يتم إنشاء كل من إمب و هسك بطريقة تعتمد على Runx1 والتعبير عن عامل النسخ ميب ومستقبل عامل النمو Csf1r (مستعمرة عامل مستقبلة 1 المستعمرة، المعروف أيضا باسم مستعمرة ماكروفيج مستعمرة عامل مستقبل) من بين أمور أخرى، يمكن تمييز إمبس من هسس من قبل افتقارهم إلى إمكانات اللمفاوية، سواء في المختبر وفي الجسم الحي ، وعدم وجود إمكانات إعادة تشكيل على المدى الطويل وعدم وجود تعبير السطح من علامة النسب سكا-1 ¹¹ . وهناك حاجة إلى نماذج رسم مصير الجينات لتوصيف الجنين البلاعم لأنها تسمح استهداف الأسلاف الجنينية في طريقة محددة الخلية والوقت المحدد. هنا نقدم بروتوكول رسم مصير المستخدمة في مختبرنا للتمييز بين النسب اثنينق من الضامة وجدت في معظم أنسجة الكبار: هسك المستمدة تسلل الضامة و هسك مستقلة البلاعم المقيمين.

وقد عثرت البلاعم المقيمين الأنسجة إلى خلايا السلائف ميب مستقلة تعبر عن مستقبلات السيتوكين Csf1r ¹² وتوجد في الجنين في E8.5-E10.5 باستخدام ثلاث استراتيجيات تكامل مصير تكميلية ⁶ . من أجل دراسة المحار كيس الدم من دون وضع علامات هس الجنين، ونحن نستخدم سلالة المعدلة وراثيا، Csf1r ^{ميريكريمر} ، معربا عن البروتين الانصهار محرض تاموكسيفين من "تحسين" ري ريكومبيناس واثنين من مستقبلات هرمون الاستروجين الماوس (مر-إكر-مر) تحت سيطرة المروج Csf1r. وبالتالي، فإن ريكومبيناس كري تكون نشطة في الخلايا csf1r-إكسبريسينغ خلال فترة زمنية محدودة. عندما تستخدم مع سلالة مراسل تحتوي على بروتين الفلورسنت المصب من لوكس-ستوب-لوكس كاسيت (Rosa26 ^{لسل-إيف} )، وسوف يؤدي إلى بيرمانفي وضع العلامات الوراثية للخلايا الموجودة في وقت الاستقراء ولكن أيضا من سلالة. الإدارة في E8.5 من شكل نشط من تاموكسيفين، 4-هدروكسيتاموكسيفين (أوه-تام)، والعلامات إمبس والبلاعم، دون وضع علامة على الكيس المحي غير مؤكدة "بدائية" الأسلاف أو هسس الجنين. وبالتالي، فقد ميزنا النمط المناعي من إمبس وذريتهم خلال التطور الجنيني، وكذلك تقييم مساهمة الضامة المستمدة الكيس المحي إلى برك بلعم الكبار. هناك حاجة إلى مزيد من العمل لتوصيف ما إذا كانت البدائية المستمدة السلف الأولية أيضا المسمى باستخدام هذا النهج، وما إذا كانت يمكن أن تسهم في برك بلعم الكبار.

Protocol

تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية وفقا للجنة رعاية الحيوان المؤسسية المعتمدة واستخدامها من معهد باستور (سيتيا).

1. في أوتيرو نبض وصفها في Csf1r ^{ميريكريمر} روزا ^لسل-يف الأجنة

1. إعداد محلول المخزون من 4-هدروكسيتاموكسيفين (أوه-تام، 50 ملغ / مل).
   1. تحت فومهود، فتح قارورة 25 ملغ من أوه تام وإضافة 250 ميكرولتر الإيثانول (100٪).
   2. نقل الحل أوه-تام إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل مع طرف اقتطاع ودوامة في أقصى سرعة لمدة 10 دقيقة.
   3. يصوتن 30 دقيقة في حمام سونيكاتور.
   4. إضافة 250 ميكرولتر من بيج-35 زيت الخروع تحت فومهود للحصول على محلول المخزون 50 ملغ / مل.
      ملاحظة: بيج-35 زيت الخروع هو مذيب مع خصائص أمفيفيليك التي تربط الجزيئات مسعور و سولوبيليزس لهم في المذيبات المائية.
   5. دوامة لمدة 5 دقائق تقريبافي أقصى سرعة ويصوتن 30 دقيقة في حمام سونيكاتور.
   6. قسامة 90 ميكرولتر (4.5 ملغ) في أنبوب ميكروسنتريفوج (1 قسامة في الحقن).
   7. تخزين في 4 درجات مئوية لمدة 1 أسبوع أو في -20 درجة مئوية على المدى الطويل كما هو موضح سابقا ¹³ .
2. إعداد محلول المخزون من البروجسترون (10 ملغ / مل)
   1. إضافة 250 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى 25 ملغ من هرمون البروجسترون لإعداد تعليق 10 ملغ / 100 ميكرولتر تحت فومهود. دوامة بلطف.
   2. إضافة 2250 ميكرولتر النفط عباد الشمس تعقيمها لجعل 10 ملغ / مل حل هرمون البروجسترون تحت غطاء محرك السيارة.
   3. دوامة لمدة 5 دقائق تقريبا في أقصى سرعة، قسامة وتخزينها في 4 درجات مئوية. لاحظ أن الحل واضح عند تخزينها.
3. إدارة تاموكسيفين
   ملاحظة: تم تقدير التطور الجنيني النظر في يوم تشكيل المكونات المهبلية كما يوم الجنينية (E) 0.5. ويتسبب إعادة التركيب عن طريق الحقن واحدة في E8.5في الحوامل Csf1r ^{ميريكريمر} الإناث ¹² . الملحق أوه-تام مع 37.5 ميكروغرام لكل غرام من البروجسترون للحد من معدلات الإجهاض بعد إدارة تاموكسيفين. الحقن في 1:00 (عن المكونات المهبلية لوحظ في الصباح).
   1. في صباح الحقن، يصوتن قسامة من الحل أوه-تام لمدة 10 دقيقة (أو حتى معلق تماما).
   2. إضافة 360 ميكرولتر كلوريد الصوديوم 0.9٪ تحت فومهود للحصول على 10 ملغ / مل حل أوه تام ودوامة تماما. يصوتن حتى الحل هو واضح ومعلق تماما (على الأقل 30 دقيقة).
   3. هرمون البروجسترون قبل الدافئة لدرجة حرارة الغرفة.
   4. مزيج 450 ميكرولتر من أوه تام و 225 ميكرولتر من هرمون البروجسترون في أنبوب ميكروسنتريفوج. دوامة.
   5. يصوتن على الأقل 10 دقيقة وتحميل على حقنة 1 مل مع إبرة 25G.
   6. في منشأة الحيوان، تزن الإناث الحوامل ( Csf1r ^{ميريكريمر} الإناث هي في ^فبب الخلفية الوراثية و نموذجية تزن بينإن 25 و 33 g).
   7. إجراء الحقن داخل البريتوني عن طريق حقن ببطء حجم المحسوبة في الماوس. بعد سحب الإبرة، اضغط بلطف على الجرح ثقب وتدليك البطن لتوزيع أوه-تام.
      ملاحظة: الجرعة حقن أوه-تام هو 75 ملغ / كغ وجرعة البروجسترون هو 37.5 ملغ / كغ. الجدول 1 يوفر حجم لحقن في الإناث الحوامل.

</ tr>

وزن الماوس (g)	إجمالي حجم لحقن من مزيج (ميكرولتر)
25	281
26	292
27	303
28	315
29	326
30	338
31	348
32	360
33	371
34	382
35	394

الجدول 1: حجم حقن 4-أوه-تاموكسيفين (أوه-تام). حجم المطلوبة لحقن واحد في E8.5 من 75 ميكروغرام لكل ز (وزن الجسم) من أوه-تام تستكمل مع 37.5 ميكروغرام لكل غرام من هرمون البروجسترون.

2. تشريح صفار الكيس (يس) والكبد الجنين (فل)

ملاحظة: تقنيات العقيمة صارمة ليست ضرورية عند التلاعب الأجنة إلا إذا كانوا ذاهبين لاستخدامها على المدى الطويل الثقافة. ومع ذلك، يجب أن تكون منطقة العمل نظيفة ومغطاة في احباط تحت ورقة ماصة.

1. إعداد الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (بس) ومزيج الهضم (بس تحتوي على 1 ملغ / مل كولاجيناز D، 100 U / مل ديوكسيريبونوكلياز الأول (الدناز الأول) و 3٪ مصل بقري الجنين).
2. التضحية الإناث الحوامل بواسطة سيرخلع فيكال في يوم الحمل المطلوب (على سبيل المثال المرحلة الجنينية E10.5).
3. قرصة الجلد فقط على الأعضاء التناسلية وجعل شق صغير في خط الوسط مع مقص. سحب الجلد نحو الرأس لفضح تماما جدار الجسم دون الفراء. قطع عضلات البطن لفضح الأعضاء الداخلية ودفع الأمعاء لفضح قرنين الرحم.
4. مع ملقط حادة متوسطة الحجم، والاستيلاء على وسادة الدهون تعلق على المبيض وسحب بلطف الرحم. قطع على مستوى عنق الرحم من قرون الرحم ورفع قرون من تجويف البريتوني. إزالة الدهون وسادة لتحرير تماما قرون الرحم وقطع قرون من المبيض على كل جانب.
5. وضع قرون في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة في طبق بتري 10 ملم. قبضة بسرعة طبقات عضلة الرحم في طرف واحد (نهاية عنق الرحم) والانزلاق مقص غرامة بين طبقة العضلات والأنسجة الساقطية للافراج عن الأجنة مع الأنسجة الساقطية المحيطة بها.
   ملاحظة: العضلات تميل إلى التعاقد بسرعة أفتr استخراج، لذلك يجب أن تكون هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن.
6. استخدام زوج واحد من ملقط غرامة لقطع غشاء ريشرت والمشيمة.
7. إزالة بلطف كيس الصفار ووضعه في 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة مع 0.5 مل من مزيج الهضم.
   ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن جمع الدم الجنينية.
   1. مباشرة بعد قطع الأوعية السري والحيوية، ونقل الجنين إلى 12-جيدا لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 10 ملي إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض الجليد (إدتا). قطع رأس الجنين باستخدام مقص غرامة حادة، في محاولة للحد من أكبر قدر ممكن من تآكل الأنسجة. احتضان على الجليد لمدة 10-15 دقيقة وجمع إدتا التي تحتوي على الدم.
8. إزالة أمنيون المحيطة الجنين.
9. للمراحل <E11.5، عد عدد أزواج سوميت لتدريج أفضل من الأجنة وأفضل قرار الوقت (كل زوج سوميت يتطور في ~ 1 ساعة 30 دقيقة).
10. قطع رأس الجنين لناملقط أو مقص غرامة. نقل الرأس إلى لوحة 24 جيدا مع 0.5 مل مزيج الهضم.
    ملاحظة: يتم تشريح العصبية العصبية والدماغ في مراحل لاحقة لتحليل التدفق الخلوي. إزالة بعناية الضفيرة الوعائية المحيطة بها.
11. قطع الجنين فوق هيندليمب وإزالة فوريليمبس.
12. لعزل الكبد، وفتح الصدر باستخدام زوج من ملقط غرامة. قرصة الأمامي للقلب وسحب بلطف أثناء استخدام الملقط الثاني لتحرير الأعضاء من الجسم.
    1. فصل بعناية الكبد الجنين من القلب والأمعاء. نقل الكبد الجنين إلى لوحة 24 جيدا مع 0.5 مل مزيج الهضم. مراقبة بعناية نقل تحت المجهر تشريح.
13. جمع منطقة الذيل (أو أي جزء آخر الجنين) عن التنميط الجيني التي كتبها البوليميراز اختبار رد فعل سلسلة (ير).
    ملاحظة: الأنسجة والأعضاء الأخرى يمكن حصادها من الأجنة E10.5 لتحليل مماثل باستخدام التدفق الخلوي. الدم، رأس، تزلجن، منطقة الشريان الأورطي- ميسونيفروس (أغم)، القلب و نيوروكتوديرم يمكن جمعها في E10.5. في مراحل لاحقة، الرئة والكلى والطحال والبنكرياس ويمكن أيضا أن يتم جمعها. وقد وصف سابقا وصفا مفصلا لتشريح الجمعية العامة العادية في مراحل تنموية مختلفة ¹⁴ .

3. معالجة الأنسجة الجنينية للتدفق الخلوي

1. احتضان الأعضاء (وضعت في مزيج الهضم) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
2. نقل الأنسجة والحل الأنزيمي على مصفاة 100 ميكرون وضعت في 6-جيدا لوحة زراعة الأنسجة مليئة 6 مل من العازلة فاكس (0.5٪ البقري مصل الزلال (بسا) و 2 ملي إدتا في برنامج تلفزيوني 1X). ينفصل ميكانيكيا عن طريق الهريس بلطف مع المكبس المطاط الأسود من حقنة 2 مل للحصول على تعليق خلية واحدة.
   ملاحظة: من الآن فصاعدا، يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات في 4 درجات مئوية.
3. جمع تعليق خلية مع ماصة باستور ونقل إلى أنبوب 15 مل.
4. الصبانn لمدة 7 دقائق عند 320 x ج عند 4 درجات مئوية. تجاهل طاف عن طريق الشفط.
5. ريسوسبيند الكرية في 60 ميكرولتر عرقلة فك العازلة (CD16 / CD32 حجب الأجسام المضادة المخفف 1/50 في فاكس العازلة).
   1. نقل 50 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة لكل بئر في أسفل جولة 96 لوحة متعددة جيدا. احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل على الجليد.
      ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تنفيذ تلطيخ في 5 مل أنابيب فاكس البوليسترين عند التعامل مع عدد قليل من العينات.
   2. نقل 10 ميكرولتر المتبقية في أنبوب فاكس البوليسترين 5 مل للحصول على بركة من العينات من كل الأنسجة. هذا التجمع سوف تكون بمثابة الضوابط ( أي عينات غير ملوثين والفلور ناقص واحد (فمو) الضوابط لكل فلوكروم). نقل 50 ميكرولتر من تجمع لكل الفلورسنت ناقص واحد (فمو) السيطرة (واحد في فلوكروم) إلى 96 لوحة متعددة جيدا.
      ملاحظة: كل عنصر تحكم فمو يحتوي على جميع الأجسام المضادة التي تقترن فلوروكروم من لوحة الأجسام المضادة، باستثناء واحدالتي يجري قياسها. وتستخدم فمو لتحديد حدود البوابة والتحكم في التداخل الطيفي في الألواح المتعددة الألوان. لمعالجة الاختلافات في الخلفية و أوتوفلورزنس بين الأنسجة المختلفة بشكل صحيح، فمن المهم لإعداد هذه الضوابط من تجمع عينات من كل الأنسجة. فإن السيطرة المناسبة للتعبير يف يكون عينات من الأجنة كري- السلبية، والتي أكدها التنميط الجيني ير.

4. السطحية أنتيجن تلطيخ

1. إعداد مزيج الأجسام المضادة في فاكس العازلة (الجدول 2). إعداد 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة لكل عينة.
   1. استخدام الأجسام المضادة التالية متجانسة: مكافحة CD45.2 (استنساخ 104)؛ مكافحة CD11b (استنساخ M1 / ​​70)؛ مكافحة F4 / 80 (استنساخ BM8). مكافحة AA4.1 (استنساخ AA4.1)؛ أنتي-كيت (كلون 2B8)؛ ومكافحة تير 119 (استنساخ Ter119).
   2. إعداد ستة يمزج الأجسام المضادة للضوابط فمو في فاكس العازلة. إعداد 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة لكل عينة السيطرة.
      لاتي: التخفيف من الأجسام المضادة في مزيج الأجسام المضادة هو مرتين أكثر تركيزا من التركيز النهائي المشار إليها في جدول المواد. يتم إعداد 6 ضوابط فمو لوحة مع ستة الأجسام المضادة اقتران فلوكروم. الجدول 2 يوفر تكوين مزيج الأجسام المضادة والضوابط فمو لأنبوب واحد.

		حجم (ميكرولتر) من الأجسام المضادة (الحجم النهائي 50 ميكرولتر)
الجسم المضاد	استنساخ	الأجسام المضادة ميكس	فمو CD45.2	فمو CD11b	فمو F4 / 80	فمو AA4.1	فمو كيت	فمو Ter119
مكافحة CD45.2	104	1	0	1	1	1	1	1
مكافحة CD11b	M1 / 70	0.5	0.5	0	0.5	0.5	0.5	0.5
مكافحة F4 / 80	BM8	1	1	1	0	1	1	1
مكافحة AA4.1	AA4.1	1	1	1	1	0	1	1
مكافحة كيت	2B8	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0	0.5
مكافحة Ter119	Ter119	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0
فاكس العازلة		45.5	46.5	46	46.5	46.5	46	46

.within-بادج = "1"> الجدول 2: حجم الأجسام المضادة المستخدمة للتلطيخ والفلورسنت ناقص واحد (فمو) الضوابط. حجم (μL) من الأجسام المضادة المطلوبة لحجم النهائي من 50 ميكرولتر.

2. إضافة 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة للعينات في لوحة 96 مولتيويل (الحجم النهائي خلال تلطيخ هو 100 ميكرولتر). ماصة بلطف صعودا وهبوطا مرتين واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
3. تدور لوحة 96 مولتيويل لمدة 7 دقائق في 320 x ج في 4 درجات مئوية وتجاهل طاف. ريسوسبيند في 200 ميكرولتر من العازلة فاكس.
4. تكرار غسل الإجراء (الخطوة 4.3) مرتين مع 150 ميكرولتر فاكس العازلة.
5. تصفية العينات والضوابط (فموس وعينات بركة غير ملوثين) إلى 5 مل أنابيب البوليسترين من خلال مصفاة 70 ميكرون. تخزين على الجليد حتى الاستحواذ.

5. تحديد إمبس والبلاعم المستمدة يس عن طريق التدفق الخلوي

ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول باستخدام 4 الليزر تدفق عداد الكريات مكافئويبد مع 405 نانومتر البنفسجي الليزر، 488 نانومتر الليزر الأزرق، 562 نانومتر الليزر الأصفر و 638 نانومتر الليزر الأحمر.

1. إعداد حبات التعويض لكل الأجسام المضادة المقترنة بعد تعليمات الشركة الصانعة. استخدام عينات غير ملوثين وحبات التعويض لتحسين كثافة الليزر.
2. لتحديد حدود البوابة، استخدم فمو (فلورزنس ناقص واحد) الضوابط لكل الأجسام المضادة.
3. من أجل استبعاد الخلايا الميتة، إضافة 1 ميكرولتر من دابي (1 ملغ / مل) إلى أنبوب (تحتوي على 200 ميكرولتر من تعليق خلية ملون) 1 دقيقة قبل الاستحواذ. استخدام إشارة دابي قوية والمعلمة المتناثرة إلى الأمام (فسك) لأداء استبعاد الخلايا الميتة والحطام.
   ملاحظة: استخدام البرمجيات من التدفق الخلوي لرسم البوابات أثناء الاستحواذ. ويمكن إجراء مصفوفة التعويض والتحليل بعد اكتساب العينة باستخدام برامج أخرى متاحة تجاريا.
4. استخدام مبعثر إلى الأمام والجانب (فسك مقابل سك) لأداء الخلية الحية والتمييز مضاعفة من إجمالي الأحداث.
5. إنشاء مؤامرات نقطة مضان في محور سجل مقياس ورسم البوابات ابنة ل، أولا، واستبعاد كريات الدم الحمراء (Ter119 ⁺ )، وبعد ذلك، لتحديد الخلايا الاصلية (كيت ⁺ ) والخلايا المكونة للدم (CD45 ⁺ كيت ^نيغ ) (انظر الشكل 1 ).
6. إنشاء الرسوم البيانية مضان لقياس كفاءة وضع العلامات من يف بين مختلف السكان المحددة في يس ( الشكل 2 )، الكبد الجنين ( الشكل 3 ) والدماغ ( الشكل 4 ).

Representative Results

تم تحقيق رسم الخرائط الجينية الوراثية من قبل الإدارة في E8.5 من أوه-تام في Csf1r- مير-إكر-مر الإناث تزاوج مع الذكور الذين يحملون مراسل Rosa26-لسل-إيف. في وجود أوه-تام، استئصال كاسيت وقف يؤدي إلى التعبير الدائم عن يف في الخلايا معربا عن Csf1r . جمعنا اثنين من الأنسجة المكونة للدم: الكيس المحي وكبد الجنين والأنسجة غير المكونة للدم، العصبية العصبية، من الأجنة في E10.5. تم الحصول على تعليق خلية واحدة عن طريق التفكك الأنزيمية والميكانيكية وتم تحليل العينات عن طريق التدفق الخلوي بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة الفلورسنت إلى جانب. بعد استبعاد الخلايا الميتة و دوبلتس، تم تحليل تعليق خلية واحدة ( الشكل 1 ). تم تعريف جميع البوابات باستخدام الضوابط مضان ناقص واحد (فمو). فمن المستحسن أيضا إجراء استبعاد كريات الدم الحمراء (خلايا Ter119 ⁺ ) لتحسين وضوح التحليل ( الشكل 1B + CD45 ^نيغ . كيت ⁺ CD45 ^منخفضة و كيت ^نيغ CD45 ⁺ ( الشكل 1 ). كما تم تحليل الأسلاف على أساس تعبيرهم عن AA4.1 ( الأشكال 2-4 ). في الواقع، AA4.1 هو علامة السطح التي تسمح لإثراء السكان السلف داخل الأسلاف ريرثروميلويد في كيس المحي، كما هو موضح في مستعمرة تشكيل المقايسات ¹⁵ . مرة واحدة تم تحديد السكان من الفائدة، ونحن كميا كفاءة وضع العلامات يف في كل السكان باستخدام الرسوم البيانية. بين كيس المحار كيت ⁺ الأسلاف، على حد سواء CD45 ^نيغ ( الشكل 2A ) و CD45 ^منخفضة ( الشكل 2B ) السكان الخلية تحتوي على AA4.1 ⁺ يف ⁺ الخلايا. ومع ذلك، AA4.1 ⁺ يف <سوب> + خلايا في الكبد والدماغ وجدت فقط في كيت ⁺ CD45 السكان السلف ^منخفضة ( الشكل 3B و 4 B ). منذ، والدماغ ليس موقعا نشطا للدم، الأسلاف وجدت في هذا النسيج يمكن أن تتوافق مع الأسلاف تعميم. وهذا يشير أيضا إلى عملية النضج السلف لأنها تهاجر من كيس المحي إلى الكبد الجنين والأنسجة الطرفية. كيت ⁺ الأسلاف التعبير الأول AA4.1، بغض النظر عن التعبير CD45، ولكن بحلول الوقت الذي تصل إلى الدورة الدموية والكبد الجنين، وجميع AA4.1 ⁺ يف ⁺ الأسلاف تعبر عن مستويات كشفها من سطح الخلية CD45. الضامة، وتعرف بأنها F4 / 80 ^مشرق CD11b ⁺ ، وجدت في كيت ^نيغ CD45 ⁺ بوابة ( الشكل 2-4 ). الضامة في الكيس صفار E10.5 والكبد والدماغ وصفت بكفاءة (60 إلى 80٪ من F4 / 80 ^مشرق CD11b ⁺ الخلايا هي يف ⁺ ) ب يا واحدة إدارة أوه-تام في E8.5 ( الشكل 2C ، 3C و 4 C ).

لمقارنة كفاءة وضع العلامات بين الفضلات، نوصي باستخدام عنصر تحكم داخلي لكفاءة إعادة التركيب. ويمكن ملاحظة التقلب في مستوى التعبير للمراسل بين التجارب، وذلك بسبب الاختلافات في التوقيت التنموي بين ليترس وسلالات الماوس عندما يتم حقن أوه-تام في الرحم . وبالتالي، فإننا نوصي أن يتم تنفيذ الجنين انطلاق من E8.5 إلى E11.5 الأجنة من قبل عد الزوج سوميت. في هذا البروتوكول، نقترح استخدام كفاءة وضع العلامات في الضامة المقيمين الدماغ (الدبقية الصغيرة) كمرجع لمقارنة كفاءة إعادة التركيب كري بين مختلف التجارب والسلالات ( الشكل 4C ). ويمكن استخدام البلاعم المقيمين الأخرى، ولكن الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا الأولى التي توصف بأنها الضامة المستمدة من الكيس المحيإف "> 16 وهي تمثل السكان الأكثر وفرة من الأنسجة الضامة المقيمين في E10.5، وبالتالي، وضع العلامات يف في الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أن تستخدم لتقييم كفاءة مصير رسم الخرائط في كل تجربة ومقارنة البيانات من ليترز مختلفة.

الشكل 1: استراتيجية النابضة لتحديد الخلايا الاصلية (كيت ⁺ CD45 ^نيغ كيت ⁺ CD45 ^منخفضة ) وخلايا متباينة المكونة للدم (كيت ^نيغ CD45 ⁺ ). ( أ ) يتم تنفيذ التمييز في الخلايا الحية و سينجليتس باستخدام تلطيخ دابي والمعلمات إلى الأمام والجانب مبعثر (فسك / سك). ( B ) بعد استبعاد خلايا الدم الحمراء (Ter119 ^نيغ )، يتم تحديد ثلاث مجموعات من الخلايا من الفائدة على أساس التعبير سطح الخلية من كيت و CD45: كيت ⁺ CD45 ^نيغ . كيت ⁺ CD45 ^منخفضة نيغ CD45 ⁺ الخلايا. ( C ) Csf1r معربا عن الخلايا عندما يتم حقن أوه-تام ويتم التعرف على ذرية في أجنة كري-ريكومبيناس إيجابية كما يعبر عن إف مقارنة مع كري-ريكومبيناس الأجنة السلبية (أكد في وقت لاحق من قبل البوليميراز اختبار رد فعل سلسلة، ير). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: وصفها الكفاءة في كيس المحي من E10.5 ^Csf1r ميريكريمر Rosa26 ^{لسل إيف} إيفريسبولزد مع أوه تام في E8.5. ( A ) كيت ⁺ CD45 ^نيج الخلايا بوابات على أساس كيت و CD45 التعبير على خلايا الكيس المحي الحي (البوابة الزرقاء، اللوحة اليسرى). AA4.1 والتعبير كيت على كيت ⁺ CD45 ^نيغ الخلايا. بلوه بوابة يرفق AA4.1 ⁺ كيت ⁺ CD45 خلايا ^نيغ (لوحة الأوسط). مقارنة وضع العلامات يف في AA4.1 ⁺ كيت ⁺ CD45 ^نيغ الخلايا (اللوحة اليمنى) في كري الضوابط السلبية (الأسود) و كري عينات إيجابية (الأخضر). تمثل الرسوم البيانية النسبي النسبة المئوية للخلايا (المحور الصادي) الموجبة لإشارة يف (المحور السيني). ( B ) كيت ⁺ CD45 الخلايا ^{المنخفضة} هي بوابات على أساس كيت و CD45 التعبير (البوابة الزرقاء، اللوحة اليسرى). AA4.1 والتعبير كيت على كيت ⁺ CD45 الخلايا ^{المنخفضة} . البوابة الزرقاء يرفق إمب، كما هو محدد AA4.1 ⁺ كيت ⁺ CD45 الخلايا ^{المنخفضة} (لوحة الأوسط). مقارنة وضع العلامات يف في AA4.1 ⁺ كيت ⁺ CD45 الخلايا ^{المنخفضة} (اللوحة اليمنى) في كري الضوابط السلبية (الأسود) و كري عينات إيجابية (الأخضر). تمثل الرسوم البيانية النسبي النسبة المئوية للخلايا (المحور الصادي) الموجبة لإشارة يف (المحور السيني). ( C ) وتعرف الخلايا المكونة للدم كما كيت ^نيغ CD45 نيغ CD45 ⁺ الخلايا. وتعرف الضامة بأنها F4 / 80 ^مشرق CD11b ⁺ الخلايا (لوحة الأوسط). مقارنة وضع العلامات يف في F4 / 80 ^مشرق CD11b ⁺ الضامة (اللوحة اليمنى) في كري الضوابط السلبية (أسود) و كري عينات إيجابية (الأخضر). تمثل الرسوم البيانية النسبي النسبة المئوية للخلايا (المحور الصادي) الموجبة لإشارة يف (المحور السيني). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: كفاءة وسم في الكبد من E10.5 ^Csf1r ميريكريمر Rosa26 ^{لسل إيف} إيفريسبولزد مع أوه تام في E8.5. ( A ) كيت ⁺ CD45 ^نيغ الخلايا بوابات على أساس كيت و CD45التعبير عن خلايا الكبد الحية (البوابة الزرقاء، اللوحة اليسرى). AA4.1 والتعبير كيت على كيت ⁺ CD45 ^نيغ الخلايا. بوابة الأزرق يرفق AA4.1 ⁺ كيت ⁺ CD45 خلايا ^نيغ (لوحة الأوسط). مقارنة وضع العلامات يف في AA4.1 ⁺ كيت ⁺ CD45 ^نيغ الخلايا (اللوحة اليمنى) في كري الضوابط السلبية (الأسود) و كري عينات إيجابية (الأخضر). تمثل الرسوم البيانية النسبي النسبة المئوية للخلايا (المحور الصادي) الموجبة لإشارة يف (المحور السيني). ( B ) كيت ⁺ CD45 الخلايا ^{المنخفضة} هي بوابات على أساس كيت و CD45 التعبير (البوابة الزرقاء، اللوحة اليسرى). AA4.1 والتعبير كيت على كيت ⁺ CD45 الخلايا ^{المنخفضة} . البوابة الزرقاء يرفق إمب، كما هو محدد AA4.1 ⁺ كيت ⁺ CD45 الخلايا ^{المنخفضة} (لوحة الأوسط). مقارنة وضع العلامات يف في AA4.1 ⁺ كيت ⁺ CD45 الخلايا ^{المنخفضة} (اللوحة اليمنى) في كري الضوابط السلبية (الأسود) و كري عينات إيجابية (الأخضر). تمثل الرسوم البيانية النسبة المئويةالخلايا (المحور ص) إيجابية للإشارة يف (محور س). ( C ) وتعرف الخلايا المكونة للدم كما كيت ^نيغ CD45 ⁺ وبوابات في الأزرق (اللوحة اليسرى). F4 / 80 و CD11b التعبير عن كيت ^نيغ CD45 ⁺ الخلايا. وتعرف الضامة بأنها F4 / 80 ^مشرق CD11b ⁺ الخلايا (لوحة الأوسط). مقارنة وضع العلامات يف في F4 / 80 ^مشرق CD11b ⁺ الضامة (اللوحة اليمنى) في كري الضوابط السلبية (أسود) و كري عينات إيجابية (الأخضر). تمثل الرسوم البيانية النسبي النسبة المئوية للخلايا (المحور الصادي) الموجبة لإشارة يف (المحور السيني). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: كفاءة وسم في الدماغ من E10.5 ^Csf1r ميريكريمر Rosa26 ^{لسل-إيف} إمبريوسبولسد مع أوه-تام في E8.5. ( A ) كيت ⁺ CD45 ^نيغ الخلايا بوابات على أساس كيت و CD45 التعبير على خلايا الدماغ الحية (البوابة الزرقاء، اللوحة اليسرى). AA4.1 والتعبير كيت على كيت ⁺ CD45 ^نيغ الخلايا. بوابة الأزرق يرفق AA4.1 ⁺ كيت ⁺ CD45 خلايا ^نيغ (لوحة الأوسط). مقارنة وضع العلامات يف في AA4.1 ⁺ كيت ⁺ CD45 ^نيغ الخلايا (اللوحة اليمنى) في كري الضوابط السلبية (الأسود) و كري عينات إيجابية (الأخضر). تمثل الرسوم البيانية النسبي النسبة المئوية للخلايا (المحور الصادي) الموجبة لإشارة يف (المحور السيني). ( B ) كيت ⁺ CD45 الخلايا ^{المنخفضة} هي بوابات على أساس كيت و CD45 التعبير (البوابة الزرقاء، اللوحة اليسرى). AA4.1 والتعبير كيت على كيت ⁺ CD45 الخلايا ^{المنخفضة} . البوابة الزرقاء يرفق إمب، كما هو محدد AA4.1 ⁺ كيت ⁺ CD45 الخلايا ^{المنخفضة} (لوحة الأوسط). مقارنة وضع العلامات يف في AA4.1 ⁺ كيت ⁺ CD45 ^منخفضة C ) وتعرف الخلايا المكونة للدم كما كيت ^نيغ CD45 ⁺ وبوابات في الأزرق (اللوحة اليسرى). F4 / 80 و CD11b التعبير عن كيت ^نيغ CD45 ⁺ الخلايا. وتعرف الضامة بأنها F4 / 80 ^مشرق CD11b ⁺ الخلايا (لوحة الأوسط). مقارنة وضع العلامات يف في F4 / 80 ^مشرق CD11b ⁺ الضامة (اللوحة اليمنى) في كري الضوابط السلبية (أسود) و كري عينات إيجابية (الأخضر). تمثل الرسوم البيانية النسبي النسبة المئوية للخلايا (المحور الصادي) الموجبة لإشارة يف (المحور السيني). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

موجات مختلفة من الخلايا السلائف المكونة للدم تتداخل جزئيا ضمن إطار زمني قصير، الأمر الذي يجعل تحليل مساهمة كل موجة من تكون الدم التنموية لخلايا المناعة من الناحية الفنية صعبة للغاية.

توفر نظم كري التي تحتوي على تاموكسيفين فرصة لوضع علامات على خلايا محددة بطريقة محرضة زمنيا وإجراء تحليل النسب في الأجنة أو البالغين، دون الحاجة إلى خارج الجسم الحي أو في زراعة المختبر أو زرعه. في سلالات كري التي تحفز تاموكسيفين، يتم إنشاء جين الانصهار بين ريكومبيناس كري البكتيرية وشكل متحولة من مجال ملزمة يجند لمستقبلات هرمون الاستروجين البشرية (كري-إير) أو بين محسن واحد نقطة متحولة كري واثنين من مستقبلات هرمون الاستروجين الماوس (مير iCre مير). الانصهار من كري مع مستقبلات هرمون الاستروجين يؤدي إلى عزل السيتوبلازمية من كري من قبل Hsp90، وبالتالي منع النووية re- إعادة التركيب بوساطة. يتم استقلاب تاموكسيفين (تام) من قبل ثه الكبد إلى 4-هدروكسيتاموكسيفين (أوه-تام)، المستقلب النشط مع تقارب عالية ملزمة لمستقبلات هرمون الاستروجين. أوه-تام ملزم الانصهار كري يؤدي إلى تعطيل التفاعل مع Hsp90، السماح لها نقل إلى النواة وبدء إعادة التركيب بوساطة كري. تم عرض حقن تام أو أوه-تام في الرحم إلى الإناث الحوامل لتنشيط إعادة التركيب في الجنين النامي. إدارة تاموكسيفين أثناء الحمل يمكن أن يؤدي إلى الإجهاض وبالتالي يقلل من حجم القمامة ولكن أيضا يمنع الولادة إذا تم تسليمها بعد منتصف الحمل، في هذه الحالة الجرو التسليم من خلال عملية قيصرية مطلوب. لموازنة آثار تاموكسيفين خلال فترة الحمل، ونحن تكملة إدارة أوه-تام مع نصف جرعة من هرمون البروجسترون، من أجل تحسين بقاء الأجنة وتقليل خطر الإجهاض ¹⁷ .

ويمكن استخدام عدة طرق لتوصيل تام أو أوه-تام إلى الإناث الحوامل. حاليا غافا عن طريق الفمغي أو داخل البريتوني (إب) يستخدم حقن تاموكسيفين. أوه-تام لديه ميزة لتكون متاحة على الفور، كما أنه لا يتطلب أن يتم استقلاب من قبل الكبد من السد الحامل. ومع ذلك، في حين تاموكسيفين من السهل جدا أن تذوب في زيت الذرة، أوه-تام من الصعب جدا لإعداد باستخدام نفس التقنية والنتائج في مستحلب. وقد كان هذا خطوة محدودة في توظيف أوه-تام لفي وضع العلامات نبض الرحم . قمنا بتكييف بروتوكول لإعداد أوه-تام التي وضعتها مجموعة من جف نيكولا ¹³ ، حيث أنها تستخدم بيج-35 زيت الخروع، مذيب مع خصائص أمفيفيليك لذوبان أوه-تام، كما حل تاموكسيفين هي واحدة من الخطوات الأكثر أهمية في الإجراء. هذا يسمح لإعداد استنساخه والأمثل من أوه-تام ويقصر كثيرا من الوقت من إعداد تاموكسيفين. وعلاوة على ذلك، فمن الضروري للتكيف تركيز أوه-تام لحقن عند استخدام سلالات كري محرض مختلفة. مزيج من صبغة البقاء على قيد الحياة (Dأبي) والحجم (فسك) أمر بالغ الأهمية لإزالة الخلايا الميتة والحطام الخلوي، على التوالي. الخلايا الميتة والحطام هي أوتوفلورزنت للغاية في معظم الأشعة فوق البنفسجية والأزرق والأحمر أجهزة الكشف عن الليزر، ويمكن أن تعرقل تحليل التدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، فإننا لا ننصح تحديد الخلايا بعد تلطيخ قبل التحليل مع التدفق الخلوي. التثبيت يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في مورفولوجيا الخلية، وبالتالي يجعل من الصعب حجم التمييز على أساس الأمام والجانب مبعثر (فسك مقابل سك). وعلاوة على ذلك، تثبيت العينات مع بفا يؤدي إلى خسارة كبيرة من يف كثافة الفلورسنت.

القيد الرئيسي في هذا البروتوكول هو أن السكان لا يتم اختبارها على وظائفها وقدرات التمايز. من أجل التغلب على هذا، يمكن فرز الخلايا بعد بروتوكول مماثل باستخدام فارزنتلي تنشيط الخلايا فارز (فاكس) لأداء فحص تشكيل مستعمرة. في هذه الحالة، يجب أن يتم تنفيذ الإجراء في ظل ظروف معقمة واستخدام مصل البقري الجنين (Fبس) في المخزن المؤقت فاكس، بدلا من بسا، ينصح بشدة. انخفاض كفاءة وسم تحقيقها مع هذه التقنية، وبالتالي عدد قليل من يف ⁺ الخلايا من الفائدة في الأنسجة الجنينية هو التحدي الرئيسي في دراسة النمط الظاهري إمب. هذا البروتوكول يستخدم 4-الليزر تدفق مقياس الكريات. ويمكن أيضا استخدام مقياس التدفق الخلوي مع 3 أشعة الليزر ولكن من المهم تكييف لوحة الأجسام المضادة لتأخذ في الاعتبار زيادة التداخل الطيفي بين الأصباغ. بالإضافة إلى ذلك، مطلوب المعايرة من الأجسام المضادة للعثور على التركيز المناسب عند تغيير لوحة الأجسام المضادة ونوصي أداء المعايرة من الأجسام المضادة والتحقق من صحة لوحة الأجسام المضادة الجديدة في تجربة تجريبية حيث يتم تجميع جميع الأجنة في الأنسجة، من أجل زيادة عدد خلايا تحليلها في الأنسجة.

وقد تم إحداث ثورة في مجال البيولوجيا التنموية من خلال طريقة كري / لوكس، التي تسمح بوضع العلامات الدائمة للخلايا في الموقع . هذا النهج يحققالأنسجة أو نوع الخلية -الخصوصية من خلال التعبير عن ريكومبيناس كري تحت سيطرة المروج محددة. في حالتنا، اخترنا لدراسة التعبير عن ريكومبيناس كري تحت سيطرة المروج من Csf1r (مستعمرة عامل مستقبلة 1 مستعمرة)، مستقبلات ميتوجينيك عامل النمو المهم للالبلاعم وأسلافهم، وذلك باستخدام سلالة التي وضعتها المجموعة من J. بولارد ¹⁸ . ميزة استراتيجية رسم مصير على أساس التعبير Csf1r مقارنة مع غيرها من الاستراتيجيات المنشورة هو أنه يسمح لوضع العلامات على الخلايا المستمدة كيس الكيس (إمب والضامة) دون وضع علامات على أي هسس الجنين ¹² . ويمكن ^لسلالة Cx3cr1 ^CreERT2 أيضا تسمية خلايا الكيس المحي دون وضع علامات على هسس ¹⁹ ، ومع ذلك فإنه يمكن فقط تسمية الضامة وسلائف بلعم لكنه لا تسمية الأسلاف إمب ¹ . سلالة ^CrERT2 Cx3cr1 لديها نفس التحذير كما Csf1r مركريمر ¹⁶ و كيت ^{مركريمر 20} ، يتم تسمية خلايا الدم الطرفية دائما في البالغين، وإن كان ذلك في كفاءة منخفضة جدا، مما يدل على وضع العلامات من هسس أثناء التنمية. وعلاوة على ذلك، كيت ^{مركريمر} مصير رسم الخرائط تسميات صفار كيس كيت ⁺ Sca1 ⁺ الأسلاف في حين إمب هي كيت ⁺ Sca1 سلبي ¹¹ . سلالة Csf1r ^{ميريكريمر} ليست تدق في ولكن تم إنشاؤه بواسطة ^{ترانزجينيسيس} المضافة الكلاسيكية، وبالتالي التعبير عن كري قد لا تتلخص تماما التعبير الذاتية من Csf1r. ومع ذلك، فإن هذا لديه ميزة لتجنب أي عيوب تنموية محتملة بسبب التعبير متخالف من Csf1r. وهذا عامل مهم يجب مراعاته عند التحليلاستراتيجيات رسم مصير أخرى تستخدم لدراسات تكون الدم التنموية، مثل Runx1 ^{مركريمر} ، كيت ^{مركريمر} و Cx3cr1 ^CreERT2 ، حيث يتم إدراج كري محرض في الموضع الداخلي. لكل من Runx1 ^{مركريمر} و كيت ^{مركريمر} ، وقد وصفت عيوب المكونة للدم التنموية في الأجنة متخالف. بشكل جماعي، الطريقة المعروضة هنا يسمح للتحقيق في الكيس المحيطي إمب البيولوجيا خلال التنمية وأيضا الصفار المستمدة الكيس المستمدة وجدت في أنسجة الكبار ومتميزة من الضامة المستمدة من هسك. وهذا من شأنه تحسين فهمنا الحالي لهذه النسب من الضامة المقيمين ووظائف محددة في مرحلة البلوغ. وقد تم تحسين توصيف إمونوفينوتيبيك من إمبس مؤخرا باستخدام الفرز الخلية ومستعمرة تشكيل المقايسات، مما يدل على أن الكيس المحي إمب تعبر على وجه التحديد CD41 و CD16 / 32 في المراحل المبكرة من التنمية ¹¹ . ومع ذلك، فإن خصوصية التعبير عن CD41و CD16 / 32 يحتاج إلى مزيد من التوصيف من E10.5 فصاعدا، وخاصة في مكانة الكبد الجنين، وذلك باستخدام نماذج رسم مصير. في الواقع، ما إذا كان التعبير CD41 و CD16 / 32 لا يزال محددا ل إمب عند مقارنتها مع هسس الجنين والأساطير المستمدة من هسك في E10.5 إلى E14.5 الجنين الكبد تحتاج إلى توضيح. طريقة عرض يسمح لتسمية إمب ولدت في كيس المحي واتباعها خلال التطور الجنيني وسوف تساهم في توصيف أكثر تفصيلا من النمط الظاهري إمب عندما البذور البذور الجنين.

يمكن أن تكون هذه الطريقة مهمة في المستقبل القريب لدراسة مسارات التمايز بين إمب. في حين أن إمبس تخرج من الكيس المحي البطانة من E8.5 إلى E10.5 4، وهذا الأسلوب يسمح فقط لتسمية جزء من الأسلاف الناشئة بين E8.5-E9.5. ولذلك، فإن الحد من هذه الطريقة هو أن جزء صغير فقط من إمب هو المسمى، مما يجعل من الصعب تحليل في الدراسات الكلاسيكية فقدان وظيفة مع الأليلات فلوكسد ل جأنديديت. بدلا من ذلك، يمكن أن تصبح العلامات متفرق ميزة في الدراسات النسيبية من التمايز إمب في الجسم الحي ، وذلك باستخدام مراسل نسيلي. ومع ذلك، فإن كفاءة وضع العلامات تحتاج إلى أن تكون مميزة لكل مراسل فلوكسد أو أليل فلوكسد المستخدمة، وكفاءة إعادة التركيب من البنيات فلوكسد يعتمد على الجينومية (الأليلات فلوكسد) أو بناء مراسل روزا 26. في الواقع، خطوط مراسل روزا مختلفة متاحة مع المروجين مختلفة ويذكر أن روزا ^{26 تدتوماتو} و ^Rosa26 سلالة ^متمغ لديها كفاءة إعادة التركيب أعلى من خط Rosa26 ^{لسل-إيف} . سلالة الماوس مراسل المستخدمة في هذا البروتوكول هو خط روزا ^{لسل-إيف} ، والتي لا يمكن أن توفر المعلومات المتعلقة العملية الديناميكية للنضج السلف المذكورة في قسم النتائج. يمكن معالجة مسألة عملية النضج جزئيا باستخدام سلالات مراسل مختلفة مثل متاغ ^{روزا 26} . في مثل هذه السلالة، يمكن للخلايا أن تكون بعيدةأوشيد على أساس الوقت المنقضي منذ حدث إعادة التركيب. جميع الخلايا في سلالة ^متممغ روزا ²⁶ أعرب عن غشاء بدت البروتين الفلورسنت تدتوماتو و كري إعادة التركيب يكسب كاسيت تدتوماتو ويسمح للتعبير عن غفب غشاء ملزمة. منذ تدتوماتو لديها نصف عمر طويل، والخلايا التي لا تزال تحتوي على تدتوماتو ولكن بدأت للتعبير عن غفب (بعد فترة وجيزة من إعادة التركيب) هي تدتوماتو ⁺ غفب ^{منخفضة / إنت} ويمكن تمييزها عن تدتوماتو ^نيغ غفب ⁺ الخلايا التي لا تعبر تدتوماتو بعد الآن و صريحة مستويات أعلى من غفب (في وقت لاحق بعد إعادة التركيب).

كما نوقش أعلاه، وإعداد أوه-تام هو خطوة حاسمة لتقديم باستمرار جرعات مماثلة من أوه-تام بين التجارب والحد من الآثار الجانبية تاموكسيفين. البروجسترون المشارك في الإدارة هو أيضا مفيدة للحد من تأثير ضار تاموكسيفين على الحمل. عنصر حاسم آخر من البروتوكول هو بقاء الخلية واحدة سوبنسيون تم الحصول عليها من الأنسجة الجنينية المختلفة. نحن عادة الحصول على> 90٪ خلايا قابلة للحياة تحليل سايتوميتريك التدفق. لتحقيق ذلك، فمن الأهمية بمكان أن تتبع جميع الخطوات بسرعة والحفاظ على جميع العينات على الجليد بعد جمع الأنسجة. ضوابط مناسبة مثل عينات غير ملوثين، والبقع واحدة والفلورسنت ناقص واحد (فمو) الضوابط المطلوبة لتحديد حدود البوابة والتحكم في التداخل الطيفي في لوحات متعددة الألوان. التغييرات في الأجسام المضادة تحتاج إلى التحقق من صحة من حيث المعايرة الأجسام المضادة والتداخل الطيفي. وأخيرا، فإن اختيار سلالة مراسل Rosa26 يحتاج إلى أن تتكيف مع السؤال العلمي الذي يتم التحقيق فيه.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 Straight Forceps	Fine Science Tools	11251-20
MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors	Fine Science Tools	15371-92
8.5 cm straight scissors	Fine Science Tools	14090-09
Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8)	BD Pharmingen	553355	1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104)	Sony	1149120	1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1)	eBioscience	17-5892	1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119)	Biolegend	560512	1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8)	BD Pharmingen	123137	1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70)	BD Pharmingen	552850	1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2)	BD Biosciences	553142
PBS 1x	Fischer Scientific	12559069
Fetal Bovine Serum	Fischer Scientific	11570506
Collagenase D	Roche	11088882001
Deoxyribonuclease I	Sigma	D4527-20KU
6-well tissue culture plate	Dutscher Dominique	353046
12-well tissue culture plate	Dutscher Dominique	353224
24-well tissue culture plate	Fischer Scientific	11874235
96 wells U-shape bottom tissue culture plate	Dutscher Dominique	353227
Syringe Plastipak 2 mL	Dutscher Dominique	300185
Nylon grid 100 µm cell strainers	Dutscher Dominique	352360
Nylon grid 70 µm cell strainers	Dutscher Dominique	352350
15 ml Falcon tubes	Dutscher Dominique	352096
Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm	Dutscher Dominique	51246
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906-500G
(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg	Sigma	H7904-25MG	Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment
Progesterone	Sigma	P3972	Always use appropriate personal protective equipment
PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL)	Sigma	C5135
Sunflower oil	Sigma	S5007-250ML
Ethanol	Sigma	24103-1L-R-D	Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood
EDTA	Sigma	E9884-500G
DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER)	Fischer Scientific	10116287
CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer	Beckman Coulter	B75408
CytoFLEX Daily QC Fluorospheres	Beckman Coulter	B53230
VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL)	Beckman Coulter	B22804
FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J	The Jackson laboratory	19098
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J	The Jackson laboratory	6148