Summary
Enquanto os macrófagos infiltrativos são continuamente recrutados para tecidos adultos a partir de precursores circulantes, os macrófagos residentes semeiam seu tecido durante o desenvolvimento, onde são mantidos sem mais entrada de progenitores. Os progenitores para macrófagos residentes foram identificados recentemente. Aqui, apresentamos métodos para o mapeamento do destino genético dos progenitores de macrófagos residentes.
Abstract
Os macrófagos são fagócitos profissionais do braço inato do sistema imunológico. Em estado estacionário, os macrófagos sésseis são encontrados em tecidos adultos, onde atuam como sentinelas de linha de frente e danos nos tecidos. Enquanto outras células imunes são continuamente renovadas a partir de células hematopoiéticas e progenitoras (HSPC) localizadas na medula óssea, uma linhagem de macrófagos, conhecida como macrófagos residentes, mostrou-se auto-mantida em tecidos sem a entrada de HSPC de medula óssea. Esta linhagem é exemplificada por microglia no cérebro, células de Kupffer no fígado e células de Langerhans na epiderme entre outros. A lâmina própria do intestino e do cólon são os únicos tecidos adultos desprovidos de macrófagos residentes independentes da HSPC. Pesquisas recentes identificaram que os macrófagos residentes são originários da hematopoiese do saco de gema extra-embrionária do (s) progenitor (es) distinto (s) das células estaminais hematopoiéticas do feto (HSC). Entre a hematopoiese definitiva do saco vitelino, eOs progenitores ritromoeloides (EMP) dão origem a células eritróides e mielóides, em particular macrófagos residentes. EMP só são gerados dentro do saco vitelino entre E8.5 e E10.5 dias de desenvolvimento e eles migram para o fígado fetal logo que a circulação está conectada, onde eles se expandem e diferenciam até pelo menos E16.5. Sua progênie inclui eritrócitos, macrófagos, neutrófilos e mastócitos, mas apenas os macrófagos derivados de EMP persistem até a idade adulta nos tecidos. A natureza transitória do surgimento do EMP e a sobreposição temporal com a geração de HSC tornam difícil a análise desses progenitores. Nós estabelecemos um protocolo de mapeamento de destino induzível por tamoxifeno com base na expressão do promotor Csf1r do receptor de citoquina de macrófagos para caracterizar células derivadas de EMP e EMP in vivo por citometria de fluxo.
Introduction
Existem várias ondas sucessivas mas sobrepostas de progenitores hematopoiéticos durante o desenvolvimento, cuja progenitura mielóide permanece na idade adulta. Em primeiro lugar, os progenitores "primitivos" unipotentes emergem no saco vitelino 1 , 2 entre E7.5-E8.25 e dão origem a macrófagos embrionários sem qualquer intermediário monocítico. Se os macrófagos derivados de progenitores primitivos persistem no cérebro adulto, uma vez que a microglia continua sendo objeto de investigação ativa. Em segundo lugar, os precursores eritemo-mieloides (EMPs) surgem no saco vitelino em E8.5, entram na corrente sanguínea e colonizam o embrião. EMPs emergem do endotélio hemogênico do saco vitelino em uma transição endotelial a hematopoiética dependente de Runx1 3 , 4 . Enquanto a EMP pode se diferenciar em macrófagos dentro do saco vitelino, eles também colonizam o fígado fetal do dia embrionário (E) 9 5 e diferemEm eritrócitos, megacariócitos, macrófagos, granulócitos de monócitos e mastócitos 6 . Os macrófagos que derivam de EMP exibem capacidade proliferativa em tecidos de desenvolvimento e adultos. Se os macrófagos derivados de EMP ignoram o estágio de diferenciação de monócitos ainda são controversos, como muito pouco se sabe sobre sua via de diferenciação 7 , 8 . Finalmente, as células estaminais hematopoiéticas (HSCs) emergem em E10.5 dentro do embrião próprio da região aorta-gonad-mesonephros e migram para o fígado fetal. Os HSCs com capacidade de repovoamento a longo prazo só são detectados após E11 (no estágio de 42 pares de somites) 9 . Lá, eles se expandem e diferenciam de E12.5 até a hematopoiese definitiva começa a se deslocar para a medula óssea, o que se torna o local predominante de produção de células sangüíneas durante a vida pós-natal 10 .
O spA sobreposição temporal e temporal no surgimento, bem como os marcadores imunofotípicos compartilhados, até agora dificultaram a nossa capacidade de distinguir as contribuições específicas dessas ondas de progenitores hematopoiéticos embrionários. Enquanto tanto o EMP quanto o HSC são gerados de forma dependente do Runx1 e expressam o fator de transcrição Myb e o receptor do fator de crescimento Csf1r (Receptor do Factor Estimulante da Colônia 1, também conhecido como Receptor do Fator de Estimulação da Colônia de Macrófagos) entre outros, os EMPs podem ser distinguidos de HSCs pela falta de potencial linfóide, tanto in vitro como in vivo , a falta de potencial de repovoamento a longo prazo e a falta de expressão superficial do marcador de linhagem Sca-1 11 . Os modelos de mapeamento do destino genético são necessários para caracterizar a ontogenia dos macrófagos, uma vez que permitem alvejar progenitores embrionários de uma maneira específica de cada célula e específica do tempo. Aqui apresentamos o protocolo de mapeamento do destino usado em nosso laboratório para discriminar entre os dois linhagensS de macrófagos encontrados na maioria dos tecidos adultos: macrófagos infiltrados derivados de HSC e macrófagos residentes independentes de HSC.
Os macrófagos residentes de tecido foram rastreados de acordo com células precursoras independentes de Myb expressando o receptor de citoquinas Csf1r 12 e estão presentes no embrião em E8.5-E10.5 usando três estratégias complementares de mapeamento de destino 6 . Para estudar a hematopoiese do saco vitelino sem rotulagem de HSC fetal, utilizamos uma cepa transgênica, Csf1r MeriCreMer , expressando uma proteína de fusão induzível por tamoxifeno de Cre recombinase "melhorada" e dois receptores de estrogênio de mouse (Mer-iCre-Mer) sob o controle de O promotor Csf1r. Assim, a Cre recombase estará ativa em células Csf1r -expressing durante uma janela de tempo limitada. Quando usado com uma estirpe repórter contendo uma proteína fluorescente a jusante de uma cassete lox-STOP-lox (Rosa26 LSL-eYFP ), isso levará ao permanenteEtiquetagem genética das células presentes no momento da indução, mas também da sua progênie. A administração em E8.5 da forma ativa de tamoxifeno, 4-hidroxitoxififeno (OH-TAM), rotula EMPs e macrófagos, sem rotulagem de progenitores "primitivos" unipotentes de vira-lata ou HSC fetal. Deste modo, caracterizamos o imunofenotipo de EMPs e sua progênie durante o desenvolvimento embrionário, bem como avaliaram a contribuição dos macrófagos derivados do saco de gema para os grupos de macrófagos adultos. São necessários mais trabalhos para caracterizar se os macrófagos primários progenitoros derivados também são rotulados usando essa abordagem e se eles podem contribuir para grupos de macrófagos adultos.
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Protocol
Os procedimentos em animais foram realizados de acordo com o comité institucional aprovado de cuidados e uso animal do Institut Pasteur (CETEA).
1. Na rotulagem de pulso Utero em embriões Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP
- Prepare a solução-mãe de 4-hidroxitoxifen (OH-TAM, 50 mg / mL).
- Sob a flexibilidade, abra o frasco de 25 mg de OH-TAM e adicione 250 μL de etanol (100%).
- Transfira a solução OH-TAM para um tubo de microcentrífuga de 2 mL com uma ponta truncada e vortex na velocidade máxima durante 10 min.
- Sonicate 30 min em um banho sonicador.
- Adicione 250 μL de óleo de ricino PEG-35 sob o fumo para obter uma solução de reserva de 50 mg / mL.
NOTA: O óleo de mamona PEG-35 é um solvente com propriedades anfifílicas que liga moléculas hidrofóbicas e as solubiliza em solventes aquosos. - Vortex por aproximadamente 5 minutosNa velocidade máxima e sonicate 30 min em um banho de sonicador.
- Alíquota 90 μL (4,5 mg) por tubo de microcentrífuga (1 alíquota por injeção).
- Armazenar a 4 ° C durante 1 semana ou a -20 ° C por longo prazo como descrito anteriormente 13 .
- Prepare a solução-mãe da Progesterona (10 mg / mL)
- Adicione 250 μL de 100% de etanol a 25 mg de progesterona para preparar uma suspensão de 10 mg / 100 μL sob o fumo. Vortex suavemente.
- Adicione 2250 μL de óleo de girassol autoclavado para formar 10 mg / ml de solução de progesterona sob o capô.
- Vortex por aproximadamente 5 min a velocidade máxima, alíquota e armazene a 4 ° C. Observe que a solução é clara quando armazenada.
- Administração de tamoxifeno
NOTA: O desenvolvimento embrionário foi estimado considerando o dia da formação do tampão vaginal como dia embrionário (E) 0,5. A recombinação é induzida por injeção única em E8.5Em fêmeas grávidas Csf1r MeriCreMer 12 . Suplementar OH-TAM com 37,5 μg por g de Progesterona para reduzir as taxas de aborto após a administração de tamoxifeno. Injetar às 13 horas (para conexão vaginal observada pela manhã).- Na manhã da injeção, sonicar uma alíquota da solução de OH-TAM durante 10 min (ou até ressuspensa completamente).
- Adicione 360 μL de NaCl 0,9% sob o fumo para obter uma solução de OH-TAM de 10 mg / mL e vorteie completamente. Sonicate até a solução ficar limpa e completamente ressuspensa (pelo menos 30 min).
- Progesterona pré-quente à temperatura ambiente.
- Misture 450 μL de OH-TAM e 225 μL de progesterona em um tubo de microcentrífuga. Vórtice.
- Sonicate pelo menos 10 min e carregue para uma seringa de 1 mL com uma agulha 25G.
- Na instalação animal, pesa a fêmea grávida (as fêmeas Csf1r MeriCreMer estão em um fundo genético FVB inata e pesam tipicamente entre elesEm 25 e 33 g).
- Realize uma injeção intraperitoneal injetando lentamente o volume calculado no mouse. Depois de retirar a agulha, pressione suavemente a ferida da punção e massageie o abdômen para distribuir o OH-TAM.
NOTA: A dose de injecção de OH-TAM é de 75 mg / kg e a dose de Progesterona é de 37,5 mg / kg. A Tabela 1 fornece o volume para injetar em fêmeas grávidas.
| Peso do mouse (g) | Volume total a injetar da mistura (μL) |
| 25 | 281 |
| 26 | 292 |
| 27 | 303 |
| 28 | 315 |
| 29 | 326 |
| 30 | 338 |
| 31 | 348 |
| 32 | 360 | </ Tr>
| 33 | 371 |
| 34 | 382 |
| 35 | 394 |
Tabela 1: Volume de injeção de 4-OH-tamoxifeno (OH-TAM). Volume necessário para uma única injecção a E8,5 de 75 μg por g (peso corporal) de OH-TAM suplementado com 37,5 μg por g de progesterona.
2. Dissecção do saco de gema (YS) e Fetal Liver (FL)
NOTA: Não são necessárias técnicas estéreis rigorosas na manipulação de embriões, a não ser que sejam usadas para cultura de longo prazo. No entanto, a área de trabalho deve ser limpa e coberta de papel alumínio em papel absorvente.
- Preparar solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS) e mistura de digestão (PBS contendo 1 mg / mL de colagenase D, 100 U / mL Deoxyribonuclease I (DNase I) e 3% de soro bovino fetal).
- Sacrifique mulheres grávidas por cerDeslocamento físico no dia de gestação requerido ( por exemplo, estágio embrionário E10.5).
- Aperte a pele por cima dos genitais e faça uma pequena incisão na linha média com tesoura. Puxe a pele em direção à cabeça para expor completamente a parede do corpo sem pele. Corte os músculos abdominais para expor os órgãos internos e empurre o intestino para expor os dois chifres uterinos.
- Com pinças contundentes de tamanho médio, pegue a almofada gorda anexada ao ovário e puxe suavemente o útero. Corte no nível cervical dos chifres uterinos e levante os chifres da cavidade peritoneal. Remova a almofada de gordura para libertar completamente os chifres uterinos e cortar os chifres do ovário de cada lado.
- Coloque os chifres em PBS gelados em uma placa de Petri de 10 mm. Agarre rapidamente as camadas do útero em uma extremidade (extremidade cervical) e deslize as tesouras finas entre a camada muscular e o tecido decual para liberar os embriões com o tecido decente circundante.
NOTA: Os músculos tendem a se contrair rapidamenteA extração, então esse passo deve ser o mais rápido possível. - Use um par de pinças finas para cortar a membrana de Reichert e a placenta.
- Remova cuidadosamente o saco vitelino e coloque-o em uma placa de cultura de tecido de 24 po com 0,5 mL de mistura de digestão.
NOTA: Nesta etapa, o sangue embrionário pode ser coletado.- Imediatamente após a separação dos vasos umbilical e vitelline, transfira o embrião para uma placa de cultura de tecidos de 12 poços contendo 10 mM de ácido etilenodiaminotetracético gelado (EDTA). Decapite o embrião usando tesouras afiadas e finas, tentando limitar o máximo possível de dilaceração do tecido. Incube no gelo por 10 a 15 minutos e colete o EDTA contendo o sangue.
- Remova o amnio que rodeia o embrião.
- Para os estágios <E11.5, conte o número de pares de somite para melhor encenação de embriões e uma melhor resolução de tempo (cada par somite se desenvolve em ~ 1 h 30 min).
- Corte a cabeça do embrião nósFórceps ou tesoura fina. Transfira a cabeça para uma placa de 24 poços com 0,5 mL de mistura de digestão.
NOTA: O neuroectodermo eo cérebro nos estágios posteriores são mais dissecados para análise de citometria de fluxo; Remova cuidadosamente o plexo vascular circundante. - Corte o embrião acima do membro posterior e remova os membros anteriores.
- Para isolar o fígado, abra o tórax usando um par de pinças finas. Aperte antes do coração e puxe suavemente enquanto usa a segunda pinça para libertar os órgãos do corpo.
- Separa cuidadosamente o fígado fetal do coração e do intestino. Transfira o fígado fetal para uma placa de 24 poços com 0,5 mL de mistura de digestão. Acompanhe cuidadosamente a transferência sob o microscópio de dissecação.
- Recolher a região da cauda (ou qualquer outra parte do embrião) para a genotipagem por meio do ensaio de reação em cadeia da polimerase (PCR).
NOTA: Outros tecidos e órgãos podem ser colhidos de embriões E10.5 para uma análise similar usando citometria de fluxo. Sangue, cabeça de esquiN, região de aorta-gonad-mesonefros (AGM), coração e neuroectoderma podem ser coletadas em E10.5. Em estágios posteriores, o pulmão, rim, baço e pâncreas também podem ser coletados. Uma descrição detalhada da dissecação da AGM em diferentes estágios de desenvolvimento foi descrita anteriormente 14 .
3. Processamento de Tecidos Embrionários para Citometria de Fluxo
- Incubar os órgãos (colocados na mistura de digestão) durante 30 min a 37 ° C.
- Transfira o tecido e a solução enzimática para um filtro de 100 μm colocado numa placa de cultura de tecido de 6 poços preenchida com 6 ml de tampão FACS (albumina de soro bovino a 0,5% (BSA) e EDTA 2 mM em 1x PBS). Dissocie-se mecanicamente suavemente com o pistão de borracha preto de uma seringa de 2 mL para obter uma suspensão de célula única.
NOTA: A partir de agora, todas as etapas devem ser realizadas a 4 ° C. - Recolher a suspensão celular com uma pipeta Pasteur e transferir para um tubo de 15 mL.
- SpiN durante 7 min a 320 xg a 4 ° C. Descarte o sobrenadante por aspiração.
- Ressuspender o sedimento em 60 μL de tampão bloqueador de Fc (anticorpo de bloqueio CD16 / CD32 diluído 1/50 em tampão FACS).
- Transfira 50 μL da suspensão de célula única por poço em uma placa de 96 poços múltiplos de fundo redondo. Incube durante pelo menos 15 minutos no gelo.
NOTA: A coloração também pode ser realizada em tubos FACS de poliestireno de 5 mL ao manusear um pequeno número de amostras. - Transfira os 10 μL restantes para um tubo FACS de poliestireno de 5 mL para obter um conjunto das amostras de cada tecido. Este conjunto servirá como controles ( ou seja, amostras não coradas e controles fluorescentes menos um (FMO) para cada fluorochrome). Transfira 50 μL da piscina para cada controle fluorescente menos um (FMO) (um por fluorochrome) para a placa 96 multi-well.
NOTA: Cada controle de FMO contém todos os anticorpos acoplados com fluorochrome do painel de anticorpos, exceto peloQue está sendo medido. Os FMOs são usados para identificar os limites do portão e para controlar a sobreposição espectral em painéis multicoloridos. Para corrigir corretamente as variações de fundo e autofluorescência entre diferentes tecidos, é importante preparar esses controles a partir do conjunto de amostras de cada tecido. O controle apropriado para a expressão de YFP serão as amostras de embriões Cre-negativos, que são confirmados pela genotipagem por PCR.
- Transfira 50 μL da suspensão de célula única por poço em uma placa de 96 poços múltiplos de fundo redondo. Incube durante pelo menos 15 minutos no gelo.
4. Coloração de antigénio de superfície
- Prepare a mistura de anticorpos no tampão FACS (Tabela 2). Prepare 50 μL de mistura de anticorpos por amostra.
- Use os seguintes anticorpos acoplados a fluorochrome: anti-CD45.2 (clone 104); Anti-CD11b (clone M1 / 70); Anti-F4 / 80 (clone BM8); Anti-AA4.1 (clone AA4.1); Anti-kit (clone 2B8); E anti-Ter119 (clone Ter119).
- Prepare seis misturas de anticorpos para os controles FMO no tampão FACS. Prepare 50 μL de mistura de anticorpos por amostra de controle.
NÃOTE: A diluição do anticorpo na mistura de anticorpos é duas vezes mais concentrada do que a concentração final indicada na tabela de materiais. Para um painel com seis anticorpos acoplados a fluoroquromo, são preparados 6 controles de FMO. A Tabela 2 fornece a composição da mistura de anticorpos e os controlos de FMO para um tubo.
| Volume (μL) de anticorpo (Volume final 50 μL) | ||||||||
| Anticorpo | Clone | Mistura de anticorpos | FMO CD45.2 | FMO CD11b | FMO F4 / 80 | FMO AA4.1 | Kit FMO | FMO Ter119 |
| Anti-CD45.2 | 104 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Anti-CD11b | M1 / 70 | 0,5 | 0,5 | 0 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Anti-F4 / 80 | BM8 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| Anti-AA4.1 | AA4.1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| Anti-kit | 2B8 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0 | 0,5 |
| Anti-Ter119 | Ter119 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0 |
| Buffer FACS | 45,5 | 46,5 | 46 | 46,5 | 46,5 | 46 | 46 | |
Tabela 2: Volume de anticorpos usando para coloração e controles Fluorescente menos um (FMO). Volume (μL) de anticorpo necessário para um volume final de 50 μL.
- Adicione 50 μL da mistura de anticorpos às amostras na placa 96-multiwell (o volume final durante a coloração é de 100 μL). Gentilmente, pipetar para cima e para baixo duas vezes e incubar em gelo durante 30 min.
- Gire a placa de 96 poços múltiplos durante 7 minutos a 320 xg a 4 ° C e descarte o sobrenadante. Ressuspender em 200 μL de tampão FACS.
- Repita o procedimento de lavagem (passo 4.3) duas vezes com 150 μL de tampão FACS.
- Filtre as amostras e os controles (FMOs e amostras de pool não mantidas) em 5 ml de tubos de poliestireno através de um filtro de 70 μm. Armazene no gelo até a aquisição.
5. Identificação de EMPs e de macrófagos derivados de YS por citometria de fluxo
NOTA: Este protocolo foi otimizado usando uma eq de citometro de fluxo laser 4Extraído com um laser Violet de 405 nm, um laser azul de 488 nm, um laser amarelo de 562 nm e um laser vermelho de 638 nm.
- Prepare contas de compensação para cada anticorpo acoplado de acordo com as instruções do fabricante. Use amostras não mantidas e contas de compensação para otimizar as intensidades do laser.
- Para identificar os limites do portão, use controles FMO (Fluorescência menos um) para cada anticorpo.
- Para excluir células mortas, adicione 1 μL de DAPI (1 mg / ml) ao tubo (contendo 200 μL de suspensão de células coradas) 1 min antes da aquisição. Use o forte sinal DAPI e o parâmetro espalhado para frente (FSC) para executar a exclusão de células mortas e detritos.
NOTA: Use o software do citómetro de fluxo para desenhar portas durante a aquisição. A matriz de compensação e a análise podem ser realizadas após a aquisição da amostra usando outro software comercialmente disponível. - Use a dispersão direta e lateral (FSC vs SSC) para executar a discriminação de células vivas e dupla de eventos totais.
- Crie parcelas de pontos de fluorescência no eixo da escala de registro e desenhe os portões da filha para, primeiro, excluir os eritrócitos (Ter119 + ) e, então, identificar células progenitoras (Kit + ) e células hematopoiéticas (CD45 + Kit neg ) (Ver Figura 1 ).
- Crie histogramas de fluorescência para quantificar a eficiência de rotulagem do YFP entre as diferentes populações identificadas no YS ( Figura 2 ), fígado fetal ( Figura 3 ) e cérebro ( Figura 4 ).
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Representative Results
O mapeamento do destino genético foi conseguido por administração em E8.5 de OH-TAM em fêmeas Csf1r-Mer-iCre-Mer acasaladas com machos portadores de um repórter Rosa26-LSL-eYFP. Na presença de OH-TAM, a excisão da cassete de parada leva à expressão permanente de YFP nas células que expressam Csf1r . Recolhemos dois tecidos hematopoiéticos: o saco vitelino e o fígado fetal e um tecido não hematopoiético, o neuroectoderma, dos embriões em E10.5. As suspensões de célula única foram obtidas por dissociação enzimática e mecânica e as amostras foram analisadas por citometria de fluxo após coloração com anticorpos de acoplamento fluorescente. Após a exclusão de células mortas e dupletos, as suspensões celulares únicas foram analisadas ( Figura 1 ). Todos os portões foram definidos usando os controles Fluorescence Minus One (FMO). Recomenda-se também realizar uma exclusão de eritrócitos (células Ter119 + ) para melhorar a clareza da análise ( Figura 1B + CD45 neg ; Kit + CD45 baixo e Kit neg CD45 + ( Figura 1 ). Os progenitores foram analisados adicionalmente com base na expressão de AA4.1 ( Figuras 2-4 ). De fato, AA4.1 é um marcador superficial que permite o enriquecimento da população progenitora dentro dos progenitores eritromoelóides no saco vitelino, conforme demonstrado nos ensaios de formação de colônias 15 . Uma vez identificadas as populações de interesse, quantificamos a eficiência de rotulagem do YFP em cada população usando histogramas. Entre o Kit saco vitelino + progenitoras, tanto CD45 negativo (Figura 2A) e populações de células CD45 de baixo (Figura 2B) contêm células AA4.1 + YFP +. No entanto, AA4.1 + YFP <As células sup> + no fígado e no cérebro só são encontradas na população de progenitores baixos Kit + CD45 ( Figura 3B e 4B ). Como o cérebro não é um sítio ativo de hematopoiese, os progenitores encontrados neste tecido podem corresponder a progenitores circulantes. Isso também sugere um processo de maturação dos progenitores à medida que migram do saco vitelino para o fígado fetal e para os tecidos periféricos. Os progenitores Kit + primeiro expressam AA4.1, independentemente da expressão de CD45, mas, quando atingem a circulação e o fígado fetal, todos os progenitores AA.2.1 + YFP + expressam níveis detectáveis de CD45 na superfície celular. Os macrófagos, definidos como F4 / 80 Bright CD11b + , foram encontrados no portão Kit neg CD45 + ( Figura 2-4 ). Os macrófagos no saco de vitela E10.5, fígado e cérebro foram rotulados de forma eficiente (60 a 80% de células F4 / 80 brilhantes CD11b + são YFP + ) b Administração única de OH-TAM em E8.5 ( Figura 2C , 3C e 4C ).
Para comparar a eficiência de rotulagem entre ninhadas, recomendamos que seja utilizado um controle interno para eficiência de recombinação. A variabilidade no nível de expressão do repórter pode ser observada entre experiências, devido a variações no tempo de desenvolvimento entre ninhadas e cepas de ratos quando o OH-TAM é injetado no útero . Por isso, recomendamos que o estágio embrionário de embriões E8.5 para E11.5 seja realizado por contagem de pares de somite. Neste protocolo, propomos usar a eficiência de rotulagem nos macrófagos residentes no cérebro (microglia) como referência para comparar a eficiência da recombinação Cre entre diferentes experimentos e cepas ( Figura 4C ). Podem ser utilizados outros macrófagos residentes, no entanto, as microglias foram as primeiras células a serem descritas como macrófagos derivados do saco da vitela16 e representam a população mais abundante de macrófagos residenciais de tecidos em E10.5. Assim, a marcação de YFP na microglia pode ser usada para avaliar a eficiência de mapeamento do destino em cada experimento e comparar dados de lixos diferentes.
Figura 1: Estratégia de gating para identificar células progenitoras (Kit + CD45 neg e Kit + CD45 baixas ) e células hematopoiéticas diferenciadas (Kit neg CD45 + ). ( A ) A discriminação de células vivas e singlets é realizada usando os parâmetros de coloração DAPI e Forward e Side Scatter (FSC / SSC). ( B ) Após exclusão de glóbulos vermelhos (Ter119 neg ), três populações de células de interesse são identificadas com base na expressão da superfície celular de Kit e CD45: Kit + CD45 neg ; Kit + CD45 baixo neg CD45 + . ( C ) células que expressam Csf1r apresentam quando o OH-TAM é injetado e sua progênie é identificada em embriões positivos para Crease recombinase como expressando YFP em comparação com os embriões Cre-recombinase negativos (confirmados posteriormente pelo ensaio de reação em cadeia da polimerase, PCR). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2: Eficiência de rotulagem no saco vitelino de E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 Embraiados LSL-eYFP pulsados com OH-TAM em E8.5. ( A ) As células negativas Kit + CD45 são fechadas com base na expressão do kit e CD45 em células do saco vitelino vivo (porta azul, painel esquerdo). AA4.1 e expressão do kit em células Kit + CD45 neg . BluO portão eletrônico inclui pilhas AA4.1 + Kit + CD45 neg (painel central). Comparação da marcação YFP em pilhas AA4.1 + Kit + CD45 neg (painel direito) em controles Cre negativo (preto) e amostras Cre positivas (verde). Os histogramas representam a porcentagem de células (eixo-y) positivo para o sinal YFP (eixo dos x). ( B ) As células baixas Kit + CD45 são fechadas de acordo com a expressão Kit e CD45 (porta azul, painel esquerdo). AA4.1 e expressão do kit em células Kit + CD45 baixas . O portão azul inclui EMP, conforme definido como pilhas AA4.1 + Kit + CD45 baixas (painel central). Comparação da marcação YFP em pilhas AA4.1 + Kit + CD45 baixas (painel direito) em controles Cre negativo (preto) e amostras Cre positivas (verde). Os histogramas representam a porcentagem de células (eixo-y) positivo para o sinal YFP (eixo dos x). ( C ) As células hematopoiéticas são definidas como Kit neg CD45
Figura 3: Eficiência de rotulagem no fígado de E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 Os embriões LSL-eYFP são impulsos com OH-TAM em E8.5. ( A ) As células negativas Kit + CD45 são fechadas com base em Kit e CD45Expressão em células vivas do fígado (portão azul, painel esquerdo). AA4.1 e expressão do kit em células Kit + CD45 neg . O portão azul inclui células AA4.1 + Kit + CD45 neg (painel do meio). Comparação da marcação YFP em pilhas AA4.1 + Kit + CD45 neg (painel direito) em controles Cre negativo (preto) e amostras Cre positivas (verde). Os histogramas representam a porcentagem de células (eixo-y) positivo para o sinal YFP (eixo dos x). ( B ) As células baixas Kit + CD45 são fechadas de acordo com a expressão Kit e CD45 (porta azul, painel esquerdo). AA4.1 e expressão do kit em células Kit + CD45 baixas . O portão azul inclui EMP, conforme definido como pilhas AA4.1 + Kit + CD45 baixas (painel central). Comparação da marcação YFP em pilhas AA4.1 + Kit + CD45 baixas (painel direito) em controles Cre negativo (preto) e amostras Cre positivas (verde). Os histogramas representam a porcentagem deCélulas (eixo-y) positivo para o sinal YFP (eixo dos x). ( C ) As células hematopoiéticas são definidas como Kit neg CD45 + e fechadas em azul (painel esquerdo). Expressão F4 / 80 e CD11b nas células Kit neg CD45 + . Os macrófagos são definidos como células CD4b + brilhantes F4 / 80 (painel central). Comparação da rotulação de YFP em macrófagos CD4b + brilhantes F4 / 80 (painel direito) em controles negativos Cre (preto) e amostras positivas Cre (verde). Os histogramas representam a porcentagem de células (eixo-y) positivo para o sinal YFP (eixo dos x). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 4: Eficiência de rotulagem no cérebro de E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospuLsed com OH-TAM em E8.5. ( A ) As células negativas Kit + CD45 são fechadas com base na expressão de Kit e CD45 em células cerebrais vivas (portão azul, painel esquerdo). AA4.1 e expressão do kit em células Kit + CD45 neg . O portão azul inclui células AA4.1 + Kit + CD45 neg (painel do meio). Comparação da marcação YFP em pilhas AA4.1 + Kit + CD45 neg (painel direito) em controles Cre negativo (preto) e amostras Cre positivas (verde). Os histogramas representam a porcentagem de células (eixo-y) positivo para o sinal YFP (eixo dos x). ( B ) As células baixas Kit + CD45 são fechadas de acordo com a expressão Kit e CD45 (porta azul, painel esquerdo). AA4.1 e expressão do kit em células Kit + CD45 baixas . O portão azul inclui EMP, conforme definido como pilhas AA4.1 + Kit + CD45 baixas (painel central). Comparação da rotulação de YFP em AA4.1 + Kit + CD45 baixa C ) As células hematopoiéticas são definidas como Kit neg CD45 + e fechadas em azul (painel esquerdo). Expressão F4 / 80 e CD11b nas células Kit neg CD45 + . Os macrófagos são definidos como células CD4b + brilhantes F4 / 80 (painel central). Comparação da rotulação de YFP em macrófagos CD4b + brilhantes F4 / 80 (painel direito) em controles negativos Cre (preto) e amostras positivas Cre (verde). Os histogramas representam a porcentagem de células (eixo-y) positivo para o sinal YFP (eixo dos x). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Discussion
As diferentes ondas de células precursoras hematopoiéticas se sobrepõem parcialmente dentro de um curto período de tempo, o que torna a análise da contribuição de cada onda de hematopoiese de desenvolvimento para células imunes tecnicamente muito desafiadora.
Os sistemas Cre induzíveis de tamoxifeno oferecem a oportunidade de marcar células específicas de forma temporariamente indutível e realizar análises de linhagem em embriões ou adultos, sem a necessidade de cultura ou transplante ex vivo ou in vitro . Nas cepas induzidas por cremes de tamoxifeno, é criado um gene de fusão entre uma recombinase recombinante bacteriana e uma forma mutante do domínio de ligação do ligando do receptor de estrogênio humano (CRE-ER) ou entre um mutante de ponto único melhorado Cre e dois receptores de estrogênio de mouse (Mer-iCre-Mer). Fusion of Cre com receptores de estrogênio leva ao seqüestro citoplasmático de Cre por Hsp90, prevenindo assim a recombinação nuclear mediada por Cre. O tamoxifeno (TAM) é metabolizado pelaE fígado em 4-hidroxitoxififeno (OH-TAM), seu metabolito ativo com alta afinidade de ligação para o receptor de estrogênio. A ligação de OH-TAM à fusão Cre conduz à interrupção da interação com Hsp90, permitindo sua translocação para o núcleo e início da recombinação mediada por Cre. A injeção de TAM ou OH-TAM no útero em fêmeas grávidas mostrou ativar a recombinação no embrião em desenvolvimento. A administração de tamoxifeno durante a gravidez pode levar ao aborto e, assim, reduz o tamanho da liteira, mas também previne o nascimento se for entregue após a gestação média, caso em que é necessário o uso de cadáveres por meio de uma operação de cesariana. Para contrabalançar os efeitos de tamoxifeno durante a gravidez, complementamos a administração de OH-TAM com uma meia dose de progesterona, a fim de melhorar a sobrevivência dos embriões e reduzir o risco de abortos 17 .
Várias rotas podem ser empregadas para entregar TAM ou OH-TAM em fêmeas grávidas. Atualmente com gava oralA injeção intraperitoneal (ip) é usada para tamoxifeno. O OH-TAM tem a vantagem de estar imediatamente disponível, pois não precisa ser metabolizado pelo fígado da barragem gravida. No entanto, enquanto o tamoxifeno é muito fácil de dissolver no óleo de milho, o OH-TAM é muito difícil de preparar usando a mesma técnica e resulta em uma emulsão. Este foi um passo limitante no emprego de OH-TAM para marcação de pulso in utero . Nós adaptamos o protocolo para a preparação de OH-TAM desenvolvido pelo grupo de JF Nicolas 13 , onde usam óleo de rícino PEG-35, um solvente com propriedades anfifílicas para solubilizar OH-TAM, uma vez que a dissolução de tamoxifeno é um dos passos mais críticos No procedimento. Isso permite uma preparação reprodutível e ótima de OH-TAM e reduz consideravelmente o tempo de preparação de tamoxifeno. Além disso, é necessário adaptar a concentração de OH-TAM para injetar quando se utilizam diferentes cepas de Cre induzíveis. A combinação de um corante de viabilidade (DAPI) e tamanho (FSC) é crítico para remover células mortas e detritos celulares, respectivamente. As células mortas e os detritos são altamente autofluorescentes na maioria dos detectores laser violeta, azul e vermelho e podem dificultar a análise de citometria de fluxo. Além disso, não recomendamos a fixação das células após a coloração antes da análise com o citómetro de fluxo. A fixação pode levar a alterações na morfologia celular e, portanto, torna a discriminação de tamanho difícil com base em Forward and Side Scatter (FSC vs. SSC). Além disso, a fixação de amostras com PFA leva a uma perda significativa de intensidade fluorescente de YFP.
A principal limitação dentro deste protocolo é que as populações não são testadas quanto à sua funcionalidade e potencial de diferenciação. Para superar isso, as células podem ser classificadas seguindo um protocolo similar usando um classificador de celular ativado por fluorescência (FACS) para realizar o ensaio de formação de colônia. Neste caso, o procedimento deve ser realizado em condições estéreis e uso de soro bovino fetal (FBS) no buffer FACS, em vez de BSA, é altamente recomendado. A baixa eficiência de rotulagem alcançada com esta técnica e, conseqüentemente, o baixo número de células YFP + de interesse por tecido embrionário é um grande desafio no estudo do fenótipo EMP. Este protocolo usa um citometro de fluxo de 4-laser. Um citómetro de fluxo com 3 láseres também pode ser usado, mas é importante adaptar o painel de anticorpos para levar em consideração o aumento da sobreposição espectral entre os corantes. Além disso, a titulação de anticorpos é necessária para encontrar a concentração apropriada ao mudar o painel de anticorpos e recomendamos realizar a titulação de anticorpos e a validação do novo painel de anticorpos em uma experiência piloto onde todos os embriões por tecido são agrupados, de modo a aumentar o número de anticorpos. Células analisadas por tecido.
O campo da biologia do desenvolvimento foi revolucionado pelo método Cre / Lox, que permite a rotulagem permanente das células in situ . Essa abordagem atingeTipo de tecido ou célula - especificidade através da expressão da recombase recombinada sob o controle de um promotor específico. No nosso caso, escolhemos estudar a expressão da recombinase Cre sob o controle do promotor de Csf1r (Receptor de Estimador de Colônia de Fator 1), um importante receptor de fator mitogênico e de crescimento para macrófagos e seus progenitores, usando uma cepa desenvolvida pelo grupo De J. Pollard 18 . A vantagem de uma estratégia de mapeamento de destino baseada na expressão de Csf1r em comparação com outras estratégias publicadas é que permite a rotulagem das células derivadas do saco de vitela (EMP e macrófagos) sem rotular qualquer HSC fetal 12 . A estirpe CX3cr1 Creert2 também pode rotular as células do saco vitelino sem rotulagem de HSCs 19 , no entanto, ela apenas pode rotular macrófagos e precursores de macrófagos, mas não rotula os progenitores EMP 1 . A estirpe CX3cr1 Creert2 tem a mesma ressalva que a Csf1r
Este método poderia ser importante em um futuro próximo para estudar as vias de diferenciação EMP. Enquanto EMPs emergem do endotoxismo do saco vitelino de E8.5 para E10.5 4, esse método só permite marcar uma fração dos progenitores emergentes entre E8.5-E9.5. Portanto, uma limitação deste método é que apenas uma pequena fração de EMP é rotulada, tornando assim difícil a análise em estudos clássicos de perda de função com alelos floxed para cAndidate genes. Alternativamente, rotulagem escassa pode se tornar uma vantagem em estudos clonais de diferenciação EMP in vivo , usando repórter clonal. No entanto, a eficiência de rotulagem precisa ser caracterizada para cada repórter floxed ou alelo floxed usado, uma vez que a eficiência de recombinação das construções floxed depende do locus genômico (alelos floxed) ou da construção repórter Rosa26. Na verdade, diferentes linhas de repórteres Rosa26 estão disponíveis com diferentes promotores e é relatado que Rosa26 tdTomato e Rosa26 mTmG têm maior eficiência de recombinação do que a linha Rosa26 LSL-eYFP . A cepa de rato repórter utilizada neste protocolo é a linha Rosa26 LSL-eYFP , que não pode fornecer informações sobre o processo dinâmico de maturação dos progenitores mencionado na seção de resultados. A questão do processo de maturação pode ser parcialmente abordada usando diferentes cepas repórter como o Rosa26 mTmG . Em tal tensão, as células podem estar distantesCalculado com base no tempo decorrido desde o evento de recombinação. Todas as células na proteína Rosa26 mTmG expressam a proteína fluorescente tdTomato ligada à membrana e a recombinação Cre propicia a cassete tdTomato e permite a expressão de GFP ligada à membrana. Uma vez que tdTomato tem uma meia-vida longa, as células que ainda contêm tdTomato, mas começaram a expressar o GFP (logo após a recombinação) são tdTomato + GFP baixo / int e podem ser distinguidas das células TDTomato neg GFP + que não expressam mais tdTomato e Expressar níveis mais elevados de GFP (mais tarde após a recombinação).
Conforme discutido acima, a preparação de OH-TAM é um passo crítico para fornecer consistentemente doses similares de OH-TAM entre experiências e reduzir os efeitos colaterais de tamoxifeno. A co-administração de progesterona também é útil para limitar o efeito deletério do tamoxifeno na gravidez. Outro elemento crítico do protocolo é a viabilidade do suspensio de célula únicaN obtidos a partir de diferentes tecidos embrionários. Geralmente, obtemos> 90% de células viáveis para análise de citometria de fluxo. Para conseguir isso, é fundamental seguir todas as etapas rapidamente e manter todas as amostras no gelo após a coleta de tecidos. Controles apropriados, como amostras não mantidas, manchas isoladas e controles fluorescentes menos um (FMO) são necessários para identificar os limites do portão e para controlar a sobreposição espectral em painéis multicoloridos. As mudanças no anticorpo precisam ser validadas em termos de titulação de anticorpos e sobreposição espectral. Finalmente, a escolha da cepa repórter Rosa26 precisa ser adaptada à questão científica investigada.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Prof. Frederic Geissmann e ao Prof. Christian Schulz por discussões perspicazes; Dr. Hannah Garner para a leitura crítica do manuscrito, o Dr. Xavier Montagutelli e o Dr. Jean Jaubert e os funcionários da unidade animal do Instituto Pasteur para apoio à criação de camundongos; E Pascal Dardenne e Vytaute Boreikaite, um Amgen Scholar, por sua assistência técnica. A pesquisa no laboratório EGP é financiada pelo Instituto Pasteur, o CNRS, o Cercle FSER (FRM e um pacote de partida do Institut Pasteur e do consórcio REVIVE. LI é apoiado por uma bolsa de doutorado do consórcio REVIVE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
References
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