Summary
Selv om infiltrerende makrofager rekrutteres kontinuerligt til voksne væv fra cirkulerende forstadier, frøer residente makrofager deres væv under udvikling, hvor de opretholdes uden yderligere indløb fra forfædre. Forfædrene for residente makrofager blev for nylig identificeret. Her præsenterer vi metoder til den genetiske skæbneplanlægning af de residente makrofagprogenitorer.
Abstract
Makrofager er faglige fagocytter fra den medfødte arm af immunsystemet. I steady-state findes sessile makrofager i voksne væv, hvor de fungerer som frontlinjesangivelser af infektion og vævsskade. Mens andre immunceller kontinuerligt fornyes fra hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPC), der er placeret i knoglemarven, har en række makrofager, der er kendt som residente makrofager, vist sig selvforsynet i væv uden input fra knoglemarvs HSPC'er. Denne slægt er eksemplificeret ved microglia i hjernen, Kupffer celler i leveren og Langerhans celler i epidermis blandt andre. Tarm- og colon lamina propria er de eneste voksne væv uden HSPC-uafhængige bosiddende makrofager. Nylige undersøgelser har identificeret, at hjemmehørende makrofager stammer fra den ekstra-embryonale æggeblomme-hæmatopoiesis fra stamceller, der er forskellige fra føtal hæmatopoietiske stamceller (HSC). Blandt æggeblomme sac definitiv hæmatopoiesis, eRythromyeloid progenitorer (EMP) giver anledning til både erythroid og myeloidceller, især residente makrofager. EMP genereres kun i æggeblomme sac mellem E8.5 og E10.5 udviklingsdage, og de migrerer til føtalelever så tidligt som omsætning er forbundet, hvor de udvides og differentieres til mindst E16.5. Deres afkom omfatter erythrocytter, makrofager, neutrofiler og mastceller, men kun EMP-afledte makrofager fortsætter indtil voksenalderen i væv. Den forbigående karakter af EMP-fremkomsten og den tidsmæssige overlapning med HSC-generering gør analysen af disse forgængere vanskelig. Vi har etableret en tamoxifen-inducerbar skæbneplanlægningsprotokol baseret på ekspression af makrofag-cytokinreceptor Csf1r-promotoren til karakterisering af EMP- og EMP-afledte celler in vivo ved flowcytometri.
Introduction
Der er flere på hinanden følgende men overlappende bølger af hæmatopoietiske stamceller under udvikling, hvis myeloid afkom forbliver i voksenalderen. For det første kommer unipotente "primitive" forfædre frem i muskelblomme sac 1 , 2 mellem E7.5-E8.25 og give anledning til embryonale makrofager uden noget monocytisk mellemprodukt. Hvorvidt makrofager afledt af primitive stamceller fortsætter i den voksne hjerne, da microglia fortsat er et emne for aktiv undersøgelse. For det andet opstår Erythro-Myeloid Precursors (EMP'er) i æggeblomme Sac ved E8.5, indtræder blodbanen og koloniserer embryoet. EMP'er kommer frem fra æggeblomme sac hæmogent endotel i en Runx1-afhængig endotel-til-hæmatopoietisk overgang 3 , 4 . Mens EMP kan differentiere i makrofager inden for æggeblommehalsen, koloniserer de også føtalelever fra embryonal dag (E) 9 5 og adskiller sigTia i erythrocytter, megakaryocytter, makrofager, monocytter granulocytter og mastceller 6 . De makrofager, der stammer fra EMP'er, udviser proliferativ kapacitet i udviklings- og voksenvæv. Hvorvidt EMP-afledte makrofager omgår monocytfasen af differentiering er stadig kontroversiel, da meget lidt er kendt om deres differentieringsvej 7 , 8 . Endelig kommer hæmatopoietiske stamceller (HSCs) frem til E10.5 inden for det egentlige embryo fra aorta-gonad-mesonephros-regionen og migrere til føtalelever. HSC'er med langvarig repopulationskapacitet registreres kun efter E11 (ved 42-somite-par-scenen) 9 . Der udvider og differentieres de fra E12.5, indtil definitiv hæmatopoiesis begynder at skifte til knoglemarv, som bliver det overvejende sted for blodcelleproduktion i postnatalt liv 10 .
SpAtiel og tidsmæssig overlapning i fremkomsten såvel som delte immunfænotypiske markører har hidtil hæmmet vores evne til at skelne de specifikke bidrag fra disse bølger af embryonale hæmatopoietiske stamceller. Mens både EMP og HSC genereres på en Runx1-afhængig måde og udtrykker transkriptionsfaktoren Myb og vækstfaktorreceptoren Csf1r (kolonistimulerende faktor 1-receptor, også kendt som makrofagkoloniestimulerende faktorreceptor) blandt andre, kan EMP'er skelnes fra HSCs ved deres mangel på lymfoide potentiale, både in vitro og in vivo , deres mangel på langsigtet repopuleringspotentiale og mangel på overfladekspression af linjemarkøren Sca- 11 . Genetiske skæbne kortlægningsmodeller er nødvendige for at karakterisere makrofag ontogeni, da de tillader målretning af embryonale forfædre på en celle-specifik og tidsspecifik måde. Her præsenterer vi skæbne-kortlægningsprotokollen anvendt i vores laboratorium for at diskriminere mellem de to linjerS af makrofager fundet i de fleste voksne væv: HSC-afledte infiltrerende makrofager og HSC-uafhængige residente makrofager.
Tissue stationære makrofager er blevet sporet tilbage til Myb-uafhængige precursorceller udtrykker cytokinreceptor Csf1r 12 og er til stede i embryoet på E8.5-E10.5 anvendelse af tre komplementære skæbne-kortlægningsstrategier 6. For at studere æggeblomme sac hæmatopoiesis uden mærkning af føtal HSCs bruger vi en transgen stamme, Csf1r MeriCreMer , der udtrykker et tamoxifen-inducerbart fusionsprotein af "forbedret" Cre recombinase og to musestrogenreceptorer (Mer-iCre-Mer) under kontrol af Csf1r-promotoren. Derfor vil Cre recombinasen være aktiv i Csf1r-ekspresserende celler under et begrænset tidsvindue. Når det anvendes med en reporterstamme indeholdende et fluorescerende protein nedstrøms for en lox-STOP-lox-kassette (Rosa26 LSL-eYFP ), vil det føre til permanentEnt genetiske mærkning af cellerne til stede på tidspunktet for induktion men også af deres afkom. Administration ved E8.5 af aktiv form af tamoxifen, 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), EMP'er og makrofager uden mærkning af æggeblomme sac unipotente "primitive" forfædre eller føtal HSCs. Dermed har vi karakteriseret immunophenotypen af EMP'er og deres afkom under embryonisk udvikling samt vurderet bidraget af æggeblomme-sac-afledte makrofager til de voksne makrofagpuljer. Yderligere arbejde er nødvendigt for at karakterisere, om primitive stamcellerafledte makrofager også mærkes med denne tilgang og om de kan bidrage til voksne makrofagpuljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprocedurer blev udført i overensstemmelse med det godkendte institut for dyrepleje og brug af Institut Pasteur (CETEA).
1. I Utero Pulse Mærkning i Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embryoer
- Forbered stamopløsningen af 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM, 50 mg / ml).
- Åbn hætteglasset med 25 mg OH-TAM under fumehood og tilsæt 250 μL ethanol (100%).
- Overfør OH-TAM-opløsningen til et 2 ml mikrocentrifugerør med en afkortet spids og hvirvel med maksimal hastighed i 10 minutter.
- Sonikere 30 minutter i et sonicatorbad.
- Tilsæt 250 μl PEG-35 ricinusolie under røggassystemet for at opnå en 50 mg / ml stamopløsning.
BEMÆRK: PEG-35 ricinusolie er et opløsningsmiddel med amfifile egenskaber, der binder hydrofobe molekyler og opløser dem i vandige opløsningsmidler. - Vortex i ca. 5 minVed maksimal hastighed og sonikere 30 minutter i et sonicatorbad.
- Aliquot 90 μl (4,5 mg) pr. Mikrocentrifugerør (1 portion pr injektion).
- Opbevares ved 4 ° C i 1 uge eller ved -20 ° C i længere tid som tidligere beskrevet 13 .
- Forbered stamopløsningen af Progesteron (10 mg / ml)
- Tilsæt 250 μl 100% ethanol til 25 mg progesteron for at fremstille en 10 mg / 100 μl suspension under fumehood. Vortex forsigtigt.
- Tilsæt 2250 μL autoklaveret solsikkeolie for at gøre 10 mg / ml progesteronopløsning under emhætten.
- Vortex i ca. 5 minutter ved maksimal hastighed, alikvot og opbevar ved 4 ° C. Bemærk, at løsningen er klar, når den opbevares.
- Tamoxifen administration
BEMÆRK: Embryonudvikling blev estimeret i betragtning af dagen for vaginal plugdannelse som Embryon dag (E) 0,5. Rekombination induceres ved en enkelt injektion ved E8.5Til gravide Csf1r MeriCreMer kvinder 12 . Supplement OH-TAM med 37,5 μg pr. G progesteron for at reducere abortfrekvenserne efter administration af tamoxifen. Injicer kl. 13.00 (for vaginale stik observeret om morgenen).- Om morgenen af injektion sonikere en alikvot af OH-TAM opløsningen i 10 minutter (eller indtil fuldstændigt resuspenderet).
- Tilsæt 360 μL NaCl 0,9% under fumehood for at opnå en 10 mg / ml OH-TAM opløsning og hvirvel grundigt. Sonikat, indtil opløsningen er klar og fuldstændigt resuspenderet (mindst 30 minutter).
- Forvarm progesteron til stuetemperatur.
- Bland 450 μL OH-TAM og 225 μL progesteron i et mikrocentrifugerør. Vortex.
- Sonikere mindst 10 minutter og læg på en 1 ml sprøjte med en 25 G nål.
- I dyreanlægget vejer den gravide hun ( Csf1r MeriCreMer kvinder er i en indavlet FVB genetisk baggrund og typisk vejer betweEn 25 og 33 g).
- Udfør en intraperitoneal injektion ved langsomt at injicere det beregnede volumen i musen. Når du har trukket nålen, skal du forsigtigt trykke på punkteringsåret og massere underlivet for at fordele OH-TAM.
BEMÆRK: OH-TAM-injektionsdosis er 75 mg / kg, og Progesteron-dosen er 37,5 mg / kg. Tabel 1 giver volumen til at injicere til gravide kvinder.
| Mus vægt (g) | Samlet volumen, der skal injiceres fra blandingen (μL) |
| 25 | 281 |
| 26 | 292 |
| 27 | 303 |
| 28 | 315 |
| 29 | 326 |
| 30 | 338 |
| 31 | 348 |
| 32 | 360 | </ Tr>
| 33 | 371 |
| 34 | 382 |
| 35 | 394 |
Tabel 1: Injektionsvolumen af 4-OH-tamoxifen (OH-TAM). Det krævede volumen til en enkelt injektion ved E8.5 på 75 μg pr. G (kropsvægt) af OH-TAM suppleret med 37,5 μg pr. G progesteron.
2. Dissektion af æggeblomme Sac (YS) og føtal lever (FL)
BEMÆRK: Sterile sterile teknikker er ikke nødvendige, når man manipulerer embryoner, medmindre de skal bruges til langsigtet kultur. Arbejdsområdet skal dog være rent og dækket af folie under absorberende papir.
- Forbered iskold fosfatbuffet saltvand (PBS) og fordøjelsesblanding (PBS indeholdende 1 mg / ml collagenase D, 100 U / ml deoxyribonuklease I (DNase I) og 3% føtalt bovint serum).
- Offer gravide kvinder af cerVical dislokation på den krævede gestationsdag ( fx embryonale stadium E10.5).
- Klip huden lige over kønsorganerne og lav et lille snit i midterlinjen med en saks. Træk huden mod hovedet for at afsløre hele kroppen væggen uden pels. Skær bukemusklerne for at eksponere de indre organer og skubbe tarmene for at udstille de to livmoderhorn.
- Med mellemstort blunt tang, tag fatfoden fast i æggestokken og træk forsigtigt livmoderen. Skær på livmoderhornets livmoderhalsniveau og løft hornene fra peritonealhulen. Fjern fedtpuden for fuldstændigt at frigøre livmoderhornene og skære hornene fra æggestokken på hver side.
- Sæt hornene i iskold PBS i en 10 mm petriskål. Hurtigt greb livmodermuskellagene i en ende (cervikal ende) og skub fx saks mellem muskellaget og det deciduale væv for at frigive embryonerne med det omgivende deciduelle væv.
BEMÆRK: Muskel har tendens til hurtigt at indgå kontraktR udvindingen, så dette trin skal være så hurtigt som muligt. - Brug et par fine tænger til at afskære Reichert's membran og placenta.
- Fjern forsigtigt sækkeposen og læg den i en 24-brønd vævskulturplade med 0,5 ml fordøjelsesblanding.
BEMÆRK: Ved dette trin kan embryonalt blod indsamles.- Umiddelbart efter adskillelse af navlestangs- og vitellinbeholdere overføres embryoet til en 12-brønd vævskulturplade indeholdende 10 mM iskold ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Dekapitér embryoet ved hjælp af skarpe fine saks og forsøger at begrænse så meget som muligt vævsfortynding. Inkubér på is i 10-15 minutter og saml EDTA indeholdende blodet.
- Fjern amnionen omkring embryoet.
- I trin <E11.5 tæller du antallet af somitpar til bedre opdeling af embryoner og en bedre tidsopløsning (hvert somite-par udvikler sig i ~ 1 time 30 minutter).
- Skær embryonets hoved osIngangen eller en fin saks. Overfør hovedet til en 24-brønds plade med 0,5 ml fordøjelsesblanding.
BEMÆRK: Neuroektoderm og hjerne i senere stadier dissekeres yderligere for flowcytometrianalyse; Fjern omhyggeligt det omkringliggende vaskulære plexus. - Skær embryonet over bagstykket og fjern forbenene.
- For at isolere leveren skal du åbne thoraxen ved hjælp af et par fine tang. Pinch anteriorly til hjertet og træk forsigtigt, mens du bruger den anden pincet til at frigøre organerne fra kroppen.
- Sørg for at adskille fostrets lever forsigtigt fra hjertet og tarmene. Overfør fostrets lever til en 24-brønds plade med 0,5 ml fordøjelsesblanding. Overvåg forsigtigt overførslen under dissekeringsmikroskopet.
- Saml haleområdet (eller en hvilken som helst anden embryodel) til genotypning ved polymerasekædereaktionsassay (PCR).
BEMÆRK: Andre væv og organer kan høstes fra E10.5 embryoner til en lignende analyse ved hjælp af flowcytometri. Blod, hoved skiN, aorta-gonad-mesonephros region (AGM), hjerte og neuroektoderm kan indsamles ved E10.5. Ved senere stadier kan lunge, nyre, milt og bugspytkirtlen også indsamles. En detaljeret beskrivelse af dissekationen af generalforsamlingen på forskellige udviklingsstadier er tidligere beskrevet 14 .
3. Behandling af embryonale væv til flowcytometri
- Inkuber organerne (placeret i fordøjelsesblandingen) i 30 minutter ved 37 ° C.
- Overfør vævs- og enzymatiske opløsning på en 100 μm filter placeret i en 6-brønd vævskulturplade fyldt med 6 ml FACS-buffer (0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA i 1x PBS). Mekanisk dissocieres ved forsigtigt at blande med det sorte gummistempel i en 2 ml sprøjte for at opnå en enkeltcellesuspension.
BEMÆRK: Fra nu af skal alle trin udføres ved 4 ° C. - Saml cellesuspensionen med en Pasteur pipette og overfør til et 15 ml rør.
- SpiN i 7 minutter ved 320 xg ved 4 ° C. Kassér supernatanten ved aspiration.
- Resuspender pelleten i 60 μl Fc-blokeringsbuffer (CD16 / CD32-blokeringsantistof fortyndet 1/50 i FACS-buffer).
- Overfør 50 μl af enkeltcellesuspensionen pr. Brønd i en 96-brøndsplad med rund bund 96. Inkubér i mindst 15 minutter på is.
BEMÆRK: Farvningen kan også udføres i 5 ml polystyren FACS rør ved håndtering af et lille antal prøver. - Overfør de resterende 10 μl i et 5 ml polystyren-FACS-rør for at opnå en pulje af prøverne fra hvert væv. Denne pulje vil fungere som kontrollen ( dvs. ufarvede prøver og fluorescerende minus en (FMO) kontrol for hver fluorochrom). Overfør 50 μl af puljen for hver fluorescerende minus en (FMO) kontrol (en pr. Fluorochrom) til 96-brøndspladen.
BEMÆRK: Hver FMO-kontrol indeholder alle fluorokrom-koblede antistoffer fra antistoffet, undtagen den eneDet måles. FMO'er bruges til at identificere gate grænser og at kontrollere for spektral overlapning i flerfarvede paneler. For at rette op på variationerne i baggrunden og autofluorescens mellem forskellige væv, er det vigtigt at forberede disse kontroller ud fra prøveprøven af hvert væv. Den passende kontrol for YFP-ekspression vil være prøverne fra Cre-negative embryoner, som bekræftes ved PCR genotyping.
- Overfør 50 μl af enkeltcellesuspensionen pr. Brønd i en 96-brøndsplad med rund bund 96. Inkubér i mindst 15 minutter på is.
4. Overfladeantigenfarvning
- Forbered antistofblandingen i FACS-buffer (tabel 2). Forbered 50 μl antistofblanding pr. Prøve.
- Brug følgende fluorokrom-koblede antistoffer: anti-CD45.2 (klon 104); Anti-CD11b (klon M1 / 70); Anti-F4 / 80 (klon BM8); Anti-AA4.1 (klon AA4.1); Anti-kit (klon 2B8); Og anti-Ter119 (klon Ter119).
- Forbered seks antistofblandinger til FMO-kontrollerne i FACS-buffer. Forbered 50 μl antistofblanding pr. Kontrolprøve.
INGENTE: Antistofffortyndingen i antistofblandingen er to gange mere koncentreret end den endelige koncentration angivet i materialetabellen. For et panel med seks fluorochrom-koblede antistoffer fremstilles 6 FMO-kontroller. Tabel 2 tilvejebringer sammensætningen af antistofblandingen og FMO-kontrollerne for et rør.
| Volumen (μl) af antistof (slutvolumen 50 μl) | ||||||||
| antistof | Klon | Antistofmix | FMO CD45.2 | FMO CD11b | FMO F4 / 80 | FMO AA4.1 | FMO Kit | FMO Ter119 |
| anti-CD45,2 | 104 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| anti-CD11b | M1 / 70 | 0,5 | 0,5 | 0 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| anti-F4 / 80 | BM8 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| anti-AA4.1 | AA4.1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| anti-Kit | 2B8 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0 | 0,5 |
| anti-TER119 | TER119 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0 |
| FACS buffer | 45,5 | 46,5 | 46 | 46,5 | 46,5 | 46 | 46 | |
Tabel 2: Antistofmængder, der bruger til farvning og fluorescerende minus en (FMO) kontrol. Volumen (μL) antistof krævet til et slutvolumen på 50 μl.
- Tilsæt 50 μl af antistofblandingen til prøverne i 96-multiwellpladen (slutvolumen under farvning er 100 μl). Forsigtigt pipetter op og ned to gange og inkubér på is i 30 minutter.
- Spinde 96-multiwellpladen i 7 minutter ved 320 xg ved 4 ° C og kassér supernatanten. Resuspenderes i 200 μl FACS buffer.
- Gentag vaskeproceduren (trin 4.3) to gange med 150 μl FACS-buffer.
- Filtrer prøverne og kontrollerne (FMO'er og ufarvede poolprøver) i 5 ml polystyrenrør gennem en 70 μm filter. Opbevares på is indtil opkøb.
5. Identifikation af EMP'er og YS-afledte makrofager ved hjælp af flowcytometri
BEMÆRK: Denne protokol blev optimeret ved anvendelse af et 4-flow-flowcytometer eqUdstyret med en 405 nm violet laser, en 488 nm blå laser, en 562 nm gul laser og en 638 nm rød laser.
- Forbered kompensationskugler for hvert koblet antistof efter producentens anvisninger. Brug ufarvede prøver og kompensationskugler til at optimere laserintensiteterne.
- For at identificere gate grænser, brug FMO (Fluorescence minus one) kontroller for hvert antistof.
- For at udelukke døde celler tilsættes 1 μL DAPI (1 mg / ml) til røret (indeholdende 200 μl farvet cellesuspension) 1 min før opkøb. Brug det stærke DAPI-signal og den fremadspredte parameter (FSC) til at udføre udelukkelse af døde celler og affald.
BEMÆRK: Brug software fra flowcytometeret til at trække porte under overtagelsen. Kompensationsmatrix og analyse kan udføres efter prøveudtagning ved anvendelse af anden kommercielt tilgængelig software. - Brug fremad og side scatter (FSC vs SSC) til at udføre live celle og dublet diskrimination fra samlede begivenheder.
- Opret fluorescens punkter i log-akse og tegne datterporte til at udelukke erythrocytter (Ter119 + ) og derefter identificere stamceller (Kit + ) og hæmatopoietiske celler (CD45 + Kit neg ) (Se figur 1 ).
- Opret fluorescenshistogrammer for at kvantificere mærkningseffektiviteten af YFP blandt de forskellige identificerede populationer i YS ( Figur 2 ), føtal lever ( Figur 3 ) og hjerne ( Figur 4 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genetisk skæbne kortlægning blev opnået ved administration ved E8.5 af OH-TAM til Csf1r-Mer-iCre-Mer kvinder med parret med en Rosa26-LSL-eYFP reporter. I nærvær af OH-TAM fører udskæring af stopkassetten til den permanente ekspression af YFP i cellerne der udtrykker Csf1r . Vi samler to hæmatopoietiske væv: æggeblomme og fostrelever og et ikke-hæmatopoiet væv, neuroektoderm, fra embryonerne ved E10.5. Encellesuspensioner blev opnået ved enzymatisk og mekanisk dissociation og prøver blev analyseret ved flowcytometri efter farvning med fluorescerende koblede antistoffer. Efter udelukkelse af døde celler og dubletter blev enkeltcellesuspensioner analyseret ( figur 1 ). Alle porte blev defineret under anvendelse af Fluorescence Minus One (FMO) kontroller. Det anbefales også at udføre en erythrocyt udelukkelse (Ter119 + celler) for at forbedre analysens klarhed ( Figur 1B + CD45 neg ; Kit + CD45 lav og Kit neg CD45 + ( Figur 1 ). Progenitorer blev yderligere analyseret baseret på deres udtryk for AA4.1 ( figur 2-4 ). Faktisk er AA4.1 en overflademarkør, der tillader berigelse af forfædlingspopulationen inden for erythromyeloid-progenitorer i æggeblommehalsen, som demonstreret i kolonidannende assays 15 . Når de interesserede populationer blev identificeret, kvantificerede vi YFP-mærkningseffektiviteten i hver population ved hjælp af histogrammer. Blandt æggeblomme Sac Kit + stamceller indeholder både CD45 neg ( Figur 2A ) og CD45 lave ( Figur 2B ) cellepopulationer AA4.1 + YFP + -celler. Men AA4.1 + YFP <sup> + -celler i lever og hjerne er kun fundet i Kit + CD45 lav progenitorpopulationen (figur 3B og 4B). Da hjernen ikke er et aktivt sted for hæmatopoiesis, kan progenitorer fundet i dette væv svare til cirkulerende progenitorer. Dette antyder også en proces med forfædre modning, da de migrerer fra æggeblomme til føtalelever og perifere væv. Kit + stamceller udtrykker først AA4.1, uanset CD45-ekspression, men når de når frem til omsætning og føtalelever, udtrykker alle AA4.1 + YFP + -præparater detekterbare niveauer af celleoverflade CD45. Makrofager, defineret som F4 / 80 lyse CD11b + , blev fundet i Kit neg CD45 + porten ( Figur 2-4 ). Makrofager i E10.5-æggesækken, lever og hjerne blev effektivt mærket (60 til 80% af F4 / 80 lyse CD11b + celler er YFP + ) b Ya enkelt OH-TAM administration ved E8.5 ( Figur 2C , 3C og 4C ).
For at sammenligne mærkningseffektiviteten mellem affaldsstoffer anbefaler vi, at der anvendes en intern kontrol for rekombinationseffektivitet. Variabilitet i reporterens udtryk kan ses mellem eksperimenter på grund af variationer i udviklings timing mellem kuld og musestammer, når OH-TAM injiceres i utero . Derfor anbefaler vi, at embryostation fra E8.5 til E11.5 embryoner udføres ved at tælle somite pair. I denne protokol foreslår vi at anvende mærkningseffektiviteten i hjernebeboede makrofager (microglia) som reference til sammenligning af effektiviteten af Cre rekombination mellem forskellige eksperimenter og stammer ( Figur 4C ). Andre residente makrofager kunne anvendes, men microglia var de første celler, der skulle beskrives som æggeblomme-sac-afledte makrofagerEf "> 16 og de repræsenterer den mest rigelige population af væv-residente makrofager ved E10.5. Således kan YFP-mærkning i microglia bruges til at vurdere skæbne-kortlægningseffektiviteten i hvert forsøg og sammenligne data fra forskellige kuld.
Figur 1: Gatingstrategi til identifikation af progenitorceller (Kit + CD45 neg og Kit + CD45 lav ) og differentierede hæmatopoietiske celler (Kit neg CD45 + ). ( A ) Diskriminering af levende celler og singletter udføres ved anvendelse af DAPI-farvning og fremadsporings- og sidestrømsparametre (FSC / SSC). ( B ) Efter rød blodcelleudestilling (Ter119 neg ) identificeres tre populationer af celler af interesse baseret på celleoverfladeekspression af Kit og CD45: Kit + CD45 neg ; Kit + CD45 lav neg CD45 + celler. ( C ) Csf1r-udtrykkende celler til stede, når OH-TAM injiceres, og deres afkom identificeres i Cre-recombinase-positive embryoner som udtryk for YFP sammenlignet med Cre-rekombinase-negative embryoner (bekræftet senere ved polymerasekædereaktionsassay, PCR). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Etiketteringseffektivitet i æggeblomme fra E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospulseret med OH-TAM ved E8.5. ( A ) Kit + CD45 negceller er gated baseret på Kit og CD45 ekspression på levende æggeblomme sac celler (blå port, venstre panel). AA4.1 og Kit udtryk på Kit + CD45 neg celler. BluE port indgår AA4.1 + Kit + CD45 neg celler (middle panel). Sammenligning af YFP mærkning i AA4.1 + Kit + CD45 neg-celler (højre panel) i Cre negative kontroller (sort) og Cre positive prøver (grøn). Histogrammer repræsenterer procentdelen af celler (y-akse) positive for YFP-signal (x-akse). ( B ) Kit + CD45 lave celler er gated baseret på Kit og CD45 udtryk (blå port, venstre panel). AA4.1 og Kit udtryk på Kit + CD45 lave celler. Blue Gate omslutter EMP, som defineret som AA4.1 + Kit + CD45 lave celler (mellempanel). Sammenligning af YFP-mærkning i AA4.1 + Kit + CD45 lave celler (højre panel) i Cre negative kontroller (sort) og Cre positive prøver (grøn). Histogrammer repræsenterer procentdelen af celler (y-akse) positive for YFP-signal (x-akse). ( C ) Hæmatopoietiske celler defineres som Kit neg CD45
Figur 3: Etiketteringseffektivitet i leveren fra E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospulseret med OH-TAM ved E8.5. ( A ) Kit + CD45 negceller er gated baseret på Kit og CD45Udtryk på levende leverceller (blå port, venstre panel). AA4.1 og Kit udtryk på Kit + CD45 neg celler. Blå port omslutter AA4.1 + Kit + CD45 neg celler (midterste panel). Sammenligning af YFP mærkning i AA4.1 + Kit + CD45 neg-celler (højre panel) i Cre negative kontroller (sort) og Cre positive prøver (grøn). Histogrammer repræsenterer procentdelen af celler (y-akse) positive for YFP-signal (x-akse). ( B ) Kit + CD45 lave celler er gated baseret på Kit og CD45 udtryk (blå port, venstre panel). AA4.1 og Kit udtryk på Kit + CD45 lave celler. Blue Gate omslutter EMP, som defineret som AA4.1 + Kit + CD45 lave celler (mellempanel). Sammenligning af YFP-mærkning i AA4.1 + Kit + CD45 lave celler (højre panel) i Cre negative kontroller (sort) og Cre positive prøver (grøn). Histogrammer repræsenterer procenten afCeller (y-akse) positive for YFP signal (x-akse). ( C ) Hæmatopoietiske celler defineres som Kit neg CD45 + og gated i blå (venstre panel). F4 / 80 og CD11b ekspression på Kit neg CD45 + celler. Makrofager defineres som F4 / 80 lyse CD11b + celler (mellempanel). Sammenligning af YFP-mærkning i F4 / 80 lyse CD11b + makrofager (højre panel) i Cre negative kontroller (sort) og Cre positive prøver (grøn). Histogrammer repræsenterer procentdelen af celler (y-akse) positive for YFP-signal (x-akse). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Etiketteringseffektivitet i hjernen fra E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospuLsed med OH-TAM ved E8.5. ( A ) Kit + CD45 negceller er gated baseret på Kit og CD45 ekspression på levende hjerneceller (blå port, venstre panel). AA4.1 og Kit udtryk på Kit + CD45 neg celler. Blå port omslutter AA4.1 + Kit + CD45 neg celler (midterste panel). Sammenligning af YFP mærkning i AA4.1 + Kit + CD45 neg-celler (højre panel) i Cre negative kontroller (sort) og Cre positive prøver (grøn). Histogrammer repræsenterer procentdelen af celler (y-akse) positive for YFP-signal (x-akse). ( B ) Kit + CD45 lave celler er gated baseret på Kit og CD45 udtryk (blå port, venstre panel). AA4.1 og Kit udtryk på Kit + CD45 lave celler. Blue Gate omslutter EMP, som defineret som AA4.1 + Kit + CD45 lave celler (mellempanel). Sammenligning af YFP-mærkning i AA4.1 + Kit + CD45 lav C ) Hæmatopoietiske celler defineres som Kit neg CD45 + og gated i blå (venstre panel). F4 / 80 og CD11b ekspression på Kit neg CD45 + celler. Makrofager defineres som F4 / 80 lyse CD11b + celler (mellempanel). Sammenligning af YFP-mærkning i F4 / 80 lyse CD11b + makrofager (højre panel) i Cre negative kontroller (sort) og Cre positive prøver (grøn). Histogrammer repræsenterer procentdelen af celler (y-akse) positive for YFP-signal (x-akse). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De forskellige bølger af hæmatopoietiske precursorceller overlapper delvist inden for en kort tidsramme, hvilket gør analysen af bidraget fra hver bølge af udviklingshematopoiesis til immunceller teknisk teknisk udfordrende.
Tamoxifen-inducerbare Cre-systemer giver mulighed for at mærke specifikke celler på en temporær inducerbar måde og udføre linieanalyse i embryoner eller voksne uden behov for ex vivo eller in vitro- kultur eller transplantation. I tamoxifen-inducerbare Cre-stammer opstår et fusionsgen mellem en bakteriel Cre rekombinase og en mutant form af det ligandbindende domæne af den humane østrogenreceptor (CRE-ER) eller mellem et forbedret enkeltpunktsmutant Cre og to musestrogenreceptorer (Mer-icre-Mer). Fusion af Cre med østrogenreceptorer fører til cytoplasmatisk sekvestrering af Cre ved Hsp90 og derved forebygger nukleær Cre-medieret rekombination. Tamoxifen (TAM) metaboliseres af thE lever i 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), dets aktive metabolit med høj bindingsaffinitet for østrogenreceptor. OH-TAM binding til fusion Cre fører til forstyrrelsen af interaktionen med Hsp90, hvilket tillader dets translokation til kernen og initiering af Cre-medieret rekombination. Injektion af TAM eller OH-TAM i utero til gravide kvinder har vist sig at aktivere rekombination i det udviklende embryo. Tamoxifen administration under graviditet kan føre til abort og dermed reducere kuldstørrelsen, men det forhindrer også fødsel, hvis den leveres efter midttegation, i hvilket tilfælde hvalp levering via en kejsersnit er påkrævet. For at modvirke tamoxifenvirkninger under graviditeten supplerer vi OH-TAM administration med en halv dosis progesteron for at forbedre overlevelse af embryoner og reducere risikoen for abort 17 .
Flere ruter kan anvendes til at levere TAM eller OH-TAM til gravide kvinder. I øjeblikket oral gavaGe eller intra peritoneal (ip) injektion anvendes til tamoxifen. OH-TAM har den fordel at være umiddelbart tilgængelig, da det ikke kræver at blive metaboliseret af leveren af den gravide dæmning. Selvom tamoxifen er meget let at opløse i majsolie, er OH-TAM imidlertid meget vanskeligt at forberede ved hjælp af samme teknik og resulterer i en emulsion. Dette har været et begrænsende trin i at anvende OH-TAM til udero puls mærkning. Vi har tilpasset protokollen til fremstilling af OH-TAM udviklet af gruppen JF Nicolas 13 , hvor de bruger PEG-35 ricinusolie, et opløsningsmiddel med amfifile egenskaber til at opløse OH-TAM, da tamoxifenopløsning er et af de mest kritiske trin I proceduren. Dette muliggør reproducerbar og optimal præparation af OH-TAM og forkorter tiden tamoxifenpræparatet væsentligt. Endvidere er det nødvendigt at tilpasse koncentrationen af OH-TAM til injektion, når der anvendes forskellige inducerbare Cre-stammer. Kombinationen af et levedygtighedsfarvestof (DAPI) og størrelse (FSC) er afgørende for at fjerne henholdsvis døde celler og cellulære rester. Døde celler og affald er stærkt autofluorescerende i de fleste af de violette, blå og røde laserdetektorer og kan hæmme flowcytometrisk analyse. Endvidere anbefaler vi ikke at fastsætte cellerne efter farvning forud for analyse med flowcytometeret. Fiksering kan føre til ændringer i cellemorfologi og giver således vanskelig diskrimination på grund af Forward and Side Scatter (FSC vs. SSC). Endvidere fører fiksering af prøver med PFA til et signifikant tab af YFP fluorescerende intensitet.
Hovedbegrænsningen inden for denne protokol er, at befolkningerne ikke testes på deres funktionalitet og differentieringspotentiale. For at overvinde dette kan celler sorteres efter en lignende protokol ved anvendelse af en fluorescensaktiveret celle sorterer (FACS) for at udføre kolonidannende assay. I dette tilfælde skal proceduren udføres under sterile betingelser og anvendelse af føtalt bovint serum (FBS) i FACS-bufferen, i stedet for BSA, anbefales stærkt. Den lave mærkningseffektivitet opnået med denne teknik og det dermed lave antal YFP + -celler af interesse pr. Embryonvæv er en stor udfordring i undersøgelsen af EMP-fænotype. Denne protokol bruger et 4-laser flow cytometer. Et flowcytometer med 3 lasere kan også anvendes, men det er vigtigt at tilpasse antistoffepanelet for at tage højde for den øgede spektrale overlapning mellem farvestoffer. Derudover kræves titrering af antistoffer for at finde den passende koncentration ved ændring af antistoffepanelet, og vi anbefaler at udføre titrering af antistoffer og validering af det nye antistofpanel i et pilotforsøg, hvor alle embryoner pr. Væv samles, for at øge antallet af Celler analyseret pr. Væv.
Udviklingsbiologiens område er blevet revolutioneret med Cre / Lox-metoden, som muliggør permanent mærkning af celler in situ . Denne tilgang opnårVævs- eller celletype -specificitet gennem ekspression af Cre recombinasen under kontrol af en specifik promotor. I vores tilfælde valgte vi at studere ekspressionen af Cre recombinasen under kontrol af promotoren af Csf1r (kolonistimulerende faktor 1 receptor), en vigtig mitogen og vækstfaktorreceptor for makrofager og deres forfædre ved anvendelse af en stamme udviklet af gruppen Af J. Pollard 18 . Fordelen ved en skæbneplanlægningsstrategi baseret på Csf1r-udtryk i forhold til andre offentliggjorte strategier er, at den tillader mærkning af æggeblomme-sac-afledte celler (EMP og makrofager) uden mærkning af nogen føtale HSCs 12 . Cx3cr1 Creert2- stammen kan også mærke æggeblommeceller uden mærkning af HSCs 19 , men det kan kun mærke makrofager og makrofagprekursorer, men det mærker ikke EMP-stamceller 1 . Cx3cr1 Creert2- stammen har samme advarsel som Csf1r
Denne metode kan være vigtig i den nærmeste fremtid for at studere EMP differentieringsveje. Mens EMP'er stammer fra æggeblomme sac endothelium fra E8.5 til E10.5 4, tillader denne metode kun at mærke en brøkdel af forfædrene, der kommer frem mellem E8.5-E9.5. Derfor er en begrænsning af denne metode, at kun en lille del af EMP er mærket, hvilket gør det vanskeligt at analysere i klassiske tab af funktionsstudier med fluxede alleler for cAndidate gener. Alternativt kan sparsom mærkning blive en fordel ved klonale undersøgelser af EMP-differentiering in vivo ved anvendelse af klonal reporter. Ikke desto mindre skal mærkningseffektiviteten karakteriseres for hver floxed reporter eller floxed allel, der anvendes, da rekombinationseffektivitet af floxede konstruktioner afhænger af genomisk locus (floxed alleler) eller Rosa26 reporterkonstruktionen. Faktisk er forskellige Rosa26-reporterlinjer tilgængelige med forskellige promotorer, og det er rapporteret, at Rosa26 tdTomato og Rosa26 mTmG- stamme har højere rekombinationseffektivitet end Rosa26 LSL-eYFP- linjen. Den reportermusestamme, der anvendes i denne protokol, er Rosa26 LSL-eYFP- linje, som ikke kan give oplysninger om den dynamiske proces af forfædringsmognad , der er nævnt i resultatafsnittet. Spørgsmålet om modningsprocessen kan delvist behandles ved hjælp af forskellige reporterstammer som Rosa26 mTmG . I en sådan belastning kan celler distancereUished baseret på den tid der er gået siden rekombinationshændelsen. Alle celler i Rosa26 mTmG- stammen udtrykker membranbundet tdTomato-fluorescerende protein og Cre-rekombination exciserer tdTomatocassetten og muliggør ekspression af membranbundet GFP. Da tdTomato har en lang halveringstid, er celler, der stadig indeholder tdTomato, men som er begyndt at udtrykke GFP (kort efter rekombination), TDTomato + GFP lav / int og kan skelnes fra tdTomato neg GFP + celler, som ikke udtrykker tdTomato længere og Udtrykker højere niveauer af GFP (senere efter rekombination).
Som diskuteret ovenfor er OH-TAM-præparation et kritisk trin for konsekvent at levere tilsvarende doser af OH-TAM mellem eksperimenter og for at reducere tamoxifen-bivirkninger. Samtidig administration af progesteron er også nyttig til at begrænse skadelig virkning af tamoxifen under graviditet. Et andet kritisk element i protokollen er levedygtigheden af single-cellesuspensionenN opnået fra forskellige embryonale væv. Vi opnår normalt> 90% levedygtige celler til flowcytometrisk analyse. For at opnå dette er det kritisk at følge alle trin hurtigt og for at opretholde alle prøver på is efter vævsopsamling. Passende kontroller som ufarvede prøver, enkelt pletter og fluorescerende minus en (FMO) kontroller er nødvendige for at identificere gate grænser og for at kontrollere for spektral overlapning i flerfarvede paneler. Ændringer i antistoffet skal valideres med hensyn til antistoftitrering og spektral overlapning. Endelig skal valget af Rosa26-reporterstammen tilpasses det videnskabelige spørgsmål, der undersøges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Prof Frederic Geissmann og Prof Christian Schulz for indgående drøftelser; Dr Hannah Garner for kritisk læsning af manuskriptet, dr. Xavier Montagutelli og dr. Jean Jaubert og personalet på Institut Pasteur dyreanlæg til støtte med musemestring; Og Pascal Dardenne og Vytaute Boreikaite, en Amgen Scholar, til deres tekniske bistand. Forskning i EGP-laboratoriet finansieres af Institut Pasteur, CNRS, Cercle FSER (FRM og en startpakke fra Institut Pasteur og REVIVE-konsortiet. LI støttes af et ph.d.-stipendium fra REVIVE-konsortiet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
- Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
- Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
- Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
- Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
- Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
- Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
- Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).
