Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry

doi: 10.3791/55305 Published: July 17, 2017

Summary

Terwijl infiltrerende macrofagen continu worden aangeworven op volwassen weefsels uit circulerende precursoren, zitten inwendige macrofagen hun weefsel tijdens ontwikkeling, waar ze worden gehandhaafd zonder verdere input van stamvaders. De voorlopers voor ingezette macrofagen werden recent geïdentificeerd. Hier presenteren wij methoden voor de genetische lotvorming van de ingezeten makrofage stamvaders.

Abstract

Macrofagen zijn professionele fagocyten uit de aangeboren arm van het immuunsysteem. In stabiele toestand worden sessiele macrofagen gevonden in volwassen weefsels waar ze fungeren als frontlinks van infectie en weefselschade. Terwijl andere immuuncellen voortdurend worden vernieuwd van hematopoietische stam- en stamcellen (HSPC) in het beenmerg, is een reeks macrofagen, bekend als inwendige macrofagen, aangetoond dat ze zelfstandig in weefsels zijn gehandhaafd zonder input van beenmerg HSPC's. Deze lijn wordt geïllustreerd door microglia in de hersenen, Kupffer cellen in de lever en Langerhans cellen in de epidermis onder anderen. De darm- en colon lamina propria zijn de enige volwassen weefsels zonder HSPC-onafhankelijke inwendige macrofagen. Recente onderzoeken hebben aangetoond dat inwendige macrofagen afkomstig zijn van de extra-embryonale dooierzak hematopoiesis van stamvader (e) die onderscheiden zijn van foetale hematopoietische stamcellen (HSC). Onder de dooierzak definitieve hematopoiesis, eRythromyeloïde stamvogens (EMP) veroorzaken zowel erythroid en myeloïde cellen, in het bijzonder inwendige macrofagen. EMP worden alleen gegenereerd binnen de dooierzak tussen de E8.5 en E10.5 dagen van ontwikkeling en ze migreren naar de foetale lever zodra de circulatie is verbonden, waar ze zich uitbreiden tot en met elkaar onderscheiden tot minstens E16.5. Hun nakomelingen omvatten erythrocyten, macrofagen, neutrofielen en mastcellen, maar alleen EMP-afgeleide macrofagen blijven tot volwassenheid in weefsels. De transiënte aard van EMP-opkomst en de tijdelijke overlap met HSC-generatie maakt de analyse van deze voorgangers moeilijk. We hebben een tamoxifen-induceerbaar loting protocol op basis van expressie van de macrofage cytokine receptor Csf1r promotor vastgesteld om EMP en afgeleide cellen in vivo door flowcytometrie te karakteriseren.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Er zijn verscheidene opeenvolgende maar overlappende golven van hematopoietische voorlopers tijdens de ontwikkeling waarvan de myeloïde nakomelingen in de volwassenheid blijven. Ten eerste komen unipotente "primitieve" stamvaders op in de muisbloemzak 1 , 2 tussen E7.5-E8.25 en geven aanleiding tot embryonale macrofagen zonder enig monocytisch intermediair. Of macrofagen afgeleid van primitieve stamvaders volharden in de volwassen hersenen, aangezien microglia een onderwerp blijft van actief onderzoek. Ten tweede ontstaan ​​er erythro-myeloïde precursoren (EMP's) in de dooierzak op E8.5, de bloedbaan binnendringen en het embryo coloniseren. EMP's komen uit het geelogenische endothelium van de dooier in een Runx1-afhankelijke endotheel-naar-hematopoietische overgang 3 , 4 . Terwijl EMP kan onderscheiden in macrofagen binnen de dooierzak, koloniseren ze ook de foetale lever vanaf de embryonale dag (E) 9 5 en verschillenTiëren in erythrocyten, megakaryocyten, macrofagen, monocyten granulocyten en mastcellen 6 . De macrofagen die afkomstig zijn van EMP's vertoont proliferatieve capaciteit in ontwikkelings- en volwassen weefsels. Of EMP-afgeleide macrofagen het monocyt-stadium van differentiatie omzeilen, is nog steeds controversieel omdat er weinig bekend is over hun differentieringsroute 7 , 8 . Tenslotte verschijnen hematopoietische stamcellen (HSC's) op E10.5 binnen het embryo dat goed is van het aorta-gonad-mesonephros-gebied en migreert naar de foetale lever. HSC's met langetermijnreplopatiecapaciteit worden pas na E11 gedetecteerd (bij de 42 somite pair-fase) 9 . Daar worden ze uitgebreid en onderscheiden van E12.5 tot definitieve hematopoiesis begint te verschuiven naar het beenmerg, dat de overheersende plaats van bloedcelproductie wordt voor de duur van het postnatale leven 10 .

De spAtiale en temporele overlap in opkomst, evenals gedeelde immunofenotypische markers heeft tot dusver ons vermogen om de specifieke bijdragen van deze golven van embryonale hematopoietische stamvogens te onderscheiden, verholpen. Terwijl zowel EMP als HSC op een Runx1-afhankelijke manier worden gegenereerd en de transcriptiefactor Myb en de groeifactorreceptor Csf1r (Colony-Stimulerende Factor 1 Receptor, ook wel Macrophage Colony Stimulating Factor Receptor) onder andere, uiten, kunnen EMP's onderscheiden worden van HSC's door hun gebrek aan lymfoïde potentieel, zowel in vitro als in vivo , hun gebrek aan langdurig repopulatiepotentieel en gebrek aan oppervlakte-expressie van de afstamingsmarkering Sca- 11 . Genetische kaartvormingsmodellen zijn nodig om macrofage ontogenie te karakteriseren, omdat ze op een celspecifieke en tijdspecifieke manier gericht zijn op embryonale voorlopers. Hier presenteren we het protocol in het laboratorium dat in ons laboratorium wordt gebruikt om tussen de twee lijn te onderscheidenS van macrofagen gevonden in de meeste volwassen weefsels: HSC-afgeleide infiltrerende macrofagen en HSC-onafhankelijke inwendige macrofagen.

Weefsel-ingezette macrofagen zijn teruggevonden naar Myb-onafhankelijke precursorcellen die de cytokine-receptor Csf1r 12 uitdrukken en aanwezig zijn in het embryo bij E8.5-E10.5 met behulp van drie complementaire strategieën voor schematische strategieën 6 . Om de bloedsomloop hematopoiesis te bestuderen zonder het labelen van foetale HSC's, gebruiken we een transgene stam, Csf1r MeriCreMer , die een tamoxifen-induceerbaar fusie-eiwit uitmaakt van 'verbeterde Cre-recombinase en twee muis-oestrogeenreceptoren (Mer-iCre-Mer) onder controle van De Csf1r promotor. Derhalve zal het Cre recombinase actief zijn in Csf1r-expressieve cellen tijdens een beperkt tijdvenster. Wanneer het wordt gebruikt met een reporterstam die een fluorescerend eiwit bevat stroomafwaarts van een lox-STOP-lox cassette (Rosa26 LSL-eYFP ), zal het leiden tot de permanenteGenetische labeling van de cellen die aanwezig zijn op het moment van inductie maar ook van hun nakomelingen. Toediening bij E8.5 van de actieve vorm van tamoxifen, 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), etiketten EMP's en macrofagen, zonder etikettering van dooierzak unipotente "primitieve" stamvogens of foetale HSC's. Daarbij hebben we het immuunfenotype van EMP's en hun nakomelingen tijdens embryonale ontwikkeling gekenmerkt, evenals de bijdrage van geel-afkomstige macrofagen aan de volwassen macrofagepoolen beoordeeld. Verdere werkzaamheden zijn nodig om te karakteriseren of primitieve stamvader-afgeleide macrofagen ook met deze aanpak worden gemerkt en of ze kunnen bijdragen aan volwassen macrofagepoolen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met het goedgekeurde instituut voor dierenwelzijn en gebruik van het Institut Pasteur (CETEA).

1. In Utero Pulse Labeling in Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embryo's

  1. Bereid de voorraadoplossing van 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM, 50 mg / ml) op.
    1. Open de 25 mg injectieflacon van OH-TAM onder het rookgedrag en voeg 250 μL ethanol (100%) toe.
    2. Breng de OH-TAM-oplossing over in een 2 ml microcentrifugebuis met een truncated tip en vortex bij maximale snelheid gedurende 10 minuten.
    3. Sonicate 30 minuten in een sonicatorbad.
    4. Voeg 250 μL PEG-35-ricinusolie toe onder de dampkwaliteit om een ​​50 mg / ml voorraadoplossing te verkrijgen.
      OPMERKING: PEG-35 ricinusolie is een oplosmiddel met amfifiele eigenschappen die hydrofobe moleculen binden en ze oplosbaar maken in waterige oplosmiddelen.
    5. Vortex gedurende ongeveer 5 minutenBij maximale snelheid en soniceren 30 minuten in een sonicatorbad.
    6. Aliquot 90 μL (4,5 mg) per microcentrifugebuis (1 portie per injectie).
    7. Bewaar bij 4 ° C gedurende 1 week of bij -20 ° C voor de lange termijn zoals eerder beschreven 13 .
  2. Bereid de voorraadoplossing van Progesteron (10 mg / ml)
    1. Voeg 250 μl 100% Ethanol toe aan 25 mg progesteron om een ​​suspensie van 10 mg / 100 μl onder de rook te bereiden. Vortex zachtjes.
    2. Voeg 2250 μL geautoclaveerde zonnebloemolie toe om 10 mg / ml progesteronoplossing onder de kap te maken.
    3. Vortex gedurende ongeveer 5 minuten bij maximale snelheid, aliquot en opslaan bij 4 ° C. Merk op dat de oplossing duidelijk is bij het opslaan.
  3. Tamoxifen toediening
    OPMERKING: Embryonale ontwikkeling werd geschat gezien de dag van de vorming van vaginale stekker als Embryonische dag (E) 0,5. Recombinatie wordt geïnduceerd door een enkele injectie bij E8.5In zwangere Csf1r MeriCreMer vrouwen 12 . Supplement OH-TAM met 37,5 μg per g Progesteron om abortuspercentages te verminderen na toediening van tamoxifen. Injecteer om 1 uur (voor de vaginale stekker die in de ochtend wordt waargenomen).
    1. Op de ochtend van de injectie soniceren een aliquot van de OH-TAM oplossing gedurende 10 minuten (of tot volledig geresuspendeerd).
    2. Voeg 360 μL NaCl 0,9% onder de dampvorm toe om een ​​10 mg / ml OH-TAM oplossing en vortex grondig te verkrijgen. Soniceren tot de oplossing helder is en volledig geresuspendeerd is (minstens 30 minuten).
    3. Voorverwarmen progesteron tot kamertemperatuur.
    4. Meng 450 μL OH-TAM en 225 μL progesteron in een microcentrifugebuis. Vortex.
    5. Soniceer tenminste 10 minuten en laad op een 1 ml spuit met een 25G naald.
    6. Weeg de zwangere vrouw in de dierenfaciliteit ( Csf1r MeriCreMer- vrouwtjes zijn in een inheemse FVB-genetische achtergrond en typisch wegenEn 25 en 33 g).
    7. Voer een intraperitoneale injectie uit door het berekende volume langzaam in de muis te injecteren. Nadat u de naald hebt ingetrokken, duwt u voorzichtig op de punctuurwond en masseer de buik om de OH-TAM te verdelen.
      OPMERKING: De dosis OH-TAM is 75 mg / kg en de Progesteron dosis is 37,5 mg / kg. Tabel 1 geeft het volume in zwangere vrouwtjes te injecteren.
</ Tr>
Muis gewicht (g) Totaal volume te injecteren uit de mix (μL)
25 281
26 292
27 303
28 315
29 326
30 338
31 348
32 360
33 371
34 382
35 394

Tabel 1: Injectievolume van 4-OH-tamoxifen (OH-TAM). Volume vereist voor een enkele injectie bij E8.5 van 75 μg per g (lichaamsgewicht) van OH-TAM aangevuld met 37,5 μg per g progesteron.

2. Dissectie van de Yolk Sac (YS) en Fetale Lever (FL)

OPMERKING: Sterke steriele technieken zijn niet nodig bij het manipuleren van embryo's, tenzij ze gebruikt worden voor de lange termijncultuur. Desalniettemin moet het werkgebied schoon zijn en bedekt zijn met folie onder absorberend papier.

  1. Bereid ijskoude fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) en digestiemix (PBS bevattende 1 mg / ml collagenase D, 100 U / ml deoxyribonuclease I (DNase I) en 3% foetaal runder serum).
  2. Offer zwangere vrouwtjes door cerVical dislocatie op de vereiste zwangerschapsdag ( bijv. Embryonale stadium E10.5).
  3. Knip de huid net boven de geslachtsdelen en maak een kleine incisie aan de middellijn met een schaar. Trek de huid naar het hoofd om de lichaamsmuur volledig zonder bont bloot te stellen. Snij de buikspieren om de inwendige organen bloot te leggen en duw de darm om de twee baarmoederhoren bloot te leggen.
  4. Met middelste stompe pennen, pak de vetstoot aan de ovary vast en trek de baarmoeder voorzichtig. Snij op de baarmoederhalssnelheid van de baarmoederhoorns en haal de hoorn uit de buikholte. Verwijder het vetpaneel om de baarmoederhoorn volledig te bevrijden en snijd de hoornen van de eierstok aan weerszijden.
  5. Zet de hoornen in ijskoude PBS in een 10 mm Petri schotel. Snijd de baarmoeder spierlagen in één uiteinde (cervicale einde) en schuif een fijne schaar tussen de spierlaag en het decidale weefsel om de embryo's met het omliggende decidale weefsel los te maken.
    OPMERKING: Spier heeft de neiging om snel afte te contractenR de winning, dus deze stap moet zo snel mogelijk zijn.
  6. Gebruik een paar fijne tang om het membraan van de Reichert en de placenta af te snijden.
  7. Verwijder de dooierzak voorzichtig en plaats deze in een 24-putjes weefselkweekplaat met 0,5 ml verteringsmengsel.
    OPMERKING: bij deze stap kan embryonaal bloed worden verzameld.
    1. Onmiddellijk na het scheiden van de navel- en vitelline-vaten, verplaats het embryo in een 12-putjes weefselkweekplaat met 10 mM ijskoud ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Decapiteer het embryo met behulp van een scherpe fijne schaar, proberen zo veel mogelijk weefselverdunning te beperken. Incubeer op ijs gedurende 10-15 minuten en haal de EDTA op die het bloed bevat.
  8. Verwijder de amnion rond het embryo.
  9. Voor fasen <E11.5, tel het aantal somietparen voor betere instalatie van embryo's en een betere tijdoplossing (elk somietpar ontwikkelt zich in ~ 1 uur 30 min).
  10. Snijd het hoofd van het embryo onsIngangen of fijne scharen. Breng het kop naar een 24-putjes plaat met 0,5 ml spijsverteringskombinat.
    OPMERKING: De neuroectoderm en de hersenen in latere fases worden verder gedissecteerd voor flowcytometrie analyse; Verwijder de omringende vasculaire plexus zorgvuldig.
  11. Knip het embryo boven de achterkant en verwijder de voorbenen.
  12. Om de lever te isoleren, open de thorax met een paar fijne tangjes. Knijp voorwaarts aan het hart en trek zachtjes terwijl u de tweede tang gebruikt om de organen van het lichaam te bevrijden.
    1. Verdeel de foetale lever uit het hart en de darm zorgvuldig. Breng de foetale lever over naar een 24-putjes plaat met 0,5 ml spijsvertering mengsel. Controleer de overdracht zorgvuldig onder de dissectiemicroscoop.
  13. Verzamel het staartgebied (of elk ander embryo-onderdeel) voor genotypering door polymerase kettingreactie-analyse (PCR).
    OPMERKING: Andere weefsels en organen kunnen worden geoogst uit E10.5 embryo's voor een soortgelijke analyse met behulp van flowcytometrie. Bloed, hoofd skiN, aorta-gonad-mesonephros regio (AGM), hart en neuroectoderm kunnen bij E10.5 verzameld worden. In latere stadia kan ook long, nier, milt en alvleesklier worden verzameld. Een gedetailleerde beschrijving van de dissectie van de algemene vergadering in verschillende ontwikkelingsfasen is eerder beschreven 14 .

3. Verwerking van embryonale weefsels voor flowcytometrie

  1. Incubeer de organen (in de spijsverteringskombuis) gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  2. Breng de weefsel- en enzymatische oplossing over op een 100 μm filter, geplaatst in een 6-putjes weefselkweekplaat, gevuld met 6 ml FACS-buffer (0,5% Bovine Serum Albumin (BSA) en 2 mM EDTA in 1x PBS). Mechanisch dissociëren door zachtjes te mengen met de zwarte rubberzuiger van een 2 ml spuit om een ​​eenzijdige suspensie te verkrijgen.
    OPMERKING: vanaf nu zijn alle stappen uitgevoerd bij 4 ° C.
  3. Verzamel de celvering met een Pasteur pipette en overbrengen in een 15 ml buis.
  4. SpiN gedurende 7 minuten bij 320 xg bij 4 ° C. Verwijder de supernatant door aspiratie.
  5. Resuspendeer de pellet in 60 μL Fc-blokkerende buffer (CD16 / CD32 blokkerende antilichaam verdund 1/50 in FACS buffer).
    1. Vervolgens 50 μl van de enkelcelsuspensie per putje in een 96-putjesplaat met ronde bodem 96. Incubeer gedurende minstens 15 minuten op ijs.
      OPMERKING: De kleuring kan ook worden uitgevoerd in 5 ml polystyreen FACS buizen bij het hanteren van een klein aantal monsters.
    2. Breng de resterende 10 μL over in een 5 ml polystyreen FACS buis om een ​​pool van de monsters van elk weefsel te verkrijgen. Dit zwembad zal dienen als de controles ( dwz onbeschadigde monsters en fluorescerende minus één (FMO) regelaar voor elke fluorochroom). Breng 50 μL van het zwembad voor elke fluorescerende minus één (FMO) controle (een per fluorochroom) over naar de 96 multi-well plaat.
      OPMERKING: Elke FMO-controle bevat alle fluorochroom-gekoppelde antilichamen uit het antilichaampaneel, behalve de eneDat wordt gemeten FMO's worden gebruikt om grenzen te identificeren en te controleren voor de spectrale overlap in multicolor panelen. Om de variaties in de achtergrond en autofluorescentie tussen verschillende weefsels correct aan te pakken, is het belangrijk om deze controles uit het pool van monsters van elk weefsel te bereiden. De juiste controle op YFP-expressie zijn de monsters van Cre-negatieve embryo's, die worden bevestigd door PCR genotypering.

4. Oppervlakte-antigeenverf

  1. Bereid de antilichamenmix in FACS-buffer (tabel 2). Bereid 50 μl antilichamenmix per monster op.
    1. Gebruik de volgende fluorochroom-gekoppelde antilichamen: anti-CD45.2 (kloon 104); Anti-CD11b (kloon M1 / ​​70); Anti-F4 / 80 (kloon BM8); Anti-AA4.1 (kloon AA4.1); Anti-kit (kloon 2B8); En anti-Ter119 (clone Ter119).
    2. Bereid zes antilichamen mixen voor de FMO controles in FACS buffer. Bereid 50 μl antilichamenmix per controlemonster op.
      NEETE: De verdunning van antilichamen in de antilichamenmix is ​​twee keer meer geconcentreerd dan de uiteindelijke concentratie die in de materiaaltafel wordt aangegeven. Voor een paneel met zes fluorochroom-gekoppelde antilichamen worden 6 FMO controles bereid. Tabel 2 geeft de samenstelling van het antilichaammengsel en FMO-controles voor één buis.
Volume (μL) van antilichaam (eindvolume 50 μl)
Antilichaam Clone Antibody Mix FMO CD45.2 FMO CD11b FMO F4 / 80 FMO AA4.1 FMO Kit FMO Ter119
anti-CD45.2 104 1 0 1 1 1 1 1
anti-CD11b M1 / 70 0.5 0.5 0 0.5 0.5 0.5 0.5
anti-F4 / 80 BM8 1 1 1 0 1 1 1
anti-AA4.1 AA4.1 1 1 1 1 0 1 1
anti-Kit 2B8 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0.5
anti-Ter119 Ter119 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0
FACS buffer 45.5 46.5 46 46.5 46.5 46 46

Tabel 2: Volume van antilichamen die gebruikt worden voor kleuring en fluorescerende minus één (FMO) controles. Volume (μL) van antilichaam vereist voor een eindvolume van 50 μl.

  1. Voeg 50 μl van het antilichamenmengsel toe aan de monsters in de 96-multiwellplaat (eindvolume tijdens het vlek is 100 μl). Duw twee keer zachtjes omhoog en omlaag en incubeer 30 minuten op ijs.
  2. Spin de 96-multiwellplaat gedurende 7 minuten bij 320 xg bij 4 ° C en wrijf de supernatant af. Resuspenderen in 200 μl FACS buffer.
  3. Herhaal de wasprocedure (stap 4.3) tweemaal met 150 μl FACS-buffer.
  4. Filter de monsters en de controles (FMO's en onbeschadigde poolmonsters) in 5 ml polystyreenbuizen door een 70 μm filter. Bewaar op ijs tot opnemen.

5. Identificatie van EMP's en YS-afgeleide macrofagen door flowcytometrie

OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd met behulp van een 4-flow-flow cytometer eqAfgezogen met een 405 nm violette laser, een 488 nm blauwe laser, een 562 nm gele laser en een rode laser van 638 nm.

  1. Bereid compensatiekralen voor elk gekoppeld antilichaam op volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik onbedekte monsters en compensatiekralen om de laserintensiteiten te optimaliseren.
  2. Om grenzen te identificeren, gebruik FMO (Fluorescentie minus één) controles voor elk antilichaam.
  3. Om dode cellen uit te sluiten, voeg 1 μL DAPI (1 mg / ml) toe aan de buis (bevattende 200 μL gekleurde cel suspensie) 1 min voor de aankoop. Gebruik het sterke DAPI-signaal en de forward-scattered parameter (FSC) om uitsluiting van dode cellen en puin te voorkomen.
    OPMERKING: Gebruik software van de flow cytometer om poorten te trekken tijdens de overname. Compensatiematrix en analyse kunnen worden uitgevoerd na het verzamelen van een monster door gebruik te maken van andere commercieel beschikbare software.
  4. Gebruik voorwaartse en zijspreiding (FSC vs SSC) om livecellen en dubbele diskriminatie uit de totale gebeurtenissen uit te voeren.
  5. Creëer fluorescentie dot plots in log-axis en teken dochter poorten om eerst erythrocyten (Ter119 + ) uit te sluiten en vervolgens voorvadercellen (Kit + ) en hematopoietische cellen (CD45 + Kit neg ) te identificeren (zie figuur 1 ).
  6. Creëer fluorescentiehistogrammen om de etiketteringsefficiëntie van YFP tussen de verschillende geïdentificeerde populaties in de YS ( Figuur 2 ), de foetale lever ( Figuur 3 ) en de hersenen te kwantificeren ( Figuur 4 ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Genetische kaartvorming werd bereikt door toediening bij E8.5 van OH-TAM in Csf1r-Mer-iCre-Mer-vrouwtjes met paren met een Rosa26-LSL-eYFP-reporter. In aanwezigheid van OH-TAM leidt afscheiding van de stopcassette naar de permanente expressie van YFP in de cellen die Csf1r uitdrukken. We verzamelden twee hematopoietische weefsels: de dooierzak en de foetale lever en een niet-hematopoietisch weefsel, de neuroectoderm, uit de embryo's bij E10.5. Enkel-cel suspensies werden verkregen door enzymatische en mechanische dissociatie en monsters werden geanalyseerd door stromingscytometrie na kleuring met fluorescente-gekoppelde antilichamen. Na uitsluiting van dode cellen en doubletten werden enkele cel suspensies geanalyseerd ( Figuur 1 ). Alle poorten werden gedefinieerd met behulp van Fluorescence Minus One (FMO) controles. Het is aan te raden om ook een erythrocyte-uitsluiting (Ter119 + -cellen) uit te voeren om de helderheid van de analyse te verbeteren ( Figuur 1B + CD45 neg ; Kit + CD45 laag en Kit neg CD45 + ( Figuur 1 ). Progenitors werden verder geanalyseerd op basis van hun expressie van AA4.1 ( Figuren 2-4 ). Inderdaad, AA4.1 is een oppervlaktemerker die de verrijking van de stamvaderbevolking in erythromyeloïde progenitors in de dooierzak toelaat, zoals aangetoond in kolonievormende assays 15 . Zodra de populaties van belang zijn geïdentificeerd, kwantificeren we de YFP-etiketteringsefficiëntie in elke populatie met behulp van histogrammen. Onder de blikzak Kit + voorlopers bevatten zowel CD45 neg ( Figuur 2A ) als CD45 lage ( Figuur 2B ) celpopulaties AA4.1 + YFP + cellen. Echter, AA4.1 + YFP <Sup> + cellen in de lever en de hersenen worden alleen gevonden in de Kit + CD45 lage voorloperpopulatie ( Figuur 3B en 4B ). Aangezien de hersenen niet een actieve plaats zijn van hematopoiesis, kunnen voorlopers die in dit weefsel zijn gevonden overeenkomen met circulerende stamvogens. Dit suggereert ook een proces van voorloper rijping als ze migreren van de dooierzak naar de foetale lever en de perifere weefsels. Kit + voorlopers drukken eerst AA4.1 uit, onafhankelijk van CD45 expressie, maar tegen de tijd dat ze circulatie en de foetale lever bereiken, laten alle AA4.1 + YFP + voorlopers detecteerbare niveaus van celoppervlak CD45 uit. Macrofagen, gedefinieerd als F4 / 80 heldere CD11b + , werden gevonden in de Kit neg CD45 + poort ( Figuur 2-4 ). Macrofagen in de E10.5-dooierzak, lever en hersenen werden efficiënt gemarkeerd (60 tot 80% van F4 / 80 lichte CD11b + cellen zijn YFP + ) b U een enkele OH-TAM toediening bij E8.5 ( Figuur 2C , 3C en 4C ).

Om de efficiëntie van de etikettering tussen rommel te vergelijken, raden we aan een interne controle voor de recombinatie-efficiëntie te gebruiken. Variabiliteit in het niveau van expressie van de verslaggever kan tussen experimenten waargenomen worden door veranderingen in ontwikkelingstijd tussen rommel en muisstammen wanneer OH-TAM in utero geïnjecteerd wordt. Daarom raden wij aan dat embryo-opstelling van E8.5 tot E11.5 embryo's wordt uitgevoerd door middel van somiet pair counting. In dit protocol stellen wij voor om de efficiëntie van de etikettering in de hersenen-ingezette macrofagen (microglia) te gebruiken als referentie om de efficiëntie van Cre-recombinatie tussen verschillende experimenten en stammen te vergelijken ( Figuur 4C ). Andere ingezette macrofagen zouden kunnen worden gebruikt, echter microglia waren de eerste cellen die beschreven werden als ooievaar-afkomstige macrofagenEf "> 16 en zij vertegenwoordigen de meest voorkomende populatie van weefsel residentiële macrofagen bij E10.5. Zo kan de YFP-etikettering in microglia worden gebruikt om de noodlot-efficiëntie in elk experiment te beoordelen en gegevens uit verschillende nestsoorten te vergelijken.

Figuur 1
Figuur 1: Gaatstrategie om stamcellen te identificeren (Kit + CD45 neg en Kit + CD45 laag ) en gedifferentieerde hematopoietische cellen (Kit neg CD45 + ). ( A ) Discriminatie van levende cellen en singlets wordt uitgevoerd met behulp van DAPI-kleuring en Forward and Side scatter (FSC / SSC) parameters. ( B ) Na afloop van rode bloedcelcellen (Ter119 neg ) worden drie populaties van belanghebbende cellen geïdentificeerd op basis van expressie van celoppervlakken van Kit en CD45: Kit + CD45 neg ; Kit + CD45 laag neg CD45 + cellen. ( C ) Csf1r-expressiecellen aanwezig wanneer OH-TAM geïnjecteerd wordt en hun nakomelingen worden geïdentificeerd in Cre-recombinase positieve embryo's als expressie van YFP in vergelijking met de Cre-recombinase-negatieve embryo's (bevestigd later door polymerase ketenreactie-analyse, PCR). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Efficiënt etikettering in de dooierzak van E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryo - spul met OH-TAM bij E8.5. ( A ) Kit + CD45 negcellen zijn gated op basis van Kit- en CD45-expressie op levende dooierzakcellen (blauwe poort, linker paneel). AA4.1 en Kit uitdrukking op Kit + CD45 neg cellen. BluE poort bevat AA4.1 + Kit + CD45 neg cellen (middenpaneel). Vergelijking van YFP etikettering AA4.1 + Kit + CD45 negatieve cellen (rechter paneel) in Cre negatieve controles (zwart) en Cre positieve monsters (groen). Histogrammen vertegenwoordigen het percentage cellen (y-as) positief voor YFP-signaal (x-as). ( B ) Kit + CD45 lage cellen zijn gated op basis van Kit en CD45 expressie (blauwe poort, linker paneel). AA4.1 en Kit expressie op Kit + CD45 lage cellen. Blauwe poort omsluit EMP, zoals gedefinieerd als AA4.1 + Kit + CD45 lage cellen (middenpaneel). Vergelijking van YFP-etikettering in AA4.1 + Kit + CD45 lage cellen (rechter paneel) in Cre negatieve controles (zwart) en Cre positieve monsters (groen). Histogrammen vertegenwoordigen het percentage cellen (y-as) positief voor YFP-signaal (x-as). ( C ) Hematopoietische cellen worden gedefinieerd als Kit neg CD45 neg CD45 + cellen. Macrofagen worden gedefinieerd als F4 / 80 lichte CD11b + cellen (middenpaneel). Vergelijking van YFP-etikettering in F4 / 80 heldere CD11b + macrofagen (rechter paneel) in Cre negatieve controles (zwart) en Cre positieve monsters (groen). Histogrammen vertegenwoordigen het percentage cellen (y-as) positief voor YFP-signaal (x-as). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Etiketteringsefficiëntie in de lever van E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryo - spul met OH-TAM bij E8.5. ( A ) Kit + CD45 negcellen zijn gated op basis van Kit en CD45Expressie op levende levercellen (blauwe poort, linker paneel). AA4.1 en Kit uitdrukking op Kit + CD45 neg cellen. Blauwe poort bevat AA4.1 + Kit + CD45 neg cellen (middenpaneel). Vergelijking van YFP etikettering AA4.1 + Kit + CD45 negatieve cellen (rechter paneel) in Cre negatieve controles (zwart) en Cre positieve monsters (groen). Histogrammen vertegenwoordigen het percentage cellen (y-as) positief voor YFP-signaal (x-as). ( B ) Kit + CD45 lage cellen zijn gated op basis van Kit en CD45 expressie (blauwe poort, linker paneel). AA4.1 en Kit expressie op Kit + CD45 lage cellen. Blauwe poort omsluit EMP, zoals gedefinieerd als AA4.1 + Kit + CD45 lage cellen (middenpaneel). Vergelijking van YFP-etikettering in AA4.1 + Kit + CD45 lage cellen (rechter paneel) in Cre negatieve controles (zwart) en Cre positieve monsters (groen). Histogrammen vertegenwoordigen het percentage vanCellen (y-as) positief voor YFP signaal (x-as). ( C ) Hematopoietische cellen zijn gedefinieerd als Kit neg CD45 + en gaten in blauw (linker paneel). F4 / 80 en CD11b expressie op Kit neg CD45 + cellen. Macrofagen worden gedefinieerd als F4 / 80 lichte CD11b + cellen (middenpaneel). Vergelijking van YFP-etikettering in F4 / 80 heldere CD11b + macrofagen (rechter paneel) in Cre negatieve controles (zwart) en Cre positieve monsters (groen). Histogrammen vertegenwoordigen het percentage cellen (y-as) positief voor YFP-signaal (x-as). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Etiketteringsefficiëntie in de hersenen van E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospuGelinkt met OH-TAM bij E8.5. ( A ) Kit + CD45 negcellen zijn gated op basis van Kit en CD45 expressie op levende hersencellen (blauwe poort, linker paneel). AA4.1 en Kit uitdrukking op Kit + CD45 neg cellen. Blauwe poort bevat AA4.1 + Kit + CD45 neg cellen (middenpaneel). Vergelijking van YFP etikettering AA4.1 + Kit + CD45 negatieve cellen (rechter paneel) in Cre negatieve controles (zwart) en Cre positieve monsters (groen). Histogrammen vertegenwoordigen het percentage cellen (y-as) positief voor YFP-signaal (x-as). ( B ) Kit + CD45 lage cellen zijn gated op basis van Kit en CD45 expressie (blauwe poort, linker paneel). AA4.1 en Kit expressie op Kit + CD45 lage cellen. Blauwe poort omsluit EMP, zoals gedefinieerd als AA4.1 + Kit + CD45 lage cellen (middenpaneel). Vergelijking van YFP-etikettering in AA4.1 + Kit + CD45 laag C ) Hematopoietische cellen zijn gedefinieerd als Kit neg CD45 + en gaten in blauw (linker paneel). F4 / 80 en CD11b expressie op Kit neg CD45 + cellen. Macrofagen worden gedefinieerd als F4 / 80 lichte CD11b + cellen (middenpaneel). Vergelijking van YFP-etikettering in F4 / 80 heldere CD11b + macrofagen (rechter paneel) in Cre negatieve controles (zwart) en Cre positieve monsters (groen). Histogrammen vertegenwoordigen het percentage cellen (y-as) positief voor YFP-signaal (x-as). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De verschillende golven van hematopoietische precursorcellen overlappen gedeeltelijk over een kort tijdsbestek, waardoor de analyse van de bijdrage van elke golf van ontwikkelingshematopoiesis aan immuuncellen technisch zeer uitdagend is.

Tamoxifen-induceerbare Cre-systemen bieden de mogelijkheid om specifieke cellen op een temporele induceerbare manier te merken en lijnanalyse uit te voeren in embryo's of volwassenen, zonder de noodzaak van ex vivo of in vitro- cultuur of transplantatie. Bij tamoxifen-induceerbare Cre-stammen wordt een fusie-gen gecreëerd tussen een bacterieel Cre recombinase en een mutante vorm van het ligand bindende domein van de menselijke oestrogeen receptor (CRE-ER) of tussen een verbeterde een-punt mutant Cre en twee muis oestrogeen receptoren (Mer-icre-Mer). Fusie van Cre met oestrogeenreceptoren leidt tot de cytoplasmatische sequestratie van Cre door Hsp90, waardoor nucleaire Cre-gemedieerde recombinatie wordt voorkomen. Tamoxifen (TAM) wordt gemetaboliseerd door thLever in 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), zijn actieve metaboliet met hoge bindingsaffiniteit voor oestrogeenreceptor. OH-TAM binding aan de fusie Cre leidt tot de verstoring van de interactie met Hsp90, waardoor de translocatie ervan mogelijk is op de kern en initiatie van Cre-gemedieerde recombinatie. Injectie van TAM of OH-TAM in de utero in zwangere vrouwen heeft aangetoond dat recombinatie in het ontwikkelende embryo wordt geactiveerd. De toediening van Tamoxifen tijdens de zwangerschap kan leiden tot abortus en vermindert dus de grootte van het nest, maar voorkomt ook de geboorte indien deze na middergeboorte afgeleverd wordt. In dat geval dient de levering van een pup door een keizersnede te worden verricht. Om tamoxifen effecten tijdens de zwangerschap tegen te gaan, aanvullen we de OH-TAM-toediening met een halve dosis progesteron om het overleving van embryo's te verbeteren en het risico op abortussen te verminderen 17 .

Verschillende routes kunnen worden gebruikt om TAM of OH-TAM in zwangere vrouwen te leveren. Momenteel mondelinge gavaGe of intra peritoneale (ip) injectie wordt gebruikt voor tamoxifen. OH-TAM heeft het voordeel om direct beschikbaar te zijn, omdat het niet nodig heeft om door de lever van de zwangere dam te worden gemetaboliseerd. Hoewel tamoxifen erg makkelijk in maïsolie kan oplossen, is OH-TAM zeer moeilijk te bereiden met dezelfde techniek en resulteert in een emulsie. Dit is een beperkingstap in het gebruik van OH-TAM voor in de buitenpuls -etikettering. We hebben het protocol voor de bereiding van OH-TAM ontwikkeld, ontwikkeld door de groep JF Nicolas 13 , waar zij PEG-35-castorolie gebruiken, een oplosmiddel met amfifiele eigenschappen om OH-TAM te solubiliseren, omdat tamoxifenoplossing een van de meest kritische stappen is In de procedure. Dit zorgt voor een reproduceerbare en optimale bereiding van OH-TAM en verlaagt de tijd van tamoxifenbereiding aanzienlijk. Verder is het nodig om de concentratie van OH-TAM aan te passen bij het injecteren van verschillende induceerbare Cre stammen. De combinatie van een levensvatbaarheidsverf (DAPI) en grootte (FSC) is cruciaal om respectievelijk dode cellen en cellulaire puin te verwijderen. Dode cellen en puin zijn zeer autofluorescerend in de meeste van de violette, blauwe en rode laser detectoren, en kunnen de flow cytometrische analyse belemmeren. Verder raden wij u aan om de cellen niet te bepalen na het vleken voorafgaand aan de analyse met de flow cytometer. Fixatie kan leiden tot veranderingen in celmorfologie en zorgt daardoor voor moeilijke grootte diskriminatie op basis van Forward and Side Scatter (FSC vs. SSC). Verder zorgt fixatie van monsters met PFA tot een significant verlies van YFP fluorescerende intensiteit.

De belangrijkste beperking binnen dit protocol is dat de populaties niet getest worden op hun functionaliteit en differentiatiepotentieel. Om dit te overwinnen kunnen cellen gesorteerd worden volgens een soortgelijk protocol met behulp van een Fluorescently-activated cell sorter (FACS) om kolonievormende assay uit te voeren. In dit geval moet de procedure onder steriele omstandigheden en het gebruik van foetaal runder serum (FBS) in de FACS-buffer, in plaats van BSA, wordt sterk aanbevolen. De lage etiketteringsefficiëntie die met deze techniek is behaald en het daardoor geringe aantal YFP + cellen van belang per embryonale weefsel is een belangrijke uitdaging in de studie van EMP fenotype. Dit protocol gebruikt een 4-laser flow cytometer. Een flow cytometer met 3 lasers kan ook gebruikt worden, maar het is belangrijk om het antilichaampaneel aan te passen om rekening te houden met de verhoogde spectrale overlap tussen kleurstoffen. Daarnaast is titratie van antilichamen nodig om de juiste concentratie te vinden bij het wijzigen van het antilichaampaneel en we raden aan het uitvoeren van titratie van antilichamen en validatie van het nieuwe antilichamenpaneel in een proefexperiment waarbij alle embryo's per weefsel worden samengevoegd om het aantal Cellen geanalyseerd per weefsel.

Het gebied van ontwikkelingsbiologie is gedreven door de Cre / Lox-methode, waardoor blijvende etikettering van cellen in situ mogelijk is . Deze aanpak bereiktWeefsel- of celtype -specificiteit door expressie van het Cre-recombinase onder de controle van een specifieke promotor. In ons geval hebben we gekozen voor het bestuderen van de expressie van het Cre recombinase onder de controle van de promotor van Csf1r (Colony Stimulating Factor 1 Receptor), een belangrijke mitogene en groeifactor receptor voor macrofagen en hun voorvaders, met behulp van een stam ontwikkeld door de groep Van J. Pollard 18 . Het voordeel van een strategie op het gebied van strategieën op het gebied van de strategie, gebaseerd op Csf1r-expressie in vergelijking met andere gepubliceerde strategieën, is dat het de etikettering van dooierzak-afkomstige cellen (EMP en macrofagen) zonder etikettering van foetale HSC's 12 mogelijk maakt . De Cx3cr1 Creert2 stam kan ook de dooiercellencellen noemen zonder HSCs 19 te labelen, maar het kan alleen macrofagen en macrofage precursoren markeren, maar het label EMP-progenitors 1 niet . De Cx3cr1 Creert2 stam heeft dezelfde caveat als de Csf1r MerCreMer 16 als Kit MerCreMer 20 , worden perifeer bloedcellen altijd gemarkeerd bij volwassenen, zij het met een zeer lage efficiëntie, waardoor de labeling van HSC's tijdens de ontwikkeling wordt aangetoond. Verder Kit MerCreMer lot mapping labels dooierzak Kit + SCA1 + voorlopers terwijl EMP zijn Kit + SCA1 negatieve 11. De Csf1r MeriCreMer stam is geen inbraak maar het werd gegenereerd door klassieke additieven transgenese, dus de expressie van de Cre kan de endogene expressie van Csf1r niet volledig herhalen. Dit heeft echter het voordeel om eventuele ontwikkelingsfouten te voorkomen die het gevolg zijn van heterozygote expressie van Csf1r. Dit is een belangrijke factor om rekening te houden bij het analyserenAndere strategieën voor het vaststellen van strategieën voor ontwikkeling van hematopoiesis, zoals Runx1 MerCreMer , Kit MerCreMer en Cx3cr1 CreERT2 , waar de induceerbare Cre in de endogene locus wordt ingevoegd. Voor zowel Runx1 MerCreMer als Kit MerCreMer zijn ontwikkelingshematopoietische defecten beschreven in heterozygote embryo's. Collectief, laat de methode die hier wordt gepresenteerd, de EMP-biologie van de dooierzak onderzoeken tijdens de ontwikkeling en ook de oogzak-afgeleide macrofagen die worden gevonden in volwassen weefsels en onderscheiden van HSC-afgeleide macrofagen. Dit zal ons huidige begrip van deze lijn van ingezeten macrofagen en hun specifieke functies in volwassenheid verbeteren. De immunofenotypische karakterisering van EMP's is recentelijk verbeterd met behulp van celsorterings- en kolonievormende assays, waarbij wordt aangetoond dat de dooierzak EMP specifiek expressie CD41 en CD16 / 32 in vroege ontwikkelingsstadia 11 . Echter, de specificiteit van expressie van CD41En CD16 / 32 heeft verdere karakterisering van E10.5 nodig, vooral in de foetale lever niche, met behulp van noodlot-mapping modellen. Inderdaad, of CD41- en CD16 / 32-expressie nog steeds specifiek is voor EMP in vergelijking met foetale HSC's en HSC-afgeleide stamvogens in de E10.5- tot E14.5-foetale lever, moet worden toegelicht. De gepresenteerde methode maakt het mogelijk om EMP gegenereerd in de dooierszak te merken en te volgen tijdens embryonale ontwikkeling en zal bijdragen tot een meer gedetailleerde karakterisering van EMP fenotype wanneer ze de foetale lever zaaien.

Deze methode kan in de nabije toekomst belangrijk zijn om EMP-differentiatiepaden te bestuderen. Terwijl EMP's voortkomen uit het dooierzakendothotelium van E8.5 tot E10.5 4, kan deze methode alleen een fractie van de voorlopers markeren die zich voordoen tussen E8.5-E9.5. Daarom is een beperking van deze methode dat slechts een kleine fractie van EMP gemerkt is, waardoor de analyse in klassieke studie met verlies van functie moeilijk wordt uitgevoerd met gevlochten allelen voor cAndidate genen. Als alternatief kan geringe etikettering een voordeel worden in clonale studies van EMP-differentiatie in vivo , met behulp van klonale reporter. Desalniettemin moet de etiketteringsefficiëntie worden gekenmerkt voor elke gevlochten reporter of gevlokte allel die wordt gebruikt, aangezien de recombinatie-efficiëntie van floxed constructs afhankelijk is van genomische locus (floxed allelen) of het Rosa26 reporterconstruct. Inderdaad, verschillende Rosa26-reporterlijnen zijn verkrijgbaar bij verschillende promotors en er wordt gemeld dat Rosa26 tdTomato en Rosa26 mTmG- stam een ​​hogere recombinatie-efficiëntie hebben dan de Rosa26 LSL-eYFP- lijn. De reporter muisstam die in dit protocol wordt gebruikt, is de Rosa26 LSL-eYFP- lijn, die geen informatie kan verstrekken over het dynamische proces van rijpingsverlies, genoemd in de resultaten sectie. De kwestie van rijpingsproces kan gedeeltelijk worden aangepakt door gebruik te maken van verschillende reporterstammen zoals de Rosa26 mTmG . In zulke spanningen kunnen cellen zich verspreidenOpgewekt op basis van de tijd die sinds het recombinatiegebeurtenis is verstreken. Alle cellen in het Rosa26 mTmG- strain express membraan gebonden tdTomato fluorescent eiwit en Cre recombinatie exciseert de tdTomato cassette en maakt het mogelijk expressie van membraan gebonden GFP. Aangezien tdTomato een lange halveringstijd heeft, zijn cellen die nog steeds TDTomato bevatten maar de GFP (kort na recombinatie) begonnen te zijn, TDTomato + GFP laag / int en kan worden onderscheiden van tdTomato neg GFP + cellen die geen TDTomato meer uitdrukken en Hogere niveaus van GFP (later na recombinatie) uitdrukken.

Zoals hierboven besproken is OH-TAM-bereiding een kritische stap om consistente doses OH-TAM tussen experimenten te leveren en tamoxifen bijwerkingen te verminderen. Progesteron co-toediening is ook handig om het schadelijke effect van tamoxifen tijdens de zwangerschap te beperken. Een ander kritisch element van het protocol is de levensvatbaarheid van de single-cell suspensioN verkregen uit verschillende embryonale weefsels. We verkrijgen normaal gesproken> 90% levensvatbare cellen voor flowcytometrische analyse. Om dit te bereiken is het van cruciaal belang om alle stappen snel te volgen en alle monsters op ijs na weefselverzameling te onderhouden. Geschikte controles zoals onbeschadigde monsters, enkele vlekken en fluorescerende minus één (FMO) controles zijn nodig om de grenzen te identificeren en om de spectrale overlap in veelkleurige panelen te controleren. Veranderingen in het antilichaam moeten worden gevalideerd in termen van antilichaamtitratie en spectrale overlap. Tenslotte moet de keuze van de Rosa26 reporter stam worden aangepast aan de wetenschappelijke vraag die wordt onderzocht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken prof Frederic Geissmann en prof Christian Schulz voor inzichtige discussies; Dr Hannah Garner voor kritisch lezen van het manuscript, Dr Xavier Montagutelli en Dr Jean Jaubert en het personeel van de Institut Pasteur-dierfaciliteit ter ondersteuning van de veeteelt; En Pascal Dardenne en Vytaute Boreikaite, een Amgen Scholar, voor hun technische bijstand. Onderzoek in het EGP-laboratorium wordt gefinancierd door de Institut Pasteur, de CNRS, de Cercle FSER (FRM en een startpakket van het Institut Pasteur en het REVIVE-consortium. LI wordt ondersteund door een PhD-genootschap van het REVIVE-consortium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 Straight Forceps Fine Science Tools 11251-20
MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors  Fine Science Tools 15371-92
8.5 cm straight scissors Fine Science Tools 14090-09
Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) BD Pharmingen 553355 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) Sony 1149120 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) eBioscience 17-5892 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) Biolegend 560512 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) BD Pharmingen 123137 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) BD Pharmingen 552850 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) BD Biosciences 553142
PBS 1x Fischer Scientific 12559069
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 11570506
Collagenase D  Roche 11088882001
Deoxyribonuclease I Sigma D4527-20KU
6-well tissue culture plate Dutscher Dominique 353046
12-well tissue culture plate Dutscher Dominique 353224
24-well tissue culture plate Fischer Scientific 11874235
96 wells U-shape bottom tissue culture plate Dutscher Dominique 353227
 Syringe Plastipak 2 mL  Dutscher Dominique 300185
Nylon grid 100 µm cell strainers Dutscher Dominique 352360
Nylon grid 70 µm cell strainers Dutscher Dominique 352350
15 ml Falcon tubes Dutscher Dominique 352096
Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm Dutscher Dominique 51246
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-500G
(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg Sigma H7904-25MG Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment
Progesterone Sigma P3972 Always use appropriate personal protective equipment
PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) Sigma C5135
Sunflower oil Sigma S5007-250ML
Ethanol  Sigma 24103-1L-R-D Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood
EDTA Sigma E9884-500G
DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) Fischer Scientific 10116287
CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer Beckman Coulter B75408
CytoFLEX Daily QC Fluorospheres Beckman Coulter  B53230
VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL) Beckman Coulter  B22804
FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J The Jackson laboratory 19098
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson laboratory 6148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106, (9), 3004-3011 (2005).
  2. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126, (22), 5073-5084 (1999).
  3. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9, (6), 541-552 (2011).
  4. Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. (2015).
  5. Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139, (19), 3521-3530 (2012).
  6. Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518, (7540), 547-551 (2015).
  7. Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42, (4), 665-678 (2015).
  8. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27, (6), 369-378 (2015).
  9. Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10, (5), 243-252 (1981).
  10. Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
  11. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11, (12), 1892-1904 (2015).
  12. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336, (6077), 86-90 (2012).
  13. Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
  14. Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
  15. Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (1), 134-139 (2005).
  16. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (6005), 841-845 (2010).
  17. Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235, (9), 2603-2612 (2006).
  18. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475, (7355), 222-225 (2011).
  19. Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38, (1), 79-91 (2013).
  20. Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43, (2), 382-393 (2015).
Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iturri, L., Saenz Coronilla, J., Lallemand, Y., Gomez Perdiguero, E. Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55305, doi:10.3791/55305 (2017).More

Iturri, L., Saenz Coronilla, J., Lallemand, Y., Gomez Perdiguero, E. Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55305, doi:10.3791/55305 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter