Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Identifikasjon av erytromyeloidprogenitorer og deres avkom i musembryoen ved flowcytometri

doi: 10.3791/55305 Published: July 17, 2017

Summary

Mens infiltrerende makrofager rekrutteres kontinuerlig til voksent vev fra sirkulerende forløpere, oppdager bosatte makrofager sitt vev under utvikling, der de opprettholdes uten ytterligere inngang fra forfedre. Forfedrene for bosatt makrofager ble nylig identifisert. Her presenterer vi metoder for kartlegging av genetisk skjebne av de residente makrofagprogenitorene.

Abstract

Makrofager er profesjonelle fagocytter fra den innfødte armen til immunsystemet. I steady-state er sessile makrofager funnet i voksne vev hvor de fungerer som frontlinjen sentineler av infeksjon og vevskader. Mens andre immunceller kontinuerlig fornyes fra hematopoietisk stamme og stamceller (HSPC) som ligger i beinmargen, har en rekke makrofager, kjent som bosatt makrofager, vist seg å være selvbetjent i vev uten inngang fra beinmargs HSPCs. Denne linjen er eksemplifisert av mikroglia i hjernen, Kupffer-celler i leveren og Langerhans-celler i epidermiene blant andre. Tarm og tarm lamina propria er de eneste voksne vevene uten HSPC-uavhengige bosatt makrofager. Nylige undersøkelser har identifisert at bosatt makrofager stammer fra den ekstra-embryonale blommesekken hematopoiesis fra stamceller som er forskjellig fra føtal hematopoietiske stamceller (HSC). Blant ølblokkesekke definitive hematopoiesis, eRythromyeloid progenitorer (EMP) gir opphav både til erytroide og myeloidceller, særlig bosatt makrofager. EMP genereres bare i blommesekken mellom E8.5 og E10.5 dager med utvikling, og de migrerer til føtalelever så tidlig som sirkulasjonen er koblet til, hvor de ekspanderer og skiller seg inntil minst E16.5. Deres avkom inkluderer erytrocytter, makrofager, nøytrofiler og mastceller, men bare EMP-avledede makrofager vedvarer til voksenlivet i vev. Den transiente karakteren av EMP-fremveksten og den tidsmessige overlapping med HSC-generasjon gjør analysen av disse forgjengerne vanskelig. Vi har etablert en tamoxifen-inducerbar skjebneprotokollprotokoll basert på ekspresjon av Cf1r-promotoren for makrofag-cytokinreceptor for å karakterisere EMP- og EMP-avledede celler in vivo ved hjelp av flytcytometri.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det er flere påfølgende, men overlappende bølger av hematopoietiske progenitorer under utvikling hvis myeloid avkom forblir i voksen alder. For det første kommer unipotente "primitive" progenitorer frem i muskelgulv sac 1 , 2 mellom E7.5-E8.25 og gir opphav til embryonale makrofager uten noe monocytisk mellomprodukt. Hvorvidt makrofager avledet fra primitive progenitorer vedvarer i den voksne hjernen, da microglia fortsatt er et emne for aktiv etterforskning. For det andre oppstår Erythro-Myeloid Precursors (EMP) i eggeplomme på E8.5, går inn i blodet og koloniserer embryoet. EMPs dukker opp fra blommesekken, hemogen endotel i en Runx1-avhengig endotel-til-hematopoietisk overgang 3 , 4 . Mens EMP kan skille seg inn i makrofager i blommesekken, koloniserer de også føtalelever fra embryonal dag (E) 9 5 og differenererTia til erytrocytter, megakaryocytter, makrofager, monocytter granulocytter og mastceller 6 . Makrofager som stammer fra EMP, utviser proliferativ kapasitet i utviklings- og voksenvev. Hvorvidt EMP-avledede makrofager omgår monocytfasen av differensiering, er fortsatt kontroversiell, da det er lite kjent om deres differensieringsvei 7 , 8 . Til slutt kommer hematopoietiske stamceller (HSCs) til å forekomme i E10.5 innenfor embryoet som er skikkelig fra aorta-gonad-mesonephros-regionen og migrere til føtalelever. HSCs med langsiktig repopulasjonskapasitet blir bare oppdaget etter E11 (på 42 somite pair-scenen) 9 . Der utvider og skilles de fra E12.5 til endelig hematopoiesis begynner å skifte til beinmarg, som blir det overordnede stedet for blodcelleproduksjon i løpet av det postnatale livet 10 .

SpAtial og tidsmessig overlapping i fremveksten, så vel som delte immunfenotypiske markører, har hittil hindret vår evne til å skille mellom de spesifikke bidragene til disse bølgene av embryonale hematopoietiske stamceller. Mens både EMP og HSC genereres på en Runx1-avhengig måte og uttrykker transkripsjonsfaktoren Myb og vekstfaktorreceptoren Csf1r (kolonistimulerende faktor 1-reseptor, også kjent som makrofagkoloniestimulerende faktorreceptor) blant annet, kan EMPs skille seg fra HSCs ved deres mangel på lymfoide potensial, både in vitro og in vivo , deres mangel på langsiktig repopulerende potensial og mangel på overflateekspresjon av linjemarkøren Sca- 11 . Genetiske skjebne-kartleggingsmodeller kreves for å karakterisere makrofag ontogeni siden de tillater målretting av embryonale progenitorer på en celle-spesifikk og tids-spesifikk måte. Her presenterer vi skjebneprotokollen som brukes i laboratoriet for å diskriminere mellom de to linjeneS av makrofager funnet i de fleste voksne vev: HSC-avledede infiltrerende makrofager og HSC-uavhengige bosatte makrofager.

Tissue hørende makrofager har blitt sporet tilbake til Myb-uavhengige forløperceller som uttrykker cytokinreseptor Csf1r 12 og er tilstede i embryo ved E8.5-E10.5 ved hjelp av tre komplementære skjebne-mapping strategier 6. For å studere blommesekk-hematopoiesis uten merking av føtal HSCs, bruker vi en transgen stamme, Csf1r MeriCreMer , som uttrykker et tamoxifen-inducerbart fusjonsprotein av "forbedret" Cre rekombinase og to musestrogenreseptorer (Mer-iCre-Mer) under kontroll av Csf1r-promotoren. Derfor vil Cre rekombinasen være aktiv i Csf1r- ekspresserende celler under et begrenset tidsvindu. Når det brukes med en reporterstamme som inneholder et fluorescerende protein nedstrøms for en lox-STOP-lox-kassett (Rosa26 LSL-eYFP ), vil det føre til permanentEnt genetisk merking av cellene tilstede ved induksjonstidspunktet, men også av deres avkom. Administrasjon ved E8.5 av den aktive formen av tamoxifen, 4-hydroksytamoksifen (OH-TAM), EMPs og makrofager, uten merking av yolkasse unipotente "primitive" progenitorer eller føtal HSCs. Dermed har vi karakterisert immunfenotypen av EMP og deres avkom under embryonisk utvikling, samt vurderte bidraget av eolkulver-avledede makrofager til de voksne makrofagbassengene. Ytterligere arbeid er nødvendig for å karakterisere om primitive stamcelleravledede makrofager også er merket ved hjelp av denne tilnærmingen og om de kan bidra til voksne makrofagbassenger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dyreprosedyrer ble utført i samsvar med godkjent institusjonell dyrepleie og brukskomité for Institut Pasteur (CETEA).

1. I Utero Pulse Labeling i Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embryoer

  1. Forbered stamløsningen av 4-hydroksytamoksifen (OH-TAM, 50 mg / ml).
    1. Under fumehood, åpne 25 mg hetteglass med OH-TAM og tilsett 250 μL etanol (100%).
    2. Overfør OH-TAM-oppløsningen til et 2 ml mikrocentrifugerør med en avkortet spiss og hvirvel ved maksimal hastighet i 10 minutter.
    3. Sonikere 30 minutter i et sonikatorbad.
    4. Tilsett 250 μL PEG-35 ricinusolje under støvfasen for å oppnå en 50 mg / ml stamløsning.
      MERK: PEG-35 ricinusolje er et løsningsmiddel med amfifile egenskaper som binder hydrofobe molekyler og solubiliserer dem i vandige løsningsmidler.
    5. Vortex i ca 5 minVed maksimal hastighet og sonikere 30 min i et sonikatorbad.
    6. Aliquot 90 μL (4,5 mg) per mikrocentrifugerør (1 alikvot per injeksjon).
    7. Oppbevares ved 4 ° C i 1 uke eller ved -20 ° C på lang sikt som tidligere beskrevet 13 .
  2. Forbered stamløsningen av progesteron (10 mg / ml)
    1. Tilsett 250 μl 100% etanol til 25 mg progesteron for å fremstille en 10 mg / 100 μl suspensjon under støvdannelsen. Vortex forsiktig.
    2. Tilsett 2250 μL autoklavert solsikkeolje for å lage 10 mg / ml progesteronløsning under hetten.
    3. Vortex i ca 5 minutter ved maksimal hastighet, alikvot og lagre ved 4 ° C. Vær oppmerksom på at løsningen er klar når den lagres.
  3. Tamoxifen administrasjon
    MERK: Embryonutvikling ble beregnet på grunn av dagen for vaginalpluggdannelse som Embryon dag (E) 0,5. Rekombinasjon induseres ved en enkelt injeksjon ved E8.5Inn i gravide Csf1r MeriCreMer kvinner 12 . Supplement OH-TAM med 37,5 μg pr. G progesteron for å redusere abortfrekvensene etter administrering av tamoxifen. Injiser klokken 13.00 (for vaginale plugg observert om morgenen).
    1. På morgenen til injeksjon, sonikere en alikvot av OH-TAM-oppløsningen i 10 minutter (eller til fullstendig resuspendert).
    2. Tilsett 360 μL NaCl 0,9% under fumehood for å oppnå en 10 mg / ml OH-TAM-løsning og virvelvann grundig. Sonikat til løsningen er klar og fullstendig resuspendert (minst 30 min).
    3. Forvarm progesteron til romtemperatur.
    4. Bland 450 μL OH-TAM og 225 μL progesteron i et mikrocentrifugerør. Vortex.
    5. Sonikere minst 10 minutter og sett på på en 1 ml sprøyte med en 25G nål.
    6. I dyreanlegget veier den gravide kvinnen ( Csf1r MeriCreMer kvinner er i en innfødt FVB genetisk bakgrunn og typisk veier betweEn 25 og 33 g).
    7. Utfør en intraperitoneal injeksjon ved langsom injeksjon av det beregnede volumet i musen. Etter at du har trukket nålen, trykker du forsiktig på punkteringsåret og masserer magen for å distribuere OH-TAM.
      MERK: OH-TAM injeksjonsdosen er 75 mg / kg og progesterondosen er 37,5 mg / kg. Tabell 1 gir volumet til injeksjon i gravide kvinner.
</ Tr>
Mus vekt (g) Totalt volum som skal injiseres fra blandingen (μL)
25 281
26 292
27 303
28 315
29 326
30 338
31 348
32 360
33 371
34 382
35 394

Tabell 1: Injeksjonsvolum av 4-OH-tamoksifen (OH-TAM). Volum som kreves for en enkelt injeksjon ved E8.5 på 75 μg per g (kroppsvekt) av OH-TAM tilsatt 37,5 μg per g progesteron.

2. Disseksjon av eggeplomme Sac (YS) og føtal lever (FL)

MERK: Sterke sterile teknikker er ikke nødvendige når man manipulerer embryoer, med mindre de skal brukes til langsiktig kultur. Arbeidsområdet må likevel være rent og dekket i folie under absorberende papir.

  1. Forbered iskald fosfatbuffet saltløsning (PBS) og fordøyelsesblanding (PBS som inneholder 1 mg / ml kollagenase D, 100 U / ml deoksyribonuklease I (DNase I) og 3% føtalt bovint serum).
  2. Offer gravide kvinner av cerVisk dislokasjon ved den nødvendige svangerskapsdagen ( f.eks. Embryonale stadium E10.5).
  3. Klem huden rett over kjønnsorganene og gjør et lite snitt på midtlinjen med saks. Trekk huden mot hodet for å utelukke kroppsveggen uten pels. Klipp bukemuskulaturen for å eksponere de indre organene og trykk på tarmene for å avsløre de to livmorhornene.
  4. Med mellomstore, stumpe tanger, ta tak i fettplaten festet til eggstokken og dra forsiktig livmoren. Kutt på livmorhalsens livmorhalsnivå og løft hornene fra bukhulen. Fjern fettputen for å fullstendig frigjøre livmorhornene og kutt hornene fra eggstokken på hver side.
  5. Sett hornene i iskald PBS i en 10 mm petriskål. Ta raskt livmorhalsmuskellagene i en ende (cervical end) og skyv fin saks mellom muskellaget og det deciduale vevet for å frigjøre embryoer med det omkringliggende deciduale vevet.
    MERK: Muskel har en tendens til å raskt kontraktsavtaleR ekstraksjonen, så dette trinnet må være så raskt som mulig.
  6. Bruk ett par fine tang for å kutte av Reichert's membran og placenta.
  7. Fjern forsiktig blommesekken og plasser den i en 24-brønners vevskulturplate med 0,5 ml fordøyelsesblanding.
    MERK: Ved dette trinnet kan embryonalt blod oppsamles.
    1. Umiddelbart etter separering av navlestreng og vitellinbeholdere, overfør embryoet til en 12-brønn vevskulturplate inneholdende 10 mM iskald etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Dekapitér embryoet ved hjelp av skarp fin saks, og prøv å begrense så mye som mulig vevsfortynning. Inkubere på is i 10-15 minutter og samle EDTA som inneholder blodet.
  8. Fjern amnion som omgir embryoet.
  9. For trinn <E11.5, teller antall somitepar for bedre oppstart av embryoer og en bedre tidsoppløsning (hvert somitepar utvikler seg i ~ 1 time 30 min).
  10. Kut embryoens hode ossIngangen eller en fin saks. Overfør hodet til en 24-brønn plate med 0,5 ml fordøyelsesblanding.
    MERK: Neurokontoderm og hjerne i senere stadier blir ytterligere dissekert for strømningscytometrianalyse; Fjern nøye den omkringliggende vaskulære pleksus.
  11. Klipp embryoen over bakre limben og fjern forbenene.
  12. For å isolere leveren, åpne thoraxen ved hjelp av et par fine tang. Klem anteriorly til hjertet og trekk forsiktig mens du bruker den andre tangen for å frigjøre organene fra kroppen.
    1. Del forsiktig fosterleveren fra hjertet og tarmene. Overfør fetale leveren til en 24-brønn plate med 0,5 ml fordøyelsesblanding. Overvåk forsiktig overføringen under dissekeringsmikroskopet.
  13. Samle haleområdet (eller en hvilken som helst annen embryodel) for genotyping ved polymerasekjedereaksjonsanalyse (PCR).
    MERK: Andre vev og organer kan høstes fra E10.5-embryoer til en lignende analyse ved hjelp av flytcytometri. Blod, hodeskoN, aorta-gonad-mesonephros region (AGM), hjerte og neuroektoderm kan samles på E10.5. Ved senere stadier kan også lunge, nyre, milt og bukspyttkjertel oppsamles. En detaljert beskrivelse av disseksjonen av generalforsamlingen ved forskjellige utviklingsstadier er tidligere beskrevet 14 .

3. Behandling av embryonale væv for flytcytometri

  1. Inkuber organene (plassert i fordøyelsesblandingen) i 30 minutter ved 37 ° C.
  2. Overfør vævs- og enzymatiske oppløsningen på en 100 μm sil som er plassert i en 6-brønd vevskulturplate fylt med 6 ml FACS-buffer (0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA i 1x PBS). Mekanisk dissocieres ved forsiktig mashing med det svarte gummikolven av en 2 ml sprøyte for å oppnå en enkeltcellesuspensjon.
    MERK: Fra nå av skal alle trinnene utføres ved 4 ° C.
  3. Samle cellesuspensjonen med en Pasteur pipette og overfør til et 15 ml rør.
  4. SpiN i 7 minutter ved 320 xg ved 4 ° C. Kast supernatanten ved aspirasjon.
  5. Resuspender pelleten i 60 μl Fc-blokkeringsbuffer (CD16 / CD32 blokkerende antistoff fortynnet 1/50 i FACS buffer).
    1. Overfør 50 μl av en-cellesuspensjonen per brønn i en 96-brønn plate med rund bunn. Inkuber i minst 15 minutter på is.
      MERK: Fargingen kan også utføres i 5 ml polystyren FACS-rør når det håndteres et lite antall prøver.
    2. Overfør de resterende 10 μL i et 5 ml polystyren FACS-rør for å oppnå et basseng av prøvene fra hvert vev. Dette bassenget vil fungere som kontroller ( dvs. ufarget prøver og fluorescerende minus en (FMO) kontroller for hver fluorokrom). Overfør 50 μl av bassenget for hver fluorescerende minus en (FMO) kontroll (en per fluorokrom) til 96-brønnplaten.
      MERK: Hver FMO-kontroll inneholder alle fluorokrom-koplede antistoffene fra antistoffpanelet, bortsett fra det eneSom blir målt. FMOer brukes til å identifisere gategrenser og å kontrollere for spektraloverlapping i flerfargete paneler. For å korrekt adressere variasjonene i bakgrunnen og autofluorescens mellom forskjellige vev, er det viktig å klargjøre disse kontrollene fra prøverammen av hvert vev. Den riktige kontrollen for YFP-ekspresjon vil være prøver fra Cre-negative embryoer, som bekreftes ved PCR-genotyping.

4. Overflateantigenfarging

  1. Forbered antistoffblandingen i FACS-buffer (tabell 2). Forbered 50 μl antistoffblanding pr. Prøve.
    1. Bruk følgende fluorokrom-koplede antistoffer: anti-CD45.2 (klon 104); Anti-CD11b (klon M1 / ​​70); Anti-F4 / 80 (klon BM8); Anti-AA4.1 (klon AA4.1); Anti-kit (klon 2B8); Og anti-Ter119 (klon Ter119).
    2. Forbered seks antistoffblandinger for FMO-kontrollene i FACS-buffer. Forbered 50 μl antistoffblanding per kontrollprøve.
      NEITE: Antistoff fortynningen i antistoffblandingen er to ganger mer konsentrert enn den endelige konsentrasjonen angitt i materialetabellen. For et panel med seks fluorokrom-koplede antistoffer, fremstilles 6 FMO kontroller. Tabell 2 gir sammensetningen av antistoffblandingen og FMO-kontrollene for ett rør.
Volum (μL) av antistoff (sluttvolum 50 ul)
antistoff Clone Antibody Mix FMO CD45.2 FMO CD11b FMO F4 / 80 FMO AA4.1 FMO Kit FMO Ter119
anti-CD45.2 104 1 0 1 1 1 1 1
anti-CD11b M1 / 70 0.5 0.5 0 0.5 0.5 0.5 0.5
anti-F4 / 80 BM8 1 1 1 0 1 1 1
anti-AA4.1 AA4.1 1 1 1 1 0 1 1
anti-Kit 2B8 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0.5
anti-Ter119 Ter119 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0
FACS buffer 45.5 46.5 46 46.5 46.5 46 46

Tabell 2: Antistoffvolum ved bruk for farging og Fluorescerende minus en (FMO) kontroller. Volum (μL) antistoff kreves for et sluttvolum på 50 ul.

  1. Tilsett 50 μl av antistoffblandingen til prøvene i 96-multiwellplaten (sluttvolum under farging er 100 μl). Rist forsiktig opp og ned to ganger og inkuber på is i 30 minutter.
  2. Spinn 96-multiwellplaten i 7 minutter ved 320 xg ved 4 ° C og kast supernatanten. Resuspender i 200 μl FACS buffer.
  3. Gjenta vaskeprosedyren (trinn 4.3) to ganger med 150 μl FACS-buffer.
  4. Filtrer prøvene og kontrollene (FMO og ufarget bassengprøver) i 5 ml polystyrenrør gjennom en 70 μm sil. Oppbevar på is til oppkjøp.

5. Identifisering av EMP og YS-avledede makrofager ved hjelp av flytcytometri

MERK: Denne protokollen ble optimalisert ved hjelp av et 4-laserstrømcytometer eqUtdelt med en 405 nm violett laser, en 488 nm blå laser, en 562 nm gul laser og en 638 nm rød laser.

  1. Forbered kompensasjonsperler for hvert koplet antistoff etter produsentens instruksjoner. Bruk ufarget prøver og kompensasjonsperler for å optimalisere laserintensiteten.
  2. For å identifisere gategrenser, bruk FMO (Fluorescence minus one) kontroller for hvert antistoff.
  3. For å utelukke døde celler, tilsett 1 μL DAPI (1 mg / ml) til røret (som inneholder 200 μl av farget cellesuspensjon) 1 min før oppkjøpet. Bruk det sterke DAPI-signalet og den fremover spredte parameteren (FSC) for å utføre ekskludering av døde celler og rusk.
    MERK: Bruk programvare fra strømningscytometeret til å tegne portene under oppkjøpet. Kompensasjonsmatrise og analyse kan utføres etter prøveoppkjøp ved hjelp av annen kommersielt tilgjengelig programvare.
  4. Bruk fremover og sidestrøm (FSC vs SSC) til å utføre levende celle og dublettdiskriminering fra totale hendelser.
  5. Lag fluorescenspunktplott i log-aksel og tegne datterportene til å ekskludere erytrocytter (Ter119 + ) og deretter identifisere stamceller (Kit + ) og hematopoietiske celler (CD45 + Kit neg ) (Se figur 1 ).
  6. Opprett fluorescenshistogrammer for å kvantifisere merkingseffektiviteten til YFP blant de forskjellige identifiserte populasjonene i YS ( Figur 2 ), fosterlever ( Figur 3 ) og hjerne ( Figur 4 ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Genetisk skjebne kartlegging ble oppnådd ved administrasjon ved E8.5 av OH-TAM til Csf1r-Mer-iCre-Mer kvinner med par som bærer en Rosa26-LSL-eYFP reporter. I nærvær av OH-TAM fører eksisjonering av stoppkassetten til det permanente uttrykket av YFP i cellene som uttrykker Csf1r . Vi samler to hematopoietiske vev: eggeplommesekken og føtalelever og et ikke-hematopoietisk vev, nevroektodermen, fra embryoene ved E10.5. Enkeltcellesuspensjoner ble oppnådd ved enzymatisk og mekanisk dissosiasjon og prøver ble analysert ved hjelp av flytcytometri etter farging med fluorescerende koplede antistoffer. Etter utelukkelse av døde celler og dubletter ble enkeltcellesuspensjoner analysert ( figur 1 ). Alle portene ble definert ved hjelp av Fluorescence Minus One (FMO) kontroller. Det anbefales også å utføre en erytrocyt ekskludering (Ter119 + celler) for å forbedre klarheten i analysen ( Figur 1B + CD45 neg ; Kit + CD45 lav og Kit neg CD45 + ( Figur 1 ). Progenitorer ble ytterligere analysert basert på deres uttrykk for AA4.1 ( figur 2-4 ). Faktisk er AA4.1 en overflate markør som tillater anrikning av stamfamilien i erytromyeloid progenitorer i eggeplomme-sagen, som vist i kolonidannende analyser 15 . Når populasjonene av interesse ble identifisert, kvantifiserte vi YFP-merkingseffektiviteten i hver populasjon ved hjelp av histogrammer. Blant eggeplommesett Kit + forfedre inneholder både CD45 neg ( Figur 2A ) og CD45 lav ( Figur 2B ) cellepopulasjoner AA4.1 + YFP + -celler. Men AA4.1 + YFP <sup> + celler i leveren og hjernen blir bare finnes i den kit + CD45 lav stamcellepopulasjonen (figur 3B og 4B). Siden hjernen ikke er et aktivt sted for hematopoiesis, kan progenitorer som finnes i dette vevet, korrespondere med sirkulerende progenitorer. Dette antyder også en prosess med forfedermodning da de migrerer fra eggeplomme til føtalelever og perifert vev. Kit + forgjengere uttrykker først AA4.1, uavhengig av CD45-uttrykk, men når de når sirkulasjon og føtale lever, uttrykker alle AA4.1 + YFP + -forløpere detekterbare nivåer av celleoverflate CD45. Makrofager, definert som F4 / 80 lyse CD11b + , ble funnet i Kit neg CD45 + porten ( Figur 2-4 ). Makrofager i E10.5-blommesekken, leveren og hjernen ble effektivt merket (60 til 80% av F4 / 80 lyse CD11b + -celler er YFP + ) b Du har en enkelt OH-TAM administrasjon ved E8.5 ( Figur 2C , 3C og 4C ).

For å sammenligne merkingseffektiviteten mellom kull, anbefaler vi at en intern kontroll for rekombinasjonseffektivitet brukes. Variabilitet i reporterens uttrykksnivå kan observeres mellom eksperimenter, på grunn av variasjoner i utviklings timing mellom søppel og musestammer når OH-TAM injiseres i utero . Derfor anbefaler vi at embryostasjonering fra E8.5 til E11.5 embryo utføres ved å telle somite par. I denne protokollen foreslår vi å bruke merkingseffektiviteten i hjernen bosatt makrofager (microglia) som referanse for å sammenligne effektiviteten av Cre rekombinasjon mellom forskjellige eksperimenter og stammer ( Figur 4C ). Andre residente makrofager kunne brukes, men microglia var de første cellene som ble beskrevet som yolkakk-avledede makrofagerEf "> 16 og de representerer den rikeste befolkningen av vevsbeboede makrofager ved E10.5. Dermed kan YFP-merking i microglia brukes til å vurdere skjebne-kartleggingseffektiviteten i hvert eksperiment og sammenligne data fra forskjellige kull.

Figur 1
Figur 1: Gatingstrategi for å identifisere stamceller (Kit + CD45 neg og Kit + CD45 lav ) og differensierte hematopoietiske celler (Kit neg CD45 + ). ( A ) Diskriminering av levende celler og singletter utføres ved bruk av DAPI-farging og Forward and Side scatter (FSC / SSC) parametere. ( B ) Etter fjerning av røde blodlegemer (Ter119 neg ) identifiseres tre populasjoner av celler av interesse basert på celleoverflateekspresjon av Kit og CD45: Kit + CD45 neg ; Kit + CD45 lav neg CD45 + celler. ( C ) Csf1r-uttrykkende celler tilstede når OH-TAM injiseres, og deres avkom identifiseres i Cre-rekombinase-positive embryoer som uttrykk for YFP sammenlignet med Cre-rekombinase-negative embryoer (bekreftet senere ved polymerasekjedereaksjonsanalyse, PCR). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Merkingseffektivitet i eggeplomme fra E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospuldert med OH-TAM ved E8.5. ( A ) Kit + CD45 negceller er inngjerdet basert på Kit og CD45 uttrykk på levende eggeplomme saksceller (blå gate, venstre panel). AA4.1 og Kit uttrykk på Kit + CD45 neg celler. BluE-porten inneholder AA4.1 + Kit + CD45 neg- celler (midtpanel). Sammenligning av YFP merking i AA4.1 + kit + CD45-neg-celler (høyre panel) i Cre negative kontroller (svart) og Cre positive prøver (grønt). Histogrammer representerer prosentandelen celler (y-aksen) positiv for YFP-signalet (x-akse). ( B ) Kit + CD45 lave celler er gated basert på Kit og CD45 uttrykk (blå gate, venstre panel). AA4.1 og Kit uttrykk på Kit + CD45 lave celler. Blå port omslutter EMP, som er definert som AA4.1 + kit + CD45 lave celler (midtre panel). Sammenligning av YFP-merking i AA4.1 + Kit + CD45 lave celler (høyre panel) i Cre negative kontroller (svart) og Cre positive prøver (grønn). Histogrammer representerer prosentandelen celler (y-aksen) positiv for YFP-signalet (x-akse). ( C ) Hematopoietiske celler er definert som Kit neg CD45 neg CD45 + celler. Makrofager er definert som F4 / 80 lyse CD11b + celler (midtpanel). Sammenligning av YFP-merking i F4 / 80 lyse CD11b + makrofager (høyre panel) i Cre negative kontroller (svart) og Cre positive prøver (grønn). Histogrammer representerer prosentandelen celler (y-aksen) positiv for YFP-signalet (x-akse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Merkingseffektivitet i leveren fra E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospuldert med OH-TAM ved E8.5. ( A ) Kit + CD45 negceller er inngjerdet basert på Kit og CD45Uttrykk på levende leverceller (blå port, venstre panel). AA4.1 og Kit uttrykk på Kit + CD45 neg celler. Blå port omslutter AA4.1 + kit + CD45 neg celler (midtre panel). Sammenligning av YFP merking i AA4.1 + kit + CD45-neg-celler (høyre panel) i Cre negative kontroller (svart) og Cre positive prøver (grønt). Histogrammer representerer prosentandelen celler (y-aksen) positiv for YFP-signalet (x-akse). ( B ) Kit + CD45 lave celler er gated basert på Kit og CD45 uttrykk (blå gate, venstre panel). AA4.1 og Kit uttrykk på Kit + CD45 lave celler. Blå port omslutter EMP, som er definert som AA4.1 + kit + CD45 lave celler (midtre panel). Sammenligning av YFP-merking i AA4.1 + Kit + CD45 lave celler (høyre panel) i Cre negative kontroller (svart) og Cre positive prøver (grønn). Histogrammer representerer prosentandelen avCeller (y-akse) positive for YFP-signal (x-akse). ( C ) Hematopoietiske celler er definert som Kit neg CD45 + og gated i blå (venstre panel). F4 / 80 og CD11b ekspression på Kit neg CD45 + celler. Makrofager er definert som F4 / 80 lyse CD11b + celler (midtpanel). Sammenligning av YFP-merking i F4 / 80 lyse CD11b + makrofager (høyre panel) i Cre negative kontroller (svart) og Cre positive prøver (grønn). Histogrammer representerer prosentandelen celler (y-aksen) positiv for YFP-signalet (x-akse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Etikett effektivitet i hjernen fra E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospuLsed med OH-TAM ved E8.5. ( A ) Kit + CD45 negceller er gated basert på Kit og CD45 uttrykk på levende hjerneceller (blå gate, venstre panel). AA4.1 og Kit uttrykk på Kit + CD45 neg celler. Blå port omslutter AA4.1 + kit + CD45 neg celler (midtre panel). Sammenligning av YFP merking i AA4.1 + kit + CD45-neg-celler (høyre panel) i Cre negative kontroller (svart) og Cre positive prøver (grønt). Histogrammer representerer prosentandelen celler (y-aksen) positiv for YFP-signalet (x-akse). ( B ) Kit + CD45 lave celler er gated basert på Kit og CD45 uttrykk (blå gate, venstre panel). AA4.1 og Kit uttrykk på Kit + CD45 lave celler. Blå port omslutter EMP, som er definert som AA4.1 + kit + CD45 lave celler (midtre panel). Sammenligning av YFP-merking i AA4.1 + Kit + CD45 lav C ) Hematopoietiske celler er definert som Kit neg CD45 + og gated i blå (venstre panel). F4 / 80 og CD11b ekspression på Kit neg CD45 + celler. Makrofager er definert som F4 / 80 lyse CD11b + celler (midtpanel). Sammenligning av YFP-merking i F4 / 80 lyse CD11b + makrofager (høyre panel) i Cre negative kontroller (svart) og Cre positive prøver (grønn). Histogrammer representerer prosentandelen celler (y-aksen) positiv for YFP-signalet (x-akse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De forskjellige bølgene av hematopoietiske forløperceller overlapper delvis innenfor en kort tidsramme, noe som gjør analysen av bidraget fra hver bølge av utviklingshematopoiesis til immunceller teknisk svært utfordrende.

Tamoxifen-inducerbare Cre-systemer gir mulighet til å merke spesifikke celler på en temporær induktiv måte og å utføre linningsanalyse i embryoer eller voksne, uten behov for eks vivo eller in vitro- kultur eller transplantasjon. I tamoksifen-inducerbare Cre-stammer opprettes et fusjonsgen mellom en bakteriell Cre rekombinase og en mutant form av det ligandbindende domene av den humane østrogenreseptor (CRE-ER) eller mellom et forbedret enkeltpunktsmutant Cre og to musestrogenreseptorer (Mer-icre-Mer). Fusjon av Cre med østrogenreseptorer fører til cytoplasmatisk sekvestrasjon av Cre ved Hsp90, og derved forebygger nukleær Cre-mediert rekombination. Tamoxifen (TAM) metaboliseres av thE lever i 4-hydroksytamoksifen (OH-TAM), dets aktive metabolitt med høy bindingsaffinitet for østrogenreseptor. OH-TAM binding til fusjon Cre fører til forstyrrelsen av interaksjonen med Hsp90, hvilket tillater dens translokasjon til kjernen og initiering av Cre-mediert rekombination. Injeksjon av TAM eller OH-TAM i utero til gravide kvinner har vist seg å aktivere rekombination i det utviklende embryoet. Tamoxifen-administrasjon under graviditet kan føre til abort og reduserer dermed kullstørrelsen, men forhindrer også fødsel hvis den leveres etter midngangsbehandling, i så fall er det nødvendig med puppelevering gjennom keisersnitt. For å motvirke tamoxifen-effekter under svangerskapet, supplerer vi OH-TAM-administrasjon med en halv dose progesteron, for å forbedre overlevelse av embryoer og redusere risikoen for abort 17 .

Flere ruter kan brukes til å levere TAM eller OH-TAM til gravide kvinner. Foreløpig muntlig gavaGe eller intra peritoneal (ip) injeksjon brukes til tamoxifen. OH-TAM har fordelen av å være umiddelbart tilgjengelig, da den ikke krever å bli metabolisert av leveren av den gravide dammen. Imidlertid, mens tamoxifen er veldig lett å oppløse i maisolje, er OH-TAM veldig vanskelig å forberede ved hjelp av samme teknikk og resulterer i en emulsjon. Dette har vært et begrensende trinn i å bruke OH-TAM for utero pulsmerking. Vi har tilpasset protokollen for utarbeidelse av OH-TAM utviklet av gruppen JF Nicolas 13 , hvor de bruker PEG-35 ricinusolje, et løsningsmiddel med amfifile egenskaper for å solubilisere OH-TAM, da tamoxifenoppløsning er en av de mest kritiske trinnene I prosedyren. Dette muliggjør reproduserbar og optimal preparering av OH-TAM og forkorter tiden tamoxifenpreparatet betydelig. Videre er det nødvendig å tilpasse konsentrasjonen av OH-TAM til injeksjon ved bruk av forskjellige inducerbare Cre-stammer. Kombinasjonen av et levedyktighetsfargestoff (DAPI) og størrelse (FSC) er avgjørende for å fjerne henholdsvis døde celler og cellulære rusk. Døde celler og rusk er svært autofluorescerende i de fleste av de fiolette, blå og røde laserdetektorer, og kan hemme strømningscytometrisk analyse. Videre anbefaler vi ikke å fikse cellene etter farging før analyse med strømningscytometer. Fiksering kan føre til endringer i celle morfologi og gjør dermed vanskelig størrelse diskriminering basert på Forward and Side Scatter (FSC vs SSC). Videre fører fiksering av prøver med PFA til et signifikant tap av YFP fluorescerende intensitet.

Hovedbegrensningen i denne protokollen er at populasjonene ikke testes på deres funksjonalitet og differensieringspotensial. For å overvinne dette, kan celler sorteres etter en lignende protokoll ved hjelp av en fluorescensaktivert celle sorterer (FACS) for å utføre kolonidannende analyse. I dette tilfellet må prosedyren utføres under sterile forhold og bruk av føtalt bovint serum (FBS) i FACS-bufferen, i stedet for BSA, anbefales sterkt. Den lave merkingseffektiviteten oppnådd med denne teknikken og det dermed lave antall YFP + -celler av interesse per embryonalt vev er en stor utfordring i studien av EMP-fenotype. Denne protokollen bruker et 4-laserstrømcytometer. Et flytcytometer med 3 lasere kan også brukes, men det er viktig å tilpasse antistoffpanelet for å ta hensyn til den økte spektrale overlappingen mellom fargestoffer. I tillegg kreves titrering av antistoffer for å finne den riktige konsentrasjonen når du bytter antistoffpanelet, og vi anbefaler at du utfører titrering av antistoffer og validering av det nye antistoffpanelet i et pilotforsøk der alle embryoer per vev er samlet, for å øke antallet Celler analysert per vev.

Utviklingsbiologiens område har blitt revolusjonert av Cre / Lox-metoden, som muliggjør permanent merking av celler på stedet . Denne tilnærmingen oppnårVev- eller celletype-spesifisitet gjennom ekspresjon av Cre rekombinasen under kontroll av en spesifikk promotor. I vårt tilfelle valgte vi å studere ekspresjonen av Cre rekombinasen under kontroll av promotoren til Csf1r (kolonistimulerende faktor 1 reseptor), en viktig mitogen og vekstfaktorreseptor for makrofager og deres stamfødte ved å bruke en stamme utviklet av gruppen Av J. Pollard 18 . Fordelen med en skjebne kartlegging strategi basert på Csf1r uttrykk i forhold til andre publiserte strategier er at det tillater merking av eggeplomme-avledede celler (EMP og makrofager) uten å merke noen foster-HSCs 12 . Cx3cr1 Creert2- stammen kan også merke yolkekkceller uten merking av HSCs 19 , men det kan bare merke makrofager og makrofagprekursorer, men det merker ikke EMP-progenitorer 1 . Cx3cr1 Creert2- stammen har samme advarsel som Csf1r MerCreMer 16 og Kit MerCreMer 20 , er perifere blodlegemer alltid merket hos voksne, om enn i svært lav effektivitet, og viser dermed merking av HSCs under utvikling. Videre er Kit MerCreMer skjebne kartlegging etiketter yolk sac Kit + Sca1 + forfedre mens EMP er Kit + Sca1 negative 11 . Csf1r MeriCreMer- stammen er ikke en innsats, men den ble generert ved klassisk additiv transgenese, således kan uttrykket av Cre ikke fullt ut rekapitulere endogent uttrykk for Csf1r. Imidlertid har dette fordelen å unngå potensielle utviklingsfeil som skyldes heterozygot ekspresjon av Csf1r. Dette er en viktig faktor for å ta hensyn til når analyseresAndre skjebne kartlegging strategier brukt for utviklingshematopoiesis studier, som Runx1 MerCreMer , Kit MerCreMer og Cx3cr1 Creert2 , der det inducerbare Cre er satt inn i det endogene lokus. For både Runx1 MerCreMer og Kit MerCreMer er utviklingshematopoietiske defekter beskrevet i heterozygote embryoer. Samlet gir metoden som presenteres her mulighet til å undersøke blommesekker EMP-biologi under utvikling, og også gula sak-avledede makrofager funnet i voksenvev og forskjellig fra HSC-avledede makrofager. Dette vil forbedre vår nåværende forståelse av denne linjen av bosatt makrofager og deres spesifikke funksjoner i voksen alder. Den immunfenotypiske karakterisering av EMP har blitt forbedret nylig ved bruk av cellesorterings- og kolonidannende analyser, hvilket viser at yolkasse EMP spesifikt uttrykker CD41 og CD16 / 32 i tidlige utviklingsstadier 11 . Men spesifisiteten til uttrykk for CD41Og CD16 / 32 trenger ytterligere karakterisering fra E10.5 og fremover, spesielt i føtal levernisje, ved hjelp av skjebne-kartlegging modeller. Faktisk, om CD41- og CD16 / 32-ekspresjonen fremdeles er spesifikk for EMP, når det sammenlignes med føtal HSC og HSC-avledede progenitorer i E10.5 til E14.5 føtal lever, må det framlegges. Den presenterte metoden tillater å merke EMP generert i eggeplomme og å følge dem under embryonisk utvikling, og det vil bidra til en mer detaljert karakterisering av EMP-fenotype når de frøer fosterleveren.

Denne metoden kan være viktig i nær fremtid for å studere EMP-differensieringsbaner. Mens EMPs kommer fra blommesekkendotelet fra E8.5 til E10.5 4, tillater denne metoden bare å merke en brøkdel av progenitorene som kommer opp mellom E8.5-E9.5. Derfor er en begrensning av denne metoden at bare en liten brøkdel av EMP er merket, noe som gjør det vanskelig å analysere i klassisk tap av funksjonstudier med fløyte alleler for cAndidate gener. Alternativt kan sparsom merking bli en fordel i klonale studier av EMP-differensiering in vivo ved bruk av klonal reporter. Ikke desto mindre må merkingseffektiviteten karakteriseres for hver floset reporter eller flom-allel som brukes, da rekombinasjonseffektivitet av flomkonstruksjoner avhenger av genomisk lokus (floksete alleler) eller Rosa26-reporterkonstruksjonen. Faktisk er forskjellige Rosa26-reporterlinjer tilgjengelig med forskjellige promotorer, og det er rapportert at Rosa26 tdTomato og Rosa26 mTmG- stammen har høyere rekombinasjonseffektivitet enn Rosa26 LSL-eYFP- linjen. Reportermusestammen som brukes i denne protokollen, er Rosa26 LSL-eYFP- linje, som ikke kan gi informasjon om den dynamiske prosessen med forfatningsmodning nevnt i resultatavsnittet. Spørsmålet om modningsprosessen kan delvis adresseres ved hjelp av forskjellige reporterstammer som Rosa26 mTmG . I en slik belastning kan celler være avskjedendeUished basert på tiden som er gått siden rekombinationshendelsen. Alle celler i Rosa26 mTmG- stammen, uttrykker membranbundet tdTomato-fluorescerende protein og Cre-rekombinasjon, ekspliserer tdTomatokassetten og tillater ekspresjon av membranbundet GFP. Siden tdTomato har en lang halveringstid, er celler som fremdeles inneholder tdTomato, men har begynt å uttrykke GFP (kort tid etter rekombination), tdTomato + GFP low / int og kan skille seg fra tdTomato neg GFP + celler som ikke uttrykker tdTomato lenger og Uttrykke høyere nivåer av GFP (senere etter rekombination).

Som diskutert ovenfor er OH-TAM-preparat et kritisk trinn for konsekvent å levere lignende doser av OH-TAM mellom eksperimenter og for å redusere tamoxifen-bivirkninger. Samtidig administrering av progesteron er også nyttig for å begrense skadelig effekt av tamoxifen ved graviditet. Et annet kritisk element i protokollen er levedyktigheten av single-cell suspensioN hentet fra forskjellige embryonale vev. Vi oppnår vanligvis> 90% levedyktige celler for strømningscytometrisk analyse. For å oppnå dette er det viktig å følge alle trinnene raskt og å opprettholde alle prøver på is etter vevsinnsamling. Passende kontroller som ufarget prøver, enkelt flekker og fluorescerende minus en (FMO) kontroller er nødvendig for å identifisere gategrenser og for å kontrollere for spektral overlapping i flerfargete paneler. Endringer i antistoffet må valideres når det gjelder antistofftitrering og spektral overlapping. Endelig må valget av Rosa26 reporterstammen tilpasses det vitenskapelige spørsmålet som undersøkes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker prof Frederic Geissmann og prof Christian Schulz for innsiktsfulle diskusjoner; Dr Hannah Garner for kritisk avlesning av manuskriptet, dr. Xavier Montagutelli og dr. Jean Jaubert og personalet på Institut Pasteur dyreanlegg for støtte med musekultur; Og Pascal Dardenne og Vytaute Boreikaite, en Amgen Scholar, for teknisk assistanse. Forskning i EGP-laboratoriet finansieres av Institut Pasteur, CNRS, Cercle FSER (FRM og en startpakke fra Institut Pasteur og REVIVE-konsortiet. LI støttes av et PhD-fellesskap fra REVIVE-konsortiet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 Straight Forceps Fine Science Tools 11251-20
MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors  Fine Science Tools 15371-92
8.5 cm straight scissors Fine Science Tools 14090-09
Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) BD Pharmingen 553355 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) Sony 1149120 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) eBioscience 17-5892 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) Biolegend 560512 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) BD Pharmingen 123137 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) BD Pharmingen 552850 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) BD Biosciences 553142
PBS 1x Fischer Scientific 12559069
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 11570506
Collagenase D  Roche 11088882001
Deoxyribonuclease I Sigma D4527-20KU
6-well tissue culture plate Dutscher Dominique 353046
12-well tissue culture plate Dutscher Dominique 353224
24-well tissue culture plate Fischer Scientific 11874235
96 wells U-shape bottom tissue culture plate Dutscher Dominique 353227
 Syringe Plastipak 2 mL  Dutscher Dominique 300185
Nylon grid 100 µm cell strainers Dutscher Dominique 352360
Nylon grid 70 µm cell strainers Dutscher Dominique 352350
15 ml Falcon tubes Dutscher Dominique 352096
Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm Dutscher Dominique 51246
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-500G
(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg Sigma H7904-25MG Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment
Progesterone Sigma P3972 Always use appropriate personal protective equipment
PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) Sigma C5135
Sunflower oil Sigma S5007-250ML
Ethanol  Sigma 24103-1L-R-D Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood
EDTA Sigma E9884-500G
DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) Fischer Scientific 10116287
CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer Beckman Coulter B75408
CytoFLEX Daily QC Fluorospheres Beckman Coulter  B53230
VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL) Beckman Coulter  B22804
FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J The Jackson laboratory 19098
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson laboratory 6148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106, (9), 3004-3011 (2005).
  2. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126, (22), 5073-5084 (1999).
  3. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9, (6), 541-552 (2011).
  4. Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. (2015).
  5. Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139, (19), 3521-3530 (2012).
  6. Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518, (7540), 547-551 (2015).
  7. Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42, (4), 665-678 (2015).
  8. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27, (6), 369-378 (2015).
  9. Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10, (5), 243-252 (1981).
  10. Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
  11. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11, (12), 1892-1904 (2015).
  12. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336, (6077), 86-90 (2012).
  13. Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
  14. Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
  15. Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (1), 134-139 (2005).
  16. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (6005), 841-845 (2010).
  17. Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235, (9), 2603-2612 (2006).
  18. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475, (7355), 222-225 (2011).
  19. Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38, (1), 79-91 (2013).
  20. Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43, (2), 382-393 (2015).
Identifikasjon av erytromyeloidprogenitorer og deres avkom i musembryoen ved flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iturri, L., Saenz Coronilla, J., Lallemand, Y., Gomez Perdiguero, E. Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55305, doi:10.3791/55305 (2017).More

Iturri, L., Saenz Coronilla, J., Lallemand, Y., Gomez Perdiguero, E. Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55305, doi:10.3791/55305 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter