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Developmental Biology

Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

doi: 10.3791/55305 Published: July 17, 2017

Summary

Mientras que los macrófagos infiltrados son continuamente reclutados en tejidos adultos a partir de precursores circulantes, los macrófagos residentes sembran su tejido durante el desarrollo, donde se mantienen sin más aportación de los progenitores. Recientemente se identificaron los progenitores de macrófagos residentes. Aquí, presentamos métodos para el mapeo de destino genético de los progenitores de macrófagos residentes.

Abstract

Los macrófagos son fagocitos profesionales del brazo innato del sistema inmunológico. En el estado estacionario, los macrófagos sésiles se encuentran en tejidos adultos donde actúan como centinelas de primera línea de infección y daño tisular. Mientras que otras células inmunitarias se renuevan continuamente a partir de células progenitoras y hematopoyéticas (HSPC) localizadas en la médula ósea, se ha demostrado que un linaje de macrófagos, conocido como macrófagos residentes, se mantiene a sí mismo en tejidos sin entrada de HSPCs de médula ósea. Este linaje se ejemplifica por microglia en el cerebro, células de Kupffer en el hígado y células de Langerhans en la epidermis entre otras. La lámina intestinal y la lámina intestinal son los únicos tejidos adultos desprovistos de macrófagos residentes independientes del HSPC. Investigaciones recientes han identificado que los macrófagos residentes se originan de la hematopoyesis extra-embrionaria del saco vitelino de progenitor (es) distinto de las células madre hematopoyéticas fetales (HSC). Entre la hematopoyesis definitiva del saco vitelino, eLos progenitores ritiomielóides (EMP) dan lugar tanto a las células eritroides y mieloides, en particular a los macrófagos residentes. EMP sólo se generan dentro del saco vitelino entre E8.5 y E10.5 días de desarrollo y migran al hígado fetal tan pronto como la circulación se conecta, donde se expanden y se diferencian hasta por lo menos E16.5. Su progenie incluye eritrocitos, macrófagos, neutrófilos y mastocitos, pero sólo los macrófagos derivados de EMP persisten hasta la edad adulta en los tejidos. La naturaleza transitoria de la emergencia EMP y la superposición temporal con la generación de HSC hace difícil el análisis de estos progenitores. Hemos establecido un protocolo de cartografía de destino inducible por tamoxifeno basado en la expresión del promotor Csf1r del receptor de citocinas de macrófagos para caracterizar células EMP y EMP derivadas in vivo mediante citometría de flujo.

Introduction

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Existen varias olas sucesivas pero superpuestas de progenitores hematopoyéticos durante el desarrollo cuya progenie mieloide permanece en la edad adulta. En primer lugar, los progenitores "primitivos" unipotentes emergen en el saco de yema de ratón 1 , 2 entre E7.5-E8.25 y dan lugar a macrófagos embrionarios sin ningún intermediario monocítico. Si los macrófagos derivados de progenitores primitivos persisten en el cerebro adulto como microglia sigue siendo un sujeto de investigación activa. En segundo lugar, Erythro-Myeloid precursores (EMPs) surgen en el saco vitelino en E8.5, entrar en el torrente sanguíneo y colonizar el embrión. EMP emerjan de la vaina vitelino endotelio hemogénico en un Runx1 dependiente de la transición endotelial a hematopoyética 3 , 4 . Mientras EMP puede diferenciarse en macrófagos dentro del saco vitelino, también colonizar el hígado fetal de día embrionario (E) 9 5 y differenEn eritrocitos, megacariocitos, macrófagos, monocitos granulocitos y mastocitos [ 6] . Los macrófagos que derivan de las PEM exhiben capacidad proliferativa en tejidos adultos y de desarrollo. Si los macrófagos derivados de EMP pasan por alto la etapa de diferenciación de los monocitos sigue siendo controvertido, ya que se sabe muy poco sobre su vía de diferenciación 7 , 8 . Finalmente, las células madre hematopoyéticas (HSCs) emergen a E10.5 dentro del embrión propio de la región aorta-gonad-mesonefros y migran al hígado fetal. Los HSC con capacidad de repoblación a largo plazo sólo se detectan después de E11 (en el estadio de 42 somites) 9 . Allí, se expanden y se diferencian de E12.5 hasta que la hematopoyesis definitiva comienza a desplazarse a la médula ósea, que se convierte en el sitio predominante de la producción de células sanguíneas durante la vida postnatal 10 .

El SPLa superposición temporal y temporal en la aparición, así como los marcadores inmuno-fenotípicos compartidos, han obstaculizado hasta ahora nuestra capacidad para distinguir las contribuciones específicas de estas ondas de progenitores hematopoyéticos embrionarios. Mientras tanto EMP y HSC se generan de una manera dependiente de Runx1 y expresan el factor de transcripción Myb y el receptor del factor de crecimiento Csf1r (Receptor del Factor Estimulador de Colonia 1, también conocido como Receptor de Factor Estimulador de Colonias de Macrófagos) entre otros, los EMPs pueden distinguirse de HSCs por su falta de potencial linfoide, tanto in vitro e in vivo , su falta de repoblación a largo plazo potencial y la falta de expresión superficial de la línea Sca-1 11 . Modelos genéticos de cartografía de destino son necesarios para caracterizar la ontogenia de macrófagos, ya que permiten la orientación de progenitores embrionarios en una célula específica y tiempo específico. Aquí presentamos el protocolo de asignación de destino utilizado en nuestro laboratorio para discriminar entre los dos linajesS de macrófagos que se encuentran en la mayoría de los tejidos adultos: macrófagos infiltrantes derivados de HSC y macrófagos residentes independientes de HSC.

Macrófagos residentes de tejidos se han rastreado a Myb-células precursoras independientes que expresan el receptor de citoquinas Csf1r 12 y están presentes en el embrión en E8.5-E10.5 utilizando tres complementarias estrategias de cartografía de destino [ 6] . Con el fin de estudiar la hematopoyesis de saco vitelino sin etiquetar HSC fetal, utilizamos una cepa transgénica, Csf1r MeriCreMer , que expresa una proteína de fusión inducible por el tamoxifeno de recombinación Cre mejorada y dos receptores de estrógenos de ratón (Mer-iCre-Mer) bajo el control de El promotor Csf1r. Por tanto, la recombinasa Cre estará activa en células que expresan Csf1r durante un intervalo de tiempo limitado. Cuando se utiliza con una cepa informadora que contiene una proteína fluorescente corriente abajo de un casete lox-STOP-lox (Rosa26 LSL-eYFP ), dará lugar a la permanenciaEtiquetado genético de las células presentes en el momento de la inducción, pero también de su progenie. La administración en E8.5 de la forma activa de tamoxifeno, 4-hidroxitamoxifeno (OH-TAM), etiqueta EMPs y macrófagos, sin etiquetar progenitores "primitivos" unipotentes de saco vitelino o HSCs fetales. Por lo tanto, hemos caracterizado el inmunofenotipo de EMPs y su progenie durante el desarrollo embrionario, así como evaluado la contribución de los macrófagos derivados del saco vitelino a las piscinas de macrófagos adultos. Se requiere trabajo adicional para caracterizar si los macrófagos derivados de progenitores primitivos también se etiquetan utilizando este enfoque y si pueden contribuir a piscinas de macrófagos para adultos.

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Protocol

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Los procedimientos en animales se realizaron de acuerdo con el comité institucional aprobado para el cuidado y uso de los animales del Institut Pasteur (CETEA).

1. En Utero Pulse Etiquetado en Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embriones

  1. Preparar la solución madre de 4-hidroxitamoxifeno (OH-TAM, 50 mg / mL).
    1. Bajo la campana, abra el vial de 25 mg de OH-TAM y agregue 250 μl de etanol (100%).
    2. Transferir la solución de OH-TAM a un tubo de microcentrífuga de 2 ml con una punta truncada y agitar vórtex a velocidad máxima durante 10 min.
    3. Sonicate 30 min en un baño de sonicador.
    4. Añadir 250 μl de aceite de ricino PEG-35 bajo la humedad para obtener una solución madre de 50 mg / ml.
      NOTA: El aceite de ricino PEG-35 es un disolvente con propiedades anfifílicas que se une a las moléculas hidrófobas y las solubiliza en disolventes acuosos.
    5. Vórtice durante aproximadamente 5 min.A velocidad máxima y sonicar durante 30 minutos en un baño sonicador.
    6. Alícuota de 90 μl (4,5 mg) por tubo de microcentrífuga (1 alícuota por inyección).
    7. Almacenar a 4 ° C durante 1 semana o a -20 ° C para el largo plazo como se ha descrito anteriormente 13 .
  2. Preparar la solución madre de Progesterona (10 mg / ml)
    1. Añadir 250 μl de Etanol al 100% a 25 mg de progesterona para preparar una suspensión de 10 mg / 100 μl bajo la humedad. Vórtice suavemente.
    2. Agregue 2250 μl de aceite de girasol esterilizado en autoclave para preparar 10 mg / ml de solución de progesterona debajo del capó.
    3. Vortex durante aproximadamente 5 min a velocidad máxima, alícuota y almacenar a 4 ° C. Tenga en cuenta que la solución es clara cuando se almacena.
  3. Administración de tamoxifeno
    NOTA: Se estimó el desarrollo embrionario considerando el día de la formación del tapón vaginal como día embrionario (E) 0,5. La recombinación se induce por inyección única a E8,5En embarazadas hembras MeriCreMer Csf1r 12 . Suplemento OH-TAM con 37,5 μ g por g de Progesterona para reducir las tasas de aborto después de la administración de tamoxifeno. Inyectar a la 1 pm (para tapón vaginal observado en la mañana).
    1. En la mañana de la inyección, sonicar una alícuota de la solución de OH-TAM durante 10 min (o hasta resuspender completamente).
    2. Añadir 360 μL de NaCl al 0,9% bajo la humedad para obtener una solución de OH-TAM de 10 mg / ml y agitar bien el vórtice. Sonicar hasta que la solución es clara y completamente resuspendido (al menos 30 min).
    3. Pre-caliente la progesterona a temperatura ambiente.
    4. Mezcle 450 μL de OH-TAM y 225 μL de progesterona en un tubo de microcentrífuga. Vórtice.
    5. Sonicar al menos 10 minutos y cargar en una jeringa de 1 ml con una aguja de 25G.
    6. En las instalaciones de los animales, pesa la hembra embarazada ( Csf1r MeriCreMer las hembras están en un fondo genético FVB consanguíneo y el peso típico entre betweEn 25 y 33 g).
    7. Realice una inyección intraperitoneal inyectando lentamente el volumen calculado en el ratón. Después de retirar la aguja, presione suavemente la herida punzante y masajee el abdomen para distribuir el OH-TAM.
      NOTA: La dosis de inyección de OH-TAM es de 75 mg / kg y la de progesterona es de 37,5 mg / kg. La Tabla 1 proporciona el volumen a inyectar en mujeres embarazadas.
</ Tr>
Peso del ratón (g) Volumen total a inyectar de la mezcla (μL)
25 281
26 292
27 303
28 315
29 326
30 338
31 348
32 360
33 371
34 382
35 394

TABLA 1 Volumen de inyección de 4-OH-tamoxifeno (OH-TAM). Volumen requerido para una sola inyección a E8,5 de 75 μg por g (peso corporal) de OH-TAM suplementado con 37,5 μg por g de progesterona.

2. Disección del saco de yema de huevo (YS) y del hígado fetal (FL)

NOTA: Las técnicas estériles rigurosas no son necesarias cuando se manipulan embriones a menos que se vayan a utilizar para la cultura a largo plazo. Sin embargo, el área de trabajo debe estar limpia y cubierta con papel absorbente.

  1. Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada y mezcla de digestión (PBS que contiene 1 mg / ml de colagenasa D, 100 U / ml de desoxirribonucleasa I (DNasa I) y 3% de suero fetal bovino).
  2. Sacrificar a mujeres embarazadas por cerVial en el día de gestación requerido ( p . Ej. Estadio embrionario E10.5).
  3. Pellizque la piel justo por encima de los genitales y haga una pequeña incisión en la línea media con unas tijeras. Tire de la piel hacia la cabeza para exponer completamente la pared del cuerpo sin piel. Cortar los músculos abdominales para exponer los órganos internos y empujar el intestino para exponer los dos cuernos uterinos.
  4. Con fórceps de tamaño mediano, agarre la almohadilla de grasa unida al ovario y tire suavemente del útero. Corte a nivel cervical de los cuernos uterinos y levante los cuernos de la cavidad peritoneal. Retire la almohadilla de grasa para liberar completamente los cuernos uterinos y corte los cuernos del ovario en cada lado.
  5. Ponga los cuernos en PBS helado en una placa de Petri de 10 mm. Agarre rápidamente las capas del músculo del útero en una extremidad (extremo cervical) y deslice las tijeras finas entre la capa del músculo y el tejido decidual para liberar los embriones con el tejido decidual circundante.
    NOTA: Los músculos tienden a contraerse rápidamenteR la extracción, por lo que este paso debe ser lo más rápido posible.
  6. Utilice un par de pinzas finas para cortar la membrana de Reichert y la placenta.
  7. Retire suavemente el saco vitelino y colóquelo en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con 0,5 ml de mezcla de digestión.
    NOTA: En este paso, se puede recolectar sangre embrionaria.
    1. Inmediatamente después de separar los vasos umbilicales y vitelinos, transferir el embrión a una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos que contenía ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) enfriado con hielo 10 mM. Decapitar el embrión con tijera fina aguda, tratando de limitar lo más posible la dilaceración de los tejidos. Incubar en hielo durante 10-15 min y recoger el EDTA que contiene la sangre.
  8. Quite el amnio que rodea al embrión.
  9. Para las etapas <E11.5, cuente el número de pares de somitas para una mejor estadificación de los embriones y una mejor resolución temporal (cada par somite se desarrolla en ~ 1 h 30 min).
  10. Cortar la cabeza del embrión nosotrosPinzas o tijeras finas. Transferir la cabeza a una placa de 24 pocillos con 0,5 ml de mezcla de digestión.
    NOTA: El neuroectodermo y el cerebro en etapas posteriores se diseccionan adicionalmente para análisis de citometría de flujo; Retire cuidadosamente el plexo vascular circundante.
  11. Cortar el embrión por encima del miembro posterior y quitar los miembros anteriores.
  12. Para aislar el hígado, abra el tórax usando un par de pinzas finas. Pellizque antes hacia el corazón y tire suavemente mientras usa la segunda pinza para liberar los órganos del cuerpo.
    1. Separar cuidadosamente el hígado fetal del corazón y el intestino. Transferir el hígado fetal a una placa de 24 pocillos con 0,5 ml de mezcla de digestión. Vigilar cuidadosamente la transferencia bajo el microscopio de disección.
  13. Recoger la región de la cola (o cualquier otra parte del embrión) para genotipificación mediante el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
    NOTA: Otros tejidos y órganos pueden ser cosechados de embriones E10.5 para un análisis similar usando citometría de flujo. Sangre, cabeza de esquíN, región aorta-gónada-mesonefrosa (AGM), corazón y neuroectodermo se pueden recoger en E10.5. En etapas posteriores, también se pueden recoger pulmón, riñón, bazo y páncreas. Una descripción detallada de la disección de la AGM en diferentes etapas de desarrollo se ha descrito anteriormente [ 14] .

3. Procesamiento de tejidos embrionarios para citometría de flujo

  1. Incubar los órganos (colocados en la mezcla de digestión) durante 30 min a 37 ° C.
  2. Transferir el tejido y la solución enzimática a un colador de 100 μm colocado en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos llena con 6 ml de tampón FACS (albúmina de suero bovino al 0,5% (BSA) y EDTA 2 mM en 1x PBS). Disociar mecánicamente suavemente macerando con el émbolo de caucho negro de una jeringa de 2 ml para obtener una suspensión de una sola célula.
    NOTA: De ahora en adelante, todos los pasos deben ser realizados a 4 ° C.
  3. Recoger la suspensión celular con una pipeta Pasteur y transferirla a un tubo de 15 mL.
  4. SpiN durante 7 min a 320 xg a 4 ° C. Desechar el sobrenadante por aspiración.
  5. Resuspender el sedimento en 60 mu l de tampón de bloqueo Fc (anticuerpo bloqueante CD16 / CD32 diluido 1/50 en tampón FACS).
    1. Transferir 50 μl de la suspensión de una sola célula por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Incubar durante al menos 15 minutos en hielo.
      NOTA: La tinción también puede realizarse en tubos FACS de poliestireno de 5 mL cuando se manipula un pequeño número de muestras.
    2. Transfiera los 10 μl restantes a un tubo FACS de poliestireno de 5 ml para obtener un conjunto de muestras de cada tejido. Esta piscina servirá como controles ( es decir, muestras sin color y controles fluorescentes menos uno (FMO) para cada fluorocromo). Transferir 50 μL de la piscina para cada uno de los controles fluorescentes menos uno (FMO) (uno por fluorocromo) a la placa de 96 pocillos múltiples.
      NOTA: Cada control de FMO contiene todos los anticuerpos acoplados con fluorocromo del panel de anticuerpos, excepto el unoQue se está midiendo. Los FMO se utilizan para identificar los límites de las puertas y para controlar la superposición espectral en los paneles multicolor. Para abordar correctamente las variaciones en el fondo y la autofluorescencia entre diferentes tejidos, es importante preparar estos controles del conjunto de muestras de cada tejido. El control apropiado para la expresión de YFP serán las muestras de embriones Cre-negativos, que se confirman por genotipificación de PCR.

4. Tinción del antígeno de superficie

  1. Preparar la mezcla de anticuerpos en tampón FACS (Tabla 2). Preparar 50 μl de mezcla de anticuerpos por muestra.
    1. Utilizar los siguientes anticuerpos acoplados al fluorocromo: anti-CD45.2 (clon 104); Anti - CD11b (clon M1 / ​​70); Anti - F4 / 80 (clon BM8); Anti - AA4.1 (clon AA4.1); Anti - Kit (clon 2B8); Y anti - Ter119 (clon Ter119).
    2. Preparar seis mezclas de anticuerpos para los controles FMO en tampón FACS. Preparar 50 μL de mezcla de anticuerpos por muestra de control.
      NOTE: La dilución de anticuerpos en la mezcla de anticuerpos es dos veces más concentrada que la concentración final indicada en la tabla de materiales. Para un panel con seis anticuerpos acoplados con fluorocromo, se preparan 6 controles de FMO. La Tabla 2 proporciona la composición de la mezcla de anticuerpos y controles FMO para un tubo.
Volumen (μl) de anticuerpo (Volumen Final 50 μL)
Anticuerpo Clon Mezcla de anticuerpos FMO CD45.2 FMO CD11b FMO F4 / 80 FMO AA4.1 Kit FMO FMO Ter119
Anti-CD45.2 104 1 0 1 1 1 1 1
Anti-CD11b M1 / 70 0,5 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,5
Anti-F4 / 80 BM8 1 1 1 0 1 1 1
Anti-AA4.1 AA4.1 1 1 1 1 0 1 1
Anti-kit 2B8 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,5
Anti-Ter119 Ter119 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0
Tampón FACS 45,5 46,5 46 46,5 46,5 46 46

Tabla 2: Volumen de anticuerpos usando para tinción y controles fluorescentes menos uno (FMO). Volumen (μl) de anticuerpo requerido para un volumen final de 50 μl.

  1. Añadir 50 μl de la mezcla de anticuerpos a las muestras en la placa de 96 pocillos múltiples (el volumen final durante la tinción es de 100 μl). Pipetar suavemente hacia arriba y hacia abajo dos veces e incubar en hielo durante 30 min.
  2. Girar la placa de 96 pocillos múltiples durante 7 min a 320 xg a 4 ° C y descartar el sobrenadante. Resuspender en 200 μl de tampón FACS.
  3. Repetir el procedimiento de lavado (paso 4.3) dos veces con 150 μl de tampón FACS.
  4. Filtrar las muestras y los controles (FMOs y muestras sin revestimiento) en tubos de poliestireno de 5 ml a través de un filtro de 70 μm. Almacenar en hielo hasta la adquisición.

5. Identificación de EMPs y macrófagos derivados de YS por citometría de flujo

NOTA: Este protocolo se optimizó utilizando un ecuador de flujo láser de 4 eqUipped con un láser violeta de 405 nm, un láser azul 488 nm, un láser amarillo 562 nm y un láser rojo 638 nm.

  1. Prepare perlas de compensación para cada anticuerpo acoplado siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilice muestras sin contener y perlas de compensación para optimizar las intensidades del láser.
  2. Para identificar los límites de la puerta, utilice controles FMO (Fluorescencia menos uno) para cada anticuerpo.
  3. Para excluir células muertas, añadir 1 μl de DAPI (1 mg / ml) al tubo (que contiene 200 μl de suspensión de células teñidas) 1 min antes de la adquisición. Utilice la fuerte señal DAPI y el parámetro de dispersión directa (FSC) para realizar la exclusión de las células muertas y los desechos.
    NOTA: Utilice software del citómetro de flujo para extraer puertas durante la adquisición. La matriz de compensación y el análisis se pueden realizar después de la adquisición de la muestra usando otro software comercialmente disponible.
  4. Utilice la dispersión directa y lateral (FSC vs SSC) para realizar la discriminación de células vivas y dobletes de los eventos totales.
  5. Crear gráficos de puntos de fluorescencia en el eje log-escala y dibujar puertas hija para, primero, excluir eritrocitos (Ter119 +) y, a continuación, para identificar las células progenitoras (Kit +) y células hematopoyéticas (CD45 + neg Kit) (Ver Figura 1).
  6. Crear histogramas de fluorescencia para cuantificar la eficiencia de etiquetado de YFP entre las diferentes poblaciones identificadas en el YS ( Figura 2 ], el hígado fetal ( Figura 3 ] y el cerebro ( Figura 4 ].

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Representative Results

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El mapeo genético del destino se logró mediante la administración a E8.5 de OH-TAM en hembras Csf1r-Mer-iCre-Mer apareadas con machos portadores de un reportero Rosa26-LSL-eYFP. En presencia de OH-TAM, la escisión del casete de parada conduce a la expresión permanente de YFP en las células que expresan Csf1r . Se recogieron dos tejidos hematopoyéticos: el saco vitelino y el hígado fetal y un tejido no hematopoyético, el neuroectodermo, de los embriones en E10.5. Las suspensiones monocelulares se obtuvieron por disociación enzimática y mecánica y las muestras se analizaron por citometría de flujo después de tinción con anticuerpos acoplados por fluorescencia. Después de la exclusión de células muertas y dobletes, se analizaron suspensiones de células individuales ( Figura 1 ). Todas las puertas se definieron utilizando Fluorescence Minus One (FMO) controles. Se recomienda realizar también una exclusión de eritrocitos (células Ter119 + ) para mejorar la claridad del análisis ( Figura 1B + CD45 neg ; Kit + CD45 bajo y Kit negativo CD45 + ( Figura 1 ). Los progenitores se analizaron adicionalmente basándose en su expresión de AA4.1 ( Figuras 2-4 ). De hecho, AA4.1 es un marcador de superficie que permite el enriquecimiento de la población progenitora dentro de los progenitores eritromeloideos en el saco vitelino, como se demuestra en los ensayos de formación de colonias [ 15] . Una vez identificadas las poblaciones de interés, se cuantificó la eficiencia de etiquetado de YFP en cada población usando histogramas. Entre el saco vitelino poblaciones de células CD45 bajo (Figura 2B) Kit + progenitores, tanto CD45 neg (Figura 2A) y contienen células AA4.1 + YFP +. Sin embargo, AA4.1 + YFP <Sup> + en el hígado y el cerebro sólo se encuentran en el Kit + CD45 población progenitora baja ( Figura 3B y 4B ). Dado que el cerebro no es un sitio activo de hematopoyesis, los progenitores encontrados en este tejido podrían corresponder a progenitores circulantes. Esto también sugiere un proceso de maduración de los progenitores a medida que migran desde el saco vitelino hacia el hígado fetal y los tejidos periféricos. Los progenitores de Kit + expresan primero AA4.1, independientemente de la expresión de CD45, pero al llegar a la circulación y al hígado fetal, todos los progenitores AA4.1 + YFP + expresan niveles detectables de CD45 de la superficie celular. Los macrófagos, definidos como F4 / 80 CD11b + brillante , se encontraron en la puerta Kit neg CD45 + ( Figura 2-4 ). Los macrófagos en el saco de vitelo E10.5, el hígado y el cerebro fueron etiquetados eficientemente (60 a 80% de F4 / 80 células CD11b + brillantes son YFP + ) b Ya una sola administración de OH - TAM a E8,5 ( Figura 2C , 3C y 4C ).

Para comparar la eficiencia del etiquetado entre las camadas, se recomienda utilizar un control interno para la eficiencia de recombinación. Variabilidad en el nivel de expresión del reportero se puede observar entre los experimentos, debido a las variaciones en el tiempo de desarrollo entre litros y cepas de ratón cuando OH-TAM se inyecta en el útero . Por lo tanto, se recomienda que el embrión estadificación de E8.5 a E11.5 embriones se realiza por somite par de recuento. En este protocolo, se propone utilizar la eficiencia de etiquetado en los macrófagos residentes en el cerebro (microglia) como una referencia para comparar la eficiencia de la recombinación Cre entre diferentes experimentos y cepas ( Figura 4C ). Otros macrófagos residentes podrían ser utilizados, sin embargo microglia fueron las primeras células que se describen como macrófagos derivados del saco vitelinoEf "> 16 y representan la población más abundante de macrófagos residentes en el tejido en E10.5 Por lo tanto, el etiquetado YFP en microglia se puede utilizar para evaluar la eficacia del mapa de destino en cada experimento y comparar los datos de diferentes camadas.

Figura 1
Figura 1: Estrategia de Gating para identificar células progenitoras (Kit + CD45 negativo y Kit + CD45 bajo ) y células hematopoyéticas diferenciadas (Kit neg CD45 + ). ( A ) La discriminación de células vivas y singulares se realiza usando los parámetros de tinción DAPI y de dispersión directa y lateral (FSC / SSC). ( B ) Tras la exclusión de glóbulos rojos (Ter119 neg ), se identifican tres poblaciones de células de interés basadas en la expresión de la superficie celular de Kit y CD45: Kit + CD45 neg ; Kit + CD45 bajo neg CD45 + . ( C ) Las células que expresan Csf1r se presentan cuando se inyecta OH-TAM y su progenie se identifican en embriones positivos a Cre-recombinase como expresando YFP en comparación con los embriones negativos a Cre-recombinase (confirmados posteriormente por el ensayo de reacción en cadena de polimerasa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Eficacia de etiquetado en el saco vitelino de E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embriones pulsados ​​con OH-TAM en E8.5. ( A ) Se administran células Kit + CD45 negativo basándose en la expresión de Kit y CD45 en células de saco vitelino vivo (puerta azul, panel izquierdo). AA4.1 y la expresión del kit en células Kit + CD45 neg . BluLa puerta E incluye células AA4.1 + Kit + CD45 neg (panel del medio). Comparación de etiquetado YFP en células NEG Kit + CD45 (panel derecho) en Cre controles negativos (negro) y muestras positivas Cre (verde) AA4.1 +. Los histogramas representan el porcentaje de células (eje y) positivo para la señal YFP (eje x). ( B ) Kit + células CD45 de bajo se basan en Kit y CD45 expresión (puerta azul, panel izquierdo). AA4.1 y el kit de expresión de Kit + células CD45 bajas. Puerta azul encierra EMP, como define como AA4.1 + Kit + células de baja CD45 (panel central). Comparación del etiquetado YFP en células bajas AA4.1 + Kit + CD45 (panel derecho) en controles negativos Cre (negro) y muestras positivas Cre (verde). Los histogramas representan el porcentaje de células (eje y) positivo para la señal YFP (eje x). ( C ) Las células hematopoyéticas se definen como Kit neg CD45 neg CD45 + . Los macrófagos se definen como células CD11b + brillantes F4 / 80 (panel del medio). Comparación del marcaje de YFP en macrófagos CD11b + brillantes F4 / 80 (panel derecho) en controles negativos Cre (negro) y muestras positivas Cre (verde). Los histogramas representan el porcentaje de células (eje y) positivo para la señal YFP (eje x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Eficacia de etiquetado en el hígado de E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embriones pulsados ​​con OH-TAM en E8.5. ( A ) Las células de kit + CD45 neg se bloquean basándose en Kit y CD45Expresión en células de hígado vivo (puerta azul, panel izquierdo). AA4.1 y la expresión del kit en células Kit + CD45 neg . El portón azul contiene células AA4.1 + Kit + CD45 neg (panel intermedio). Comparación de etiquetado YFP en células NEG Kit + CD45 (panel derecho) en Cre controles negativos (negro) y muestras positivas Cre (verde) AA4.1 +. Los histogramas representan el porcentaje de células (eje y) positivo para la señal YFP (eje x). ( B ) Kit + células CD45 de bajo se basan en Kit y CD45 expresión (puerta azul, panel izquierdo). AA4.1 y el kit de expresión de Kit + células CD45 bajas. Puerta azul encierra EMP, como define como AA4.1 + Kit + células de baja CD45 (panel central). Comparación del etiquetado YFP en células bajas AA4.1 + Kit + CD45 (panel derecho) en controles negativos Cre (negro) y muestras positivas Cre (verde). Los histogramas representan el porcentaje deCélulas (eje y) positivas para la señal YFP (eje x). ( C ) Las células hematopoyéticas se definen como Kit neg CD45 + y se conectan en azul (panel izquierdo). F4 / 80 y CD11b en células Kit neg CD45 + . Los macrófagos se definen como células CD11b + brillantes F4 / 80 (panel del medio). Comparación del marcaje de YFP en macrófagos CD11b + brillantes F4 / 80 (panel derecho) en controles negativos Cre (negro) y muestras positivas Cre (verde). Los histogramas representan el porcentaje de células (eje y) positivo para la señal YFP (eje x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Eficacia de etiquetado en el cerebro a partir de E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospuLsed con OH-TAM en E8.5. ( A ) Las células de kit + CD45 neg se bloquean basándose en la expresión de Kit y CD45 en células de cerebro vivas (puerta azul, panel izquierdo). AA4.1 y la expresión del kit en células Kit + CD45 neg . El portón azul contiene células AA4.1 + Kit + CD45 neg (panel intermedio). Comparación de etiquetado YFP en células NEG Kit + CD45 (panel derecho) en Cre controles negativos (negro) y muestras positivas Cre (verde) AA4.1 +. Los histogramas representan el porcentaje de células (eje y) positivo para la señal YFP (eje x). ( B ) Kit + células CD45 de bajo se basan en Kit y CD45 expresión (puerta azul, panel izquierdo). AA4.1 y el kit de expresión de Kit + células CD45 bajas. Puerta azul encierra EMP, como define como AA4.1 + Kit + células de baja CD45 (panel central). Comparación del etiquetado YFP en AA4.1 + Kit + CD45 bajo C ) Las células hematopoyéticas se definen como Kit neg CD45 + y se conectan en azul (panel izquierdo). F4 / 80 y CD11b en células Kit neg CD45 + . Los macrófagos se definen como células CD11b + brillantes F4 / 80 (panel del medio). Comparación del marcaje de YFP en macrófagos CD11b + brillantes F4 / 80 (panel derecho) en controles negativos Cre (negro) y muestras positivas Cre (verde). Los histogramas representan el porcentaje de células (eje y) positivo para la señal YFP (eje x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Las diferentes ondas de células precursoras hematopoyéticas se solapan parcialmente en un corto período de tiempo, lo que hace que el análisis de la contribución de cada onda de hematopoyesis de desarrollo a las células inmunológicas sea técnicamente muy difícil.

Los sistemas de Cre inducibles con tamoxifeno ofrecen la oportunidad de marcar células específicas de una manera inducible en el tiempo y realizar análisis de linaje en embriones o adultos, sin necesidad de cultivo ex vivo o in vitro o trasplante. En cepas de Cre inducibles por tamoxifeno, se crea un gen de fusión entre una recombinasa Cre recombinante bacteriana y una forma mutante del dominio de unión al ligando del receptor de estrógenos humano (CRE-ER) o entre un mutante de Cre de un punto mutante mejorado y dos receptores de estrógeno de ratón (Mer-iCre-Mer). La fusión de Cre con receptores de estrógeno conduce al secuestro citoplásmico de Cre por Hsp90, evitando así la recombinación nuclear mediada por Cre. El tamoxifeno (TAM) es metabolizado por elE hígado en 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), su metabolito activo con alta afinidad de unión para el receptor de estrógenos. La unión OH-TAM a la fusión Cre conduce a la interrupción de la interacción con Hsp90, permitiendo su translocación al núcleo y la iniciación de la recombinación mediada por Cre. Se ha demostrado que la inyección de TAM o OH-TAM in útero en mujeres embarazadas activa la recombinación en el embrión en desarrollo. La administración de tamoxifeno durante el embarazo puede conducir al aborto y, por lo tanto, reduce el tamaño de la camada, pero también evita el parto si se entrega después de la mitad de la gestación, en cuyo caso se debe administrar el parto a través de una cesárea. Para contrarrestar los efectos del tamoxifeno durante el embarazo, complementamos la administración de OH-TAM con una media dosis de progesterona, con el fin de mejorar la supervivencia de los embriones y reducir el riesgo de abortos 17 .

Se pueden emplear varias vías para administrar TAM o OH-TAM a mujeres embarazadas. Actualmente gava oralSe utiliza inyección intraperitoneal o intraperitoneal (ip) para el tamoxifeno. OH-TAM tiene la ventaja de estar inmediatamente disponible, ya que no requiere ser metabolizado por el hígado de la presa embarazada. Sin embargo, aunque el tamoxifeno es muy fácil de disolver en el aceite de maíz, el OH-TAM es muy difícil de preparar usando la misma técnica y resulta en una emulsión. Esto ha sido un paso limitante en el empleo de OH-TAM para el marcado de pulso in utero . Hemos adaptado el protocolo para la preparación de OH-TAM desarrollado por el grupo de JF Nicolas 13 , donde se utiliza el aceite de ricino PEG-35, un disolvente con propiedades anfifílicas para solubilizar OH-TAM, ya que la disolución del tamoxifeno es una de las etapas más críticas En el procedimiento. Esto permite una preparación reproducible y óptima de OH-TAM y acorta considerablemente el tiempo de preparación del tamoxifeno. Además, es necesario adaptar la concentración de OH-TAM para inyectar cuando se usan diferentes cepas inducibles de Cre. La combinación de un colorante de viabilidad (DAPI) y el tamaño (FSC) es crítico para eliminar las células muertas y los desechos celulares, respectivamente. Las células muertas y los desechos son altamente autofluorescentes en la mayoría de los detectores láser violeta, azul y rojo, y pueden obstaculizar el análisis de citometría de flujo. Además, no se recomienda fijar las células después de la tinción antes del análisis con el citómetro de flujo. La fijación puede conducir a cambios en la morfología de las células y, por lo tanto, dificulta la discriminación de tamaños basada en la dispersión directa y lateral (FSC vs. SSC). Además, la fijación de muestras con PFA conduce a una pérdida significativa de la intensidad fluorescente YFP.

La principal limitación dentro de este protocolo es que las poblaciones no son probadas en su funcionalidad y potencial de diferenciación. Para superar esto, las células pueden clasificarse siguiendo un protocolo similar usando un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) para realizar el ensayo de formación de colonias. En este caso, el procedimiento debe realizarse en condiciones estériles y el uso de suero fetal bovino (FBS) en el tampón FACS, en lugar de BSA, es altamente recomendable. La escasa eficacia de marcaje lograda con esta técnica y el consiguiente número bajo de células YFP + de interés por tejido embrionario es un desafío importante en el estudio del fenotipo EMP. Este protocolo utiliza un citómetro de flujo de 4 láser. También puede usarse un citómetro de flujo con 3 láseres, pero es importante adaptar el panel de anticuerpos para tener en cuenta el aumento de la superposición espectral entre tintes. Adicionalmente, se requiere titulación de anticuerpos para encontrar la concentración apropiada al cambiar el panel de anticuerpos y se recomienda realizar la titulación de anticuerpos y la validación del nuevo panel de anticuerpos en un experimento piloto en el que se agrupan todos los embriones por tejido con el fin de aumentar el número de anticuerpos Células analizadas por tejido.

El campo de la biología del desarrollo ha sido revolucionado por el método Cre / Lox, que permite el etiquetado permanente de las células in situ . Este enfoque lograTipo de tejido o célula-especificidad a través de la expresión de la recombinasa Cre bajo el control de un promotor específico. En nuestro caso, se optó por estudiar la expresión de la Cre recombinasa bajo el control del promotor de Csf1r (Colony Stimulating Factor 1 Receptor), un importante factor mitogénico y factor de crecimiento para los macrófagos y sus progenitores, utilizando una cepa desarrollada por el grupo De J. Pollard 18 . La ventaja de una estrategia de cartografía de destino basada en la expresión de Csf1r en comparación con otras estrategias publicadas es que permite el etiquetado de células derivadas de sacos de yema (EMP y macrófagos) sin etiquetar ningún HSC fetal [ 12] . La cepa Cx3cr1 CreERT2 también puede etiquetar las células del saco de yema sin etiquetar HSCs 19 , sin embargo, sólo puede etiquetar macrófagos y precursores de macrófagos, pero no etiqueta EMP progenitores 1 . La cepa Cx3cr1 CreERT2 tiene la misma advertencia que la Csf1r MerCreMer 16 como en Kit MerCreMer 20 , las células sanguíneas periféricas se etiquetan siempre en adultos, aunque con una eficiencia muy baja, demostrando así el etiquetado de HSC durante el desarrollo. Además, Kit MerCreMer cartografía de etiquetas yolk sac Kit + Sca1 + progenitores mientras que EMP son Kit + Sca1 negativo 11 . La cepa Csf1r MeriCreMer no es un knock-in pero fue generada por la transgénesis aditiva clásica, por lo tanto la expresión de la Cre no puede recapitular completamente la expresión endógena de Csf1r. Sin embargo, esto tiene la ventaja de evitar cualquier posible defecto de desarrollo debido a la expresión heterocigota de Csf1r. Este es un factor importante a tener en cuenta al analizarOtras estrategias de asignación de destino utilizadas para estudios de hematopoyesis de desarrollo, tales como Runx1 MerCreMer , Kit MerCreMer y Cx3cr1 CreERT2 , donde el Cre inducible se inserta en el locus endógeno. Tanto para Runx1 MerCreMer como para Kit MerCreMer , se han descrito defectos hematopoyéticos de desarrollo en embriones heterocigóticos. En conjunto, el método presentado aquí permite investigar la biología EMP del saco vitelino durante el desarrollo y también los macrófagos derivados del saco vitelino encontrados en tejidos adultos y distintos de los macrófagos derivados de HSC. Esto mejorará nuestra comprensión actual de este linaje de macrófagos residentes y sus funciones específicas en la edad adulta. La caracterización inmunofenotípica de EMP ha sido mejorado recientemente utilizando clasificación de células y ensayos de formación de colonias, lo que demuestra que el saco de yema EMP específicamente expresar CD41 y CD16 / 32 en las primeras etapas de desarrollo [ 11] . Sin embargo, la especificidad de expresión de CD41Y CD16 / 32 necesita una caracterización adicional a partir de E10.5 en adelante, especialmente en el nicho de hígado fetal, usando modelos de mapeo de destino. De hecho, si la expresión de CD41 y CD16 / 32 es todavía específica para EMP cuando se compara con HSC fetal y progenitores derivados de HSC en el hígado fetal E10.5 a E14.5 necesitan ser aclaradas. El método presentado permite etiquetar la EMP generada en el saco vitelino y seguirlas durante el desarrollo embrionario y contribuirá a una caracterización más detallada del fenotipo EMP cuando sembran el hígado fetal.

Este método podría ser importante en un futuro próximo para estudiar las vías de diferenciación EMP. Mientras EMP emergen del endotelio del saco vitelino de E8.5 a E10.5 4, este método sólo permite etiquetar una fracción de los progenitores emergentes entre E8.5-E9.5. Por lo tanto, una limitación de este método es que sólo una pequeña fracción de EMP está etiquetado, lo que dificulta el análisis en estudios clásicos de pérdida de función con alelos floxed para cAndidate genes. Alternativamente, el etiquetado escaso podría convertirse en una ventaja en estudios clonales de diferenciación de EMP in vivo , usando reportero clonal. Sin embargo, la eficiencia de etiquetado necesita ser caracterizada para cada reportero floxed o alelo floxed utilizado, ya que la eficiencia de recombinación de las construcciones floxed depende del locus genómico (alelos floxed) o del constructor reportero Rosa26. De hecho, diferentes líneas de reportero Rosa26 están disponibles con diferentes promotores y se ha informado que Rosa26 tdTomato y Rosa26 mTmG cepa tienen mayor eficacia de recombinación que la línea Rosa26 LSL-eYFP . La cepa de ratón reportero usada en este protocolo es la línea Rosa26 LSL-eYFP , la cual no puede proporcionar información sobre el proceso dinámico de maduración de progenitor mencionado en la sección de resultados. La cuestión del proceso de maduración se puede abordar parcialmente usando diferentes cepas de reportero como el Rosa26 mTmG . En tal cepa, las células pueden ser distantesBasado en el tiempo transcurrido desde el evento de recombinación. Todas las células de la cepa Rosa26 mTmG expresan la proteína fluorescente tdTomato ligada a la membrana y la recombinación de Cre excita el casete tdTomato y permite la expresión de la GFP unida a la membrana. Desde tdTomato tiene una larga vida media, las células que todavía contienen tdTomato pero han comenzado a expresar la GFP (poco después de la recombinación) son tdTomato + GFP baja / int y se puede distinguir de tdTomato neg GFP + células que no expresan tdTomato más y Expresan niveles más altos de GFP (más tarde después de la recombinación).

Como se discutió anteriormente, la preparación de OH-TAM es un paso crítico para administrar consistentemente dosis similares de OH-TAM entre experimentos y para reducir los efectos secundarios de tamoxifeno. La coadministración de progesterona también es útil para limitar el efecto deletéreo del tamoxifeno en el embarazo. Otro elemento crítico del protocolo es la viabilidad del suspensio de una sola célulaN obtenidos de diferentes tejidos embrionarios. Usualmente obtenemos> 90% de células viables para el análisis de citometría de flujo. Para lograr esto, es crítico seguir todos los pasos rápidamente y mantener todas las muestras en hielo después de la recolección de tejido. Se requieren controles apropiados tales como muestras sin tinte, manchas únicas y controles fluorescentes menos uno (FMO) para identificar los límites de la puerta y para controlar la superposición espectral en paneles multicolor. Los cambios en el anticuerpo necesitan ser validados en términos de titulación de anticuerpos y superposición espectral. Por último, la elección de la cepa Rosa26 reportero necesita ser adaptada a la pregunta científica que se investiga.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen al Prof. Frédéric Geissmann y al Profesor Christian Schulz por las discusiones perspicaces; Dr Hannah Garner para la lectura crítica del manuscrito, el Dr. Xavier Montagutelli y el Dr. Jean Jaubert y el personal de la instalación de animales del Instituto Pasteur para el apoyo con la cría de ratón; Y Pascal Dardenne y Vytaute Boreikaite, becario de Amgen, por su asistencia técnica. La investigación en el laboratorio de EGP está financiada por el Institut Pasteur, el CNRS, el Cercle FSER (FRM) y un paquete inicial del Institut Pasteur y el consorcio REVIVE, que cuenta con el apoyo de una beca de doctorado del consorcio REVIVE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 Straight Forceps Fine Science Tools 11251-20
MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors  Fine Science Tools 15371-92
8.5 cm straight scissors Fine Science Tools 14090-09
Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) BD Pharmingen 553355 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) Sony 1149120 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) eBioscience 17-5892 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) Biolegend 560512 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) BD Pharmingen 123137 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) BD Pharmingen 552850 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) BD Biosciences 553142
PBS 1x Fischer Scientific 12559069
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 11570506
Collagenase D  Roche 11088882001
Deoxyribonuclease I Sigma D4527-20KU
6-well tissue culture plate Dutscher Dominique 353046
12-well tissue culture plate Dutscher Dominique 353224
24-well tissue culture plate Fischer Scientific 11874235
96 wells U-shape bottom tissue culture plate Dutscher Dominique 353227
 Syringe Plastipak 2 mL  Dutscher Dominique 300185
Nylon grid 100 µm cell strainers Dutscher Dominique 352360
Nylon grid 70 µm cell strainers Dutscher Dominique 352350
15 ml Falcon tubes Dutscher Dominique 352096
Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm Dutscher Dominique 51246
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-500G
(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg Sigma H7904-25MG Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment
Progesterone Sigma P3972 Always use appropriate personal protective equipment
PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) Sigma C5135
Sunflower oil Sigma S5007-250ML
Ethanol  Sigma 24103-1L-R-D Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood
EDTA Sigma E9884-500G
DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) Fischer Scientific 10116287
CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer Beckman Coulter B75408
CytoFLEX Daily QC Fluorospheres Beckman Coulter  B53230
VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL) Beckman Coulter  B22804
FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J The Jackson laboratory 19098
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson laboratory 6148

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References

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Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo
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Iturri, L., Saenz Coronilla, J., Lallemand, Y., Gomez Perdiguero, E. Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55305, doi:10.3791/55305 (2017).More

Iturri, L., Saenz Coronilla, J., Lallemand, Y., Gomez Perdiguero, E. Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55305, doi:10.3791/55305 (2017).

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