Summary
ويصف المقال طريقة تزيد من الإنتاجية في حين موازنة الجهد والدقة لاستخراج الدهون من أغشية الخلايا من الكائنات الحية الدقيقة لاستخدامها في توصيف كل من الدهون الكلية والوفرة النسبية للدهون مؤشر لتحديد بنية المجتمع الميكروبية التربة في الدراسات مع العديد من العينات.
Abstract
وتعتبر المجتمعات الميكروبية من العوامل المهمة والمنظمين لعمليات النظم الإيكولوجية. لفهم كيفية إدارة النظم الإيكولوجية قد تؤثر على المجتمعات الميكروبية، وتقنية دقيقة نسبيا ولكن جهد كثيف لتقليل تكوين المجتمع الميكروبي هو تحليل الأحماض الدهنية الفوسفورية (بلفا). وقد وضعت بلفا لتحليل المؤشرات الحيوية الفوسفورية، والتي يمكن استخدامها كمؤشرات للكتلة الحيوية الميكروبية وتكوين مجموعات وظيفية واسعة من الفطريات والبكتيريا. وقد استخدمت عادة لمقارنة التربة تحت المجتمعات النباتية البديلة، والبيئة، ونظم الإدارة. وقد تبين أن طريقة بفا حساسة للكشف عن التحولات في تكوين المجتمع الميكروبي.
وقد تم تطوير طريقة بديلة، واستخلاص واستخلاص ميثيل الأحماض الدهنية (ميدي-فا) للاستخراج السريع من الدهون الكلية، دون فصل جزء الفوسفورية، من الثقافات الخالصة ك تقنية تحديد الميكروبية. هذه الطريقة هيسريع ولكن أقل ملاءمة لعينات التربة لأنها تفتقر إلى خطوة أولية تفصل جزيئات التربة وتبدأ بدلا من ذلك مع رد فعل التصبن التي من المرجح أن تنتج التحف من المادة العضوية الأساسية في التربة.
توضح هذه المقالة الطريقة التي تزيد الإنتاجية بينما موازنة الجهد والدقة لاستخراج الدهون من أغشية الخلايا من الكائنات الحية الدقيقة لاستخدامها في توصيف كل من الدهون الكلية والوفرة النسبية للدهون مؤشر لتحديد بنية المجتمع الميكروبية التربة في الدراسات مع العديد من العينات. الطريقة تجمع بين الدقة التي تحققت من خلال التنميط بلفا عن طريق استخراج وتركيز الدهون في التربة كخطوة أولى، والحد من الجهد من خلال سابونيفينغ المواد العضوية المستخرجة ومعالجة مع طريقة ميدي-فا كخطوة ثانية.
Introduction
ونظرا للدور الرئيسي للكائنات المجهرية في دورة المغذيات 1 ، وتعديل تكوين المجتمع النباتي 2 ، وتنظيم إنتاجية النبات 3 ، وتحلل المادة العضوية 4 ، فهم المجتمعات الميكروبية للتربة أمر حيوي لفهم النظم الإيكولوجية الأرضية.
وبسبب وفرة عالية نسبيا في التربة، وتوقيعها الكيميائي، يمكن استخدام المؤشرات الحيوية للدهون لتعريف المجموعات الإيكولوجية المهيمنة التي تضم المجتمعات الميكروبية للتربة 5 . من خلال تحديد المؤشرات الحيوية للدهون التي هي سمة من مجموعات الميكروبات المختلفة، يمكننا تقدير الدهون الكلية، ومن ثم فصل هذه الدهون في المجموعات ذات الصلة إيكولوجيا مثل الجرام إيجابية (غم +) والبكتيريا السالبة الغرام (غم)، الفطريات الفطرية (آم) و سابروتروفيك الفطريات، و أكتينوميستس 5 ، سس = "كريف"> 6 ، 7 ، 8 .
هناك العديد من الطرق لتوصيف جوانب المجتمعات الميكروبية. طريقة بلفا هي واحدة تستخدم عادة لفهم بنية المجتمع الميكروبية الأساسية. بل هو وسيلة فعالة لتقييم وفرة النسبية من المجموعات الميكروبية وكذلك الكتلة الحيوية الميكروبية الكلية. بسبب دوران الدهون السريع، كما يسمح التنميط بلفا نسبيا الكشف السريع للتغيرات في المجتمع الميكروبي التربة ويعطي المعلومات التي تسمح المقارنة بين وظيفة النظام الإيكولوجي، على سبيل المثال، الفطرية: نسب البكتيريا لتقييم معدلات الدراجات المغذية 1 ، 9 ، 10 . ومع ذلك، في حين أن طريقة استخراج بلفا هي وقت تكريم ويحظى باحترام جيد، بل هو أيضا مضيعة للوقت ولا يفي جيدا لدراسات على نطاق النظام الإيكولوجي التي تتطلب عددا كبيرا من العينات من نطاق مكرراتf "> 11 ، 12 .
في المقابل، فإن طريقة استخراج استر الميثيل الأحماض الدهنية (ميدي-فا) لديه القدرة على السماح الإنتاجية السريعة. في هذه الطريقة، يتم سابونيفيد العينات، وتحويلها إلى فام، المستخرجة، ومن ثم تحليلها. طريقة ميدي-فا سريعة ولكن أقل تمييزا من بلفا، الذي يجمع بين استخراج الدهون مع فصل فئات الدهون المختلفة 13 (الدهون الفوسفاتية، الدهون المحايدة، والسكرية).
في هذا البروتوكول، ونحن تصف الطريقة التي تجمع بين عناصر كل من بلفا و ميدي-فا التنميط الدهون. فإنه يستخدم استخراج الدهون باستخدام الخطوات الأولية استخراج الكلوروفورم من طريقة بلي و ديير المعدلة، ومن ثم التصبن والتحويل إلى فامس. وهذا يوفر وسيلة قوية للكشف عن هيكل المجتمع الميكروبي مع استبعاد الكثير من الضوضاء الخلفية من المواد غير الميكروبية 5 ، 14 15 . من خلال إجراء استخراج الأولي وعزل المكونات القابلة للذوبان العضوية ( مثل الدهون) قبل أداء ميدي-فا، واستكمال هذا مع خطوة تنقية، بروتوكول يوفر التوازن بين السرعة والدقة.
Protocol
ملاحظة: دائما ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (ب) طوال العملية. لتجنب تلوث العينات المحتملة، لا تلمس الأواني الزجاجية بأيد عارية. ارتداء القفازات المناسبة عند تشغيل بروتوكول الخطوات التي تتطلب التعامل مع الكلوروفورم.
1. التحضيرات (2 أيام ل ~ 40 عينات)
- جمع التربة في أكياس معقمة والنقل من الميدان في برودة تحتوي على الجليد. إذا لم يكن من الممكن لغرب التربة الطازجة وتجميد الجافة على الفور، وتخزين العينات في الفريزر -80 درجة مئوية حتى جاهزة لبدء التحليل.
- إعداد التربة عن طريق التجانس. إزالة الجذور والحجارة وتفتيت كلودس بواسطة النخل الخشنة (على سبيل المثال 2 مم).
- التحضير لتجميد التجفيف عن طريق وضع العينات الفرعية في حاوية مناسبة وفقا لتعليمات دليل مجفف تجميد وتجميد الجافة في أقرب وقت ممكن. مرة واحدة يتم تجميد التربة المجففة، وتخزينها في حاوية مغلقة مع المجففة حتى الاستخراج. فمن الأفضل ل sمزق تجميد التربة المجففة على الأقل -20 درجة مئوية ولكن يفضل أن يكون -80 درجة مئوية.
- في التحضير للاستخراج، إزالة تجميد التربة المجففة من التخزين وطحن إلى الاتساق مثل الدقيق. طرق لطحن تشمل الكرة مطحنة، الكرة الخافق، و هاون والمدقة. بعد طحن التربة، تخزينها في المجمد (انظر 1.3).
ملاحظة: كمية العينة المستخدمة للاستخراج يعتمد على محتوى المادة العضوية. والمبادئ التوجيهية العامة هي استخدام 0.5 إلى 1 غرام من التربة التي هي 12 إلى 18٪ من الكربون بالوزن، و 3 إلى 5 غرام لتربة 1 إلى 3٪ من الكربون بالوزن. - قبل شطف 30 مل أنابيب الطرد المركزي مع الهكسان. إضافة ما يقرب من 2 إلى 3 مل من الهكسان إلى أنابيب ودوامة لمدة 5 ثوانى. صب الهكسان إلى أنبوب آخر، ودوامة. الهكسان (2 إلى 3 مل) يمكن استخدامها لشطف متسلسل ستة أنابيب. قم بتخزين األنابيب المشطفة بالهيكسان المقلوب في غطاء الدخان والتخلص من الهكسان المستخدم في حاوية النفايات المناسبة.
- التفاف الأواني الزجاجية في 2 إلى 3 طبقات من رقائق الألومنيوم ومكان في الفرن غطس. خبز(غطس) الأواني الزجاجية في 450 درجة مئوية لمدة 4.5 ساعة.
- إعداد الكواشف.
- بالنسبة لكمية التربة المستخدمة، قم بإضافة مواد كيميائية في نسبة حجم 0.8: 1: 2 لعازلة الفوسفات (P-بوفر): تشكل 3 : ميوه.
- إعداد P- حل العازلة: الفوسفات العازلة: 0.1 M، ودرجة الحموضة 7.0.
- إضافة 61 مل من 1M K 2 هبو 4 الأسهم، العقيمة (الكيميائية يجب أن يكون أكس درجة معتمدة أو أفضل). إضافة 39 مل من 1 M خ 2 بو 4 الأسهم، العقيمة (الكيميائية يجب أن يكون أكس درجة معتمدة أو أفضل). ملء إلى 1000 مل مع نوع 1 المياه. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك. تخزين محلول غير المستخدمة لمدة تصل إلى 7 د في درجة الحرارة المحيطة أو 30 يوما في الثلاجة.
- بدلا من ذلك، تزن 10.62 غرام من K 2 هبو 4 و 5.31 غرام من خ 2 بو 4 ؛ تمييع إلى 1 لتر مع المياه من النوع 1. تحقق من الرقم الهيدروجيني، وضبط إذا لزم الأمر.
- إعداد كاشف 1، كاشف التصبن.
- الاستغناء 300 مل من نوع 1 المياه.إضافة 300 مل من تش 3 أوه (هبلك الصف أو أعلى). إضافة 90.00 غرام من هيدروكسيد الصوديوم (أكس المعتمدة أو أفضل). إضافة الكريات هيدروكسيد الصوديوم إلى الحل أثناء التحريك. يحرك حتى يذوب الكريات. فمن المستحسن لتخزين هذا الحل لا يزيد عن 30 د.
- إعداد كاشف 2، ميثيلاتيون كاشف.
- الاستغناء 275 مل من تش 3 أوه (هبلك الصف أو أعلى). إضافة 325 مل من شهادة 6.00 N هكل مع التحريك. فمن المستحسن لتخزين هذا الحل لا يزيد عن 30 د.
- إعداد كاشف 3، كاشف استخراج: 50٪ C 6 H 14 (هيكسان)، 50٪ C 5 H 12 O (متب).
- في غطاء الدخان، والجمع بين 200 مل من C 6 H 14 (هبلك الصف أو أعلى) و 200 مل من C 5 H 12 O (هبلك الصف أو أعلى). اخلط جيدا؛ غطاء بإحكام. مخزن في الاشتعال مجلس الوزراء أو الدخان غطاء محرك السيارة لمدة لا تزيد عن 1 سنة.
- إعداد كاشف 4، قاعدة كاشف غسل.
- الاستغناء 900مل من نوع 1 الماء إلى كوب. إضافة 10.80 غرام من هيدروكسيد الصوديوم (أكس معتمد أو أفضل) مع التحريك. يحرك حتى يذوب الكريات. فمن المستحسن لتخزين هذا الحل لا يزيد عن 30 د.
- إعداد حل المخزون من المعيار الداخلي.
- تزن 100 ملغ من 19: 0 معيار إي. أضف إلى 50 مل من قارورة الحجمي المشطف الهكسان. إضافة ~ 15 مل من محلول هيكسان-متب (كاشف 3) إلى قارورة، دوامة في حل. أعلى إلى 50 مل مع حل هيكسان-متب (كاشف 3). كاب ودوامة لخلط. نقل إلى أنابيب الزجاج الشطف هيكسان مع بتف اصطف قبعات وتخزينها في -20 درجة مئوية.
2. اليوم 1 - استخراج الأحماض الدهنية من التربة (4 إلى 5 ساعات ل ~ 40 عينات)
- إعداد ثلاثة 5 إلى 10 مل ماصات الاستغناء عن P- العازلة، الكلوروفورم، والميثانول.
ملاحظة: تم اقتراح بدائل خطرة أقل للكلوروفورم كمستخلصات. قد يؤدي ذلك إلى معدلات تعادل الدهون 16 ، 17 ، ولكن لا يتم تقييمها في هذا البروتوكول. - تزن التربة المجففة تجميد إلى أنابيب الطرد المركزي 30 مل وتسجيل كتلة التربة.
- قم بصنع فراغتين وضمن معيار فحص (التربة التي تم استخراجها سابقا).
- في غطاء الدخان، إضافة الكواشف إلى التربة في أنبوب الطرد المركزي في الترتيب التالي: P- العازلة، تشكل 3 ، و ميوه (الجدول 1). السماح للتربة الوقت إلى الرطب بعد إضافة P- العازلة قبل إضافة تشكل 3 . كاب أنابيب الطرد المركزي بإحكام وتغطي لحماية من الضوء.
- وضعها على شاكر أفقيا التأكد من أنها آمنة بشكل جيد. مع ضبط السرعة على 280 دورة في الدقيقة، يهز لمدة 1 ساعة 18 .
- إعداد اثنين من 16 ملم × 150 ملم أنابيب الزجاج لكل عينة على النحو التالي: تسمية أنبوب وإضافة نفس حجم تشكل 3 وحجم مساو من P- العازلة.
- إزالة أنابيب الطرد المركزي من شاكر وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1،430زغ و 25 درجة مئوية. وينبغي أن يكون فصل المرحلة مرئية في أنبوب زجاجي.
- في غطاء الدخان، صب طاف من أنبوب الطرد المركزي في واحدة من أنابيب أعدت في الخطوة 2.6. كرر الخطوات من 2.4 إلى 2.5 وصب طاف في أنبوب الثاني.
- غطاء آمن جميع أنابيب الزجاج مم 16 ملم × 150 ملم مع قبعات اصطف بتف وعكس 10 × لخلط.
- السماح للعينات للوقوف دون عائق بين عشية وضحاها لاستكمال فصل المرحلتين. للقيام بذلك، والحفاظ على العينات في الظلام مجلس الوزراء / الفضاء أو مغطاة في رقائق الألومنيوم في درجة حرارة الغرفة. فمن المقبول للسماح للمستخلصات فصل خلال عطلة نهاية الأسبوع.
- بدلا من ذلك، إذا كان أحد يرغب في الانتقال مباشرة إلى الخطوة التالية، أو إذا أخذت العينات بالانزعاج في اليوم التالي، عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1000 x ج و 25 درجة مئوية.
ملاحظة: موضوع جميع العينات ضمن مجموعة المقارنة إلى نفس الوقت فصل فصل الوقت.
- بدلا من ذلك، إذا كان أحد يرغب في الانتقال مباشرة إلى الخطوة التالية، أو إذا أخذت العينات بالانزعاج في اليوم التالي، عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1000 x ج و 25 درجة مئوية.
3 يوم2 - عزل الدهون (3 إلى 4 ساعات ل ~ 40 عينات)
- بدوره على جهاز التبخر و فخ المذيبات. تعيين جهاز التبخر إلى 33 درجة مئوية وسخن.
- إعداد الشافطة فراغ في غطاء محرك السيارة: قارورة الجانب جنبا إلى جنب مع مضخة فراغ، وطول أنابيب عالية النقاء وماصة زجاجية.
- نضح الطبقة العليا واجهة (حوالي 2/3 من الطريق إلى أسفل) من اثنين من أنابيب الزجاج، والحفاظ على الطبقة المائية. كرر العملية باستخدام ماصة نظيفة لكل عينة.
- الجمع بين الطبقات المائية من استخراج من الأنبوب الثاني مع أن في الأنبوب الأول عن طريق الصب بعناية. تأكد من أن أنبوب الصب خالية من الخدوش أو الشقوق.
- مرة واحدة يتم الجمع بين مقتطفات تشكل 3 ، فحص السائل - يجب أن يكون واضحا. إذا لم تضف ميوه حتى واضحة.
- تجف أسفل جميع العينات باستخدام جهاز التبخير فراغ. تبدأ مع إعدادات درجة الحرارة 33 درجة مئوية، ودوامة سرعة 26٪، والضغط 400 ملي بار.
- Pالدانتيل العينات في نظام التبخر وبعد 10 دقيقة ببطء خفض الضغط إلى 350 ميليبار.
- رصد التقدم وعندما يكون مستوى السائل في الأنبوب قد وصلت إلى مستوى كتلة التدفئة، وانخفاض الضغط إلى 300 ميليبار.
- الاستمرار في مراقبة ارتفاع السائل المتبقي وعندما يكون حوالي 1 سم في العمق، وانخفاض الضغط إلى 200 ميليبار.
- بعد تجفيف العينات، إزالة العينات وتشغيل المضخة لمدة 10 دقيقة إضافية لمسح الأبخرة.
- كاب أنابيب بإحكام وتخزين الدهون في الثلاجة في -80 درجة مئوية.
- تخلص من السائل المستنشق وفقا للوائح السلامة الكيميائية المعمول بها.
4. اليوم 3 - التصغير والمثيلة (6 حتي 7 ساعات ل ~ 40 عينات)
- بدوره على الحمامات المائية. تعيين حمام 1 إلى 95 درجة مئوية وحمام 2 إلى 80 درجة مئوية.
- تعيين موزعات الماصة والتأكد من أنها الاستغناء عن حجم الصحيح.
كاشف 1: 1 مل لكل عينة
كاشف 2: 2 مل لكل عينة
كاشف 3: 1.25 مل لكل عينة
كاشف 4: 3 مل لكل عينة
ملاحظة: سوف عملية التدفئة بناء الضغط في الأنبوب. لا تستخدم خدش، متصدع، أو أنابيب متكسرة. - باستخدام موزع بيبيت إضافة 1.0 مل من كاشف 1 إلى الدهون المجففة. كاب بإحكام، دوامة لمدة 5 ثوان ومكان في الرف.
- وضع رف أنابيب العينة في حمام الماء 95 درجة مئوية لمدة 5min. إزالة رف أنابيب من الحمام والتحقق من أنابيب للتسريبات، وأشار إلى فقاعات ارتفاع في الأنبوب. قم بإعادة ربط أو استبدال قبعات أنابيب التسرب، وتحقق مرة أخرى من الشقوق أو الرقائق. مواصلة تسخين أنابيب في حمام مائي لمدة 10 دقيقة إضافية.
- إزالة عينات من حمام 1 ومكان في حمام 2 (80 درجة مئوية) ومواصلة الحضانة لمدة 15 دقيقة أخرى.
- إزالة الأنابيب وتبريد العينات عن طريق وضع الرف في وعاء من مياه الصنبور للتبريد.
- إضافة 2 مل من كاشف 2 إلى كل عينة. كاب بإحكام ودوامة لمدة 5 إلى 10S. وضع الرف في حمام الماء 80 درجة مئوية واحتضان لمدة 10 دقيقة.
- إزالة رف أنابيب من حمام الماء ووضعها في مقلاة من مياه الصنبور للتبريد. يهيج الرف من أنابيب لتسريع عملية التبريد.
ملاحظة: لا تتجاوز الوقت ودرجة الحرارة. الكثير من التدفئة يمكن أن تتحلل فامز. - باستخدام موزع الماصة إضافة 1.25 مل من كاشف 3 إلى كل أنبوب عينة لاستخراج الأحماض الدهنية استرات الميثيل. كاب بإحكام ووضع أنابيب على شاكر لمدة 10 دقيقة.
- بعد الهز، والسماح للحامل من أنابيب الجلوس لمدة 10 دقيقة للمراحل لفصل. نقل المرحلة العضوية (الطبقة العليا) إلى 16 مم × 100 مم أنبوب اختبار الزجاج باستخدام ماصة الزجاج.
- كرر الاستخراج عن طريق إضافة مرة أخرى كاشف 3، والهز، والسماح مراحل لفصل، ونقل المرحلة العليا.
مالحظة ال تقم بنقل أي من املرحلة السفلى. من الجيد ترك كمية صغيرة من أعلى مرحلة في الأنبوب. - باستخدام موزع الماصة، إضافة 3 مل من كاشف 4 إلى ثه 16 مم × 100 مم أنابيب.
- كاب أنابيب الاختبار بإحكام ودوامة لمدة 20-30 ثانية.
- بعد فورتيكسينغ، أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 1000 × ز.
- باستخدام ماصة الزجاج نظيفة، نضح المرحلة العضوية العليا ونقل إلى قنينة العنبر 4- مل.
- بدوره على جهاز التبخر و فخ المذيبات. تعيين جهاز التبخر إلى 30 درجة مئوية، وسرعة دوامة إلى 26٪، والفراغ إلى 200 ميليبار، وسخن الصحافة.
- مراقبة التقدم. بعد تجفيف العينات، إزالة العينات وتشغيل المضخة لمدة 10 دقيقة إضافية لمسح الأبخرة.
- إزالة الماصة من زجاجات كاشف 1 و 4 ومضخة من خلال بعض حمض المخفف (على سبيل المثال 1٪ حمض الهيدروكلوريك)، تليها المياه دي. شطف الماصة المستخدمة ل كاشف 2 عن طريق ضخ المياه من خلال دي. في غطاء محرك السيارة، واستنزاف المذيبات من الماصة المستخدمة ل كاشف 3 في حاوية مناسبة والاحتفاظ بها في غطاء محرك السيارة حتى بقايا المذيبات قد تبخرت.
- تخزين الماصات مقلوب، مع إزالة الغطاسين لمنع ستيكينز من صمامات الاختيار.
- استخدام الماصات الزجاج مرة واحدة ثم التخلص في حاوية مناسبة.
- في غطاء محرك السيارة، السماح بقايا المذيبات على الأواني الزجاجية لتتبخر.
- شطف الأواني الزجاجية مع الماء النظيف ومحلول المنظفات.
5. اليوم 4 - إعداد حل العمل ونقل فامس إلى قوارير غا (2-3 ساعات ل ~ 40 عينات)
- جمع المواد: 4 مل قارورة العنبر مع عينات المجففة. العنبر 2 مل قارورة غ؛ 400 ميكرولتر إدراج أسفل الزجاج المسطح والقبعات. 500 حقنة الزجاج ميكرولتر. 50 مل قارورة الحجمي. محلول المخزون - إثيل نوناديكانويت (19: 0 إي المعيار الداخلي) في 50/50 الهكسان / متب (كاشف 3).
- باستخدام حقنة الزجاج، إضافة 500 ميكرولتر من إيثيل نوناديكانويت (19: 0 إي) حل الأسهم إلى 50 مل حجمي قارورة.
- ملء قارورة إلى درجة الحجمي مع كاشف 3.
- كاب قارورة وعكس 5X لخلط.
- نقل 3 مل إلى قارورة نظيفة 4 مل لملح حل العمل.
- استخدام ثه حقنة الزجاج، إضافة 300 ميكرولتر من حل العمل لكل من 4 مل قارورة تحتوي على الأحماض الدهنية المجففة استرات الميثيل وكاب.
- دوامة العينة لمدة 15 ثانية ووضع جانبا للوقوف لمدة 15 دقيقة.
- باستخدام ماصة باستور الزجاج، ونقل بعناية معلقة استرات الميثيل الحمضية الدهنية إلى قارورة 2 مل غ تحتوي على إدراج 400 ميكرولتر.
- تخزين قوارير غ مختومة في الفريزر -20 درجة مئوية قبل التحليل.
- تقديم عينات لتحليل غ.
ملاحظة: يجب إجراء التحليل باستخدام عمود غ محدد والشروط الموضحة في الملف التكميلي S1 . فمن الأفضل أن يتم الانتهاء من تحليل غ في غضون 2 أسابيع من مثيلة.
Representative Results
يمكن تجميع جداول البيانات من التقارير في جدول بيانات أو قاعدة بيانات. بعد تعديل عامل الاستجابة (عامل تصحيح يطبع الاستجابة لأطوال سلسلة مختلفة)، يمكن مقارنة مناطق الذروة مع منطقة الذروة من المعايير الخارجية أو الداخلية للوصول إلى تركيز في المستخلص. من خلال تقسيم من خلال كتلة من التربة المستخرجة، ويمكن التعبير عن البيانات كما كتلة من فام لكل غرام من التربة، أو باستخدام الوزن الجزيئي لكل فام، وأكثر شيوعا ذكرت نمول في كل غرام من التربة. مجموع فامس الميكروبية يدل على إجمالي الكتلة الحيوية الميكروبية، ويمكن مقارنة بين العلاجات ( الشكل 1 ). ويمكن أيضا أن ترتبط بعض فاميس مع مجموعات ميكروبية معينة مثل الجرام إيجابية أو البكتيريا سالبة الجرام، الشعيات، الفطريات الفطرية ميكروهيزال، والفطريات سابروتروفيك 19 ، 20 ،
F إيغور 1 : مجموع الكتلة الحيوية فام. مقارنة بين إجمالي الكتلة الحيوية فام العلامات الحيوية (نمول ز -1 التربة) من الذرة المستمرة، المخصبة المرج، والمروج غير المخصبة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : الكتلة الحيوية فام من البكتيريا والفطريات. مقارنة العلاج من البكتيرية والفاكهة فام بيوماركر الكتلة الحيوية (نمول ز -1 التربة) من الذرة المستمرة، المخصبة المرج، و البراعم غير المخصبة.كتلة فطرية وبكتيرية من وفرة المطلقة. متوسط (سوم f / سوم b). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : غير متري الأبعاد التحجيم من المؤشرات الحيوية الدهون فام. مقارنة بين المجتمع الميكروبي الكلي باستخدام ملامح وفرة المطلقة من جميع المؤشرات الحيوية الدهون فام الميكروبية. وفي هذا المثال، تفصل المجتمعات المتواصلة من الذرة والمراعي غير المخصبة عن بعضها البعض وهي متباعدة جدا في حين أن بعض عينات البراري المخصبة لها مجتمعات ميكروبية تشبه تلك التي تنتمي إلى الذرة، بينما تشبه غيرها من البراري غير المخصب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: T ح ه حتىوأضاف ل فين نوع تي، propor منظمة الشفافية الدولية على الصورة ز -1 التربة، وهو د ر ح مجلة إكزكتف إنتلجنس ريفيو أوردي ص س و إضافة ITI س ن. هذا أمر مهم لاستخلاص صحيح وفصل من العضوي ومائي طور.
Discussion
لفحص عينات متعددة من التجارب مع العديد من مكررات و / أو وحدات تجريبية، قد يجد الباحثون تحليل الدهون الدهنية الفوسفورية (بلفا) لتكون باهظة من حيث الوقت والمواد 25 . مع طريقة بلفا، يتم استخراج فوسفوليبيدس غشاء الخلية، وتنقيته، وتحديدها باستخدام تعديل بل و ديير 26 ثنائي الطور استخراج المائي العضوي. ويلي ذلك مرحلة الكروماتوجرافيا السيليكا الصلبة المرحلة لفصل الدهون عن طريق قطبية، ومثيلة القلوية من الأحماض الدهنية الفوسفاتية في استرات الميثيل الأحماض الدهنية. في بلفا التنميط العائد الدهون يمكن أن تكون منخفضة ولكن من نقاء عالية جدا. أدخلت هوية الميكروبية طريقة بديلة، الإجراء الأحماض الدهنية ميثيل استر (ميدي-فا). في طريقة ميدي-فا، يتم استخراج جميع الدهون مباشرة من الثقافات النقية أو التربة / الرواسب عينات 11 ، 12 ، 27 من خلالالتصبين. هذه الطريقة لديها فقدان الدهون أقل وسريع لأنه ليس لديه أي من تركيز أو تنقية الخطوات من طريقة بلفا. ومع ذلك، في حين أن طريقة ميدي-فا سريعة وأقل تكلفة، لأنه كان مصمم أصلا لتحديد الكائنات الحية في الثقافة الخالصة، لا توجد خطوات أولية استخراج أو تنقية. وهكذا، يمكن أن تشمل مركبات تشبه الدهون تشترك في استخراجها من المادة العضوية في التربة التي تشوه توقيع المجتمع 27 ، 28 ، 29 . لأن هذا الإدراج يمكن أيضا تشويه التدابير الكتلة الحيوية، وعادة ما تستخدم ميدي-فا فقط لوصف نوعيا الخشنة الدهون في التربة 13 .
الإجراء الذي وصفنا هنا يجمع بين أفضل من اثنين من إجراءات استخراج منفصلة: 1) استخراج وتركيز الدهون باستخدام طريقة بلي و داير 26 المعدلة، و 2) حمض الدهني ميثيل استر سابونيفيكاتيون، المثيلة، واستخراج، وإجراءات غسل قاعدة وضعت تجاريا. وقد تم تطوير هذه الطريقة لتحقيق فوائد كل من هذه البروتوكولات مع التقليل من عيوب 15 . من خلال إجراء استخراج الأولي وعزل المكونات القابلة للذوبان العضوية ( مثل الدهون) قبل أداء ميدي-فا، واستكمال هذا مع خطوة تنقية، ويوفر هذا البروتوكول التوازن بين السرعة والدقة. على الرغم من أن هذه الطريقة قد لا تكون مناسبة عند الحاجة إلى نقاء عالية ( أي لتحليل 13 C بلفا) أو عند تحليل الدهون الفوسفاتية والدهون المحايدة بشكل منفصل، في كثير من الحالات فإنه يسمح للكشف عن استجابات المجتمع الميكروبي للظروف البيئية مع حساسية أكبر من الحمض النووي القائم الأساليب 30 ، 31 ، 32 ، 33 . تتحلل الدهون الغشائية بسرعة بعد موت الخلايا مما يسمح لهمتعكس المجتمع الميكروبي الحية في وقت أخذ العينات 5 ، 7 ، على النقيض من الحمض النووي البيئي التي يأتي الكثير من المعلومات من الكائنات الميتة أو غير النشطة 34 . وبالنظر إلى ارتفاع معدل السكون لوحظ بين الكائنات الحية الدقيقة التربة 35 ، توصيف الكتلة الحيوية الحية يمكن استخدامها لفهم التفاعلات الزئبق النباتي الزماني على نطاق زمني غرامة نسبيا ويمكن استخدام المؤشرات الحيوية للدهون لفحص الحالة الفسيولوجية للمجتمع الميكروبية 7 . وقد تبين أن هناك حاجة إلى أساليب الإنتاجية العالية لتقييم الاستجابة الميكروبية في إعدادات حقل كبير 25 ، وبينما الطريقة التي نقترح هنا لا تكرار دقة بلفا العلامات البيولوجية التنميط، فإنه يزيد الإنتاجية مع التقليل من التقلب أدركت مع ميدي-فا إجراء. وقد أثبتت هذه الطريقة أن تكون أداة فعالة في معالجةالمسائل المتعلقة بديناميات المجتمع الميكروبي على مجموعة واسعة من التربة في الدراسات الزراعية والنظم الإيكولوجية واسعة النطاق 36 و 37 و 38 و 42 و 43 و 44 و 45 و 46 و 47 و 48 و 49 و 50 .
يتم الجمع بين الطبقات الدهنية مع هذا الأسلوب، وربما يكون هناك فقدان المعلومات الواردة في تلك الطبقات منفصلة 22 ، 39 ، ولكن الجمع بين الطبقات الدهون قد تعزز القدرة على الكشف عن أصل الفطريات الفطرية ميكروهيزال من ω5c 16: 1 من كل من الفوسفور - ومحايدة الدهون 40 . وبالإضافة إلى ذلك، في حين رقد يكون عدد الأحماض الدهنية غير المعروفة (التي يمكن أن تكون مشتقة من المواد العضوية غير الحية) أعلى مع هذا الأسلوب، فقد تبين أن أقل من ميدي-فا ويسمح للمقارنة العلاج من التشكيلات الدهنية من الدراسات مع العديد من العينات حيث عينة والقدرة الإنتاجية هي مصدر قلق 15 . ويعتقد عموما أن الجزء المحايد ينبع أساسا من دهون التخزين التي تنتجها الفطريات، على الرغم من أنه قد يكون هناك أيضا بعض المساهمة الأصغر من حيوانات التربة 41 . في ضوء هذا، فإن الطريقة الموصوفة هنا قد تسفر عن نتائج تظهر مساهمة أكبر من الدهون الفطرية 18: 2 ω 6،9c و 18: 1 ω 9C من بلفا. وتشمل الدهون الأخرى التي تميل إلى الظهور في جزء محايد بعض الأحماض الدهنية المشبعة، على سبيل المثال 16: 0، 18: 0، 20: 0.
هناك طرق مختلفة حيث يمكن التعبير عن البيانات الدهنية وتحليلها. التمثيل الأكثر شيوعا هي وفرة (نمول ز -1 التربة)، كسور الخلدن (نمول الدهون الفردية نمول -1 مجموع الدهون)، و الخلد في المئة (جزء الخلد * 100). تطبيع من قبل الدهون الكلية في العينة، وجزء الخلد والخلية في المئة هي قياسات للوفرة النسبية من الدهون معين. بعد التحول المناسب، على سبيل المثال ، أركسين الجذر التربيعي، جزء الخلد هو مناسب للاستخدام في التحليل من قبل المكونات الرئيسية أو التكرار تحليل التحليل. وفرة هو المبلغ المطلق للدهون المستخرجة المستخرجة لكل غرام من التربة. لأن كمية الدهون في الخلية ثابتة بشكل معقول، واستخراج الدهون عالية الكفاءة وشاملة، وفرة الكلي هو تقدير جيد من الدهون الإجمالية ووفرة من المؤشرات الرئيسية تعكس الكتلة الحيوية للمجموعة الإيكولوجية التي تمثل 17 . وأخيرا، طريقة جيدة للنظر في تكوين المجتمع الميكروبي هو استخدام طرق تحليل متعددة المتغيرات 16 ، على سبيل المثال ، أساليب التنسيق مثل التحجيم متعدد الأبعاد غير المتماثلة (نمدس -التي لا تحتاج إلى تحويل البيانات) أو تحليل المكونات الرئيسية (يكا)، يمكن أن تكون مفيدة لمقارنة الوفرة النسبية لجميع المؤشرات الحيوية للدهون.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مركز البحيرات العظمى لبحوث الطاقة الحيوية التابع لوزارة الطاقة (مكتب العلوم البيولوجية التابع لوزارة الطاقة دي-FC02-07ER64494) ومكتب كفاءة الطاقة والطاقة المتجددة التابع لوزارة الطاقة (دي-AC05-76RL01830). ويود المؤلفون أن يعترفوا بأندرس غوردا لصاحبه ومساهمته الماهرة في التصوير بالفيديو والتحرير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RapidVap | Labconco | 7900000 | Evaporative system |
| RapidVap | Labconco | 7491400 | Sample block |
| Chem-resistant vacuum pump | Labconco | 7584000 | Vacuum pump |
| Chemical trap cannister | Labconco | 7815300 | Trap cannister |
| Solvent insert | Labconco | 7515200 | Solvent trap insert |
| Diaphragm pump | Welch | 7398000 | DryFast vacuum pump |
| Water bath | Fisher | 15-462-15Q | 2 well water bath |
| Gas chromatograph | Various | N/A | For sample analysis |
| Centrifuge | Various | N/A | For sample separation |
| Freeze Dryer | Various | N/A | For sample lyophilization |
| Repipet (6) | BrandTech | 4720440 | For dispensing reagents |
| Vortex | Fisher | 02-215-365 | Analog vortex mixer |
| Teflon centrifuge tubes | Thermo/Nalgene | 3114-0030 | Teflon sample tubes |
| Caps | Thermo/Nalgene | DS3131-0020 | Caps for teflon tubes |
| Test tube | Corning | 9825-16 | 16x100mm tubes |
| Test tube | Corning | 9825-16xx | 16x150mm tubes |
| Caps | Corning | 9998-15 | 15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner |
| Pasteur pipets | Fisher | 13-678-20B | 14.6cm |
| 500 uL glass syringe | Fisher | 13684106LC | Hamilton 81217 |
| Amber vials | Agilent | 5182-0716 | 4mL Amber vials |
| Caps | Agilent | 5182-0717 | Blue screw caps |
| Inserts | Agilent | 5181-3377 | 400uL flat bottom glass inserts |
| Standards | |||
| 19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate) | VWR | TCN0459-5G | Analytical standard |
| Chemicals | |||
| Dipotassium phosphate (K2HPO4 - ACS grade or better) | Various | N/A | For making Phosphate-Buffer |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 - ACS grade or better) | Various | N/A | For making Phosphate-Buffer |
| Methanol (CH3OH - HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagents 1 & 2 |
| Sodium hydroxide (NaOH - ACS grade or better) | Various | N/A | For making Reagents 1 & 4 |
| Hydrochloric acid (6N HCL) | Various | N/A | For making Reagent 2 |
| Hexane (HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagent 3 |
| MTBE (Methyl tert-butyl ether - HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagent 3 |
References
- Van Der Heijden, M. G. a, Bardgett, R. D., Van Straalen, N. M. The unseen majority: Soil microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems. Ecol Lett. 11 (3), 296-310 (2008).
- Bever, J. D., et al. Rooting theories of plant community ecology in microbial interactions. Trends Ecol Evol. 25 (8), 468-478 (2010).
- Suleiman, A. K. A., Manoeli, L., Boldo, J. T., Pereira, M. G., Roesch, L. F. W. Shifts in soil bacterial community after eight years of land-use change. Syst Appl Microbiol. 36 (2), 137-144 (2013).
- Sayer, E. J., et al. Grassland management influences spatial patterns of soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 61, 61-68 (2013).
- Fernandes, M. F., Saxena, J., Dick, R. P. Comparison of Whole-Cell Fatty Acid (MIDI) or Phospholipid Fatty Acid (PLFA) Extractants as Biomarkers to Profile Soil Microbial Communities. Microbial Ecol. 66 (1), 145-157 (2013).
- van der Heijden, M. G. A., Wagg, C. Soil microbial diversity and agro-ecosystem functioning. Plant Soil. 363 (1-2), 1-5 (2013).
- Allison, V. J., Miller, R. M., Jastrow, J. D., Matamala, R., Zak, D. R. Changes in soil microbial community structure in a tallgrass prairie chronosequence. Soil Sci Soc Am J. 69 (5), 1412-1421 (2005).
- Kowalchuk, G. A., Buma, D. S., de Boer, W., Klinkhamer, P. G. L., van Veen, J. A. Effects of above-ground plant species composition and diversity on the diversity of soil-borne microorganisms. A van Leeuw. 81 (1-4), 509-520 (2002).
- Bardgett, R. D., Hobbs, P. J., Frostegard, A. Changes in soil fungal:bacterial biomass ratios following reductions in the intensity of management of an upland grassland. Biol Fert Soils. 22 (3), 261-264 (1996).
- Frostegård, Å, Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol Biochem. 43 (8), 1621-1625 (2011).
- Haack, S. K., Garchow, I. H., Odelson, D. A., Forney, L. J., Klug, M. J. Accuracy , Reproducibility , and Interpretation of Fatty Acid Methyl Ester Profiles of Model Bacterial Communitiest. Appl Environ Microbiol. 60 (7), 2483-2493 (1994).
- Drenovsky, R. E., Elliott, G. N., Graham, K. J., Scow, K. M. Comparison of phospholipid fatty acid ( PLFA ) and total soil fatty acid methyl esters ( TSFAME ) for characterizing soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 36, 1793-1800 (2004).
- Cavigelli, M. A., Robertson, G. P., Klug, M. Fatty acid methyl ester ( FAME ) profiles as measures of soil microbial community structure. Plant Soil. 170, 99-113 (1995).
- Findlay, R. Determination of microbial community structure using phospholipid fatty acid profiles. Molecular microbial ecology manual. , Available from: https://www.researchgate.net/profile/Robert_Findlay2/publication/281208148_Determination_of_microbial_community_structure_using_phospholipid_fatty_acid_profiles/links/55db4f0b08aec156b9afe776.pdf 2885-2906 (2004).
- Balser, T. C., Liang, C., Gutknecht, J. L. Linking microbial community analysis and ecosystem studies: A rapid lipd analysis protocol for high throughput. Biol Fert Soils. , Forthcoming (2017).
- Findlay, R. H., King, G. M., Watling, L., Watling, L. E. S. Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sediments Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sedimentst. Appl Environ Microbiol. 55 (11), 2888-2893 (1989).
- Willers, C., Jansen van Rensburg, P. J., Claassens, S. Microbial signature lipid biomarker analysis - an approach that is still preferred, even amid various method modifications. J Appl Microbiol. 118 (6), 1251-1263 (2015).
- Balser, T. C. Phospholipid Fatty-acid Analysis (PLFA). Protocol. , Available from: http://nature.berkeley.edu/soilmicro/methods/BalserPLFA.pdf (2017).
- Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty-acids in phospholipids and lipopolysachharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 24 (4), 317-323 (1992).
- Frostegard, A., Tunlid, A., Baath, E. Phospholipid fatty-acid composition, biomass, and activity of microbial communities from 2 soil types experimentally exposed to different heavy-metals. Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3605-3617 (1993).
- Federle, T. W., Dobbins, D. C., Thorntonmanning, J. R., Jones, D. D. Microbial biomass, activity, and community structure in subsurface soils. Ground Water. 24 (3), 365-374 (1986).
- Vestal, J. R., White, D. C. Lipid analysis in microbial ecology - quantitative approaches to the study of microbial communities. BioScience. 39 (8), 535-541 (1989).
- Wilkinson, S. G. Gram negative bacteria. Microbial Lipids. , 299-488 (1988).
- Balser, T. C., Treseder, K., Ekenler, M. Using lipid analysis and hyphal length to quantify AM and saprotrophic fungal abundance along a soil chronosequence. Soil Biol Biochem. 37 (3), 601-604 (2005).
- Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Phys. (37), 911-917 (1959).
- Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of Fatty Acid Methyl Ester (FAME) Methods for Characterizing Microbial Communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
- Jandl, G., Leinweber, P., Schulten, H., Ekschmitt, K. Contribution of primary organic matter to the fatty acid pool in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 37, 1033-1041 (2005).
- Nielsen, P., Petersen, S. O. Ester-linked polar lipid fatty acid profiles of soil microbial communities: a comparison of extraction methods and evaluation of interference from humic acids. Soil Biol Biochem. 32, 1241-1249 (2000).
- Duncan, D. S., Jewell, K. A., Suen, G., Jackson, R. D. Detection of short-term cropping system-induced changes to soil bacterial communities differs among four molecular characterization methods. Soil Biol Biochem. 96, 160-168 (2016).
- Liang, C., et al. Switchgrass rhizospheres stimulate microbial biomass but deplete microbial necromass in agricultural soils of the upper Midwest, USA. Soil Biol Biochem. 94, 173-180 (2016).
- Jangid, K., et al. Land-use history has a stronger impact on soil microbial community composition than aboveground vegetation and soil properties. Soil Biol Biochem. 43 (10), 2184-2193 (2011).
- Ritz, K., et al. Spatial structure in soil chemical and microbiological properties in an upland grassland. FEMS Microbiol Ecol. 49 (2), 191-205 (2004).
- Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. J Chem Inf Model. 53 (9), 1689-1699 (2013).
- Lennon, J. T., Jones, S. E. Microbial seed banks: The ecological and evolutionary implications of dormancy. Nat Rev Microbiol. 9 (2), 119-130 (2011).
- Gutknecht, J. L. M., Field, C. B., Balser, T. C. Microbial communities and their responses to simulated global change fluctuate greatly over multiple years. Glob Change Biol. 18, 225-269 (2012).
- Pei, Z., et al. Soil and tree species traits both shape soil microbial communities during early growth of Chinese subtropical forests. Soil Biol Biochem. 96, 180-190 (2016).
- Oates, L. G., Duncan, D. S., Sanford, G. R., Liang, C., Jackson, R. D. Bioenergy cropping systems that incorporate native grasses stimulate growth of plant-associated soil microbes in the absence of nitrogen fertilization. Ag Ecosys Environ. 233, 396-403 (2016).
- Bååth, E. The use of neutral lipid fatty acids to indicate the physiological conditions of soil fungi. Microbial Ecol. 45 (4), 373-383 (2003).
- Ngosong, C., Gabriel, E., Ruess, L. Use of the signature Fatty Acid 16:1ω5 as a tool to determine the distribution of arbuscular mycorrhizal fungi in soil. J Lipids. 2012, 236807 (2012).
- Sharma, M. P., Buyer, J. S. Comparison of biochemical and microscopic methods for quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in soil and roots. Appl Soil Ecol. 95, 86-89 (2015).
- Oates, L. G., Balser, T. C., Jackson, R. D. Subhumid pasture soil microbial communities affected by presence of grazing, but not grazing management. Appl Soil Ecol. 59, 20-28 (2012).
- Liang, C. Potential legacy effects of biofuel cropping systems on soil microbial communities in southern Wisconsin, USA. Ag Sci. 2 (2), 131-137 (2011).
- Herzberger, A. J., Duncan, D. S., Jackson, R. D. Bouncing Back Plant-Associated Soil Microbes Respond Rapidly to Prairie Establishment. PloS One. 9 (12), 1-14 (2014).
- Fraterrigo, J. M., Balser, T. C., Turner, M. G. Microbial community variation and its relationship with nitrogen mineralization in historically altered forests. Ecology. 87 (3), 570-579 (2006).
- Kao-Kniffin, J., Balser, T. C. Elevated CO2 differentially alters belowground plant and soil microbial community structure in reed canary grass-invaded experimental wetlands. Soil Biol Biochem. 39 (2), 517-525 (2007).
- Mentzer, J. L., Goodman, R. M., Balser, T. C. Microbial response over time to hydrologic and fertilization treatments in a simulated wet prairie. Plant Soil. 284 (1-2), 85-100 (2006).
- Ushio, M., Wagai, R., Balser, T. C., Kitayama, K. Variations in the soil microbial community composition of a tropical montane forest ecosystem: Does tree species matter. Soil Biol Biochem. 40 (10), 2699-2702 (2008).
- Bartelt-Ryser, J., Joshi, J., Schmid, B., Brandl, H., Balser, T. Soil feedbacks of plant diversity on soil microbial communities and subsequent plant growth. Perspect Plant Ecol. 7 (1), 27-49 (2005).
- Fichtner, A., von Oheimb, G., Härdtle, W., Wilken, C., Gutknecht, J. L. M. Effects of anthropogenic disturbances on soil microbial communities in oak forests persist for more than 100 years. Soil Biol Biochem. 70, 79-87 (2014).
