Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

En lipidekstraksjons- og analysemetode for karakterisering av jordmikrober i eksperimenter med mange prøver

Published: July 16, 2017 doi: 10.3791/55310
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 4, 1
1Department of Agronomy and Great Lakes Bioenergy Research Center, University of Wisconsin - Madison, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin - Madison, 3Department of Soil, Water, and Climate, University of Minnesota, 4Faculty of Science and Engineering, Curtin University

Summary

Artikkelen beskriver en metode som øker gjennomstrømmingen samtidig som innsats og nøyaktighet balanseres for utvinning av lipider fra cellemembranene til mikroorganismer for bruk ved karakterisering av både totale lipider og den relative overflod av indikatorlipider for å bestemme jordmikrobiell samfunnsstruktur i studier med mange prøver.

Abstract

Mikrobielle samfunn er viktige drivere og regulatorer av økosystemprosesser. For å forstå hvordan forvaltningen av økosystemene kan påvirke mikrobielle samfunn, er en relativt presis, men innsatsintensiv teknikk for å analysere mikrobiell samfunnssammensetning, fosfolipidfettsyre (PLFA) analyse. PLFA ble utviklet for å analysere fosfolipidbiomarkører, som kan brukes som indikatorer for mikrobiell biomasse og sammensetningen av brede funksjonelle grupper av sopp og bakterier. Det har ofte blitt brukt til å sammenligne jordarter under alternative plantesamfunn, økologi og styringssystemer. PLFA-metoden har vist seg å være følsom for å oppdage skift i mikrobiell samfunnssammensetning.

En alternativ metode, utvinning og analyse av fettsyremetylester (MIDI-FA) ble utviklet for rask utvinning av totale lipider, uten separering av fosfolipidfraksjonen, fra rene kulturer som en mikrobiell identifikasjonsteknikk. Denne metoden erRask, men er mindre egnet for jordprøver fordi den mangler et innledende trinn som skiller jordpartikler og begynner i stedet med en forsåpningsreaksjon som sannsynligvis produserer artefakter fra bakgrunnen organisk materiale i jorden.

Denne artikkelen beskriver en metode som øker gjennomstrømmingen, samtidig som man balanserer innsats og nøyaktighet for utvinning av lipider fra cellemembranene til mikroorganismer for bruk for å karakterisere både totale lipider og den relative overflod av indikatorlipider for å bestemme jordmikrobiell samfunnsstruktur i studier med mange prøver. Metoden kombinerer nøyaktigheten oppnådd gjennom PLFA-profilering ved å ekstrahere og konsentrere jordlipider som et første trinn, og en reduksjon i innsats ved å saponifisere det organiske materialet ekstrahert og behandle med MIDI-FA-metoden som et andre trinn.

Introduction

Gitt nøkkelrollen av mikroorganismer i næringssyklus 1 , modifisering av plantesammensetning 2 , regulering av planteproduktivitet 3 og dekomponering av organisk materiale 4 , er forståelse av jordmikrobielle samfunn en avgjørende for å forstå terrestriske økosystemer.

På grunn av deres relativt høye overflod i jord og deres kjemiske signatur kan lipidbiomarkører brukes til å profilere de dominerende økologiske gruppene som omfatter jordmikrobielle samfunn 5 . Ved å kvantifisere lipidbiomarkører som er karakteristiske for forskjellige mikrobielle grupper, kan vi estimere totale lipider, og deretter adskille disse lipidene til økologisk relevante grupper som Gram-positive (Gm +) og Gram-negative (Gm) bakterier, arbuskulær mykorrhizal (AM) og saprotrofisk Sopp og actinomycetes 5 , Ss = "xref"> 6 , 7 , 8 .

Det er mange metoder for å karakterisere aspekter av mikrobielle samfunn. PLFA-metoden er en vanlig brukt til å forstå grunnleggende mikrobiell samfunnsstruktur. Det er en effektiv måte å vurdere den relative overflaten av mikrobielle grupper, samt total mikrobiell biomasse. På grunn av rask lipidomsetning gir PLFA-profilering også relativt rask gjenkjenning av endringer i jordmikrobiell samfunn og gir informasjon som gjør det mulig å sammenligne økosystemfunksjonen, f.eks. Sopp: bakterieforhold for å vurdere næringssyklus 1 , 9 , 10 . Imidlertid, mens PLFA-ekstraksjonsmetoden er æret og respektert, er det også tidkrevende og gir ikke godt til økosystemskala-studier som krever et stort antall prøver fra feltskalaereplikaterF "> 11 , 12 .

I motsetning hertil har fettsyremetylester-ekstraksjonsmetoden (MIDI-FA) potensialet til å gi rask gjennomstrømning. I denne metoden blir prøver saponified, konvertert til FAMEs, ekstrahert, og deretter analysert. MIDI-FA-metoden er rask, men mindre diskriminerende enn PLFA, som kombinerer ekstraksjon av lipider med separasjon av forskjellige lipidklasser 13 (fosfolipider, nøytrale lipider og glykolipider).

I denne protokollen beskriver vi en metode som kombinerer elementer fra både PLFA og MIDI-FA lipid profilering. Den anvender ekstraksjon av lipider ved anvendelse av de første kloroformekstraksjonstrinnene i den modifiserte Bligh og Dyer-metoden, og deretter forsåpning og konvertering til FAMEs. Dette gir en robust måte å oppdage mikrobiel samfunnsstruktur mens det utelukkes mye av bakgrunnsstøy fra ikke-mikrobielt materiale 5 , 14 15 . Ved å utføre den første ekstraksjonen og isolere de organisk oppløselige komponentene ( f.eks. Lipider) før du utfører MIDI-FA, og fullføre dette med et rensingstrinn, gir protokollen en balanse mellom hastighet og presisjon.

Protocol

MERK: Bruk alltid passende personlig verneutstyr (PPE) gjennom hele prosedyren. For å unngå potensiell prøveforurensning må du ikke berøre glassvarer med bare hender. Bruk egnede hansker når du kjører protokollsteg som krever håndtering av kloroform.

1. Forberedelser (2 dager for ~ 40 prøver)

  1. Samle jord i sterile poser og transporter fra feltet i en kjøler som inneholder is. Hvis det ikke er mulig å sive frisk jord og fryse tørr umiddelbart, oppbevar prøvene i en -80 ° C fryser til klar for å starte analysen.
  2. Forbered jord ved homogenisering. Fjern røtter og steiner og bryte opp klumper ved grov sikting ( f.eks. 2 mm).
  3. Forbered deg på frysetørking ved å sette underprøver i en passende beholder som beskrevet av instruksjonene til frysetørkerens håndbok og frys så snart som mulig. Når jordene er frysetørket, oppbevares i en lukket beholder med tørkemiddel til utvinning. Det er best å sRevet frysetørket jord i minst -20 ° C, men fortrinnsvis ved -80 ° C.
  4. Som forberedelse til ekstraksjon, fjern frysetørket jord fra lagring og slip til en mellignende konsistens. Metoder for sliping inkluderer kulmølle, ballbjelker og mørtel og pestle. Etter sliping av jord, oppbevares i en fryser (se 1.3).
    MERK: Mengden prøve som brukes til utvinning, avhenger av innholdet av organisk materiale. En generell retningslinje er å bruke 0,5 til 1 g av en jord som er 12 til 18 vekt% karbon og 3 til 5 g for en jord 1 til 3 vekt% karbon i vekt.
  5. Skyll 30 ml sentrifugerør med heksan. Tilsett ca. 2 til 3 ml heksan til rør og hvirvel i 5 sek. Dekanter heksan til et annet rør og hvirvel. Hexan (2 til 3 ml) kan brukes til å rense seks rør serielt. Oppbevar heksanskyllede rør innvendig i avtrekksdekselet og kast bort brukt heksan i en passende avfallsbeholder.
  6. Fest glasset i 2 til 3 lag aluminiumsfolie og sett i muffelovnen. Bake(Muffle) glass ved 450 ° C i 4,5 timer.
  7. Forbered reagenser.
    1. For jord mengden som anvendes, tilsette kjemikalier i et 0,8: 1: 2 volum-forhold for fosfat-buffer (P-buffer): CHCl3: MeOH.
    2. Forbered P-buffer løsning: Fosfatbuffer: 0,1 M, pH 7,0.
      1. Legg til 61 ml 1M K 2 HPO 4 lager, steril (kjemisk skal være ACS-sertifisert klasse eller bedre). Legg til 39 ml 1 M KH 2 PO 4 lager, steril (kjemisk skal være ACS-sertifisert klasse eller bedre). Fyll til 1000 ml med type 1 vann. Juster pH til 7,0 med NaOH eller HCI. Oppbevar ubrukt oppløsning i opptil 7 d ved omgivelsestemperatur eller 30 dager i kjøleskap.
      2. Alternativt veier 10,62 g K 2 HPO 4 og 5,31 g KH 2 PO 4 ; Fortynnes til 1 liter med type 1 vann. Kontroller pH, juster om nødvendig.
    3. Forbered Reagens 1, Saponification Reagent.
      1. Dispensér 300 ml Type 1 vann.Tilsett 300 ml CH3OH (HPLC-kvalitet eller høyere). Tilsett 90,00 g NaOH (sertifisert ACS eller bedre). Tilsett NaOH pellets til løsningen under omrøring. Rør til pellets oppløses. Det anbefales å lagre denne løsningen ikke lenger enn 30 d.
    4. Fremstille reagens 2, metyleringsreagens.
      1. Dispensere 275 ml CH3OH (HPLC-kvalitet eller høyere). Tilsett 325 ml sertifisert 6,00 N HCL under omrøring. Det anbefales å lagre denne løsningen ikke lenger enn 30 d.
    5. Overflaten av det reagens 3, Ekstraksjonsreagens: 50% C 6 H 14 (heksan), 50% C 5 H 12 O (MTBE).
      1. I avtrekksviften kombineres 200 ml C 6 H 14 (HPLC-kvalitet eller høyere) og 200 ml C 5 H 12 O (HPLC-kvalitet eller høyere). Bland godt; Hetten tett. Oppbevares i brennbarhetsskap eller avtrekksdeksel i ikke mer enn 1 år.
    6. Forbered Reagent 4, Base Wash Reagent.
      1. Dispense 900Ml type 1 vann til beker. Tilsett 10,80 g NaOH (Sertifisert ACS eller bedre) under omrøring. Rør til pellets oppløses. Det anbefales å lagre denne løsningen ikke lenger enn 30 d.
    7. Forbered lagerløsning av intern standard.
      1. Veid ut 100 mg 19: 0 EE standard. Tilsett til 50 ml heksan skyllet volumetrisk kolbe. Tilsett ~ 15 ml Hexane-MTBE-oppløsning (reagens 3) til kolben, virvel for å oppløse. Tørk opp til 50 ml med Hexane-MTBE-oppløsning (reagens 3). Cap og virvle for å blande. Overfør til heksan-skyllede glassrør med PTFE-lommer og lagre ved -20 ° C.

2. DAG 1 - Ekstraksjon av fettsyrer fra jord (4 til 5 timer for ~ 40 prøver)

  1. Tilbered tre 5 til 10 ml dispenseringspipetter for P-buffer, kloroform og metanol.
    MERK: Mindre farlige alternativer til kloroform er foreslått som ekstrakter. Disse kan resultere i ekvivalente lipidutvinningsgrader 16 , 17 , men evalueres ikke i denne protokollen.
  2. Veie frysetørket jord i 30 ml sentrifugerør og lag jordmasse.
  3. Lag to emner og ta med en kontrollstandard (en jord som tidligere har blitt ekstrahert).
  4. I avtrekksskap, tilsett reagensene til jord i sentrifugerøret i den følgende rekkefølge: P-buffer, CHCI3, og MeOH (tabell 1). La jorda tid å våte etter P-buffer tillegg før tilsetning av CHCl 3 . Cap centrifugerørene tett og deksel for å beskytte mot lys.
  5. Legg dem på risteren horisontalt og sørg for at de er godt festet. Med hastighetsinnstillingen på 280 rpm, rist i 1 time 18 .
  6. Fremstill to 16 mm x 150 mm glassrør for hver prøve som følger: Label røret og legge det samme volum CHCI3, og et likt volum med P-buffer.
  7. Fjern sentrifugerørene fra risteren og sentrifuger i 10 minutter ved 1.430Xg og 25 ° C. Faseseparasjon bør være synlig i glassrøret.
  8. I avtrekksdekselet dekanterer supernatanten fra sentrifugerøret til ett av rørene fremstilt i trinn 2.6. Gjenta trinnene 2.4 til 2.5 og dekanter supernatanten i andre rør.
  9. Sikkerhetskap alle 16 mm × 150 mm glassrør med PTFE-lined caps og inverter 10 x for å blande.
  10. La prøvene stå uforstyrret over natten for å fullføre separasjonen av de to faser. For å gjøre dette behold prøvene i et mørkt skap / rom eller dekket av aluminiumsfolie ved romtemperatur. Det er akseptabelt å la ekstraktene skille seg over helgen.
    1. Alternativt, hvis man ønsker å flytte direkte til neste trinn, eller hvis prøver blir forstyrret neste dag, sentrifuger prøvene i 10 minutter ved 1000 xg og 25 ° C.
      MERK: Underkast alle prøver i en sammenligningsgruppe til samme faseavstandstid.

3. DAG2 - Isolering av lipider (3 til 4 timer for ~ 40 prøver)

  1. Slå på fordampningsapparat og løsemiddelfelle. Sett fordampningsapparat til 33 ° C og forvarme.
  2. Sett opp en vakuumsuger i hetten: en sidearmkolbe koblet til en vakuumpumpe, en lengde med høy renhetsrør og en glasspip.
  3. Aspirer topplaget og grensesnittet (ca. 2/3 av veien ned) av de to glassrørene, og hold det vandige laget. Gjenta prosessen med en ren pipette for hver prøve.
  4. Kombiner de vandige lagene av ekstrakt fra det andre røret med det i det første røret ved forsiktig dekantering. Forsikre deg om at røret som dekanterer, er fritt for riper eller sprekker.
  5. Når CHCl 3- ekstraktene er kombinert, kontroller væsken - det skal være klart. Hvis ikke tilsatt MeOH til klar.
  6. Tørk ned alle prøvene ved hjelp av vakuumfordampningsapparatet. Begynn med innstillinger av temperatur 33 ° C, hvirvelhastighet 26% og trykk 400 mbar.
  7. PSperre prøvene i fordampningssystemet og senk trykket til 350 mbar sakte etter 10 minutter.
  8. Overvåk fremdriften og når væskenivået i røret har nådd nivået på varmeblokken, senk trykket til 300 mbar.
  9. Fortsett å overvåke høyden på gjenværende væske og når den er ca 1 cm i dybden, senk trykket til 200 mbar.
  10. Etter at prøvene har tørket, fjern prøver og kjør pumpen i ytterligere 10 minutter for å fjerne damper.
  11. Kast rørene tett og lagre lipidene i en fryser ved -80 ° C.
  12. Kast bort væsken i henhold til gjeldende forskrifter for kjemikaliesikkerhet.

4. DAG 3 - Forsepning og metylering (6 til 7 timer for ~ 40 prøver)

  1. Slå på vannbadene. Sett bad 1 til 95 ° C og bad 2 til 80 ° C.
  2. Still pipetternes dispensere og sørg for at de dispenserer riktig volum.
    Reagens 1: 1 ml pr. Prøve
    Reagens 2: 2 ml pr. Prøve
    Reagens 3: 1,25 ml pr. Prøve
    Reagens 4: 3 ml pr. Prøve
    MERK: Oppvarmingsprosessen vil bygge trykk i røret. Ikke bruk riper, sprekker eller flis.
  3. Bruk en pipettdispenser tilsett 1,0 ml reagens 1 til de tørkede lipidene. Cap tett, virvel i 5 s og sett i et stativ.
  4. Sett rekken av prøverørene inn i 95 ° C vannbadet i 5 minutter. Fjern rekken av rør fra badekaret og kontroller rørene for lekkasjer, indikert av at bobler stiger opp i røret. Trekk på eller skift ut dekslene til lekkende rør, og kontroller igjen for sprekker eller flis. Fortsett oppvarming av rørene i vannbadet i ytterligere 10 minutter.
  5. Fjern prøver fra bad 1 og sett i bad 2 (80 ° C) og fortsett inkuberingen i ytterligere 15 minutter.
  6. Fjern rørene og avkjøle prøvene ved å plassere stativet i en panne med vann fra springen for avkjøling.
  7. Tilsett 2 ml reagens 2 til hver prøve. Cap tett og virvel i 5 til 10 s. Plasser stativet i 80 ° C vannbad og inkuber i 10 minutter.
  8. Fjern stativet av rør fra vannbadet og sett i en panne med vann fra springen for avkjøling. Rist rørene for å akselerere kjøleprosessen.
    MERK: Ikke overskrider tid og temperatur. For mye oppvarming kan forringe FAMEs.
  9. Ved bruk av pipettdispenseren tilsettes 1,25 ml reagens 3 til hvert prøverør for å ekstrahere fettsyremetylestere. Cap tett og legg rørene på risteren i 10 minutter.
  10. Etter risting, la rekken av rør sitte i 10 minutter for fasene å skille. Overfør den organiske fasen (topplag) til et 16 mm x 100 mm glassrør med glasspipet.
  11. Gjenta utvinningen ved å legge igjen reagens 3, riste, la faser skille, og overføre toppfasen.
    MERK Ikke overfør noe av bunnfasen. Det er greit å forlate en liten mengde toppfase i røret.
  12. Bruk pipettdispenseren, tilsett 3 ml reagens 4 til thE 16 mm x 100 mm rør.
  13. Tørr rørene tett og vortex i 20-30 s.
  14. Etter vortexing, sentrifuger i 3 minutter ved 1000 × g.
  15. Bruk en ren glasspipett, aspirer den øverste organiske fasen og overfør til et 4 ml amber hetteglass.
  16. Slå på fordampningsapparat og løsemiddelfelle. Sett fordampningsapparatet til 30 ° C, hvirvelhastigheten til 26%, vakuumet til 200 mbar og trykk på forvarming.
  17. Overvåk fremdriften. Etter at prøvene har tørket, fjern prøver og kjør pumpen i ytterligere 10 minutter for å fjerne damper.
  18. Fjern pipetten fra reagensflasker 1 og 4 og pump gjennom en fortynnet syre ( f.eks. 1% HC1), etterfulgt av DI-vann. Skyll pipetten som brukes til reagens 2 ved å pumpe gjennom DI vann. I hetten må du løse løsningsmidlet fra pipetten som brukes til reagens 3, i en passende beholder, og hold den i hetten til løsningsmiddelrester har fordampet.
  19. Oppbevar pipene omvendt, med stengene fjernet for å hindre stiftG av sjekkventilene.
  20. Bruk glasspipene en gang og kast deretter i en passende beholder.
  21. I hetten, la løsningsmiddelrester på glassvarer fordampe.
  22. Skyll glasset med rent vann og vaskemiddel.

5. DAG 4 - Forberedelse av arbeidsløsningen og overføring av FAMEs til GC-hetteglassene (2-3 timer for ~ 40 prøver)

  1. Samle materialer: 4 ml amber hetteglass med tørkede prøver; Gule 2 ml GC hetteglass; 400 μL flate bunn glass innsatser og caps; 500 μl glass sprøyte; 50 ml volumetrisk kolbe; Lagervare - Ethyl-nonadecanoat (19: 0 EE intern standard) i 50/50 heksan / MTBE (reagens 3).
  2. Ved hjelp av glassprøyten, tilsett 50 μl etyl-nonadecanoat (19: 0 EE) stamløsning i en 50 ml volumetrisk kolbe.
  3. Fyll kolben til volumetrisk score med reagens 3.
  4. Cap-kolbe og inverter 5x for å blande.
  5. Overfør 3 ml til et rent 4 ml hetteglass for et arbeidsløsningsreservoar.
  6. Bruke thE glass sprøyte, tilsett 300 μl av arbeidsoppløsningen til hvert av de 4 ml hetteglassene som inneholder de tørkede fettsyremetylestere og hetten.
  7. Vortex prøven i 15 s og sett til side for å stå i 15 min.
  8. Bruk et glass Pasteur pipette, overfør forsiktig de suspenderte fettsyremetylesterene til et 2 ml GC-hetteglass som inneholder 400 μL innsatsen.
  9. Oppbevar forseglede GC-hetteglass i en -20 ° C fryser før analyse.
  10. Send inn prøver for GC analyse.
    MERK: Analysen må utføres ved hjelp av en bestemt GC-kolonne og betingelser som er beskrevet i tilleggsfil S1 . Det er best at GC-analysen blir fullført innen 2 uker med metylering.

Representative Results

Datatabellene fra rapportene kan samles i et regneark eller en database. Etter justering for responsfaktor (en korreksjonsfaktor som normaliserer responsen for forskjellige kjedelengder), kan toppområdene sammenlignes med toppområdet for eksterne eller interne standarder for å komme til en konsentrasjon i ekstraktet. Ved å dele gjennom massen av utvunnet jord, kan dataene uttrykkes som masse FAME per gram jord eller ved å bruke molekylvekten til hver FAME, den mer vanlig rapporterte nmol pr. Gram jord. Summen av mikrobielle FAMEs er indikativ for total mikrobiell biomasse, og kan sammenlignes mellom behandlinger ( Figur 1 ). Visse FAMEer kan også knyttes til bestemte mikrobielle grupper som Gram-positive eller Gram-negative bakterier, actinomycetes, arbuscular mycorrhizal sopp og saprotrofe sopp 19 , 20 , , 22 , 23 , 24 . Forholdet mellom massen av spesifikke biomarkører kan gjenspeile den relative overflod av disse gruppene ( figur 2 ). Samlet FAME overflodmønster skaper fingeravtrykk på fellesskapsnivå, noe som tillater sammenligning av mikrobiell fellesskapssvikt gjennom multivariate teknikker som ordinering ( figur 3 ). I motsetning til de fleste DNA-baserte tilnærminger, kan lipiddata på lokalt nivå analyseres enten som relative eller absolutte overflod. Hvis total biomasse varierer vesentlig blant prøver, vil disse to tilnærmingene gi svært forskjellige resultater; De økologiske spørsmålene under eksperimentet bør bestemme hvilken tilnærming som brukes.

Figur 1
F Igure 1 : Total FAME biomasse. Sammenligning av total FAME biomarker biomasse (nmol g -1 jord) fra kontinuerlig mais, befruktet prairie og uferdig prairie. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2 : FAME biomasse av bakterier og sopp. Behandling sammenligning av bakteriell og sopp FAME biomarker biomasse (nmol g -1 jord) fra kontinuerlig mais, befruktet prairie og unfertilized prairie.Fungal og bakteriemasse fra absolutt overflod. Gjennomsnittlig (sum f / sum b). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 3
Figur 3 : Ikke-metrisk dimensjonell skalering av FAME lipidbiomarkører. Sammenligning av det overordnede mikrobielle samfunnet ved hjelp av absolutte overflodprofiler av alle mikrobielle FAME lipidbiomarkører. I dette eksemplet separeres kontinuerlige mais og uferdige prairie-fellesskap og er svært langt fra hverandre mens noen befruktede prairieprøver har mikrobielle samfunn som ligner dem fra mais, og andre ligner den ubebrevne prairie. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1
Tabell 1: T h e sål ven t typen, propor ti på s det tilsatt g -1 jord, en d t h eir Orde r o f legge iti o n. Dette er viktig for riktig utvinning og separasjon av organiske og vandige faser.

Discussion

For undersøkelse av flere prøver fra eksperimenter med mange replikater og / eller eksperimentelle enheter, kan forskere finne fosfolipidfettsyreanalyse (PLFA) å være uoverkommelig når det gjelder tid og materialer 25 . Ved PLFA-metoden blir cellemembranfosfolipider ekstrahert, renset og identifisert ved bruk av den modifiserte Bligh og Dyer 26 -tofase vandig-organisk ekstraksjon. Dette følges av fastfase silikakromatografi for å separere lipider ved polaritet og en alkalisk metylering av fosfolipidfettsyrer i fettsyremetylestere. I PLFA kan profilering lipidutbytte være lav, men av meget høy renhet. Mikrobiell ID introduserte en alternativ metode, fettsyremethylester-prosedyren (MIDI-FA). I MIDI-FA-metoden blir alle lipider ekstrahert direkte fra rene kulturer eller jord / sedimentprøver 11 , 12 , 27 gjennomforsåpning. Denne metoden har lavere lipid tap og er rask fordi den ikke har noen av konsentrasjonene eller rensingstrinnene i PLFA-metoden. Imidlertid, mens MIDI-FA-metoden er rask og rimeligere, fordi den opprinnelig ble utformet for å identifisere organismer i ren kultur, er det ingen innledende ekstraksjons- eller rensingstrinn. Dermed kan det inkludere lipidlignende forbindelser som samekstraheres fra jordorganisk materiale som forvrenger fellesskiltnavnet 27 , 28 , 29 . Fordi denne inkluderingen også kan forvride biomassetiltak, har MIDI-FA vanligvis kun blitt brukt til grovt kvalitativt å beskrive jordlipider 13 .

Prosedyren vi beskriver her kombinerer det beste av de to separate ekstraksjonsprosedyrene: 1) en ekstraksjon og konsentrasjon av lipider ved hjelp av den modifiserte Bligh og Dyer 26- metoden, og 2) fettsyremetylesteren saPonifiserings-, metylerings-, ekstraksjons- og basisvaskprosedyre utviklet kommersielt. Denne metoden ble utviklet for å oppnå fordelene ved begge disse protokollene, samtidig som ulemperne 15 minimeres. Ved å utføre den første ekstraksjonen og isolere de organisk oppløselige komponentene ( f.eks. Lipider) før du utfører MIDI-FA, og fullføre dette med et rensingstrinn, gir denne protokollen en balanse mellom hastighet og presisjon. Selv om denne metoden kanskje ikke er egnet når høy renhet kreves ( dvs. for 13 C PLFA analyse) eller når det analyseres fosfolipider og nøytrale lipider separat, gjør det i mange tilfeller mulig å påvise mikrobial samfunnsresponser på miljøforhold med større følsomhet enn DNA-basert Metoder 30 , 31 , 32 , 33 . Membranlipider nedbrytes raskt etter at celledød tillater dem åReflektere det levende mikrobielle samfunnet ved prøvetaking 5 , 7 , i motsetning til miljø-DNA, hvor mye av informasjonen kommer fra døde eller inaktive organismer 34 . I lys av den høye dvalevilkåren observert blant jordmikroorganismer 35 , kan karakteriseringen av levende biomasse brukes til å forstå tidsmessige plante-mikrobe-interaksjoner i en relativt fin temporal skala og lipidbiomarkører kan brukes til å analysere den fysiologiske statusen til det mikrobielle samfunn 7 . Det har vist seg at høye gjennomstrømmingsmetoder er nødvendige for å vurdere mikrobiel respons i store feltinnstillinger 25 , og mens metoden vi foreslår her ikke gjengir nøyaktigheten av PLFA biomarkørprofilering, øker den gjennomstrømmingen samtidig som variasjonen blir realisert med MIDI-FA fremgangsmåte. Metoden har vist seg å være et effektivt verktøy for adresseringSpørsmål knyttet til mikrobiell samfunnsdynamikk på et bredt spekter av jordsmonn i store landbruks- og økosystemstudier 36 , 37 , 38 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 .

Lipid klasser er kombinert med denne metoden, og det kan være et tap av informasjonen som finnes i de separate klassene 22 , 39 , men kombinering av lipidklassene kan styrke kraften til å oppdage arbuskulær mycorrhizal sopp opprinnelse av 16: 1 ω5c fra begge fosfor - og nøytrale lipider 40 . I tillegg, mens tAntallet ukjente fettsyrer (som kan stamme fra ikke-levende organisk materiale) kan være høyere med denne metoden, det ble vist å være lavere enn MIDI-FA og muliggjør behandling av sammenligning av lipidprofiler fra studier med mange prøver hvor prøven Gjennomgangskapasitet er en bekymring 15 . Den nøytrale fraksjonen antas generelt å stamme primært fra lagringslipider produsert av sopp, selv om det også kan være noe mindre bidrag fra jordfauna 41 . I lys av dette kan fremgangsmåten beskrevet her gi resultater som viser et større bidrag av sopplipidene 18: 2ω 6,9c og 18: 1ω 9c enn PLFA. De andre lipidene som har en tendens til å dukke opp i den nøytrale fraksjonen, inkluderer noen av de mettede fettsyrene, f.eks. 16: 0, 18: 0, 20: 0.

Det finnes forskjellige måter hvor lipiddata kan uttrykkes og analyseres. De vanligste representasjonene er overflod (nmol g -1 jord), mole fractioN (nmol individuell lipid nmol -1 total lipid) og molprosent (molfraksjon * 100). Normalisert av de totale lipidene i en prøve er molfraksjon og molprosent tiltak av den relative overflod av en gitt lipid. Etter en hensiktsmessig transformasjon, f.eks . Arcsin kvadratrot, er molfraksjonen hensiktsmessig for bruk ved analyse av hovedkomponenter eller redundansanalyseprøving. Overflod er absolutt mengde av et gitt lipid ekstrahert pr. Gram jord. Fordi mengden lipid per celle er rimelig konstant, og lipidekstraksjonen er svært effektiv og omfattende, er total overflod et godt estimat av totale lipider, og overfloden av nøkkelindikatorer reflekterer biomassen til den økologiske gruppen den representerer 17 . Endelig er en god måte å se på mikrobiell samfunnssammensetning å bruke multivariate analysemetoder 16 , for eksempel ordinasjonsmetoder som ikke-metrisk flerdimensjonal skalering (NMDS -Som ikke trenger dataomforming) eller hovedkomponentanalyse (PCA), kan være nyttig for å sammenligne den relative overflaten av alle lipidbiomarkører.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert delvis av DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Science of Science DE-FC02-07ER64494) og DOE OBP Office of Energy Efficiency and Renewable Energy (DE-AC05-76RL01830). Forfatterne vil gjerne anerkjenne Anders Gurda for hans pasient og dyktige bidrag til videografi og redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RapidVap Labconco 7900000 Evaporative system
RapidVap Labconco 7491400 Sample block
Chem-resistant vacuum pump Labconco 7584000 Vacuum pump
Chemical trap cannister Labconco 7815300 Trap cannister
Solvent insert Labconco 7515200 Solvent trap insert
Diaphragm pump Welch 7398000 DryFast vacuum pump
Water bath Fisher 15-462-15Q 2 well water bath
Gas chromatograph Various N/A For sample analysis
Centrifuge Various N/A For sample separation
Freeze Dryer Various N/A For sample lyophilization
Repipet (6) BrandTech 4720440 For dispensing reagents
Vortex Fisher 02-215-365 Analog vortex mixer
Teflon centrifuge tubes Thermo/Nalgene 3114-0030 Teflon sample tubes
Caps Thermo/Nalgene DS3131-0020 Caps for teflon tubes
Test tube Corning 9825-16 16x100mm tubes
Test tube Corning 9825-16xx 16x150mm tubes
Caps Corning 9998-15 15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner
Pasteur pipets Fisher 13-678-20B 14.6cm
500 uL glass syringe Fisher 13684106LC Hamilton 81217
Amber vials Agilent 5182-0716 4mL Amber vials
Caps Agilent 5182-0717 Blue screw caps
Inserts Agilent 5181-3377 400uL flat bottom glass inserts
Standards
19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate) VWR TCN0459-5G Analytical standard
Chemicals
Dipotassium phosphate (K2HPO4 - ACS grade or better) Various N/A For making Phosphate-Buffer
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 - ACS grade or better) Various N/A For making Phosphate-Buffer
Methanol (CH3OH - HPLC grade or better) Various N/A For making Reagents 1 & 2
Sodium hydroxide (NaOH - ACS grade or better) Various N/A For making Reagents 1 & 4
Hydrochloric acid (6N HCL) Various N/A For making Reagent 2
Hexane (HPLC grade or better) Various N/A For making Reagent 3
MTBE (Methyl tert-butyl ether - HPLC grade or better) Various N/A For making Reagent 3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Der Heijden, M. G. a, Bardgett, R. D., Van Straalen, N. M. The unseen majority: Soil microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems. Ecol Lett. 11 (3), 296-310 (2008).
  2. Bever, J. D., et al. Rooting theories of plant community ecology in microbial interactions. Trends Ecol Evol. 25 (8), 468-478 (2010).
  3. Suleiman, A. K. A., Manoeli, L., Boldo, J. T., Pereira, M. G., Roesch, L. F. W. Shifts in soil bacterial community after eight years of land-use change. Syst Appl Microbiol. 36 (2), 137-144 (2013).
  4. Sayer, E. J., et al. Grassland management influences spatial patterns of soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 61, 61-68 (2013).
  5. Fernandes, M. F., Saxena, J., Dick, R. P. Comparison of Whole-Cell Fatty Acid (MIDI) or Phospholipid Fatty Acid (PLFA) Extractants as Biomarkers to Profile Soil Microbial Communities. Microbial Ecol. 66 (1), 145-157 (2013).
  6. van der Heijden, M. G. A., Wagg, C. Soil microbial diversity and agro-ecosystem functioning. Plant Soil. 363 (1-2), 1-5 (2013).
  7. Allison, V. J., Miller, R. M., Jastrow, J. D., Matamala, R., Zak, D. R. Changes in soil microbial community structure in a tallgrass prairie chronosequence. Soil Sci Soc Am J. 69 (5), 1412-1421 (2005).
  8. Kowalchuk, G. A., Buma, D. S., de Boer, W., Klinkhamer, P. G. L., van Veen, J. A. Effects of above-ground plant species composition and diversity on the diversity of soil-borne microorganisms. A van Leeuw. 81 (1-4), 509-520 (2002).
  9. Bardgett, R. D., Hobbs, P. J., Frostegard, A. Changes in soil fungal:bacterial biomass ratios following reductions in the intensity of management of an upland grassland. Biol Fert Soils. 22 (3), 261-264 (1996).
  10. Frostegård, Å, Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol Biochem. 43 (8), 1621-1625 (2011).
  11. Haack, S. K., Garchow, I. H., Odelson, D. A., Forney, L. J., Klug, M. J. Accuracy , Reproducibility , and Interpretation of Fatty Acid Methyl Ester Profiles of Model Bacterial Communitiest. Appl Environ Microbiol. 60 (7), 2483-2493 (1994).
  12. Drenovsky, R. E., Elliott, G. N., Graham, K. J., Scow, K. M. Comparison of phospholipid fatty acid ( PLFA ) and total soil fatty acid methyl esters ( TSFAME ) for characterizing soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 36, 1793-1800 (2004).
  13. Cavigelli, M. A., Robertson, G. P., Klug, M. Fatty acid methyl ester ( FAME ) profiles as measures of soil microbial community structure. Plant Soil. 170, 99-113 (1995).
  14. Findlay, R. Determination of microbial community structure using phospholipid fatty acid profiles. Molecular microbial ecology manual. , Available from: https://www.researchgate.net/profile/Robert_Findlay2/publication/281208148_Determination_of_microbial_community_structure_using_phospholipid_fatty_acid_profiles/links/55db4f0b08aec156b9afe776.pdf 2885-2906 (2004).
  15. Balser, T. C., Liang, C., Gutknecht, J. L. Linking microbial community analysis and ecosystem studies: A rapid lipd analysis protocol for high throughput. Biol Fert Soils. , Forthcoming (2017).
  16. Findlay, R. H., King, G. M., Watling, L., Watling, L. E. S. Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sediments Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sedimentst. Appl Environ Microbiol. 55 (11), 2888-2893 (1989).
  17. Willers, C., Jansen van Rensburg, P. J., Claassens, S. Microbial signature lipid biomarker analysis - an approach that is still preferred, even amid various method modifications. J Appl Microbiol. 118 (6), 1251-1263 (2015).
  18. Balser, T. C. Phospholipid Fatty-acid Analysis (PLFA). Protocol. , Available from: http://nature.berkeley.edu/soilmicro/methods/BalserPLFA.pdf (2017).
  19. Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty-acids in phospholipids and lipopolysachharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 24 (4), 317-323 (1992).
  20. Frostegard, A., Tunlid, A., Baath, E. Phospholipid fatty-acid composition, biomass, and activity of microbial communities from 2 soil types experimentally exposed to different heavy-metals. Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3605-3617 (1993).
  21. Federle, T. W., Dobbins, D. C., Thorntonmanning, J. R., Jones, D. D. Microbial biomass, activity, and community structure in subsurface soils. Ground Water. 24 (3), 365-374 (1986).
  22. Vestal, J. R., White, D. C. Lipid analysis in microbial ecology - quantitative approaches to the study of microbial communities. BioScience. 39 (8), 535-541 (1989).
  23. Wilkinson, S. G. Gram negative bacteria. Microbial Lipids. , 299-488 (1988).
  24. Balser, T. C., Treseder, K., Ekenler, M. Using lipid analysis and hyphal length to quantify AM and saprotrophic fungal abundance along a soil chronosequence. Soil Biol Biochem. 37 (3), 601-604 (2005).
  25. Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
  26. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Phys. (37), 911-917 (1959).
  27. Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of Fatty Acid Methyl Ester (FAME) Methods for Characterizing Microbial Communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
  28. Jandl, G., Leinweber, P., Schulten, H., Ekschmitt, K. Contribution of primary organic matter to the fatty acid pool in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 37, 1033-1041 (2005).
  29. Nielsen, P., Petersen, S. O. Ester-linked polar lipid fatty acid profiles of soil microbial communities: a comparison of extraction methods and evaluation of interference from humic acids. Soil Biol Biochem. 32, 1241-1249 (2000).
  30. Duncan, D. S., Jewell, K. A., Suen, G., Jackson, R. D. Detection of short-term cropping system-induced changes to soil bacterial communities differs among four molecular characterization methods. Soil Biol Biochem. 96, 160-168 (2016).
  31. Liang, C., et al. Switchgrass rhizospheres stimulate microbial biomass but deplete microbial necromass in agricultural soils of the upper Midwest, USA. Soil Biol Biochem. 94, 173-180 (2016).
  32. Jangid, K., et al. Land-use history has a stronger impact on soil microbial community composition than aboveground vegetation and soil properties. Soil Biol Biochem. 43 (10), 2184-2193 (2011).
  33. Ritz, K., et al. Spatial structure in soil chemical and microbiological properties in an upland grassland. FEMS Microbiol Ecol. 49 (2), 191-205 (2004).
  34. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. J Chem Inf Model. 53 (9), 1689-1699 (2013).
  35. Lennon, J. T., Jones, S. E. Microbial seed banks: The ecological and evolutionary implications of dormancy. Nat Rev Microbiol. 9 (2), 119-130 (2011).
  36. Gutknecht, J. L. M., Field, C. B., Balser, T. C. Microbial communities and their responses to simulated global change fluctuate greatly over multiple years. Glob Change Biol. 18, 225-269 (2012).
  37. Pei, Z., et al. Soil and tree species traits both shape soil microbial communities during early growth of Chinese subtropical forests. Soil Biol Biochem. 96, 180-190 (2016).
  38. Oates, L. G., Duncan, D. S., Sanford, G. R., Liang, C., Jackson, R. D. Bioenergy cropping systems that incorporate native grasses stimulate growth of plant-associated soil microbes in the absence of nitrogen fertilization. Ag Ecosys Environ. 233, 396-403 (2016).
  39. Bååth, E. The use of neutral lipid fatty acids to indicate the physiological conditions of soil fungi. Microbial Ecol. 45 (4), 373-383 (2003).
  40. Ngosong, C., Gabriel, E., Ruess, L. Use of the signature Fatty Acid 16:1ω5 as a tool to determine the distribution of arbuscular mycorrhizal fungi in soil. J Lipids. 2012, 236807 (2012).
  41. Sharma, M. P., Buyer, J. S. Comparison of biochemical and microscopic methods for quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in soil and roots. Appl Soil Ecol. 95, 86-89 (2015).
  42. Oates, L. G., Balser, T. C., Jackson, R. D. Subhumid pasture soil microbial communities affected by presence of grazing, but not grazing management. Appl Soil Ecol. 59, 20-28 (2012).
  43. Liang, C. Potential legacy effects of biofuel cropping systems on soil microbial communities in southern Wisconsin, USA. Ag Sci. 2 (2), 131-137 (2011).
  44. Herzberger, A. J., Duncan, D. S., Jackson, R. D. Bouncing Back Plant-Associated Soil Microbes Respond Rapidly to Prairie Establishment. PloS One. 9 (12), 1-14 (2014).
  45. Fraterrigo, J. M., Balser, T. C., Turner, M. G. Microbial community variation and its relationship with nitrogen mineralization in historically altered forests. Ecology. 87 (3), 570-579 (2006).
  46. Kao-Kniffin, J., Balser, T. C. Elevated CO2 differentially alters belowground plant and soil microbial community structure in reed canary grass-invaded experimental wetlands. Soil Biol Biochem. 39 (2), 517-525 (2007).
  47. Mentzer, J. L., Goodman, R. M., Balser, T. C. Microbial response over time to hydrologic and fertilization treatments in a simulated wet prairie. Plant Soil. 284 (1-2), 85-100 (2006).
  48. Ushio, M., Wagai, R., Balser, T. C., Kitayama, K. Variations in the soil microbial community composition of a tropical montane forest ecosystem: Does tree species matter. Soil Biol Biochem. 40 (10), 2699-2702 (2008).
  49. Bartelt-Ryser, J., Joshi, J., Schmid, B., Brandl, H., Balser, T. Soil feedbacks of plant diversity on soil microbial communities and subsequent plant growth. Perspect Plant Ecol. 7 (1), 27-49 (2005).
  50. Fichtner, A., von Oheimb, G., Härdtle, W., Wilken, C., Gutknecht, J. L. M. Effects of anthropogenic disturbances on soil microbial communities in oak forests persist for more than 100 years. Soil Biol Biochem. 70, 79-87 (2014).

Tags

Miljøvitenskap utgave 125 fosfatipidfettsyre (PLFA) fettsyremetylester (FAME) MIDI-FA lipidbiomarkør mikrobiell samfunn bakterier sopp ordinering jordmikrobiologi
En lipidekstraksjons- og analysemetode for karakterisering av jordmikrober i eksperimenter med mange prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oates, L. G., Read, H. W.,… More

Oates, L. G., Read, H. W., Gutknecht, J. L. M., Duncan, D. S., Balser, T. B., Jackson, R. D. A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples. J. Vis. Exp. (125), e55310, doi:10.3791/55310 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter