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कई नमूनों के साथ प्रयोगों में मृदा की सूक्ष्मजीवों को वर्णित करने के लिए एक लिपिड निष्कर्षण और विश्लेषण विधि

doi: 10.3791/55310 Published: July 16, 2017

Summary

लेख में एक विधि का वर्णन किया गया है जो कई नमूनों के साथ अध्ययन में मिट्टी की सूक्ष्म जैविक समुदाय संरचना को निर्धारित करने के लिए कुल लिपिड्स और रिश्तेदार लिपिड दोनों को चित्रित करने में उपयोग के लिए सूक्ष्मजीवों के सेल झिल्ली से लिपिड के लिपिडों के निष्कासन के लिए प्रयास और सटीकता को संतुलित करता है।

Abstract

माइक्रोबियल समुदाय महत्वपूर्ण चालकों और पारिस्थितिक तंत्र प्रक्रियाओं के नियामक हैं। पारिस्थितिक तंत्र का प्रबंधन माइक्रोबियल समुदायों को कैसे प्रभावित कर सकता है यह समझने के लिए, माइक्रोबियल समुदाय संरचना परखने के लिए एक अपेक्षाकृत सटीक लेकिन प्रयास-गहन तकनीक है फॉस्फोलिपिड फैटी एसिड (पीएलएफए) विश्लेषण। पीएलएफा को फॉस्फोलाइपिड बायोमार्कर का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया था, जिसका उपयोग माइक्रोबियल बायोमास के संकेतकों और कवक और जीवाणु के व्यापक कार्यात्मक समूहों के रूप में किया जा सकता है। यह आमतौर पर वैकल्पिक वनस्पति समुदायों, पारिस्थितिकी और प्रबंधन शासनों के अंतर्गत मिट्टी की तुलना करने के लिए उपयोग किया जाता है। पीएलएफए विधि को माइक्रोबियल समुदाय संरचना में बदलाव का पता लगाने के लिए संवेदनशील होना दिखाया गया है।

एक वैकल्पिक विधि, फैटी एसिड मिथाइल एस्टर निष्कर्षण और विश्लेषण (मिडी-एफए) को कुल लिपिडों के तेजी से निकालने के लिए विकसित किया गया था, जो फास्फोलिपिड अंश के बिना, शुद्ध संस्कृतियों से माइक्रोबियल पहचान तकनीक के रूप में विकसित किया गया था। यह विधि हैमिट्टी के नमूनों के लिए तेज़ लेकिन कम अनुकूल है क्योंकि इसमें मिट्टी के कणों को अलग करने के लिए एक प्रारंभिक कदम नहीं है और इसके बजाय एक saponification प्रतिक्रिया के साथ शुरू होता है जो संभावना है कि मिट्टी में पृष्ठभूमि कार्बनिक पदार्थ से कलाकृतियों का उत्पादन होता है।

यह आलेख एक ऐसी विधि का वर्णन करता है जो कई नमूनों के साथ अध्ययन में मिट्टी की सूक्ष्म जैविक समुदाय संरचना को निर्धारित करने के लिए कुल लिपिड्स और रिश्तेदार लिपिड दोनों को चित्रित करने में उपयोग के लिए सूक्ष्मजीवों के सेल झिल्ली से लिपिड के लिपिडों के निष्कासन के लिए प्रयास और सटीकता को बढ़ाते हुए एक तरीका का वर्णन करता है। विधि पहले चरण के रूप में मिट्टी लिपिड निकालने और ध्यान केंद्रित करके PLFA रूपरेखा के माध्यम से हासिल की गई सटीकता को जोड़ती है, और दूसरे चरण के रूप में मिडी-एफए पद्धति के साथ कार्बनिक पदार्थ निकाले जाने और प्रसंस्करण के प्रयासों में कमी।

Introduction

पौष्टिक साझेदारी 1 में सूक्ष्मजीवों की महत्वपूर्ण भूमिका, पौधों की सामजिक संरचना 2 , पौधे की उत्पादकता 3 के संशोधन, और कार्बनिक पदार्थों का अपघटन 4 में संशोधन, स्थलीय पारिस्थितिक तंत्र को समझने के लिए मिट्टी की सूक्ष्मजीवों को समझना महत्वपूर्ण है।

मिट्टी में उनके अपेक्षाकृत उच्च बहुतायत के कारण, और उनके रासायनिक हस्ताक्षर, लिपिड बायोमार्करों का इस्तेमाल मिट्टी के माइक्रोबियल समुदायों 5 के प्रमुख पर्यावरणीय समूहों को प्रोफाइल करने के लिए किया जा सकता है। लिपिड बायोमार्कर की मात्रा को बढ़ाकर हम अलग-अलग लिपिड्स का अनुमान लगा सकते हैं, और फिर इन लिपिड को पारिस्थितिक रूप से संबंधित समूहों जैसे कि ग्राम पॉजिटिव (ग्राम +) और ग्राम नेगेटिव (जीएम) जीवाणु, अर्बुस्क्युलर मायकोर्हाजल (एएम) और एसप्रोट्रॉफिक कवक, और एक्टिनोमायसीस 5 , Ss = "xref"> 6 , 7 , 8

माइक्रोबियल समुदायों के पहलुओं को चिह्नित करने के लिए कई तरीके हैं। मूलभूत माइक्रोबियल समुदाय संरचना को समझने के लिए पीएलएफए विधि आमतौर पर इस्तेमाल की जाती है। यह माइक्रोबियल समूह के सापेक्ष बहुतायत के साथ-साथ कुल माइक्रोबियल बायोमास का आकलन करने का एक प्रभावी तरीका है। तेजी से लिपिड टर्नओवर के कारण, पीएलएफए प्रोफाइलिंग ने मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय में बदलावों की तुलना में तेजी से पहचान की है और सूचना देता है जो पारिस्थितिक तंत्र की कार्यप्रणाली की तुलना करने की अनुमति देता है, उदा। फंगल: बैक्टीरियल अनुपात पोषक तत्व साइकिल चलाना 1 , 9 , 10 की दर का आकलन करने के लिए। हालांकि, जबकि पीएलएफए निष्कर्षण पद्धति का समय सम्मानित और अच्छी तरह से सम्मानित है, यह भी समय लगता है और खुद को पारिस्थितिक तंत्र-स्तरीय अध्ययनों में अच्छी तरह से उधार नहीं करता है, जिसके लिए बड़े पैमाने पर नमूने फ़ील्ड स्केल से नकल की आवश्यकता होती हैच "> 11 , 12

इसके विपरीत, फैटी एसिड मिथाइल एस्टर निष्कर्षण पद्धति (मिडी-एफए) में तेजी से प्रवाह की अनुमति देने की क्षमता है। इस पद्धति में, नमूनों को saponified, FAMEs में परिवर्तित, निकाले गए, और फिर विश्लेषण किया गया। मिडी एफए विधि तेजी से लेकिन पीएलएफए से कम भेदभाव है, जो विभिन्न लिपिड कक्षाओं 13 (फास्फोलिपिड्स, तटस्थ लिपिड, और ग्लाइकोलीपिड) के अलग होने के साथ लिपिड निकासी को जोड़ती है।

इस प्रोटोकॉल में, हम एक विधि का वर्णन करते हैं जो पीएलएफए और मिडी-एफए दोनों लिपिड प्रोफाइलिंग के तत्वों को जोड़ती है। यह संशोधित ब्लीच और डायर विधि के प्रारंभिक क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण कदमों का उपयोग करते हुए लिपिड निकालने का कार्य करता है, और फिर फेपे में सैपोनिफिकेशन और रूपांतरण। यह माइक्रोबियल सामुदायिक संरचना का पता लगाने का एक मजबूत तरीका प्रदान करता है जबकि गैर-माइक्रोबियल सामग्री 5 , 14 15 नमूनों के साथ बड़े पैमाने पर अध्ययन से लिपिड का विश्लेषण करने के लिए यह तर्कसंगत और आर्थिक रूप से व्यावहारिक बनाने के लिए अधिक सटीकता को बनाए रखते हुए सटीकता को बरकरार रखता है। मिडी-एफए प्रदर्शन करने से पूर्व, कार्बनिक-घुलनशील घटकों ( उदाहरण के लिपिड) को अलग करने और पृथक करने से, और इसे शुद्धिकरण चरण के साथ पूरा करने से, प्रोटोकॉल गति और सटीक के बीच संतुलन प्रदान करता है

Protocol

नोट: पूरी प्रक्रिया के दौरान हमेशा उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें। संभावित नमूना संदूषण से बचने के लिए, नंगे हाथों से कांच के बने पदार्थ को स्पर्श न करें। क्लोरोफॉर्म के संचालन के लिए आवश्यक प्रोटोकॉल चरण चलाते समय उचित दस्ताने पहनें

1. तैयारी (~ 40 नमूनों के लिए 2 दिन)

  1. मिट्टी को बाँझ बैग में ले लीजिए और कूलर युक्त बर्फ में क्षेत्र से परिवहन। यदि ताजा मिट्टी की छलनी और तुरंत सुखाने के लिए संभव नहीं है, तो विश्लेषण शुरू करने के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नमूने संग्रहीत करें।
  2. होमोजिनायझिंग द्वारा मिट्टी तैयार करें जड़ों और पत्थरों को निकालें और मोटे सिवेिंग ( जैसे 2 मिमी) के द्वारा कोड़े को तोड़ दें।
  3. फ्रिज ड्रायर मैनुअल के निर्देशों के मुताबिक उचित कंटेनर में सबसामलों डालकर फ्रीज सुखाने के लिए तैयार करें और जितनी जल्दी हो सके सूखे फ्रीज करें। एक बार मिट्टी फ्रीज सूख दी जाती है, जब तक कि निष्कर्षण तक desiccant के साथ एक सील कंटेनर में स्टोर करें। यह एस के लिए सबसे अच्छा हैकम से कम -20 डिग्री सेल्सियस पर सूखे मिट्टी फ्रीज करें, लेकिन अधिमानतः -80 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. निकासी की तैयारी में, सूखे मिट्टी को भंडारण से फ्रीज करें और पीसकर आटे की तरह स्थिरता दें। पीसने के तरीके में बॉल मिल, बॉल बटर, और मोर्टार और मूसल शामिल हैं। मिट्टी पीसने के बाद, फ्रीज़र में स्टोर करें (1.3 देखें)।
    नोट: निष्कर्षण के लिए प्रयुक्त नमूना की मात्रा इसकी कार्बनिक पदार्थ की सामग्री पर निर्भर करती है। एक सामान्य दिशानिर्देश एक मिट्टी के 0.5 से 1 ग्राम का उपयोग होता है जो कि वजन से 12 से 18% कार्बन होता है, और 3 से 5 ग्राम वजन से 1 से 3% कार्बन के लिए होता है।
  5. हेक्सेन के साथ 30 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब पूर्व-कुल्ला 5 सेकंड के लिए ट्यूबों और भंवर के लिए लगभग 2 से 3 एमएल हेक्सेन जोड़ें। डिकंट हेक्सेन को एक और ट्यूब, और भंवर। हेक्सेन (2 से 3 एमएल) का प्रयोग छह ट्यूबों को क्रमशः छिड़कने के लिए किया जा सकता है। हेक्सन-रग्नेटेड ट्यूबों को धूआं हुड में उलटा और उपयुक्त कचरे के कंटेनर में उपयोग किए गए हेक्सेन का निपटान करें।
  6. कांच के बने पदार्थ को एल्यूमीनियम पन्नी के 2 से 3 परतों में लपेटें और मस्त भट्टी में जगह दें। सेंकना4.5 घ के लिए 450 डिग्री सेल्सियस (मफल) के कांच के बने पदार्थ
  7. अभिकर्मकों को तैयार करें
    1. उपयोग की गई मिट्टी की मात्रा के लिए, फॉस्फेट-बफर (पी-बफर) के लिए 0.8: 1: 2 मात्रा अनुपात में रसायनों को जोड़ें: सीएचएल 3 : मेओएच।
    2. पी-बफर समाधान तैयार करें: फॉस्फेट-बफर: 0.1 एम, पीएच 7.0।
      1. 61 एमएल 1 एम के 2 एचपीओ 4 स्टॉक, बाँझ (रासायनिक एसीएस प्रमाणित ग्रेड या बेहतर होना चाहिए) जोड़ें। 39 एमएल 1 एम केएच 2 पीओ 4 स्टॉक, बाँझ (रासायनिक एसीएस प्रमाणित ग्रेड या बेहतर होना चाहिए) जोड़ें। प्रकार 1 पानी के साथ 1000 एमएल भरें। NaOH या एचसीएल के साथ पीएच को 7.0 में समायोजित करें अपरिष्कृत समाधान को परिवेश तापमान पर 7 डी तक या एक रेफ्रिजरेटर में 30 दिनों के लिए स्टोर करें।
      2. वैकल्पिक रूप से, के 2 एचपीओ 4 के 10.62 ग्राम और केएच 2 पीओ 4 के 5.31 ग्राम का वजन; प्रकार 1 पानी के साथ 1 एल को पतला पीएच की जांच करें, यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें
    3. अभिकर्मक 1, सपोनीकरण अभिकर्मक तैयार करें
      1. प्रकार 1 पानी के 300 एमएल के बावजूद।सीएच 3 ओएच (एचपीएलसी ग्रेड या उच्चतर) के 300 एमएल जोड़ें। NaOH (प्रमाणित एसीएस या बेहतर) के 90.00 ग्राम जोड़ें। हलचल के दौरान हल करने के लिए NaOH छर्रों को जोड़ें। छर्रों भंग होने तक हलचल इस समाधान को 30 घ से अधिक समय तक संग्रहीत करने की अनुशंसा की जाती है।
    4. अभिकर्मक 2 तैयार करें, मेथिलरण अभिकर्मक
      1. सीएच 3 ओएच (एचपीएलसी ग्रेड या उच्चतर) के 275 एमएल का वितरण सरगर्मी के दौरान 325 एमएल प्रमाणित 6.00 एन एचसीएल जोड़ें। इस समाधान को 30 घ से अधिक समय तक संग्रहीत करने की अनुशंसा की जाती है।
    5. अभिकर्मक 3, निष्कर्षण अभिकर्मक तैयार करें: 50% सी 6 एच 14 (हेक्सेन), 50% सी 5 एच 12 ओ (एमटीबीई)।
      1. धूआं हुड में, 200 एमएल का सी 6 एच 14 (एचपीएलसी ग्रेड या उच्चतर) और 200 एमएल का सी 5 एच 12 ओ (एचपीएलसी ग्रेड या उच्चतर) मिलाएं। अच्छी तरह मिलाएं; कसकर टोपी 1 साल से अधिक समय तक फ्लैमबेस कैबिनेट या फ्यूम हुड में स्टोर करें।
    6. अभिकर्मक 4 तैयार करें, बेस वॉश अभिकर्मक
      1. 900 का आदान-प्रदानप्रकार 1 पानी बीकर के एमएल सरगर्मी के दौरान 10.80 ग्राम NaOH (प्रमाणित एसीएस या बेहतर) जोड़ें। छर्रों भंग होने तक हलचल इस समाधान को 30 घ से अधिक समय तक संग्रहीत करने की अनुशंसा की जाती है।
    7. आंतरिक मानक के शेयर समाधान तैयार करें
      1. 1 9: 0 ईई मानक के 100 मिलीग्राम वजन करें। हेक्सेन-रिन्स्ड वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क के 50 एमएल में जोड़ें। ~ 15 एमएल हेक्सेन-एमटीबीई समाधान (रिएगेंट 3) फ्लास्क, भंग करने के लिए भंग करने के लिए जोड़ें। हेक्सेन-एमटीबीई समाधान (अभिकर्मक 3) के साथ 50 एमएल तक सबसे ऊपर। कैप और भंवर के मिश्रण करने के लिए हेफ़ेन्स-रिनिज्ड ग्लास ट्यूबों को पीटीएफई के साथ कैप और स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफर करें।

2. दिन 1 - मिट्टी से फैटी एसिड का एक्सट्रैक्शन (~ 40 नमूनों के लिए 4 से 5 घंटे)

  1. पी-बफर, क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल के लिए तीन 5-10 एमएल वितरण पिपेट तैयार करें।
    नोट: क्लोरोफॉर्म के लिए कम खतरनाक विकल्प को अदला-बदली के रूप में प्रस्तावित किया गया है। ये बराबर लिपिड वसूली दर 16 में हो सकता है , 17 , लेकिन इस प्रोटोकॉल में मूल्यांकन नहीं किया गया है।
  2. फ्रीज सूखे मिट्टी को 30 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों और रिकॉर्ड मिट्टी के द्रव्यमान में तौलिए।
  3. दो रिक्त स्थान बनायें और एक जांच मानक शामिल करें (एक मिट्टी जो पहले से निकाली गई है)।
  4. धूमिल हुड में, अभिकर्मकों को निम्न क्रम में अपकेंद्रित्र ट्यूब में मिट्टी में जोड़ें: पी-बफर, सीएचएल 3 , और मेओएच (तालिका 1)। सीएलसी 3 को जोड़ने से पहले पी-बफर जोड़ के बाद मिट्टी का समय गीला होने दें। अपकेंद्रित्र ट्यूबों कसकर कैप करें और प्रकाश से बचाने के लिए कवर करें।
  5. उन्हें क्षैतिज क्षैतिज रूप से सुनिश्चित कर लें कि वे अच्छी तरह सुरक्षित हैं। 280 आरपीएम पर गति सेटिंग के साथ, 1 एच 18 के लिए शेक
  6. प्रत्येक नमूने के लिए दो 16 मिमी x 150 मिमी कांच के नलिका तैयार करें: ट्यूब लेबल करें और सीएचसीएल 3 की समान मात्रा और पी-बफर का बराबर मात्रा जोड़ें।
  7. 10 मिनट के लिए 1430 में टकरानेवाला और अपकेंद्रित्र से अपकेंद्रित्र ट्यूब निकालेंXg और 25 डिग्री सेल्सियस चरण अलग करना ग्लास ट्यूब में दिखाई देनी चाहिए।
  8. धूमिल हुड में, चरण 2.6 में तैयार ट्यूबों में से एक अपकेंद्रित्र ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला छानना। 2.4 से 2.5 के चरणों को दोहराएं और दूसरी ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला को छानना।
  9. सुरक्षित रूप से सभी 16 मिमी × 150 मिमी गिलास ट्यूबों को पीटीएफ-लाइन वाले कैप के साथ कैप करें और 10 एक्स मिश्रण करने के लिए पलटना करें।
  10. नमूनों को दो चरणों के पृथक्करण को पूरा करने के लिए रात भर अव्यवस्थित होने की अनुमति दें। ऐसा करने के लिए, नमूने को एक अंधेरे कैबिनेट / अंतरिक्ष में रखें या कमरे के तापमान पर एल्यूमीनियम पन्नी में कवर करें। यह सप्ताह के अंत तक अर्क को अलग करने की अनुमति देने के लिए स्वीकार्य है।
    1. वैकल्पिक रूप से, अगर कोई अगले चरण में सीधे स्थानांतरित होने की इच्छा रखता है, या यदि नमूने अगले दिन परेशान हो जाते हैं, तो 1000 मिनट और 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेंटीफ्यूज नमूने
      नोट: एक समान चरण अलग करने के लिए एक तुलना समूह के भीतर सभी नमूने खड़े समय।

3 दिन2 - लिपिड का अलगाव (~ 40 नमूनों के लिए 3 से 4 घंटे)

  1. वाष्पीकरण तंत्र और विलायक जाल चालू करें वाष्पीकरण तंत्र को 33 डिग्री सेल्सियस और प्रीहिट में सेट करें।
  2. हुड में एक वैक्यूम ऐस्पिरेटर सेट करें: एक वैक्यूम पंप, एक उच्च शुद्धता टयूबिंग की लंबाई और एक ग्लास पाइपेट से जुड़ा एक साइड-बांह फ्लास्क।
  3. दो ग्लास ट्यूबों के ऊपर परत और इंटरफ़ेस (लगभग 2/3 तरह से) की तरक्की करें, जलीय परत को बनाए रखना। प्रत्येक नमूने के लिए एक साफ pipet का उपयोग करते हुए प्रक्रिया को दोहराएं।
  4. दूसरी ट्यूब से निकालने के जलीय परतों को संयोजित करके पहले ट्यूब में सावधानीपूर्वक डिंटिंग करके मिलाएं। यह सुनिश्चित कर लें कि ट्यूब को ढांकना खरोंच या दरार से मुक्त है।
  5. एक बार CHCl 3 निष्कर्षों को मिलाकर, तरल का निरीक्षण करें - यह स्पष्ट होना चाहिए। यदि स्पष्ट नहीं होने तक मेओएच को न जोड़ें
  6. वैक्यूम वाष्पीकरण तंत्र के उपयोग से सभी नमूनों को सूखा। तापमान की सेटिंग्स 33 डिग्री सेल्सियस से शुरू करें, भंवर की गति 26% और दबाव 400 एमबार।
  7. पीवाष्पीकरण प्रणाली में नमूनों को ले जाएं और 10 मिनट के बाद धीरे-धीरे 350 एमबार के दबाव को कम करें।
  8. प्रगति की निगरानी करें और जब ट्यूब में तरल स्तर हीटिंग ब्लॉक के स्तर पर पहुंच गया है, 300 एमबार के दबाव को कम करें।
  9. शेष तरल की ऊंचाई पर नज़र रखने के लिए जारी रखें और जब यह गहराई में लगभग 1 सेंटीमीटर है, तो 200 एमबार का दबाव कम हो जाएगा।
  10. नमूने सूखने के बाद, नमूनों को हटा दें और वाष्प को साफ करने के लिए 10 अतिरिक्त मिनट के लिए पंप चलाएं।
  11. ट्यूबों को कसकर कैप करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजर में लिपिड स्टोर करें
  12. लागू रासायनिक सुरक्षा नियमों के अनुसार एस्पिरेटेड तरल का निपटान करना

4. दिन 3 - साबुनिकीकरण और मेथिलिकेशन (~ 40 नमूनों के लिए 6 से 7 घंटे)

  1. पानी के स्नान चालू करें स्नान 1 से 95 डिग्री सेल्सियस और स्नान 2 से 80 डिग्री सेल्सियस सेट करें
  2. Pipet dispensers सेट और सुनिश्चित करें कि वे सही मात्रा का वितरण कर रहे हैं।
    अभिकर्मक 1: 1 एमएल प्रति नमूना
    अभिकर्मक 2: प्रति नमूना 2 एमएल
    अभिकर्मक 3: 1.25 एमएल प्रति नमूना
    अभिकर्मक 4: 3 एमएल प्रति नमूना
    नोट: हीटिंग प्रक्रिया ट्यूब में दबाव का निर्माण करेगी। खरोंच, फटा, या चिप्पी नलियों का उपयोग न करें।
  3. एक पाइप डिस्पेंसर का उपयोग सूख लिपिड के लिए 1.0 एमएल का अभिकर्मक जोड़ता है। कसकर कैप करें, रैक में 5 एस और जगह के लिए भंवर।
  4. नमूना ट्यूबों के रैक को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। स्नान से ट्यूबों के रैक को निकालें और ट्यूब में बढ़ते बुलबुले से संकेतित लीक के लिए ट्यूबों की जांच करें। लीक ट्यूबों के कैप्स को पीछे हटाना या बदलना, और दरारें या चिप्स के लिए फिर से जाँच करें एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए पानी के स्नान में ट्यूबों को गर्म करना जारी रखें
  5. नमूने 1 स्नान और स्नान 2 (80 डिग्री सेल्सियस) में जगह और एक और 15 मिनट के लिए ऊष्मायन जारी रखें।
  6. ट्यूबों को निकालें और रैक को ठंडा करने के लिए नल का एक पैन में रखकर नमूनों को शांत कर दें।
  7. प्रत्येक नमूने के लिए 2 एमआई का अभिकर्मक जोड़ें। 5 से 10 के लिए कसकर और भंवर कैप करें रैक को 80 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें और 10 मिनट के लिए सेवन करें।
  8. पानी के स्नान से ट्यूबों के रैक को निकालें और ठंडा करने के लिए नल का पानी भरें। कूलिंग प्रक्रिया को गति देने के लिए ट्यूबों के रैक को बढ़ाएं।
    नोट: समय और तापमान से अधिक न हो। बहुत ज्यादा हीटिंग FAMEs नीचा सकता है
  9. फैटी एसिड मिथाइल एस्टर को निकालने के लिए प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए प्रिपेट 3 के 1.25 एमएल के पाइप डिस्पेंसर का उपयोग करना। कसकर कैप करें और ट्यूबों को 10 मिनट के लिए रखें
  10. झटकों के बाद, ट्यूबों के रैक अलग चरणों के लिए 10 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें। एक ग्लास pipet का उपयोग कर एक 16 मिमी x 100 मिमी कांच टेस्ट ट्यूब के लिए कार्बनिक चरण (शीर्ष परत) को स्थानांतरित करें।
  11. फिर से Reagent 3 जोड़कर निष्कर्षण दोहराएं, चरणों को अलग करने की अनुमति दें, और शीर्ष चरण को स्थानांतरित करें।
    नोट नीचे के किसी भी चरण को स्थानांतरित न करें। ट्यूब में शीर्ष चरण की एक छोटी राशि को छोड़ना ठीक है
  12. पाइप डिस्पेंसर का उपयोग करना, अभिकर्मक 4 से वें के 3 एमएल जोड़ेंई 16 मिमी x 100 मिमी ट्यूब
  13. टेस्ट ट्यूबों को कसकर और 20-30 एस के लिए भंवर कैप करें
  14. Vortexing के बाद, 1,000 मिनट पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
  15. एक साफ ग्लास pipet का उपयोग करना, शीर्ष कार्बनिक चरण महाप्राणण करना और 4-एमएल एम्बर शीशी को स्थानांतरित करना।
  16. वाष्पीकरण तंत्र और विलायक जाल चालू करें वाष्पीकरण तंत्र को 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, भंवर की गति 26%, 200 एमबी की वैक्यूम और प्रीहिट प्रेस करें।
  17. प्रगति की निगरानी करें नमूने सूखने के बाद, नमूनों को हटा दें और वाष्प को साफ करने के लिए 10 अतिरिक्त मिनट के लिए पंप चलाएं।
  18. अभिकर्मक की बोतलें 1 और 4 से पिपेट को निकालें और कुछ पतला एसिड ( जैसे 1% एचसीएल) के माध्यम से पंप करें, इसके बाद डि पानी का पालन करें। डीआई पानी के माध्यम से पम्पिंग द्वारा अभिकर्मक 2 के लिए इस्तेमाल किया गया पिपेट कुल्ला। हुड में, एक उचित कंटेनर में Reagent 3 के लिए इस्तेमाल किया pipet से विलायक निकास और विलायक अवशेषों सुखाया है जब तक हुड में इसे रखो।
  19. स्टिकिन को रोकने के लिए हटाए गए plungers के साथ उलटा पिपेटों को स्टोर करेंचेक वाल्व का जी
  20. कांच के पाइपट का उपयोग करें एक बार और फिर एक उचित कंटेनर में निपटान
  21. हुड में, कांच के बने पदार्थों पर विलायक अवशेषों को लुप्त हो जाना।
  22. स्वच्छ पानी और डिटर्जेंट समाधान के साथ कांच के बने पदार्थों को कुल्ला।

5. दिन 4 - जीसी शीशियों (~ 40 नमूनों के लिए 2-3 घंटे) के कार्य समाधान और फामेल्स के हस्तांतरण की तैयारी

  1. सामग्री इकट्ठा करें: सूखे नमूनों के साथ 4 एमएल एम्बर शीश; एम्बर 2 एमएल जीसी शीशियों; 400 μL फ्लैट नीचे ग्लास आवेषण और कैप; 500 μL ग्लास सिरिंज; 50 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क; स्टॉक समाधान - 50/50 हेक्सेन / एमटीबीई (अभिकर्मक 3) में इथेल नॉनएडेकैनेट (1 9: 0 ईई आंतरिक मानक)।
  2. ग्लास सिरिंज का उपयोग, 500 एमएल एथिल नॉनडेकैनेट (1 9: 0 ईई) स्टॉक समाधान को 50 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में जोड़ें।
  3. Reagent 3 के साथ बड़ा स्कोर फ्लास्क भरें
  4. कैप फ्लास्क और 5x को पलटने के लिए मिश्रण।
  5. एक कार्यशील समाधान जलाशय के लिए एक साफ 4 एमएल शीशी में 3 एमएल स्थानांतरण।
  6. वें का उपयोग करनाई ग्लास सिरिंज, सूख फैटी एसिड मिथाइल एस्टर और टोपी युक्त 4 एमएल शीशियों में से प्रत्येक के लिए काम करने के समाधान के 300 μL जोड़ें।
  7. 15 एस के लिए नमूना भंवर और 15 मिनट के लिए खड़े एक तरफ सेट
  8. गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, निलंबित फैटी एसिड मिथाइल एस्टर को 400 एमएल डालने वाले 2 एमएल जीसी शीशी में ध्यान से ट्रांसफर करें।
  9. विश्लेषण से पहले एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र में सीसीएल जीसी शीशियों को स्टोर करें।
  10. जीसी विश्लेषण के लिए नमूने जमा करें
    नोट: विश्लेषण एक विशिष्ट जीसी स्तंभ और शर्तों का उपयोग किया जाना चाहिए जो पूरक फ़ाइल S1 में वर्णित हैं। यह सबसे अच्छा है कि मेथिलिकेशन के 2 सप्ताह के भीतर जीसी विश्लेषण पूरा किया जा सकता है।

Representative Results

रिपोर्ट से डेटा तालिकाओं को एक स्प्रैडशीट या डेटाबेस में जोड़ा जा सकता है। प्रतिक्रिया कारक के समायोजन के बाद (अलग-अलग श्रृंखला लंबाई के लिए प्रतिक्रिया को सुधारने वाला सुधार कारक), पीक क्षेत्रों को बाहरी या आंतरिक मानकों के चोटी के क्षेत्र से तुलना में निकालने में एकाग्रता प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। मिट्टी के द्रव्यमान के माध्यम से विभाजित करके, डेटा को प्रत्येक ग्राम के फेम प्रति ग्राम के द्रव्यमान के रूप में व्यक्त किया जा सकता है या प्रत्येक फ़ेम के आणविक वजन का उपयोग करके, अधिक सामान्यतः सूचना दी गई ग्राम ग्राम की मात्रा माइक्रोबियल FAMEs का योग कुल माइक्रोबियल बायोमास का संकेत है, और उपचार के बीच तुलना की जा सकती है ( चित्रा 1 )। कुछ फैमेल्स भी विशिष्ट सूक्ष्म जैविक समूहों जैसे ग्राम-पॉजिटिव या ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया, एक्टिनोमायसीस, अर्बस्क्युलर मायकोर्हिजल कवक और सप्राट्रॉफ़िक कवक 19 , 20 , के साथ जुड़े हो सकते हैं। , 22 , 23 , 24 विशिष्ट जैवमार्करों के द्रव्यमान के अनुपात इन समूहों ( चित्रा 2 ) के रिश्तेदार बहुतायत को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। कुल मिलाकर फैम बहुतायत के पैटर्न समुदाय के स्तर के उंगलियों के निशान बनाते हैं, जो कि बहुविध तंत्र जैसे कि समन्वय ( चित्रा 3 ) के माध्यम से माइक्रोबियल समुदाय असमानता की तुलना की अनुमति देते हैं। अधिकांश डीएनए आधारित दृष्टिकोण के विपरीत, सामुदायिक स्तर के लिपिड डेटा का विश्लेषण या तो रिश्तेदार या पूर्ण बहुतायत के रूप में किया जा सकता है। यदि कुल बायोमास नमूनों के बीच काफी अलग है, तो ये दो दृष्टिकोण बहुत अलग परिणाम देंगे; प्रयोग के अंतर्निहित पारिस्थितिक प्रश्नों का निर्धारण करना चाहिए कि किस दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है

आकृति 1
एफ Iigure 1 : कुल FAME बायोमास निरंतर मक्का, निषेचित प्रेयरी, और उर्वरित प्रेयरी से कुल फेम बायोमाकर बायोमास (एनएमोल जी -1 मिट्टी) की तुलना में। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : बैक्टीरिया और कवक के फाम बायोमास। निरंतर मकई, निषेचित प्रेयरी, और बिना खुलने वाले प्राइरी से जीवाणु और कवक फॅम बायोमाकर बायोमास (एनएमोल जी -1 मिट्टी) की उपचार की तुलना। पूर्ण बहुतायत से फंगल और बैक्टीरिया मास। औसत (राशि एफ / राशि बी) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> चित्र तीन
चित्रा 3 : फेम लिपिड बायोमार्कर की गैर-मीट्रिक आयामी स्केलिंग सभी माइक्रोबियल फेम लिपिड बायोमार्कर के पूर्ण बहुतायत प्रोफाइल का उपयोग करके समग्र माइक्रोबियल समुदाय की तुलना। इस उदाहरण में, निरंतर मकई और बिना खारिज वाले प्रेयरी समुदायों को अलग कर दिया गया है और बहुत दूर हैं जबकि कुछ निषेचित प्रैरी नमूनों में माइक्रोबियल समुदाय हैं जो मकई से होते हैं, और दूसरों को बिना खुलने वाली प्रेयरी के समान मिलता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

तालिका एक
तालिका 1: टी एच इतनाएल ven टी प्रकार, रों पर propor ti जी -1 मिट्टी, एक टी एच eir आर orde आईटीआई हीं जोड़ने गयी। उचित निष्कर्षण और जैविक और जलीय चरणों के विभाजन के लिए यह महत्वपूर्ण है।

Discussion

कई प्रतिकृतियां और / या प्रयोगात्मक इकाइयों के प्रयोग से कई नमूने की परीक्षा के लिए, शोधकर्ताओं को समय और सामग्री 25 के संदर्भ में फॉस्फोलिपिड फैटी एसिड विश्लेषण (पीएलएफए) निषेधात्मक हो सकता है। पीएलएफए विधि के साथ, सेल झिल्ली फॉस्फोलाइपिड्स को निकाले, शुद्ध और संशोधित ब्लीय और डायर 26 दो-चरण जलीय-कार्बनिक निष्कर्षण का उपयोग करके पहचान की जाती है। इसके बाद ठोस-चरण सिलिका क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग-अलग लिपिड्स को ध्रुवीकरण से अलग किया जाता है, और फॉस्फोलिपिड फैटी एसिड का फैटी एसिड मिथाइल एस्टर में एक आंशिक मेथिलैलेशन होता है। पीएलएफए प्रोफाइलिंग लिपिड यील्ड में कम हो सकता है लेकिन बहुत ही उच्च शुद्धता माइक्रोबियल आईडी ने वैकल्पिक विधि, फैटी एसिड मिथाइल-एस्टर प्रक्रिया (मिडी-एफए) पेश की। मिडी-एफए पद्धति में, सभी लिपिड सीधे शुद्ध संस्कृतियों या मिट्टी / तलछट के नमूने 11 , 12 , 27 से निकाले जाते हैंसैपोनिफिकेशन। इस विधि में लिपिड हानि कम है और यह तेजी से है क्योंकि इसमें पीएलएफए पद्धति का कोई एकाग्रता या शुद्धि कदम नहीं है। हालांकि, मिडी-एए पद्धति तेजी से और कम खर्चीली है, क्योंकि यह मूल रूप से शुद्ध संस्कृति में जीवों की पहचान के लिए डिजाइन किया गया था, कोई प्रारंभिक निष्कर्षण या शुद्धि कदम नहीं हैं। इस प्रकार, इसमें लिपिड जैसे यौगिकों को मिट्टी कार्बनिक पदार्थ से सह-निकाला जा सकता है जो समुदाय हस्ताक्षर 27 , 28 , 2 को बिगाड़ देता है। चूंकि यह समावेशन बायोमास उपायों को बिगाड़ सकता है, इसलिए मिडी-एफए आमतौर पर केवल मृदा लिपिड 13 का वर्णन करने के लिए क्वॉलिफायर रूप से इस्तेमाल किया जाता है।

हम जो प्रक्रिया का वर्णन करते हैं वह यहां दो अलग-अलग निष्कर्षण प्रक्रियाओं को जोड़ती है: 1) संशोधित ब्लेघ और डायर 26 विधि का उपयोग करके लिपिड का एक निष्कर्षण और एकाग्रता, और 2) फैटी एसिड मिथाइल एस्टर सापोनीकरण, मेथिलिकेशन, निष्कर्षण, और आधार धोने की प्रक्रिया व्यावसायिक रूप से विकसित हुई। इस पद्धति को इन प्रोटोकॉल दोनों के लाभों को प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था जबकि नुकसान कम करने में 15 मिडी-एफए प्रदर्शन करने से पहले जैविक-घुलनशील घटकों ( उदाहरण के लिपिड) को प्रारंभ करने और अलग करने से, और यह शुद्धिकरण चरण के साथ पूरा करने से, यह प्रोटोकॉल गति और सटीक के बीच संतुलन प्रदान करता है हालांकि यह विधि उपयुक्त नहीं हो सकती है जब उच्च शुद्धता की आवश्यकता होती है ( यानी , 13 सी पीएलएएएस विश्लेषण के लिए) या जब फॉस्फोलिपिड्स और तटस्थ लिपिड का विश्लेषण अलग से किया जाता है, तो कई मामलों में यह सूक्ष्मजीव समुदाय की प्रतिक्रियाओं को डीएनए आधारित विधियों 30 , 31 , 32 , 33 झिल्ली लिपिड कोशिका मृत्यु के बाद उन्हें तेजी से विघटित कर देते हैंपर्यावरणीय डीएनए के विपरीत 5 , 7 नमूना लेने के समय रहने वाले माइक्रोबियल समुदाय को प्रतिबिंबित करते हैं, जिसमें अधिकांश जानकारी मृत या निष्क्रिय जीवों 34 से होती है । मिट्टी के सूक्ष्मजीवों 35 में देखे गए निष्क्रियता की उच्च दर को देखते हुए, जीवित बायोमास की विशेषता का इस्तेमाल अपेक्षाकृत बेहतर अस्थायी पैमाने पर अस्थायी पौध-सूक्ष्म अंतर को समझने के लिए किया जा सकता है और लिपिड बायोमार्करों का उपयोग माइक्रोबियल समुदाय 7 की शारीरिक स्थिति परखने के लिए किया जा सकता है। यह दिखाया गया है कि बड़े क्षेत्र की सेटिंग 25 में सूक्ष्म जैविक प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए उच्च थ्रूपूट तरीकों की आवश्यकता होती है, और जब भी हम जिस पद्धति का प्रस्ताव करते हैं वह पीएलएफा बायोमार्कर प्रोफाइलिंग की सटीकता को दोहराते नहीं हैं, यह मिडआई-एफए के साथ एहसास परिवर्तनशीलता को कम करते हुए इसे बढ़ा देता है प्रक्रिया। इस तरीके से संबोधित करने में एक प्रभावी उपकरण साबित हुआ हैबड़े पैमाने पर कृषि और पारिस्थितिकी तंत्र अध्ययन में मादक द्रव्यों की एक विस्तृत श्रृंखला पर माइक्रोबियल समुदाय की गतिशीलता से संबंधित प्रश्न 36 , 37 , 38 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50

लिपिड कक्षाओं को इस पद्धति के साथ जोड़ दिया जाता है और उन अलग कक्षा 22 , 3 9 में निहित जानकारी का नुकसान हो सकता है, लेकिन लिपिड कक्षाओं के संयोजन से दोनों phospho से 16: 1 ω5c के arbuscular mycorrhizal कवक उत्पत्ति का पता लगाने की शक्ति को मजबूत कर सकता है - और तटस्थ-लिपिड 40 इसके अलावा, टी जबकिवह अज्ञात फैटी एसिड की संख्या (जो गैर-जीवित कार्बनिक पदार्थ से प्राप्त किया जा सकता है) इस पद्धति से अधिक हो सकती है, यह मिडी-एफए से कम दिखाया गया था और कई नमूनों के साथ लिपिड प्रोफाइल की तुलना में इलाज की अनुमति देता है जहां नमूना इनपुट क्षमता एक चिंता का विषय है 15 साधारण रूप से तटस्थ अंश को मुख्य रूप से कवक द्वारा निर्मित भंडारण लिपिडों से प्राप्त करना माना जाता है, यद्यपि मादा प्रजाति 41 से कुछ छोटे योगदान भी हो सकते हैं। इस के प्रकाश में, यहां वर्णित विधि पीएलएफए की तुलना में फंगल लिपिड्स 18: 2 ω 6, 9 सी और 18: 1 ω 9 सी का बड़ा योगदान दिखा सकता है। अन्य लिपिड जो तटस्थ अंश में दिखते हैं, उनमें से कुछ संतृप्त फैटी एसिड, जैसे कि 16: 0, 18: 0, 20: 0

ऐसे कई तरीके हैं जिनमें लिपिड डेटा व्यक्त और विश्लेषण किया जा सकता है। सबसे आम प्रस्तुति बहुतायत (एनएमोल जी -1 मिट्टी), तिल फ्रैक्टियो हैएन (एनएमओएल व्यक्तिगत लिपिड एनएमएल -1 कुल लिपिड), और तिल प्रतिशत (मोल अंश * 100)। नमूना में कुल लिपिड्स द्वारा सामान्यीकृत, तिल अंश और तिल प्रतिशत दिए गए लिपिड के रिश्तेदार बहुतायत के उपाय हैं। एक उपयुक्त परिवर्तन के बाद, उदाहरण के लिए , आर्सेलस वर्ग-रूट, तिल अंश प्रमुख घटक या अतिरेक विश्लेषण समन्वय द्वारा विश्लेषण में उपयोग के लिए उपयुक्त है। प्रचुर मात्रा में दिए गए लिपिड की प्रति ग्राम मिट्टी की प्रति ग्राम निकाली गई है। क्योंकि प्रति सेल लिपिड की मात्रा काफी स्थिर है, और लिपिड निष्कर्षण अत्यधिक कुशल और व्यापक है, कुल बहुतायत कुल लिपिड का अच्छा अनुमान है और प्रमुख संकेतकों की बहुतायत यह पारिस्थितिक समूह के बायोमास को दर्शाती है जो यह 17 को दर्शाती है। अंत में, माइक्रोबियल समुदाय संरचना को देखने का एक अच्छा तरीका मल्टीवीरेट विश्लेषण पद्धतियों का उपयोग करना है 16 , जैसे , समन्वय पद्धति जैसे कि गैर-बहुविध आयामी स्केलिंग (एनएमडीएस -जो डेटा परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है) या प्रिंसिपल घटकों का विश्लेषण (पीसीए), सभी लिपिड बायोमार्करों की सापेक्ष बहुतायत की तुलना करने के लिए उपयोगी हो सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम डीओई ग्रेट लेक्स बायोनेर्जी रिसर्च सेंटर (डीओई बीईआर ऑफिस डीओ-एफसी02-07ER64494) और डीओई ओबीपी ऊर्जा दक्षता और अक्षय ऊर्जा (डीए-एसी05 -76आरएलए 08030) के कार्यालय द्वारा भाग में किया गया था। लेखकों ने अपने मरीज के लिए एंडरस गुर्दा को वीडियोग्राफी और संपादन के लिए निपुण योगदान के लिए स्वीकार करना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RapidVap Labconco 7900000 Evaporative system
RapidVap Labconco 7491400 Sample block
Chem-resistant vacuum pump Labconco 7584000 Vacuum pump
Chemical trap cannister Labconco 7815300 Trap cannister
Solvent insert Labconco 7515200 Solvent trap insert
Diaphragm pump Welch 7398000 DryFast vacuum pump
Water bath Fisher 15-462-15Q 2 well water bath
Gas chromatograph Various N/A For sample analysis
Centrifuge Various N/A For sample separation
Freeze Dryer Various N/A For sample lyophilization
Repipet (6) BrandTech 4720440 For dispensing reagents
Vortex Fisher 02-215-365 Analog vortex mixer
Teflon centrifuge tubes Thermo/Nalgene 3114-0030 Teflon sample tubes
Caps Thermo/Nalgene DS3131-0020 Caps for teflon tubes
Test tube Corning 9825-16 16x100mm tubes
Test tube Corning 9825-16xx 16x150mm tubes
Caps Corning 9998-15 15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner
Pasteur pipets Fisher 13-678-20B 14.6cm
500 uL glass syringe Fisher 13684106LC Hamilton 81217
Amber vials Agilent 5182-0716 4mL Amber vials
Caps Agilent 5182-0717 Blue screw caps
Inserts Agilent 5181-3377 400uL flat bottom glass inserts
Standards
19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate) VWR TCN0459-5G Analytical standard
Chemicals
Dipotassium phosphate (K2HPO4 - ACS grade or better) Various N/A For making Phosphate-Buffer
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 - ACS grade or better) Various N/A For making Phosphate-Buffer
Methanol (CH3OH - HPLC grade or better) Various N/A For making Reagents 1 & 2
Sodium hydroxide (NaOH - ACS grade or better) Various N/A For making Reagents 1 & 4
Hydrochloric acid (6N HCL) Various N/A For making Reagent 2
Hexane (HPLC grade or better) Various N/A For making Reagent 3
MTBE (Methyl tert-butyl ether - HPLC grade or better) Various N/A For making Reagent 3

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References

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कई नमूनों के साथ प्रयोगों में मृदा की सूक्ष्मजीवों को वर्णित करने के लिए एक लिपिड निष्कर्षण और विश्लेषण विधि
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Oates, L. G., Read, H. W., Gutknecht, J. L. M., Duncan, D. S., Balser, T. B., Jackson, R. D. A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples. J. Vis. Exp. (125), e55310, doi:10.3791/55310 (2017).More

Oates, L. G., Read, H. W., Gutknecht, J. L. M., Duncan, D. S., Balser, T. B., Jackson, R. D. A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples. J. Vis. Exp. (125), e55310, doi:10.3791/55310 (2017).

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