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Un metodo di estrazione e analisi lipidica per la caratterizzazione dei microbi del suolo negli esperimenti con molti campioni

doi: 10.3791/55310 Published: July 16, 2017

Summary

L'articolo descrive un metodo che aumenta il throughput, mentre equilibra lo sforzo e la precisione per l'estrazione dei lipidi dalle membrane cellulari di microrganismi per l'uso nella caratterizzazione di entrambi i lipidi totali e l'abbondanza relativa dei lipidi indicatori per determinare la struttura della comunità microbica del suolo negli studi con molti campioni.

Abstract

Le comunità microbiche sono importanti driver e regolatori dei processi ecosistemici. Per capire come la gestione degli ecosistemi possa influenzare le comunità microbiche, una tecnica relativamente precisa ma intensa per la valutazione della composizione microbica della comunità è l'analisi dell'acido grasso fosfolipidico (PLFA). PLFA è stato sviluppato per analizzare i biomarkers di fosfolipidi, che possono essere usati come indicatori della biomassa microbica e la composizione di ampie funzionalità di funghi e batteri. È stato comunemente utilizzato per confrontare i terreni in comunità vegetali alternative, ecologia e regimi di gestione. Il metodo PLFA è stato dimostrato sensibile alla rilevazione degli spostamenti nella composizione microbica della comunità.

Un metodo alternativo, l'estrazione e l'analisi del metil estere di acidi grassi (MIDI-FA) è stata sviluppata per l'estrazione rapida dei lipidi totali, senza separazione della frazione fosfolipidica, dalle culture pura come tecnica di identificazione microbica. Questo metodo èRapida ma meno adatta per i campioni di terreno perché manca di un passo iniziale che separa le particelle del terreno e inizia invece con una reazione di saponificazione che probabilmente produce manufatti della materia organica di fondo nel terreno.

Questo articolo descrive un metodo che aumenta il throughput, mentre equilibra lo sforzo e la precisione per l'estrazione dei lipidi dalle membrane cellulari di microrganismi per l'uso nella caratterizzazione di entrambi i lipidi totali e l'abbondanza relativa dei lipidi indicatori per determinare la struttura della comunità microbica del suolo negli studi con molti campioni. Il metodo combina l'accuratezza raggiunta attraverso la profilazione PLFA estraendo e concentrando i lipidi del suolo come primo passo e riducendo lo sforzo saponendo il materiale organico estratto e lavorando con il metodo MIDI-FA come un secondo passo.

Introduction

Dato il ruolo fondamentale dei microrganismi nel ciclo nutrizionale 1 , la modifica della composizione della comunità vegetali 2 , la regolazione della produttività vegetale 3 e la decomposizione della materia organica 4 , la comprensione delle comunità microbiche del suolo è fondamentale per la comprensione degli ecosistemi terrestri.

A causa della loro abbondanza relativamente elevata nel suolo e della loro firma chimica, i biomarkers lipidici possono essere utilizzati per profilare i gruppi ecologici dominanti che comprendono le comunità microbiche del suolo 5 . Quantificando i biomarkers lipidici che sono caratteristici di diversi gruppi microbici, possiamo stimare i lipidi totali e quindi separare questi lipidi in gruppi ecologicamente rilevanti come i batteri Gram positivi (Gm +) e Gram negativi (Gm-), i micoresi arbuscolari (AM) e saprotrofici Funghi e actinomycetes 5 , Ss = "xref"> 6 , 7 , 8 .

Ci sono molti metodi per caratterizzare gli aspetti delle comunità microbiche. Il metodo PLFA è comunemente usato per comprendere la struttura comunitaria microbica di base. È un modo efficace per valutare l'abbondanza relativa dei gruppi microbici e la biomassa microbica totale. A causa del rapido turnover dei lipidi, la profilazione PLFA consente anche una rilevazione relativamente veloce dei cambiamenti nella comunità microbica del suolo e fornisce informazioni che consentono di confrontare la funzione dell'ecosistema, ad esempio, i rapporti batterici con funghi per valutare i tassi di ciclaggio dei nutrienti 1 , 9 , 10 . Tuttavia, mentre il metodo di estrazione PLFA è rispettato e rispettato, è anche un tempo che richiede tempo e non si presta a studi su scala ecosistemica che richiedono un gran numero di campioni provenienti da repliche di scala di campoF "> 11 , 12 .

Al contrario, il metodo di estrazione del metil estere dell'acido grasso (MIDI-FA) ha il potenziale per consentire un rapido throughput. In questo metodo i campioni vengono saponificati, convertiti in FAME, estratti e quindi analizzati. Il metodo MIDI-FA è rapido ma meno discriminante di PLFA, che combina l'estrazione dei lipidi con la separazione delle diverse classi lipidiche 13 (fosfolipidi, lipidi neutri e glicolipidi).

In questo protocollo, descriviamo un metodo che combina gli elementi di PLFA e di profilassi lipidico MIDI-FA. Utilizza l'estrazione dei lipidi usando le fasi iniziali di estrazione del cloroformio del metodo Bligh e Dyer modificato e quindi la saponificazione e la conversione a FAMEs. Questo fornisce un modo robusto per rilevare la struttura della comunità microbica escludendo gran parte del rumore di fondo da materiale non microbico 5 , 14 15 . Eseguendo l'estrazione iniziale e isolando i componenti solubili in organico ( ad esempio i lipidi) prima di eseguire MIDI-FA e completandolo con una fase di purificazione, il protocollo offre un equilibrio tra velocità e precisione.

Protocol

NOTA: indossare sempre adeguati dispositivi di protezione individuale (PPE) durante tutta la procedura. Per evitare possibili contaminazioni del campione, non toccare le vetrine con le mani nude. Indossare guanti appropriati quando eseguono passaggi di protocollo che richiedono la manipolazione di cloroformio.

1. Preparativi (2 giorni per ~ 40 campioni)

  1. Raccogliere il suolo in sacchetti sterili e trasportare dal campo in un contenitore contenente ghiaccio. Se non è possibile schiarire il terreno fresco e lasciarli congelare immediatamente, conservare i campioni in un congelatore da -80 ° C fino a quando non sarà pronto per iniziare l'analisi.
  2. Preparare il terreno mediante omogeneizzazione. Rimuovere le radici e le pietre e rompere i tondini da una setacciatura grossolana ( es. 2 mm).
  3. Preparare l'essiccazione congelante inserendo i sottoinsiemi in un contenitore appropriato come indicato nel manuale del congelatore e congelare asciutto il più presto possibile. Una volta che i suoli vengono congelati, conservare in un contenitore sigillato con essiccante fino all'estrazione. È meglio sTritare il suolo congelato a un minimo di -20 ° C ma preferibilmente a -80 ° C.
  4. In preparazione all'estrazione, rimuovere i terreni secchi di liofilizzazione dalla conservazione e macinare a una consistenza di farina. I metodi di macinazione includono il mulino a sfera, il battitore a sfere e il mortaio e il pestello. Dopo aver macinato il terreno, conservare in un congelatore (vedere 1.3).
    NOTA: la quantità di campione utilizzata per l'estrazione dipende dal suo contenuto di materia organica. Un orientamento generale è quello di utilizzare 0,5-1 g di un terreno che è dal 12 al 18% in peso di carbonio e da 3 a 5 g per un terreno dal 1 al 3% in peso di carbonio.
  5. Pre-risciacquare tubi centrifuga da 30 ml con esano. Aggiungere circa 2 a 3 ml di esano ai tubi e vortex per 5 sec. Decanta l'esano ad un altro tubo e vortice. L'esano (da 2 a 3 ml) può essere utilizzato per risciacquare seriamente sei tubi. Conservare i tubi esauriti esagonali invertiti nel cappuccio e smaltire l'esano utilizzato in un contenitore di rifiuti appropriato.
  6. Avvolgere le vetrerie in 2 o 3 strati di fogli di alluminio e collocare nella fornace a muffola. Infornare(Muffola) a 450 ° C per 4,5 ore.
  7. Preparare reagenti.
    1. Per la quantità di terreno impiegata, aggiungete sostanze chimiche in un rapporto di volume 0,8: 1: 2 per il tampone fosfato (P-buffer): CHCl 3 : MeOH.
    2. Preparare la soluzione P-tampone: Fosfato-Buffer: 0,1 M, pH 7,0.
      1. Aggiungere 61 ml di 1M K 2 HPO 4 , sterile (chimico deve essere certificato ACS o meglio). Aggiungere 39 ml di 1 M KH 2 PO 4 , sterile (chimico deve essere certificato ACS o meglio). Riempire a 1000 mL con acqua tipo 1. Regolare il pH a 7,0 con NaOH o HCl. Conservare la soluzione inutilizzata per un massimo di 7 giorni a temperatura ambiente o 30 giorni in frigorifero.
      2. In alternativa, pesare 10,62 g di K 2 HPO 4 e 5,31 g di KH 2 PO 4 ; Diluire a 1 L con acqua tipo 1. Controllare il pH, regolare se necessario.
    3. Preparare il reagente 1, il reagente di saponificazione.
      1. Dispensare 300 ml di acqua tipo 1.Aggiungere 300 ml di CH 3 OH (grado HPLC o superiore). Aggiungere 90,00 g di NaOH (ACS certificato o meglio). Aggiungere la pellicola di NaOH alla soluzione mescolando. Mescolare finché le pellet si dissolvono. Si raccomanda di memorizzare questa soluzione non più di 30 d.
    4. Preparare il reagente 2, il reagente per la metilazione.
      1. Dispensare 275 ml di CH 3 OH (grado HPLC o superiore). Aggiungere 325 ml di certificato 6,00 N HCL mescolando. Si raccomanda di memorizzare questa soluzione non più di 30 d.
    5. Preparare il reagente 3, il reagente di estrazione: 50% C 6 H 14 (esano), 50% C 5 H 12 O (MTBE).
      1. Nella cappa fumo, combinare 200 mL di C 6 H 14 (grado HPLC o superiore) e 200 mL di C 5 H 12 O (HPLC grado o superiore). Mescolare bene; Cappuccio strettamente. Conservare in armadio infiammabile o cappuccio per almeno 1 anno.
    6. Preparare il reagente 4, il reagente di lavaggio base.
      1. Dispensare 900ML di acqua di tipo 1 al bicchiere. Aggiungere 10,80 g di NaOH (ACS certificato o meglio) mescolando. Mescolare finché le pellet si dissolvono. Si raccomanda di memorizzare questa soluzione non più di 30 d.
    7. Preparare la soluzione di magazzino di standard interno.
      1. Ponderate 100 mg di standard 19: 0 EE. Aggiungere a 50 ml di pallone volumetrico lavato con esano. Aggiungere 15 ml di soluzione di Hexane-MTBE (reagente 3) a pallone, turbine per sciogliere. Portare a 50 mL con soluzione di Hexane-MTBE (reagente 3). Cappa e turbinio per mescolare. Trasferire in tubi di vetro espanso con tappi foderati in PTFE e conservare a -20 ° C.

2. GIORNO 1 - Estrazione degli acidi grassi dal suolo (da 4 a 5 ore per ~ 40 campioni)

  1. Preparare tre pipette di erogazione da 5 a 10 mL per P-buffer, cloroformio e metanolo.
    NOTA: sono state proposte meno alternative pericolose per il cloroformio come estrattori. Questi possono determinare tassi equivalenti di recupero dei lipidi 16 , 17 , ma non sono valutati in questo protocollo.
  2. Pesare i suoli congelati in tubi di centrifuga da 30 ml e registrare la massa del suolo.
  3. Effettuare due spazi vuoti e includere uno standard di controllo (un terreno estratto in precedenza).
  4. Nella cappa, aggiungere i reagenti al terreno in provetta da centrifuga nel seguente ordine: P-tampone, CHCl 3, e MeOH (Tabella 1). Lasciare il tempo terreni a umido dopo l'aggiunta P-tampone prima di aggiungere il CHCl 3. Coprire i tubi della centrifuga e coprire per proteggere dalla luce.
  5. Metterli sullo scuotitore in senso orizzontale assicurandoti che siano ben fissati. Con la velocità impostata su 280 giri / min, agitare per 1 h 18 .
  6. Preparare due 16 mm x 150 mm tubi di vetro per ogni campione come segue: Etichettare la provetta e aggiungere lo stesso volume di CHCl 3 e un volume uguale di P-buffer.
  7. Rimuovere i tubi della centrifuga dall'agitatore e centrifugare per 10 minuti a 1.430Xg e 25 ° C. La separazione di fase deve essere visibile nel tubo di vetro.
  8. Nella cappa di fumo, decantare il surnatante dal tubo di centrifuga in uno dei tubi preparati al punto 2.6. Ripetere i passaggi da 2.4 a 2.5 e decantare il surnatante nel secondo tubo.
  9. Bloccare saldamente tutti i tubi di vetro 16 mm × 150 mm con tappi in PTFE e invertiti 10 x per mescolare.
  10. Consentire ai campioni di rimanere indisturbati durante la notte per completare la separazione delle due fasi. A tal fine, conservare i campioni in un armadietto scuro o in uno strato di alluminio a temperatura ambiente. È accettabile permettere che gli estratti si separino durante il fine settimana.
    1. In alternativa, se si desidera passare direttamente al passo successivo o se i campioni vengono disturbati il ​​giorno successivo, centrifugare campioni per 10 minuti a 1.000 xg e 25 ° C.
      NOTA: Soggetti tutti i campioni all'interno di un gruppo di confronto allo stesso tempo di separazione di fase.

3. GIORNO2 - Isolamento dei lipidi (da 3 a 4 ore per ~ 40 campioni)

  1. Accendere l'apparecchio di evaporazione e la trappola solvente. Impostare l'apparecchio di evaporazione a 33 ° C e preriscaldare.
  2. Impostare un aspiratore di vuoto nel cofano: un braccio laterale collegato ad una pompa a vuoto, una lunghezza di tubo di alta purezza e una pipetta di vetro.
  3. Aspirare lo strato superiore e l'interfaccia (circa 2/3 del senso di discesa) dei due tubi di vetro, mantenendo lo strato acquoso. Ripetere il processo utilizzando una pipetta pulita per ogni campione.
  4. Combinare i strati acquosi di estratto dal secondo tubo con quello nel primo tubo attentamente decantando. Assicurarsi che il tubo in decantazione sia privo di graffi o crepe.
  5. Una volta che i CHCl 3 estratti vengono combinati, ispezionare il liquido - dovrebbe essere chiaro. Se non aggiungete MeOH finché non sia chiaro.
  6. Asciugare tutti i campioni utilizzando l'apparecchio di evaporazione sotto vuoto. Iniziare con impostazioni della temperatura di 33 ° C, velocità vortice 26% e pressione 400 mbar.
  7. PPigiate i campioni nel sistema di evaporazione e dopo 10 minuti lentamente abbassate la pressione a 350 mbar.
  8. Monitorare il progresso e quando il livello del liquido nel tubo ha raggiunto il livello del blocco di riscaldamento, diminuire la pressione a 300 mbar.
  9. Continuare a monitorare l'altezza del liquido residuo e quando è di circa 1 cm di profondità, diminuire la pressione a 200 mbar.
  10. Dopo aver asciugato i campioni, rimuovere i campioni e far funzionare la pompa per altri 10 minuti per eliminare i vapori.
  11. Bloccare i tubi saldamente e conservare i lipidi in un congelatore a -80 ° C.
  12. Smaltire il liquido aspirato in conformità alle vigenti norme in materia di sicurezza chimica.

4. GIORNO 3 - Saponificazione e metilazione (da 6 a 7 ore per ~ 40 campioni)

  1. Accendere i bagni d'acqua. Impostare il bagno da 1 a 95 ° C e bagnare da 2 a 80 ° C.
  2. Impostare i distributori della pipetta e assicurarsi di distribuire il volume corretto.
    Reagente 1: 1 mL per campione
    Reagente 2: 2 mL per campione
    Reagente 3: 1,25 mL per campione
    Reagente 4: 3 mL per campione
    NOTA: Il processo di riscaldamento creerà pressione nel tubo. Non utilizzare tubi graffiati, incrinati o tagliati.
  3. Utilizzando un distributore di pipetta aggiungere 1.0 mL di Reagente 1 ai lipidi secchi. Capeggiare bene, vortexare per 5 s e collocare in un rack.
  4. Mettere il rack dei tubi di campionamento nel bagno d'acqua di 95 ° C per 5 minuti. Rimuovere il rack dei tubi dalla vasca e controllare le tubazioni per le perdite, indicati da bolle che aumentano nel tubo. Riavvitare o sostituire i tappi di tubi perdenti e controllare nuovamente le crepe oi chip. Continuare a riscaldare i tubi nel bagno d'acqua per altri 10 minuti.
  5. Rimuovere i campioni dal bagno 1 e collocare nel bagno 2 (80 ° C) e continuare l'incubazione per altri 15 minuti.
  6. Rimuovere i tubi e raffreddare i campioni posizionando il rack in una padella di acqua del rubinetto per raffreddare.
  7. Aggiungere 2 mL di Reagente 2 ad ogni campione. Capeggiare bene e vortex per 5 a 10s. Mettere il rack nell'acqua da 80 ° C e incubare per 10 min.
  8. Rimuovere il rack dei tubi dal bagno d'acqua e metterlo in una padella di acqua del rubinetto per raffreddare. Agitare la cremagliera dei tubi per accelerare il processo di raffreddamento.
    NOTA: Non superare il tempo e la temperatura. Troppo il riscaldamento potrebbe degradare FAMEs.
  9. Utilizzando il dispensatore di pipetta aggiungere 1,25 ml di reagente 3 ad ogni tubo di campione per estrarre gli esteri metilici dell'acido grasso. Cappare bene e mettere i tubi sull'agitatore per 10 min.
  10. Dopo la scossa, lasciare riposare il rack dei tubi per 10 minuti per separare le fasi. Trasferire la fase organica (top layer) ad un tubo di prova di vetro da 16 mm x 100 mm usando una pipetta di vetro.
  11. Ripetere l'estrazione aggiungendo aggiungendo il reagente 3, scuotendo, consentendo la separazione delle fasi e il trasferimento della fase superiore.
    NOTA Non trasferire alcuna parte inferiore. È bene lasciare una piccola quantità di fase superiore nel tubo.
  12. Utilizzando l'erogatore della pipetta, aggiungete 3 mL di Reagente 4 a thTubi da 16 mm x 100 mm.
  13. Bloccare i tubi di prova strettamente e vorticarsi per 20-30 s.
  14. Dopo vortexing, centrifugare per 3 min a 1000 × g.
  15. Usando una pipetta di vetro pulita, aspirare la fase organica superiore e trasferire in una fiala ambrata da 4 ml.
  16. Accendere l'apparecchio di evaporazione e la trappola solvente. Impostare l'apparecchio di evaporazione a 30 ° C, la velocità del vortice fino al 26%, il vuoto a 200 mbar e premere il preriscaldamento.
  17. Monitorare il progresso. Dopo aver asciugato i campioni, rimuovere i campioni e far funzionare la pompa per altri 10 minuti per eliminare i vapori.
  18. Rimuovere la pipetta dalle bottiglie reagenti 1 e 4 e pompare attraverso un po 'di acido diluito ( es. 1% HCl), seguita da acqua DI. Sciacquare la pipetta utilizzata per il reagente 2 pompando attraverso l'acqua di DI. Nel cappuccio, scolare il solvente dalla pipetta utilizzata per il reagente 3 in un contenitore appropriato e tenerlo nella cappa finché i residui di solvente non sono evaporati.
  19. Conservare le pipette invertite, con i pistoncini rimossi per impedire il bastoneG delle valvole di ritegno.
  20. Usare pipette di vetro una volta e poi smaltire in un contenitore appropriato.
  21. Nel cappuccio, lasciare residui di solvente sul vetro per evaporare.
  22. Sciacquare le vetrerie con acqua pulita e soluzione detergente.

5. GIORNO 4 - Preparazione della soluzione di lavoro e trasferimento di FAME ai flaconi GC (2-3 ore per ~ 40 campioni)

  1. Raccogliere i materiali: 4 ml di fiale ambrato con campioni secchi; Ambrati 2 ml di fiale GC; Inserti e capsule in vetro a fondo piatto da 400 μL; 500 μL siringa di vetro; 50 mL pallone volumetrico; Soluzione in titanio - Nonadecanoato etilico (19: 0 EE standard interno) in 50/50 esano / MTBE (Reagente 3).
  2. Utilizzando la siringa di vetro, aggiungere 500 μL di soluzione di base di nonadecanoato etilico (19: 0 EE) a una fiala volumetrica da 50 ml.
  3. Riempire il pallone al punteggio volumetrico con il reagente 3.
  4. Tappo di protezione e invertito 5x per mescolare.
  5. Trasferire 3 mL in un flacone pulito da 4 mL per un serbatoio di soluzione di lavoro.
  6. Usando thS, aggiungere 300 μL della soluzione di lavoro a ciascuna delle fiale da 4 ml contenenti gli esteri metilici dell'acido grasso secchi e il cappuccio.
  7. Vortex il campione per 15 s e mettere da parte stand per 15 minuti.
  8. Usando una pipetta di Pasteur di vetro, trasferire accuratamente gli esteri metilici dell'acido grasso sospeso in un flaconcino da 2 ml di GC contenente l'inserto da 400 μL.
  9. Conservare i flaconi sigillati GC in un congelatore -20 ° C prima dell'analisi.
  10. Invia campioni per l'analisi GC.
    NOTA: L'analisi deve essere eseguita utilizzando una specifica colonna GC e le condizioni descritte nel file aggiuntivo S1 . È meglio che l'analisi del GC sia completata entro 2 settimane dalla metilazione.

Representative Results

Le tabelle di dati dai report possono essere raggruppate in un foglio di calcolo o database. Dopo aver regolato il fattore di risposta (un fattore di correzione che normalizza la risposta per diverse lunghezze di catena), le aree di picco possono essere confrontate con l'area di picco degli standard esterni o interni per arrivare ad una concentrazione nell'estratto. Dividendo attraverso la massa del suolo estratto, i dati possono essere espressi come massa di FAME per grammo di terreno o, utilizzando il peso molecolare di ogni FAME, il più comunemente riportato nmol per grammo di terreno. La somma dei FAME microbici è indicativa della biomassa microbica totale e può essere confrontata tra i trattamenti ( Figura 1 ). Alcuni FAME possono anche essere associati a particolari gruppi microbici come batteri Gram-positivi o Gram-negativi, Actinomycetes, funghi micorrizali arbuscolari e funghi saprotrofici 19 , 20 , , 22 , 23 , 24 . I rapporti della massa di biomarcatori specifici possono riflettere l'abbondanza relativa di questi gruppi ( Figura 2 ). Complessivamente i modelli di abbondanza FAME creano impronte digitali a livello comunitario, che consentono di confrontare la dissimilarità delle comunità microbiche attraverso tecniche multivariate come l'ordinazione ( Figura 3 ). In contrasto con la maggior parte degli approcci basati sul DNA, i dati lipidici a livello comunitario possono essere analizzati sia come abitudini relative o assolute. Se la biomassa totale differisce sostanzialmente tra i campioni, questi due approcci daranno risultati molto diversi; Le domande ecologiche sottostanti all'esperimento dovrebbero determinare quale approccio viene utilizzato.

Figura 1
F Igure 1 : biomassa totale FAME. Confronto tra la biomassa totale biomarker FAME (nmol g -1 terreno) dal grano continuo, prateria fecondata e prateria non fertilitata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2 : FOME biomassa di batteri e funghi. Trattamento confronto di biomassa biomarker FAME batterica e fungina (nmol g -1 terreno) dal mais continuo, prateria fecondata e prateria non fertilitata. Massa fungine e batteriche da abbondanza assoluta. Media (somma f / somma b). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ve_content "per: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 3
Figura 3 : Scala dimensionale non metrica dei biomarker lipidici FAME. Confronto della comunità microbica globale usando profili assoluti di abbondanza di tutti i biomarkers lipidi microbici FAME. In questo esempio, il mais continuo e le comunità di prateria non fertili si sono separati e sono molto distanti, mentre alcuni campioni di prateria fecondata hanno comunità microbiche che somigliano a quelle del mais e altri somigliano alla prateria non fertile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1
Tabella 1: T h e cosìl ven tipo t, propor zi s aggiunti g -1 terreno, uno d t h EIR orde r o f inserirlo iti o n. Ciò è importante per una corretta estrazione e separazione delle fasi organiche e acquose.

Discussion

Per l'esame di campioni multipli provenienti da esperimenti con molti replicati e / o unità sperimentali, i ricercatori possono trovare l'analisi di acido grasso-acido fosfolipidico (PLFA) in modo proibitivo in termini di tempo e di materiali 25 . Con il metodo PLFA, i fosfolipidi della membrana cellulare vengono estratti, purificati e identificati utilizzando l'estrazione acquosa-organica bidimensionale Bligh e Dyer 26 . Ciò è seguita da una cromatografia silica a fase solida per separare i lipidi dalla polarità e una metilazione alcalina di acidi grassi di fosfolipidi in esteri metilici dell'acido grasso. Nella profilazione PLFA la resa lipidica può essere bassa ma di purezza molto alta. ID Microbial ha introdotto un metodo alternativo, la procedura di metil-estere dell'acido grasso (MIDI-FA). Nel metodo MIDI-FA, tutti i lipidi vengono estratti direttamente da colture pura o campioni di terreno / sedimento 11 , 12 , 27 attraversosaponificazione. Questo metodo ha una minore perdita di lipidi ed è rapido perché non ha nessuna delle fasi di concentrazione o di purificazione del metodo PLFA. Tuttavia, mentre il metodo MIDI-FA è veloce e meno costoso, perché è stato originariamente progettato per identificare gli organismi nella cultura pura, non ci sono iniziali operazioni di estrazione o di purificazione. Così può includere composti lipidici co-estratti dalla materia organica del suolo che distorcono la firma comunitaria 27 , 28 , 29 . Poiché questa inclusione può anche distorcere le misure della biomassa, MIDI-FA è stata usata tipicamente per descrivere qualitativamente i lipidi del suolo 13 .

La procedura che descriviamo qui combina il meglio delle due procedure di estrazione separate: 1) un'estrazione e una concentrazione di lipidi usando il metodo Bligh e Dyer 26 modificato e 2) l'estere metilico dell'acido grassoLa silificazione, la metilazione, l'estrazione e la procedura di lavaggio base sviluppata in commercio. Questo metodo è stato sviluppato per ottenere i vantaggi di entrambi questi protocolli, minimizzando gli svantaggi 15 . Eseguendo l'estrazione iniziale e isolando i componenti solubili in organico ( ad es. Lipidi) prima di eseguire MIDI-FA e completandolo con una fase di purificazione, questo protocollo offre un equilibrio tra velocità e precisione. Anche se questo metodo potrebbe non essere adatto quando richiede purezza elevata ( cioè per 13 C PLFA) o quando analizza separatamente i fosfolipidi ei lipidi neutri, in molti casi consente di individuare le risposte microbiche della comunità a condizioni ambientali con maggiore sensibilità rispetto a quella del DNA Metodi 30 , 31 , 32 , 33 . I lipidi a membrana si decompongono rapidamente dopo la morte cellulare che li ha permessiRiflettono la comunità microbica vivente al momento del campionamento 5 , 7 , contrariamente al DNA ambientale in cui gran parte delle informazioni provengono da organismi morti o inattivi 34 . Data l'elevata percentuale di dormienza osservata tra i microrganismi del suolo 35 , la caratterizzazione della biomassa viva può essere utilizzata per comprendere le interazioni temporanee tra pianta e microbi a una scala temporale relativamente fine e i biomarkers lipidici possono essere utilizzati per analizzare lo stato fisiologico della comunità microbica 7 . È stato dimostrato che sono necessari metodi di trasmissione elevata per valutare la risposta microbica in grandi impostazioni di campo 25 e, sebbene il metodo che proponiamo qui non replica l'accuratezza della profilazione dei biomarker PLFA, aumenta il throughput minimizzando la variabilità realizzata con la MIDI-FA procedura. Il metodo si è rivelato uno strumento efficace nell'affrontareDomande relative alla dinamica delle comunità microbiche su un'ampia gamma di suoli in studi su vasta scala agricoli e ecosistemi 36 , 37 , 38 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 .

Le classi lipidiche sono combinate con questo metodo e ci può essere una perdita delle informazioni contenute in quelle classi separate 22 , 39 , ma combinando le classi lipidiche può rafforzare il potere di rilevare l'origine arbuscolare dei funghi micorisici del 16: 1 ω5c da entrambi i fosfori - e lipidi neutri 40 . Inoltre, mentre tIl numero di acidi grassi sconosciuti (che potrebbero derivare da materia organica non vivente) può essere più elevato con questo metodo, è stato dimostrato inferiore a quello di MIDI-FA e consente il confronto tra i profili lipidici da studi con molti campioni in cui il campione La capacità di trasmissione è una preoccupazione 15 . La frazione neutrale è generalmente pensata derivare principalmente da lipidi di deposito prodotti dai funghi, anche se può esserci anche un minor contributo della fauna del suolo 41 . Alla luce di questo, il metodo descritto qui può dare risultati che mostrano un maggior contributo dei lipidi fungini 18: 2 ω 6,9c e 18: 1 ω 9c rispetto a PLFA. Gli altri lipidi che tendono ad apparire nella frazione neutrale includono alcuni degli acidi grassi saturi, ad es. 16: 0, 18: 0, 20: 0.

Esistono diversi modi in cui i dati lipidici possono essere espressi e analizzati. Le rappresentazioni più comuni sono l'abbondanza (nmol g -1 terreno), mole fractioN (nmol singolo lipid nmol -1 totale lipid), e mole percentuale (frazione mole * 100). Normalizzati dai lipidi totali in un campione, la frazione molare e il mole percentuale sono misure della relativa abbondanza di un dato lipide. Dopo una trasformazione appropriata, ad esempio , la frazione quadrata di radice quadrata di arcsine è appropriata per l'uso in analisi da parte dei componenti principali o dell'ordinazione di analisi di ridondanza. L'abbondanza è la quantità assoluta di un dato lipide estratto per grammo di terreno. Poiché la quantità di lipidi per cellula è ragionevolmente costante e l'estrazione lipidica è altamente efficiente e completa, l'abbondanza totale è una buona stima dei lipidi totali e l'abbondanza di indicatori chiave riflette la biomassa del gruppo ecologico che rappresenta 17 . Infine, un buon modo per esaminare la composizione microbica della comunità è quello di utilizzare metodi di analisi multivariata 16 , ad esempio metodi di ordinazione come la scala multimetrica nonmetrica (NMDS -Che non necessita di trasformazione dei dati) o analisi dei componenti principali (PCA), può essere utile per confrontare l'abbondanza relativa di tutti i biomarker lipidici.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato in parte dal DOE BER Ufficio di Scienza DE-FC02-07ER64494 e DOE OBP Ufficio di Efficienza Energetica e Energia Rinnovabile (DE-AC05-76RL01830). Gli autori vorrebbero riconoscere Anders Gurda per il suo paziente e competente contributo alla videografia e al montaggio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RapidVap Labconco 7900000 Evaporative system
RapidVap Labconco 7491400 Sample block
Chem-resistant vacuum pump Labconco 7584000 Vacuum pump
Chemical trap cannister Labconco 7815300 Trap cannister
Solvent insert Labconco 7515200 Solvent trap insert
Diaphragm pump Welch 7398000 DryFast vacuum pump
Water bath Fisher 15-462-15Q 2 well water bath
Gas chromatograph Various N/A For sample analysis
Centrifuge Various N/A For sample separation
Freeze Dryer Various N/A For sample lyophilization
Repipet (6) BrandTech 4720440 For dispensing reagents
Vortex Fisher 02-215-365 Analog vortex mixer
Teflon centrifuge tubes Thermo/Nalgene 3114-0030 Teflon sample tubes
Caps Thermo/Nalgene DS3131-0020 Caps for teflon tubes
Test tube Corning 9825-16 16x100mm tubes
Test tube Corning 9825-16xx 16x150mm tubes
Caps Corning 9998-15 15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner
Pasteur pipets Fisher 13-678-20B 14.6cm
500 uL glass syringe Fisher 13684106LC Hamilton 81217
Amber vials Agilent 5182-0716 4mL Amber vials
Caps Agilent 5182-0717 Blue screw caps
Inserts Agilent 5181-3377 400uL flat bottom glass inserts
Standards
19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate) VWR TCN0459-5G Analytical standard
Chemicals
Dipotassium phosphate (K2HPO4 - ACS grade or better) Various N/A For making Phosphate-Buffer
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 - ACS grade or better) Various N/A For making Phosphate-Buffer
Methanol (CH3OH - HPLC grade or better) Various N/A For making Reagents 1 & 2
Sodium hydroxide (NaOH - ACS grade or better) Various N/A For making Reagents 1 & 4
Hydrochloric acid (6N HCL) Various N/A For making Reagent 2
Hexane (HPLC grade or better) Various N/A For making Reagent 3
MTBE (Methyl tert-butyl ether - HPLC grade or better) Various N/A For making Reagent 3

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References

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Un metodo di estrazione e analisi lipidica per la caratterizzazione dei microbi del suolo negli esperimenti con molti campioni
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Oates, L. G., Read, H. W., Gutknecht, J. L. M., Duncan, D. S., Balser, T. B., Jackson, R. D. A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples. J. Vis. Exp. (125), e55310, doi:10.3791/55310 (2017).More

Oates, L. G., Read, H. W., Gutknecht, J. L. M., Duncan, D. S., Balser, T. B., Jackson, R. D. A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples. J. Vis. Exp. (125), e55310, doi:10.3791/55310 (2017).

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