Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

En lipid extraktions- och analysmetod för karakterisering av markmikrober i experiment med många prov

doi: 10.3791/55310 Published: July 16, 2017

Summary

Artikeln beskriver en metod som ökar genomströmningen samtidigt som man balanserar ansträngning och noggrannhet för utvinning av lipider från mikroorganismernas membranmembran för användning vid karakterisering av både totala lipider och den relativa överflödigheten av indikatorlipider för bestämning av markmikrobiell samhällsstruktur i studier med många prover.

Abstract

Mikrobiella samhällen är viktiga drivrutiner och reglerare för ekosystemprocesser. För att förstå hur förvaltningen av ekosystem kan påverka mikrobiella samhällen är en relativt exakt men ansträngningskrävande teknik för att analysera mikrobiell gemenskapsammansättning fosfolipidfettsyra (PLFA) -analys. PLFA utvecklades för att analysera fosfolipidbiomarkörer, som kan användas som indikatorer på mikrobiell biomassa och sammansättningen av breda funktionella grupper av svampar och bakterier. Det har vanligtvis använts för att jämföra jordar i alternativa växtsamhällen, ekologi och förvaltningssystem. PLFA-metoden har visat sig vara känslig för att detektera skift i mikrobiell samhällssammansättning.

En alternativ metod, extrakt och analys av fettsyra-metylester (MIDI-FA) utvecklades för snabb extraktion av totala lipider, utan separation av fosfolipidfraktionen, från rena kulturer som en mikrobiell identifieringsteknik. Denna metod ärSnabb men är mindre lämplig för markprover eftersom det saknar ett första steg som skiljer markpartiklar och börjar istället med förtvålningsreaktion som sannolikt producerar artefakter från bakgrunden organisk substans i jorden.

Denna artikel beskriver en metod som ökar genomströmningen samtidigt som man balanserar ansträngning och noggrannhet för utvinning av lipider från mikroorganismernas membranmembran för användning för att karakterisera både totala lipider och den relativa överflöd av indikatorlipider för bestämning av markmikrobiell samhällsstruktur i studier med många prover. Metoden kombinerar noggrannheten som uppnåtts genom PLFA-profilering genom att extrahera och koncentrera marklipider som ett första steg och en minskning av ansträngningen genom att förtviva det organiska materialet som extraheras och behandlas med MIDI-FA-metoden som ett andra steg.

Introduction

Med tanke på mikroorganismernas viktiga roll i näringscykeln 1 , modifiering av växtföreningens sammansättning 2 , reglering av växtproduktivitet 3 och sönderdelning av organiskt material 4 är förståelsen av markmikrobiella samhällen en viktig förståelse för markbundna ekosystem.

På grund av deras relativt stora överflöd i marken och deras kemiska signatur kan lipidbiomarkörer användas för att profilera de dominerande ekologiska grupperna som innefattar mikrobiella gemenskaper i jorden 5 . Genom att kvantifiera lipidbiomarkörer som är karakteristiska för olika mikrobiella grupper kan vi uppskatta totala lipider, och separera sedan dessa lipider i ekologiskt relevanta grupper, såsom Gram-positiva (Gm +) och gramnegativa (Gm) bakterier, arbuskulär mykorrhizal (AM) och saprotrofisk Svampar och aktinomycetes 5 , Ss = "xref"> 6 , 7 , 8 .

Det finns många metoder för att karakterisera aspekter av mikrobiella samhällen. PLFA-metoden är en som vanligtvis används för att förstå grundläggande mikrobiell samhällsstruktur. Det är ett effektivt sätt att bedöma den relativa överflöd av mikrobiella grupper samt total mikrobiell biomassa. På grund av snabb lipidomsättning möjliggör PLFA-profilering också relativt snabb detektering av förändringar i jordmikrobiell gemenskap och ger information som möjliggör jämförelse av ekosystemfunktionen, t.ex. svamp: bakterieförhållanden för att bedöma näringscykeln 1 , 9 , 10 . Medan PLFA-extraktionsmetoden är tidskrävad och väl respekterad, är det också tidskrävande och låter sig inte bra i studier av ekosystemskalor som kräver ett stort antal prover från fältskalansreplikatF "> 11 , 12 .

I motsats härtill har fettsyra-metylester-extraktionsmetoden (MIDI-FA) potential att möjliggöra snabb genomströmning. I denna metod förtäppas proverna, omvandlas till FAMEs, extraheras och analyseras därefter. MIDI-FA-metoden är snabb men mindre diskriminerande än PLFA, som kombinerar extraktion av lipider med separation av olika lipidklasser 13 (fosfolipider, neutrala lipider och glykolipider).

I det här protokollet beskriver vi en metod som kombinerar element i både lipofilter och PLI-lipidprofilering. Det utnyttjar extraktion av lipider med användning av de initiala kloroformutvinningsstegen i den modifierade Bligh och Dyer-metoden och sedan förtvålning och omvandling till FAMEs. Detta ger ett robust sätt att upptäcka mikrobiell samhällsstruktur samtidigt som mycket av bakgrundsbruset utesluts från icke-mikrobiellt material 5 , 14 15 . Genom att utföra den initiala extraktionen och isolera de organiskt lösliga komponenterna (t ex lipider) innan MIDI-FA utförs och slutföra detta med ett reningssteg, erbjuder protokollet en balans mellan hastighet och precision.

Protocol

OBS! Använd alltid lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) under hela proceduren. För att undvika potentiell provförorening, rör inte glasvaror med nakna händer. Använd lämpliga handskar när du kör protokollsteg som kräver hantering av kloroform.

1. Förberedelser (2 dagar för ~ 40 prov)

  1. Samla marken i sterila påsar och transportera från fältet i en kylare som innehåller is. Om det inte är möjligt att sikta friskt jord och frysta torrt omedelbart, förvara proven i en -80 ° C frys tills den är klar för att börja analysen.
  2. Förbered jorden genom homogenisering. Ta bort rötter och stenar och bryta upp kloddar genom grov siktning ( t.ex. 2 mm).
  3. Förbered dig för frysningstorkning genom att placera delprover i en lämplig behållare enligt instruktionerna i frysdrogen manuellt och frys så snart som möjligt. När marken är frystorkad, förvara i en sluten behållare med torkmedel tills extraktion. Det är bäst att sTorka frystorkad jord i minst -20 ° C men helst vid -80 ° C.
  4. Förberedelse för extraktion, ta bort frystorkade jordar från förvaring och slipa till en mjölliknande konsistens. Metoder för slipning inkluderar bollkvarn, bollbeater och mortel och pestle. Efter slipning, lagra i en frys (se 1.3).
    OBS: Mängden prov som används för extraktion beror på innehållet i organiskt material. En allmän riktlinje är att använda 0,5 till 1 g av en jord som är 12 till 18 vikt% kol och 3 till 5 g för en jord 1 till 3 vikt% kol.
  5. Skölj 30 ml centrifugrör med hexan. Tillsätt ca 2 till 3 ml hexan till rör och virvel i 5 sek. Dekantera hexan till ett annat rör och virvel. Hexan (2 till 3 ml) kan användas för att seriellt skölja sex rör. Förvara hexansköljda rör inverterade i avloppsugan och kassera använt hexan i en lämplig avfallsbehållare.
  6. Vik glaset i 2 till 3 lager aluminiumfolie och placera i muffelugnen. Baka(Muffel) glasvaror vid 450 ° C i 4,5 timmar.
  7. Förbered reagens.
    1. För jorden mängd som används, tillsätta kemikalier i en 0,8: 1: 2 volymförhållande för fosfat-buffert (P-buffert): CHCl3: MeOH.
    2. Förbered P-buffertlösning: Fosfatbuffert: 0,1 M, pH 7,0.
      1. Lägg till 61 ml 1M K 2 HPO 4 lager, steril (kemikalie ska vara ACS-certifierad eller bättre). Lägg till 39 ml 1 M KH 2 PO 4 lager, steril (kemikalie ska vara ACS-certifierad eller bättre). Fyll till 1000 ml med typ 1 vatten. Justera pH till 7,0 med NaOH eller HCl. Förvaras oanvänd lösning i upp till 7 d vid rumstemperatur eller 30 dagar i kylskåp.
      2. Alternativt, väg upp 10,62 g K 2 HPO 4 och 5,31 g KH 2 PO 4; Späd till 1 liter med typ 1 vatten. Kontrollera pH, justera om det behövs.
    3. Beredning av reagens 1, förtvålningsreagens.
      1. Dispensera 300 ml av typ 1 vatten.Lägga 300 ml CH3OH (HPLC-kvalitet eller högre). Tillsätt 90,00 g NaOH (certifierad ACS eller bättre). Tillsätt NaOH-pellets till lösningen under omröring. Rör om tills pelleten löser upp. Det rekommenderas att lagra denna lösning inte längre än 30 d.
    4. Framställ Reagens 2, Metyleringsreagens.
      1. Dispensera 275 ml CH3OH (HPLC-kvalitet eller högre). Tillsätt 325 ml certifierat 6,00 N HCL under omröring. Det rekommenderas att lagra denna lösning inte längre än 30 d.
    5. Förbereda Reagens 3, Extraction Reagent: 50% C 6 H 14 (hexan), 50% C 5 H 12 O (MTBE).
      1. Blanda i 200 ml C 6 H 14 (HPLC-kvalitet eller högre) och 200 ml C 5 H 12 O (HPLC-kvalitet eller högre) i rökkåpan. Blanda väl; Locket tätt. Förvara i brännbarhetsskåp eller spishäll under högst 1 år.
    6. Bered reagens 4, basvattenreagens.
      1. Dispense 900Ml av typ 1 vatten till bägaren. Tillsätt 10,80 g NaOH (Certified ACS eller bättre) under omröring. Rör om tills pelleten löser upp. Det rekommenderas att lagra denna lösning inte längre än 30 d.
    7. Förbered stamlösning av intern standard.
      1. Väg ut 100 mg 19: 0 EE-standard. Tillsätt till 50 ml hexan sköljd volymkolv. Tillsätt ~ 15 ml hexan-MTBE-lösning (reagens 3) till kolven, virvel för att upplösas. Stryk upp till 50 ml med Hexane-MTBE-lösning (reagens 3). Keps och virvla för att blanda. Överför till hexansköljda glasrör med PTFE-fodrade kepsar och lagra vid -20 ° C.

2. DAG 1 - Extraktion av fettsyror från marken (4 till 5 h för ~ 40 prov)

  1. Förbered tre 5 till 10 ml dispenseringspipetter för P-buffert, kloroform och metanol.
    OBS: Mindre farliga alternativ till kloroform har föreslagits som extraktionsmedel. Dessa kan resultera i ekvivalenta lipidåtervinningsgrader 16 , 17 , men utvärderas inte i detta protokoll.
  2. Väga frystorkade jordar i 30 ml centrifugrör och registrera markmassan.
  3. Gör två ämnen och inkludera en kontrollstandard (en mark som tidigare har extraherats).
  4. I dragskåp, till reagensen till jorden i centrifugröret i följande ordning: P-buffert, CHCI3, och MeOH (tabell 1). Låt jordarna tid att blöta efter P-bufferttillägget innan du tillsätter CHCl 3 . Häll centrifugrören tätt och täcka för att skydda mot ljus.
  5. Placera dem på skakan horisontellt och se till att de är väl säkrade. Med hastighetsinställningen på 280 rpm, skaka i 1 h 18 .
  6. Förbereda två 16 mm x 150 mm glasrör för varje prov enligt följande: Märk röret och lägga till samma volym av CHCI3 och en lika stor volym P-buffert.
  7. Ta bort centrifugrören från skakan och centrifugera i 10 min vid 1 430Xg och 25 ° C. Faseparation ska vara synlig i glasröret.
  8. I avloppsugan dekantera supernatanten från centrifugröret i ett av rör framställda i steg 2.6. Upprepa steg 2,4 till 2,5 och dekantera supernatanten i det andra röret.
  9. Skydda säkert alla 16 mm × 150 mm glasrör med PTFE-fodrade lock och invertera 10 x för att blanda.
  10. Låt proven stå ostörd över natten för att slutföra separationen av de två faserna. För att göra detta, behåll proverna i ett mörkt skåp / utrymme eller täckt av aluminiumfolie vid rumstemperatur. Det är acceptabelt att extrakten separeras under helgen.
    1. Alternativt, om man vill flytta direkt till nästa steg, eller om prov störs nästa dag, centrifugera prov i 10 minuter vid 1000 xg och 25 ° C.
      OBS: Ämne alla prover inom en jämförelsegrupp till samma fasavskiljningstid.

3. DAG2 - Isolering av lipider (3 till 4 h för ~ 40 prov)

  1. Slå på evaporationsapparaten och lösningsmedelsfällan. Sätt in evaporationsapparaten till 33 ° C och förvärm.
  2. Ställ in en vakuumsugare i huven: en sidolarmkolv ansluten till en vakuumpump, en längd av högreningsrör och en glaspipett.
  3. Aspirera toppskiktet och gränssnittet (ungefär 2/3 av vägen ner) på de två glasrören, behåll det vattenhaltiga skiktet. Upprepa processen med en ren pipett för varje prov.
  4. Kombinera de vattenhaltiga skikten av extrakt från det andra röret med det i det första röret genom noggrant dekantering. Se till att röret som dekanteras är fritt från repor eller sprickor.
  5. När CHCl 3- extrakten är kombinerade, inspektera vätskan - det borde vara klart. Om inte tillsätt MeOH tills det är klart.
  6. Torka ner alla prov med hjälp av vakuumavdunstningsapparaten. Börja med inställningar av temperatur 33 ° C, vortexhastighet 26% och tryck 400 mbar.
  7. PSpetsa proven i avdunstningssystemet och sänka trycket långsamt till 350 mbar efter 10 minuter.
  8. Övervaka framstegen och när vätskenivån i röret har nått värmeblockets nivå, minska trycket till 300 mbar.
  9. Fortsätt att övervaka höjden på den återstående vätskan och när den är ca 1 cm djup, minska trycket till 200 mbar.
  10. När provet har torkat, ta bort prov och kör pumpen i ytterligare 10 minuter för att tömma ångor.
  11. Häll rören tätt och lagra lipiderna i en frys vid -80 ° C.
  12. Kassera den aspirerade vätskan i enlighet med gällande kemikaliesäkerhetsbestämmelser.

4. DAG 3 - Förtvålning och metylering (6 till 7 h för ~ 40 prov)

  1. Slå på vattenbadet. Ställ bad 1 till 95 ° C och bad 2 till 80 ° C.
  2. Ställ in pipettdisplayerna och se till att de levererar rätt volym.
    Reagens 1: 1 ml per prov
    Reagens 2: 2 ml per prov
    Reagens 3: 1,25 ml per prov
    Reagens 4: 3 ml per prov
    OBS: Uppvärmningen kommer att bygga tryck i röret. Använd inte repade, sprickade eller flisade rör.
  3. Använd en pipettdispenser tillsätt 1,0 ml reagens 1 till de torkade lipiderna. Cap tätt, virvel i 5 s och placera i ett ställ.
  4. Placera provrörstången i 95 ° C vattenbadet i 5 minuter. Ta bort räcken av rör från badet och kontrollera rören för läckage, som indikeras av bubblor som stiger upp i röret. Dra tillbaka eller byt ut locken på läckande rör och kontrollera igen för sprickor eller spån. Fortsätt värma rören i vattenbadet i ytterligare 10 minuter.
  5. Ta bort prov från bad 1 och placera i bad 2 (80 ° C) och fortsätt inkubationen under ytterligare 15 minuter.
  6. Ta bort rören och kyla provet genom att placera hällen i en kran med kranvatten för kylning.
  7. Tillsätt 2 ml reagens 2 till varje prov. Kepsen tätt och virvel i 5 till 10 s. Placera stället i 80 ° C vattenbad och inkubera i 10 minuter.
  8. Ta bort stativet från rören från vattenbadet och sätt i en kran med kranvatten för kylning. Agitera racket med rör för att påskynda kylprocessen.
    OBS! Överskrid inte tid och temperatur. För mycket uppvärmning kan försämra FAMEs.
  9. Med hjälp av pipettdispensern tillsätt 1,25 ml reagens 3 till varje provrör för att extrahera fettsyrametylestrarna. Kepsen tätt och lägg rören på skakan i 10 minuter.
  10. Efter skakning, låt stativet sitta i 10 minuter för faserna att separera. Överför den organiska fasen (övre skiktet) till ett 16 mm x 100 mm glasprovslang med hjälp av en glaspipett.
  11. Upprepa extraktionen genom att åter tillsätta reagens 3, skaka, låta faser separera och överföra toppfasen.
    OBS! Överför inte någon av nedre faserna. Det är bra att lämna en liten mängd toppfas i röret.
  12. Använd pipettdispensern, tillsätt 3 ml reagens 4 till thE 16 mm x 100 mm rör.
  13. Häll provrören tätt och virvel i 20-30 s.
  14. Efter virveling centrifugeras i 3 min vid 1000 x g.
  15. Använd en ren glaspipett, aspirera den övre organiska fasen och överföra till en 4 ml amberflaska.
  16. Slå på evaporationsapparaten och lösningsmedelsfällan. Sätt in evaporationsapparaten till 30 ° C, virvelhastigheten till 26%, vakuumet till 200 mbar och tryck förvärmningen.
  17. Övervaka framstegen. När provet har torkat, ta bort prov och kör pumpen i ytterligare 10 minuter för att tömma ångor.
  18. Ta bort pipetten från reagensflaskorna 1 och 4 och pumpa genom någon utspädd syra ( t.ex. 1% HCl) följt av DI-vatten. Skölj pipetten som används för reagens 2 genom att pumpa genom DI-vatten. I huven dränerar du lösningsmedlet från pipetten som används för reagens 3 i en lämplig behållare och håller den i huven tills lösningsmedelsresterna har avdunstats.
  19. Förvara pipetterna inverterade, med plungarna avlägsna för att förhindra klämmaG av backventilerna.
  20. Använd glaspipor en gång och släng sedan i en lämplig behållare.
  21. I huven, låt lösningsmedelsrester på glasvaror förångas.
  22. Skölj glasvaror med rent vatten och rengöringsmedel.

5. DAG 4 - Förberedelse av arbetslösning och överföring av FAME till GC-flaskorna (2-3 h för ~ 40 prov)

  1. Samla material: 4 ml amberflaskor med torkade prov; Bärnstensfärgade 2 ml GC-ampuller; 400 μL platta glasinsatser och kepsar; 500 μL glas spruta; 50 ml volymkolv; Lagerlösning - Ethyl-nonadecanoat (19: 0 EE intern standard) i 50/50 hexan / MTBE (reagens 3).
  2. Använd glaskruven genom att tillsätta 500 μL etylnonadecanoatlösning (19: 0 EE) i en 50 ml volymkolv.
  3. Fyll kolven till volymen med Reagent 3.
  4. Kepsflaskan och invertera 5x för att blanda.
  5. Överför 3 ml till en ren 4 ml injektionsflaska för en arbetslösningsreservoar.
  6. Använda thE glas spruta, tillsätt 300 μL arbetslösning till var och en av de 4 ml flaskorna innehållande de torkade fettsyra metylestrarna och locket.
  7. Vortexa provet i 15 s och lägg åt sidan för att stå i 15 min.
  8. Använd en glaspasteurpipett, försiktigt överföra de suspenderade fettsyrametylestrarna till en 2 ml GC-flaska innehållande 400 μl-insatsen.
  9. Förvara förseglade GC-ampuller i en -20 ° C frys före analysen.
  10. Skicka in prov för GC-analys.
    OBS: Analysen måste utföras med en specifik GC-kolonn och villkor som beskrivs i kompletterande fil S1 . Det är bäst att GC-analysen är klar inom 2 veckor efter metylering.

Representative Results

Datatabellerna från rapporterna kan samlas i ett kalkylblad eller en databas. Efter justering för responsfaktor (en korrigeringsfaktor som normaliserar svaret för olika kedjelängder) kan toppområden jämföras med toppområdet för externa eller interna standarder för att komma fram till en koncentration i extraktet. Genom att dela genom massan av utvunnet jord kan data uttryckas som massa av FAME per gram jord eller, med användning av molekylvikten för varje FAME, den mer vanligen rapporterade nmolen per gram jord. Summan av mikrobiella FAMEs indikerar total mikrobiell biomassa och kan jämföras mellan behandlingar ( Figur 1 ). Vissa FAME-föreningar kan också associeras med särskilda mikrobiella grupper, såsom gram-positiva eller gramnegativa bakterier, aktinomyceter, arbuscular mycorrhizalsvampar och saprotrofa svampar 19 , 20 , , 22 , 23 , 24 . Massförhållandena för specifika biomarkörer kan återspegla den relativa överflödigheten hos dessa grupper ( Figur 2 ). Övergripande FAME överflödsmönster skapar fingeravtryck på gemenskapsnivå, vilket möjliggör jämförelse av mikrobiell samhällsskillnad genom multivariata tekniker som ordination ( Figur 3 ). I motsats till de flesta DNA-baserade tillvägagångssätt kan lipiddata på gemenskapsnivå analyseras antingen som relativa eller absoluta överflöd. Om den totala biomassan skiljer sig väsentligen bland prover, kommer dessa två tillvägagångssätt att ge mycket olika resultat; De ekologiska frågorna som ligger till grund för experimentet bör avgöra vilken metod som används.

Figur 1
F Igur 1 : Total FAME biomassa. Jämförelse av den totala biomassan för biomassa från biomassa (nmol g -1 ) från kontinuerlig majs, befruktad prairie och obefruktad prairie. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2 : FAME biomassa av bakterier och svampar. Behandling jämförelse av bakteriell och svampig FAME biomarkör biomassa (nmol g -1 jord) från kontinuerlig majs, befruktad prairie och obefruktad prairie. Svamp och bakteriemassa från absolut överflöd. Medelvärde (summa f / summa b). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 3
Figur 3 : Icke-metrisk dimensionell skalning av FAME lipidbiomarkörer. Jämförelse av övergripande mikrobiella samfund med absoluta överflödsprofiler av alla mikrobiella FAME lipidbiomarkörer. I det här exemplet separeras kontinuerliga majs och obefintliga präriegemenskaper och är väldigt långt ifrån varandra, medan vissa befruktade prärieprover har mikrobiella samhällen som liknar dem från majs och andra liknar den obefintliga prärie. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

bord 1
Tabell 1: Tj ^ e l ven t typ, proportionalitets ti s tillsatt g -1 jord, en d t h EIR orde r o f lägga iti o n. Detta är viktigt för korrekt extraktion och separation av de organiska och vattenhaltiga faserna.

Discussion

För undersökning av flera prov från experiment med många replikat och / eller experimentella enheter kan forskare hitta fosfolipidfettsyraanalys (PLFA) för att vara oöverträffad när det gäller tid och material 25 . Med PLFA-metoden extraheras cellmembranfosfolipider, renas och identifieras med användning av den modifierade Bligh och Dyer 26 tvåfas vattenhaltig organisk extraktion. Detta följs av silikakromatografi i fast fas för att separera lipider genom polaritet och en alkalisk metylering av fosfolipidfettsyror i fettsyra-metylestrar. I PLFA kan profilering av lipider vara låg men av mycket hög renhet. Mikrobiellt ID införde en alternativ metod, fettsyra-metylesterproceduren (MIDI-FA). I MIDI-FA-metoden extraheras alla lipider direkt från rena kulturer eller mark / sedimentprover 11 , 12 , 27 genomförtvålning. Denna metod har lägre lipidförlust och är snabb eftersom den inte har någon av koncentrations- eller reningsstegen i PLFA-metoden. Medan MIDI-FA-metoden är snabb och billigare, eftersom den ursprungligen var utformad för att identifiera organismer i ren kultur, finns inga initiala extraktions- eller reningssteg. Således kan det innefatta lipidliknande föreningar samekstraherade från organiska organiska material som förvränger gemenskapsunderskriften 27 , 28 , 29 . Eftersom denna inkludering också kan snedvrida biomassanordningar har MIDI-FA typiskt endast använts för att grovt kvalitativt beskriva marklipider 13 .

Förfarandet som vi beskriver här kombinerar det bästa av de två separata extraktionsförfarandena: 1) en extraktion och koncentration av lipider med användning av den modifierade Bligh och Dyer 26- metoden och 2) fettsyra-metylestern saPonifiering, metylering, extraktion och basvätskeprocedur som utvecklats kommersiellt. Denna metod utvecklades för att uppnå fördelarna med båda dessa protokoll samtidigt som nackdelarna 15 minimeras. Genom att utföra den initiala extraktionen och isolera de organiskt lösliga komponenterna (t ex lipider) innan MIDI-FA utförs och slutföra detta med ett reningssteg, erbjuder detta protokoll en balans mellan hastighet och precision. Även om denna metod kanske inte är lämplig när hög renhet krävs ( dvs. för 13 C PLFA-analys) eller när man analyserar fosfolipider och neutrala lipider separat, möjliggör det i många fall detektion av mikrobiella samhällsresponser på miljöförhållanden med större känslighet än DNA-baserad Metoder 30 , 31 , 32 , 33 . Membranlipider sönderdelas snabbt efter celldöd så att de kanReflektera det levande mikrobiella samhället vid tidpunkten för provtagning 5 , 7 , i motsats till miljö-DNA där mycket av informationen kommer från döda eller inaktiva organismer 34 . Med tanke på den höga dormanshastigheten som observeras bland markmikroorganismer 35 kan karaktäriseringen av levande biomassa användas för att förstå tidsmässiga växtmikro-interaktioner i en relativt fin temporär skala och lipidbiomarkörer kan användas för att analysera mikrobiella samhällets fysiologiska status 7 . Det har visat sig att höga genomströmningsmetoder krävs för att bedöma mikrobiellt svar i stora fältinställningar 25 och medan metoden vi föreslår här inte replikerar noggrannheten av PLFA-biomarkörsprofilering ökar den genomströmningen samtidigt som den minimerar variationen realiserad med MIDI-FA procedur. Metoden har visat sig vara ett effektivt verktyg vid adresseringFrågor kring mikrobiell samhällsdynamik på ett stort antal jordar i storskaliga jordbruks- och ekosystemstudier 36 , 37 , 38 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 .

Lipidklasser kombineras med denna metod och det kan finnas en förlust av informationen i de separata klasserna 22 , 39 men kombinationen av lipidklassen kan stärka kraften för att detektera det arbusculara mycorrhizala svampuppkomsten av 16: 1 co5c från båda fosforerna - och neutrala lipider 40 . Dessutom, medan tHans antal okända fettsyror (som kan härledas från icke-levande organiskt material) kan vara högre med denna metod, det visade sig vara lägre än MIDI-FA och möjliggör behandling jämförelse av lipidprofiler från studier med många prover där prov Genomströmningskapacitet är en oro 15 . Den neutrala fraktionen anses allmänt att härledas främst från lagringslipider som framställs av svampar, men det kan också vara något mindre bidrag från jordfena 41 . Mot bakgrund av detta kan metoden som beskrivs här ge resultat som visar ett större bidrag från svamplipiderna 18: 2 co 6,9c och 18: 1 co 9c än PLFA. De andra lipiderna som tenderar att dyka upp i den neutrala fraktionen inkluderar några av de mättade fettsyrorna, t.ex. 16: 0, 18: 0, 20: 0.

Det finns olika sätt på vilka lipiddata kan uttryckas och analyseras. De vanligaste representationerna är överflöd (nmol g -1 jord), mole fractioN (nmol individuell lipid nmol -1 total lipid) och molprocent (molfraktion * 100). Normaliserad av de totala lipiderna i ett prov är molfraktion och molprocent åtgärder av den relativa överflödet av en given lipid. Efter en lämplig transformation, t.ex. arcsin kvadratrot, är molfraktionen lämplig för användning vid analys av huvudkomponenter eller redundansanalysordination. Överflöd är den absoluta mängden av en given lipid extraherad per gram jord. Eftersom mängden lipid per cell är rimligt konstant och lipidutvinningen är mycket effektiv och omfattande är total överflöd en bra uppskattning av totala lipider och överflöd av nyckelindikatorer återspeglar biomassan i den ekologiska gruppen som den representerar 17 . Slutligen är ett bra sätt att titta på mikrobiell samhällssammansättning att använda multivariata analysmetoder 16 , t.ex. ordningsmetoder som icke-metrisk multidimensionell skalning (NMDS -Som inte behöver dataomvandling) eller huvudkomponentanalys (PCA), kan vara användbar för att jämföra den relativa överflödigheten av alla lipidbiomarkörer.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades delvis av DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494) och DOE OBP Office för energieffektivitet och förnybar energi (DE-AC05-76RL01830). Författarna skulle vilja erkänna Anders Gurda för hans patient och skickliga bidrag till videografi och redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RapidVap Labconco 7900000 Evaporative system
RapidVap Labconco 7491400 Sample block
Chem-resistant vacuum pump Labconco 7584000 Vacuum pump
Chemical trap cannister Labconco 7815300 Trap cannister
Solvent insert Labconco 7515200 Solvent trap insert
Diaphragm pump Welch 7398000 DryFast vacuum pump
Water bath Fisher 15-462-15Q 2 well water bath
Gas chromatograph Various N/A For sample analysis
Centrifuge Various N/A For sample separation
Freeze Dryer Various N/A For sample lyophilization
Repipet (6) BrandTech 4720440 For dispensing reagents
Vortex Fisher 02-215-365 Analog vortex mixer
Teflon centrifuge tubes Thermo/Nalgene 3114-0030 Teflon sample tubes
Caps Thermo/Nalgene DS3131-0020 Caps for teflon tubes
Test tube Corning 9825-16 16x100mm tubes
Test tube Corning 9825-16xx 16x150mm tubes
Caps Corning 9998-15 15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner
Pasteur pipets Fisher 13-678-20B 14.6cm
500 uL glass syringe Fisher 13684106LC Hamilton 81217
Amber vials Agilent 5182-0716 4mL Amber vials
Caps Agilent 5182-0717 Blue screw caps
Inserts Agilent 5181-3377 400uL flat bottom glass inserts
Standards
19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate) VWR TCN0459-5G Analytical standard
Chemicals
Dipotassium phosphate (K2HPO4 - ACS grade or better) Various N/A For making Phosphate-Buffer
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 - ACS grade or better) Various N/A For making Phosphate-Buffer
Methanol (CH3OH - HPLC grade or better) Various N/A For making Reagents 1 & 2
Sodium hydroxide (NaOH - ACS grade or better) Various N/A For making Reagents 1 & 4
Hydrochloric acid (6N HCL) Various N/A For making Reagent 2
Hexane (HPLC grade or better) Various N/A For making Reagent 3
MTBE (Methyl tert-butyl ether - HPLC grade or better) Various N/A For making Reagent 3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Der Heijden, M. G. a, Bardgett, R. D., Van Straalen, N. M. The unseen majority: Soil microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems. Ecol Lett. 11, (3), 296-310 (2008).
  2. Bever, J. D., et al. Rooting theories of plant community ecology in microbial interactions. Trends Ecol Evol. 25, (8), 468-478 (2010).
  3. Suleiman, A. K. A., Manoeli, L., Boldo, J. T., Pereira, M. G., Roesch, L. F. W. Shifts in soil bacterial community after eight years of land-use change. Syst Appl Microbiol. 36, (2), 137-144 (2013).
  4. Sayer, E. J., et al. Grassland management influences spatial patterns of soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 61, 61-68 (2013).
  5. Fernandes, M. F., Saxena, J., Dick, R. P. Comparison of Whole-Cell Fatty Acid (MIDI) or Phospholipid Fatty Acid (PLFA) Extractants as Biomarkers to Profile Soil Microbial Communities. Microbial Ecol. 66, (1), 145-157 (2013).
  6. van der Heijden, M. G. A., Wagg, C. Soil microbial diversity and agro-ecosystem functioning. Plant Soil. 363, (1-2), 1-5 (2013).
  7. Allison, V. J., Miller, R. M., Jastrow, J. D., Matamala, R., Zak, D. R. Changes in soil microbial community structure in a tallgrass prairie chronosequence. Soil Sci Soc Am J. 69, (5), 1412-1421 (2005).
  8. Kowalchuk, G. A., Buma, D. S., de Boer, W., Klinkhamer, P. G. L., van Veen, J. A. Effects of above-ground plant species composition and diversity on the diversity of soil-borne microorganisms. A van Leeuw. 81, (1-4), 509-520 (2002).
  9. Bardgett, R. D., Hobbs, P. J., Frostegard, A. Changes in soil fungal:bacterial biomass ratios following reductions in the intensity of management of an upland grassland. Biol Fert Soils. 22, (3), 261-264 (1996).
  10. Frostegård, Å, Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol Biochem. 43, (8), 1621-1625 (2011).
  11. Haack, S. K., Garchow, I. H., Odelson, D. A., Forney, L. J., Klug, M. J. Accuracy , Reproducibility , and Interpretation of Fatty Acid Methyl Ester Profiles of Model Bacterial Communitiest. Appl Environ Microbiol. 60, (7), 2483-2493 (1994).
  12. Drenovsky, R. E., Elliott, G. N., Graham, K. J., Scow, K. M. Comparison of phospholipid fatty acid ( PLFA ) and total soil fatty acid methyl esters ( TSFAME ) for characterizing soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 36, 1793-1800 (2004).
  13. Cavigelli, M. A., Robertson, G. P., Klug, M. Fatty acid methyl ester ( FAME ) profiles as measures of soil microbial community structure. Plant Soil. 170, 99-113 (1995).
  14. Findlay, R. Determination of microbial community structure using phospholipid fatty acid profiles. Molecular microbial ecology manual. Available from: https://www.researchgate.net/profile/Robert_Findlay2/publication/281208148_Determination_of_microbial_community_structure_using_phospholipid_fatty_acid_profiles/links/55db4f0b08aec156b9afe776.pdf 2885-2906 (2004).
  15. Balser, T. C., Liang, C., Gutknecht, J. L. Linking microbial community analysis and ecosystem studies: A rapid lipd analysis protocol for high throughput. Biol Fert Soils. Forthcoming (2017).
  16. Findlay, R. H., King, G. M., Watling, L., Watling, L. E. S. Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sediments Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sedimentst. Appl Environ Microbiol. 55, (11), 2888-2893 (1989).
  17. Willers, C., Jansen van Rensburg, P. J., Claassens, S. Microbial signature lipid biomarker analysis - an approach that is still preferred, even amid various method modifications. J Appl Microbiol. 118, (6), 1251-1263 (2015).
  18. Balser, T. C. Phospholipid Fatty-acid Analysis (PLFA). Protocol. Available from: http://nature.berkeley.edu/soilmicro/methods/BalserPLFA.pdf (2017).
  19. Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty-acids in phospholipids and lipopolysachharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 24, (4), 317-323 (1992).
  20. Frostegard, A., Tunlid, A., Baath, E. Phospholipid fatty-acid composition, biomass, and activity of microbial communities from 2 soil types experimentally exposed to different heavy-metals. Appl Environ Microbiol. 59, (11), 3605-3617 (1993).
  21. Federle, T. W., Dobbins, D. C., Thorntonmanning, J. R., Jones, D. D. Microbial biomass, activity, and community structure in subsurface soils. Ground Water. 24, (3), 365-374 (1986).
  22. Vestal, J. R., White, D. C. Lipid analysis in microbial ecology - quantitative approaches to the study of microbial communities. BioScience. 39, (8), 535-541 (1989).
  23. Wilkinson, S. G. Gram negative bacteria. Microbial Lipids. 299-488 (1988).
  24. Balser, T. C., Treseder, K., Ekenler, M. Using lipid analysis and hyphal length to quantify AM and saprotrophic fungal abundance along a soil chronosequence. Soil Biol Biochem. 37, (3), 601-604 (2005).
  25. Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
  26. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Phys. (37), 911-917 (1959).
  27. Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of Fatty Acid Methyl Ester (FAME) Methods for Characterizing Microbial Communities. Soil Sci Soc Am J. 64, (5), 1659-1668 (2000).
  28. Jandl, G., Leinweber, P., Schulten, H., Ekschmitt, K. Contribution of primary organic matter to the fatty acid pool in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 37, 1033-1041 (2005).
  29. Nielsen, P., Petersen, S. O. Ester-linked polar lipid fatty acid profiles of soil microbial communities: a comparison of extraction methods and evaluation of interference from humic acids. Soil Biol Biochem. 32, 1241-1249 (2000).
  30. Duncan, D. S., Jewell, K. A., Suen, G., Jackson, R. D. Detection of short-term cropping system-induced changes to soil bacterial communities differs among four molecular characterization methods. Soil Biol Biochem. 96, 160-168 (2016).
  31. Liang, C., et al. Switchgrass rhizospheres stimulate microbial biomass but deplete microbial necromass in agricultural soils of the upper Midwest, USA. Soil Biol Biochem. 94, 173-180 (2016).
  32. Jangid, K., et al. Land-use history has a stronger impact on soil microbial community composition than aboveground vegetation and soil properties. Soil Biol Biochem. 43, (10), 2184-2193 (2011).
  33. Ritz, K., et al. Spatial structure in soil chemical and microbiological properties in an upland grassland. FEMS Microbiol Ecol. 49, (2), 191-205 (2004).
  34. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. J Chem Inf Model. 53, (9), 1689-1699 (2013).
  35. Lennon, J. T., Jones, S. E. Microbial seed banks: The ecological and evolutionary implications of dormancy. Nat Rev Microbiol. 9, (2), 119-130 (2011).
  36. Gutknecht, J. L. M., Field, C. B., Balser, T. C. Microbial communities and their responses to simulated global change fluctuate greatly over multiple years. Glob Change Biol. 18, 225-269 (2012).
  37. Pei, Z., et al. Soil and tree species traits both shape soil microbial communities during early growth of Chinese subtropical forests. Soil Biol Biochem. 96, 180-190 (2016).
  38. Oates, L. G., Duncan, D. S., Sanford, G. R., Liang, C., Jackson, R. D. Bioenergy cropping systems that incorporate native grasses stimulate growth of plant-associated soil microbes in the absence of nitrogen fertilization. Ag Ecosys Environ. 233, 396-403 (2016).
  39. Bååth, E. The use of neutral lipid fatty acids to indicate the physiological conditions of soil fungi. Microbial Ecol. 45, (4), 373-383 (2003).
  40. Ngosong, C., Gabriel, E., Ruess, L. Use of the signature Fatty Acid 16:1ω5 as a tool to determine the distribution of arbuscular mycorrhizal fungi in soil. J Lipids. 2012, 236807 (2012).
  41. Sharma, M. P., Buyer, J. S. Comparison of biochemical and microscopic methods for quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in soil and roots. Appl Soil Ecol. 95, 86-89 (2015).
  42. Oates, L. G., Balser, T. C., Jackson, R. D. Subhumid pasture soil microbial communities affected by presence of grazing, but not grazing management. Appl Soil Ecol. 59, 20-28 (2012).
  43. Liang, C. Potential legacy effects of biofuel cropping systems on soil microbial communities in southern Wisconsin, USA. Ag Sci. 2, (2), 131-137 (2011).
  44. Herzberger, A. J., Duncan, D. S., Jackson, R. D. Bouncing Back Plant-Associated Soil Microbes Respond Rapidly to Prairie Establishment. PloS One. 9, (12), 1-14 (2014).
  45. Fraterrigo, J. M., Balser, T. C., Turner, M. G. Microbial community variation and its relationship with nitrogen mineralization in historically altered forests. Ecology. 87, (3), 570-579 (2006).
  46. Kao-Kniffin, J., Balser, T. C. Elevated CO2 differentially alters belowground plant and soil microbial community structure in reed canary grass-invaded experimental wetlands. Soil Biol Biochem. 39, (2), 517-525 (2007).
  47. Mentzer, J. L., Goodman, R. M., Balser, T. C. Microbial response over time to hydrologic and fertilization treatments in a simulated wet prairie. Plant Soil. 284, (1-2), 85-100 (2006).
  48. Ushio, M., Wagai, R., Balser, T. C., Kitayama, K. Variations in the soil microbial community composition of a tropical montane forest ecosystem: Does tree species matter. Soil Biol Biochem. 40, (10), 2699-2702 (2008).
  49. Bartelt-Ryser, J., Joshi, J., Schmid, B., Brandl, H., Balser, T. Soil feedbacks of plant diversity on soil microbial communities and subsequent plant growth. Perspect Plant Ecol. 7, (1), 27-49 (2005).
  50. Fichtner, A., von Oheimb, G., Härdtle, W., Wilken, C., Gutknecht, J. L. M. Effects of anthropogenic disturbances on soil microbial communities in oak forests persist for more than 100 years. Soil Biol Biochem. 70, 79-87 (2014).
En lipid extraktions- och analysmetod för karakterisering av markmikrober i experiment med många prov
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oates, L. G., Read, H. W., Gutknecht, J. L. M., Duncan, D. S., Balser, T. B., Jackson, R. D. A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples. J. Vis. Exp. (125), e55310, doi:10.3791/55310 (2017).More

Oates, L. G., Read, H. W., Gutknecht, J. L. M., Duncan, D. S., Balser, T. B., Jackson, R. D. A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples. J. Vis. Exp. (125), e55310, doi:10.3791/55310 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter