Summary
علينا أن نظهر منصة ميكروفلويديك مع شبكة القطب سطح المتكاملة التي تجمع بين الاستشعار عن نبض مقاوم (RPS) مع سي دي إم أيه (CDMA)، إلى تعدد كشف والتحجيم من الجزيئات في قنوات ميكروفلويديك متعددة.
Abstract
معالجة ميكروفلويديك من العينات البيولوجية عادة ما ينطوي على تلاعب التفاضلية من الجسيمات العالقة ضمن الحقول قوة مختلفة من أجل يجزئ مكانيا العينة على أساس الملكية البيولوجية من الفائدة. للتوزيع المكاني الناتجة لاستخدامها قراءات الفحص، وكثيرا ما تتعرض أجهزة ميكروفلويديك إلى التحليل المجهري تتطلب أجهزة معقدة مع ارتفاع التكاليف وتخفيض قابلية. لمعالجة هذا القيد، قمنا بتطوير تكنولوجيا الاستشعار إلكترونية متكاملة للكشف عن المضاعفة من الجسيمات في مواقع مختلفة على رقاقة ميكروفلويديك. لدينا التكنولوجيا، ودعا رموز ميكروفلويديك، تجمع نبض مقاوم الاستشعار مع سي دي إم أيه لضغط 2D المعلومات المكانية إلى إشارة كهربائية 1D. في هذه الورقة، ونحن تقديم دليل عملي لهذه التكنولوجيا رموز ميكروفلويديك للكشف عن وحجم الخلايا السرطانية مثقف توزيعها عبر قنوات ميكروفلويديك متعددة. مثلالمصادق عليها من قبل المجهر عالية السرعة، ويمكن للتكنولوجيا لدينا تحليل بدقة السكان الخلية كثيفة جميع إلكترونيا دون الحاجة إلى أداة خارجية. على هذا النحو، يمكن للرموز ميكروفلويديك يحتمل تمكين متكاملة من الأجهزة منخفضة التكلفة المختبر على واحد في رقاقة التي هي مناسبة تماما لاختبار نقطة من الرعاية من العينات البيولوجية.
Introduction
كشف دقيق وتحليل الجزيئات البيولوجية مثل الخلايا والبكتيريا أو الفيروسات العالقة في السائل هو من مصلحة كبيرة لمجموعة من التطبيقات 1، 2، 3. حسنا المطابقة في الحجم وأجهزة ميكروفلويديك توفر مزايا فريدة من نوعها لهذا الغرض مثل ذات حساسية عالية، لطيف التلاعب العينة والمكروية تسيطر عليها بشكل جيد، 4، 5، 6، 7. وبالإضافة إلى ذلك، أجهزة ميكروفلويديك يمكن أن تكون مصممة لاستخدام مزيج من ديناميات السوائل وحقول القوة ليجزئ بشكل سلبي على السكان غير متجانسة من الجزيئات البيولوجية على أساس الخصائص المختلفة 8، 9، 10، 11، 12. في تلك جهازالصورة، توزيع الجسيمات الناتجة يمكن أن تستخدم قراءات لكن المعلومات المكانية يمكن الوصول إليها عادة إلا من خلال المجهر، مما يحد من فائدة عملية للجهاز ميكروفلويديك من خلال ربطه إلى بنية تحتية المختبر. ولذلك، جهاز استشعار المتكاملة التي يمكن أن التقرير بسهولة رسم الخرائط الزمانية المكانية الجزيئات، كما يتم التلاعب فيها على جهاز ميكروفلويديك، من المحتمل أن تمكن منخفضة التكلفة ومتكاملة أجهزة المختبر على واحد في رقاقة التي هي جاذبية خاصة لاختبار عينات في الجوال ، المناطق ذات الموارد المحدودة.
وقد استخدمت أقطاب رقيقة كما أجهزة الاستشعار المدمجة في أجهزة ميكروفلويديك لمختلف التطبيقات 13 و 14. نبض مقاوم الاستشعار (RPS) جذابة بشكل خاص للاستشعار متكاملة من جزيئات صغيرة في قنوات ميكروفلويديك، حيث أنها توفر آلية قوية وحساسة، والكشف عن الإنتاجية العالية مباشرة من القياسات الكهربائية 15. في الديرة، وتعديل مقاومة بين زوج من الأقطاب الكهربائية، منغمسين في المنحل بالكهرباء، ويستخدم كوسيلة للكشف عن الجسيمات. عندما يمر الجسيمات من خلال فتحة، الحجم بناء على أمر من الجسيمات، يتم استخدام عدد واتساع النبضات عابرة في التيار الكهربائي لحساب وحجم الجسيمات، على التوالي. وعلاوة على ذلك، هندسة استشعار يمكن أن تكون مصممة مع قرار الطباعة التصويرية لتشكيل الطول الموجي نبض مقاوم من أجل تعزيز حساسية 16، 17، 18، 19 أو لتقدير الوضع الرأسي للجسيمات في قنوات الموائع الدقيقة 20.
وأدخلنا مؤخرا مقاوم المضاعفة تكنولوجيا الاستشعار عن نبض قابلة للوبسيطة تسمى ميكروفلويديك الأكواد متعامد كشفها بواسطة الاستشعار الكهربائية (رموز ميكروفلويديك) 21. رموز الموائع الدقيقة تعتمد علىشبكة مترابطة من أجهزة الاستشعار نبض مقاوم، يتألف كل منها من مجموعة من الأقطاب الكهربائية مجهريا لتعديل التوصيل بطريقة ومميزة فريدة من نوعها، وذلك لتمكين مضاعفة. لقد صممت خصيصا لكل جهاز استشعار لإنتاج إشارات كهربائية المتعامدة مماثلة لرموز الرقمية المستخدمة في سي دي إم أيه 22 (CDMA) شبكات الاتصالات السلكية واللاسلكية، بحيث الفردية إشارة استشعار نبض مقاوم يمكن استرداد فريد من الموجي الناتج واحد، حتى لو إشارات من أجهزة استشعار مختلفة تتداخل. وبهذه الطريقة، لدينا التكنولوجيا الكمادات المعلومات المكانية 2D من الجسيمات إلى إشارة كهربائية 1D، والسماح رصد الجسيمات في مواقع مختلفة على رقاقة ميكروفلويديك، مع الحفاظ على حد سواء تعقيد device- وعلى مستوى النظام إلى الحد الأدنى.
في هذه الورقة، نقدم بروتوكول مفصلة عن الطرق التجريبية والحسابية اللازمة لاستخدام التكنولوجيا رموز ميكروفلويديك، وكذلك صالنتائج epresentative من استخدامه في تحليل العينات البيولوجية المحاكاة. استخدام النتائج من جهاز النموذج مع أربعة أجهزة استشعار المضاعفة كمثال لشرح هذه التقنية، ونحن نقدم البروتوكولات على (1) عملية التصنيع الدقيق لإنشاء أجهزة ميكروفلويديك مع التكنولوجيا رموز ميكروفلويديك، (2) وصف الإعداد التجريبية بما في ذلك الإلكترونية، والبصرية، وفلويديك الأجهزة، (3) خوارزمية الكمبيوتر من أجل فك رموز التدخل إشارات من أجهزة الاستشعار المختلفة، و (4) نتائج من كشف وتحليل الخلايا السرطانية في القنوات ميكروفلويديك. ونحن نعتقد أن استخدام بروتوكول مفصلة وصفها هنا، يمكن للباحثين الآخرين تطبيق التكنولوجيا لدينا لأبحاثهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصميم أقطاب الترميز
ملاحظة: يظهر الشكل 1A هيكل 3-D من الأقطاب micropatterned.
- تصميم مجموعة من أربعة رموز الذهب 7 بت لترميز قنوات الموائع الدقيقة 23.
- بناء اثنين من الخطية ردود الفعل التحول سجلات (LFSRs)، يمثل كل منها متعدد الحدود البدائية.
- استخدام LFSRs لإنشاء زوج يفضل من -sequences 7 بت م.
- دوريا تحول الزوج يفضل من -sequences م وإضافتها في وزارة الدفاع 2 لتوليد أربعة رموز الذهب متميزة.
- تصميم تخطيط الأقطاب الترميز (الشكل 1B).
- وضع ثلاث محطات الكهربائي، تمثل، السلبية، وأقطاب المرجعية إيجابية في ثلاث زوايا.
- يتتبع مسار القطب الإيجابي والسلبي على طرفي نقيض من كل قناة ميكروفلويديك.
- تمديد الأقطاب الإيجابية والسلبية فيقنوات ميكروفلويديك كما أصابع القطب، بعد تعيين فريد كود الذهب (الشكل 1C).
- وضع القطب المرجع في ما بين الأصابع الإيجابية والسلبية القطب.
- وضع آثار إيجابية وسلبية القطب بعيدا عن أصابع إشارة القطب الأبعد من أجل تقليل التوصيل الكهربائي خارج المنطقة الترميز.
2. التصنيع الدقيق من أقطاب السطحية
ملاحظة: يظهر الشكل 2B عملية تصنيع أقطاب السطح.
- تنظيف رقاقة البورسليكات الزجاج 4 بوصة في حل سمكة البيرانا (حمض الكبريتيك 98٪: 30٪ هيدروجين بيروكسيد = 5: 1) عند 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإزالة جميع الملوثات العضوية. ثم وضع رقاقة على لوحة 200 درجة مئوية الساخنة لمدة 20 دقيقة لإزالة المياه المتبقية.
- نقل الرقاقة إلى الدوار. الاستغناء 2 مل مقاومة للضوء سلبي على رقاقة وتدور الرقاقة بسرعة 3، 000 دورة في الدقيقة لمدة 40 ق إلى معطف موحد الرقاقة بطبقة مقاومة للضوء 1.5 ميكرون.
- وضع رقاقة على لوحة 150 درجة مئوية الساخنة وخبز مقاوم الضوء نسج لمدة 1 دقيقة.
- كشف مقاومة للضوء إلى 365 نانومتر ضوء الأشعة فوق البنفسجية (225 ميغا جول / سم 2) من خلال قناع الكروم باستخدام اليجنر قناع.
- وضع رقاقة على لوحة 100 درجة مئوية الساخنة وخبز مقاومة للضوء يتعرض لمدة 1 دقيقة.
- تطوير مقاومة للضوء عن طريق غمر الرقاقة في مطور مقاومة للضوء (RD6) لمدة 15 ثانية. رش بلطف منزوع الأيونات الماء (DI) ويغسل الرقاقة. الجافة التي تهب النيتروجين المضغوط.
- وضع رقاقة مع مقاومة للضوء منقوشة في جهاز تبخير المعادن البريد شعاع، وإيداع فيلم الكروم 20 نانومتر سميكة، يليه فيلم الذهب 80 نانومتر سميكة على الرقاقة عند ضغط قاعدة 3 × 10 -6 عربة مع معدل ترسب 1 A / S.
- تزج الرقاقة المعدنية المغلفة في الأسيتون في مجموعة حمام بالموجات فوق الصوتية على تردد 40 كيلوهرتز مع 100٪ السعة لمدة 30 دقيقة في المزاج الغرفةature لحفر مقاوم الضوء الأساسي واستكمال عملية رفع قبالة.
- الزهر ويفر إلى أجزاء أصغر باستخدام منشار تقطيع التقليدية.
3. تصنيع مقلب SU-8 قنوات ميكروفلويديك
ملاحظة: يظهر الشكل 2A عملية تصنيع القالب لقنوات الموائع الدقيقة.
- تنظيف وخبز رقاقة السيليكون 4 بوصة باستخدام نفس الإجراء الموضح في 2.1.
- نقل الرقاقة إلى الدوار. صب 4 مل مقاوم الضوء على الرقاقة. معطف الرقاقة مع مقاومة للضوء.
- تدور الرقاقة عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية.
- تدور الرقاقة عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية.
- تدور الرقاقة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية للحصول على مغلفة بشكل موحد 15 ميكرون طبقة مقاومة للضوء سميكة.
- ضع وجه رقاقة حتى على غرف الأبحاث مسح غارقة في الأسيتون وإزالة مقاومة للضوء المتبقية من مساعدات وحواف الرقاقة.
- نقل الرقاقة على رر الساخنيأكلون الخبز لينة. أولا، خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. ثم التحرك بسرعة الرقاقة إلى 95 درجة مئوية طبق ساخن وتخبز لمدة 2 دقيقة.
- كشف مقاومة للضوء إلى 365 نانومتر ضوء الأشعة فوق البنفسجية (180 ميغا جول / سم 2) من خلال قناع الكروم باستخدام اليجنر قناع.
- خبز بعد التعرض الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ثم على درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- تزج الرقاقة في التطوير ويهز بلطف الحاوية لمدة 3 دقائق. ثم، وشطف الرقاقة مع الكحول الأيزوبروبانول (IPA) وجففها التي تهب النيتروجين المضغوط. إذا ظهرت بقايا بيضاء اللون على الرقاقة، تزج به في مطور من جديد وتطوير لوقت أطول وجافة.
- خبز الرقاقة على طبق من 200 ° C ساخنة لمدة 30 دقيقة حتى يجف تماما.
- قياس سمك مقاومة للضوء نمط باستخدام profilometer في مواقع مختلفة في جميع أنحاء رقاقة لضمان الاتساق.
- Silanize الرقاقة العفن من خلال الاستفادة من تقنية ترسيب البخار. إضافة 200 ميكرولتر من طن تبريدichlorosilane في طبق بتري ومكان في مجفف فراغ جنبا إلى جنب مع SU-8 العفن رقاقة لمدة 8 ساعات.
4. جمعية جهاز رموز ميكروفلويديك
- وضع رقاقة السيليكون 4 بوصة مع القالب في 150 مم طبق بيتري، وإصلاحه عن طريق تسجيل من أطرافها.
- مزيج من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) قبل البوليمر وعبر رابط في نسبة 10: 1، وتصب 50 غرام من الخليط في طبق بيتري. وضع طبق بتري في مجفف فراغ لديغا الخليط لمدة 1 ساعة، ومن ثم علاجه في الفرن على 65 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات (الشكل 2A).
- قطع طبقة PDMS علاجه باستخدام مشرط وقشر تشغيله الرقاقة العفن باستخدام الملقط. حجم الجهاز إثبات صحة المبدأ هو ما يقرب من 20 ملم × 7 ملم. ثم لكمة ثقوب بقطر 1.5 مم من خلال PDMS لمدخل ومخرج للقناة ميكروفلويديك باستخدام الناخس الخزعة.
- تنظيف جوانب نمط من الجزء PDMS من خلال وضع طر على شريط لاصق غرفة نظيفة.
- تنظيف الركيزة الزجاج مع أقطاب السطح قبل الشطف مع الأسيتون، IPA والمياه DI والجافة باستخدام النيتروجين المضغوط.
- تفعيل أسطح PDMS والركيزة الزجاج في البلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية مع الجانب مجهريا من كل جزء في مواجهة مولد الترددات اللاسلكية البلازما وضعت في 100 ميغاواط.
- محاذاة قناة PDMS ميكروفلويديك مع الأقطاب على سطح الركيزة الزجاج باستخدام المجهر الضوئي ومن ثم جلب اثنين من السطوح تنشيط البلازما في الاتصال الجسدي.
- خبز الجهاز على لوحة 70 ° C الساخنة لمدة 5 دقائق، مع الجانب الزجاج التي تواجه طبق ساخن.
- ربط منصات الاتصال من الأقطاب الكهربائية مع الأسلاك عن طريق لحام.
5. إعداد نموذج مقلد البيولوجية
- ثقافة الخلايا HeyA8 الإنسان بسرطان المبيض في RPMI 1640 تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين الستربتومايسين في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئويةحتى تصل إلى 80٪ التقاء.
- نضح في وسائل الاعلام من قارورة الثقافة باستخدام ماصة الزجاج. الاستغناء ثم نضح 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لغسل الخلايا.
- احتضان الخلايا في 2 مل 0.05٪ (ث / ت) حل التربسين لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية إلى تعليق الخلايا الملتصقة. ثم، إضافة 4 مل من وسائل الإعلام والثقافة لتحييد التربسين.
- الطرد المركزي تعليق خلية في 100 × ز لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه في أنبوب الاختبار. ثم، نضح طاف تماما.
- إعادة تعليق الخلايا في 1-2 مل برنامج تلفزيوني 1X قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا لكتل الخلايا فصل ميكانيكيا.
- رسم كمية صغيرة من تعليق خلية في ماصة وحساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- تمييع تعليق الخلية مع برنامج تلفزيوني لإعداد عينة مع تركيز الخلية النهائي من 10 5 -10 6 خلية / مل.
6. تشغيل رموز جهاز ميكروفلويديك
ملاحظة: فايجوري 3 يظهر الإعداد التجريبية.
- وضع الجهاز رموز ميكروفلويديك على مرحلة المجهر الضوئي.
- تطبيق 400 كيلو هرتز موجة جيبية إلى القطب إشارة على الرقاقة باستخدام مولد وظيفة الإلكترونية.
- توصيل الأقطاب الإيجابية والسلبية الاستشعار لاثنين من مكبرات الصوت عبر مقاومة مستقلة لتحويل الإشارات الحالية من كل لإشارات الجهد.
- طرح الاستشعار القطب الموجب إشارة الجهد من إشارة الجهد الاستشعار الكهربائي السلبية باستخدام مكبر للصوت فرق جهد من أجل الحصول على إشارة القطبين.
- استخدام كاميرا عالية السرعة لتشغيل سجل بصريا من الجهاز لأغراض التحقق من صحة والتوصيف.
- طرد تعليق الخلية من خلال الجهاز رموز ميكروفلويديك في معدل تدفق ثابت (50-1،000 ميكرولتر / ساعة) باستخدام مضخة الحقنة.
- قياس إشارة مقاومة التشكيل باستخدام مكبر للصوت قفل في.
- توصيل إشارة إشارة التيار المتردد إلى المرجعإدخال erence من مكبر للصوت قفل في. توصيل إشارة التفاضلية القطبين إلى مكبر للصوت قفل في مثل إشارة الدخل.
- الحصول على سعة RMS للإشارة التفاضلية من إخراج مكبر للصوت قفل في.
- أخذ عينات من مكبر للصوت إشارة خرج قفل في في 1 معدل ميغاهيرتز إلى الكمبيوتر من خلال لوحة الحصول على البيانات لمزيد من التحليل.
7. معالجة الإشارات الاستشعار
- نقل البيانات الكهربائية المسجلة في MATLAB لمرحلة ما بعد المعالجة وفك.
- تصفية الإشارات المسجلة في المجال الرقمي باستخدام فلتر بتروورث (MATLAB المدمج في وظيفة) لإزالة الضوضاء عالية التردد (> 2.5 كيلو هرتز).
- إنشاء مكتبة رمز قالب من إشارات أجهزة الاستشعار.
- تحديد إشارات كود غير متداخلة تمثيلية المقابلة لكل أجهزة الاستشعار في الجهاز واستخراج هذه الكتل إشارة من مجموعة البيانات كما ناقلات الموجي منفصلة.
- تطبيع كل قالب ناقلات كود الموجيمن قوتها. استخدام MATLAB المدمج في وظيفة (bandpower) لقياس قوة الإشارة.
- استخدام وظيفة MATLAB (إعادة تشكيل) لتوسيع مكتبة قالب من خلال خلق رقميا إصدارات إشارات كود تطبيع مع فترات متفاوتة لاستيعاب الاختلافات في سرعة تدفق الخليوي أكثر من الأقطاب الكهربائية.
- تحديد الكتل إشارة التي تتوافق مع استشعار النشاط (عتبة: SNR> 12 ديسيبل) في الموجي تصفيتها. سوف الموجي مع SNR تحت عتبة أن تعامل على أنها الضوضاء.
- فك كتل الفردية من النشاط استشعار في الإشارات المسجلة باستخدام خوارزمية تكرارية قائمة على أساس إلغاء تدخل على التوالي، وهي تقنية تستخدم عادة في شبكات الاتصالات CDMA متعدد المستخدمين 24، 25.
- حساب عبر ارتباط كل كتلة إشارة مع كل من القوالب في المكتبة باستخدام انزلاق المنتج نقطة.
- تحديد القالب الذي ينتج تأمؤسسة لصناعة السيارات في ارتباط الذروة لتحديد المهيمنة الفردية إشارة كود الاستشعار. تسجل الوقت وسعة كل من ذروة الارتباط الذاتي.
- بناء على إشارة كود استشعار تقدير عن طريق التوسع في قالب كود حددت بناء على قياس الارتباط الذاتي الذروة السعة والمعلومات (تم تحديدها في الخطوة 7.5.2) توقيت.
- طرح يقدر إشارة كود استشعار من البيانات الأصلية.
- تكرار العملية من 7.5.1، حتى لا تشبه إشارة المتبقية أي إشارة في مكتبة القالب، الذي يعرف رياضيا على النحو معامل الارتباط كونها أقل من 0.5.
- حدد الأولية تقديرات أجهزة الاستشعار إشارة من الخطوة 7.5 باستخدام عملية التحسين.
- إعادة بناء الإشارة بإضافة إشارات استشعار الفردية المقدرة من كل التكرار.
- اكتساح السعة ومدة وتوقيت الإشارات استشعار الفردية حول التقديرات الأصلية لإنتاج أفضل تتناسب مع الإشارة الكهربائية المسجلةبناء على المربعات الصغرى تقريب 26.
- تحويل سعة الإشارات استشعار يقدر في حجم الخلية عن طريق إشارات كهربائية معايرة ضد الصور البصرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر جهاز رموز ميكروفلويديك تتألف من أربعة أجهزة استشعار موزعة على أربع قنوات ميكروفلويديك في الشكل 1B. في هذا النظام، وقد تم تصميم المقطع العرضي من كل قناة ميكروفلويديك لتكون قريبة من حجم الخلية بحيث (1) خلايا متعددة لا يمكن ان تمر على الأقطاب في موازاة و (2) ما زالت خلايا قريبة من الأقطاب زيادة حساسية . تم تصميم كل جهاز استشعار لتوليد الرمز الفريد 7 بت. ثم تم اختبار الجهاز باستخدام تعليق خلية. وتظهر إشارات كهربائية سجلت المقابلة لأربعة أجهزة استشعار الفردية بما يرتبط بها من رموز رقمية مثالية في الشكل (4). تسجل الإشارات تتطابق بشكل وثيق مع نبضات مربع مثالية، بينما الانحرافات صغيرة موجودة. هذه الانحرافات تنتج عن مزيج من عدة عوامل بما في ذلك المجال الكهربائي غير موحدة بين أقطاب متحد المستوى، اقتران بين أزواج مختلفة الكهربائي، والشكل الكروي للالخلايا، فضلا عن سرعة تدفق مستمر من الخلايا في قنوات ميكروفلويديك. أنشأنا مكتبة قالب بناء على إشارات استشعار مشفر. خلال ربط الإشارات المسجلة مع كافة القوالب في المكتبة، ونحن مصممون على القالب الذي ينتج أقصى الذروة لصناعة السيارات في الارتباط (الشكل 4). كما الرموز الرقمية للقنوات ميكروفلويديك صممت لتكون متعامدة على بعضها البعض، يمكن أن تحدد بقوة والمهيمنة لصناعة السيارات في ارتباط الذروة في هذه العملية. باستخدام هذا النهج، يمكننا تحديد حسابيا قناة ميكروفلويديك الخلية مرت، ومدة إشارة الاستشعار، وبالتالي سرعة تدفق الخلية.
لا يمكن للتكنولوجيا رموز ميكروفلويديك حل الحالات عندما خلايا متعددة في وقت واحد يتفاعل مع أقطاب الترميز. عندما تحدث مثل هذه التداخلات، وإشارات من أجهزة الاستشعار الفردية تتداخل والموجي الناتج لا يمكن بسهولة تترافق مع أيقالب واحد المقابلة لاستشعار معين. فك بدقة هذه الإشارات المتداخلة مهم بشكل خاص لمعالجة موثوق عينات ذات الكثافة السكانية العالية، حيث من المحتمل أن تحدث التدخلات. لحل تداخل الأحداث، وضعنا خوارزمية تكرارية على أساس مخطط إلغاء تدخل المتعاقبة (SIC) 24، 25، والتي عادة ما تستخدم للكشف متعدد المستخدمين في شبكات الاتصالات CDMA. يوضح الشكل (5) كيف يتم تنفيذ خوارزمية SIC في حل الموجي التي نتجت عن أربع خلايا متداخلة في أربع قنوات ميكروفلويديك مختلفة. في كل تكرار، توصلنا أولا المهيمنة في قمة صناعة السيارات في الارتباط (الشكل 5A، 2 العمود الثاني)، الموافق أقوى إشارة التدخل، من خلال ربط الموجي الإدخال (الشكل 5A، 1 العمود الواحد) مع مكتبة قالب. واستنادا إلى قالب ور المختارةانه الناتجة صناعة السيارات في ارتباط السعة، فإننا ثم يقدر أقوى التدخل إشارة (الشكل 5A، 3 عمود الثالثة) وطرح عليه من الموجي الإدخال. صدر الموجي المتبقية إلى التكرار التالي كإدخال. واستمرت هذه العملية حتى علاقة للإشارة المتبقية مع مكتبة قالب لم تسفر عن واضحة قمة صناعة السيارات في الارتباط (الشكل 5A، الصف الخامس 5، 2 الثانية مؤامرة). وبعد انتهاء عملية إلغاء تدخل أعدنا بناء على تقدير الموجي من خلال الجمع بين جميع الإشارات المقدرة من كل تكرار (الشكل 6A). باستخدام عملية التحسين بناء على الأقل تقريب المربعات لتقليل الخطأ مربع يعني بين الموجي الأصلي وإشارة إعادة بنائها، قمنا بتحديث تقديراتنا لسعة، والمدة، وتوقيت النسبي للإشارات كود استشعار الفردية (الشكل 6B). نحن أيضا يقدر حجمالخلايا اكتشفت على أساس السعة من إشارات أجهزة الاستشعار الفردية المقدرة. ولتحقيق ذلك، نحن معايرة سعة إشارة كهربائية مع أحجام خلية قياس بصريا باستخدام الانحدار الخطي (الشكل 6B). مقارنة نتائجنا من رموز ميكروفلويديك مع المعلومات التي تم الحصول عليها من سجلت في نفس الوقت صور المجهر عالية السرعة يدل على أن حجم الخلية وسرعة يمكن أن تقاس بدقة، وهو ما يؤكد نتائجنا (الجدول 1). ويبين الشكل 6C صورة مجهرية عالية السرعة سجلت في نفس الوقت تستخدم للتحقق من صحة نتيجة فك.
للتدليل على استنساخ نتائجنا وأيضا أداء تكنولوجيا رموز ميكروفلويديك لتجهيز العينات الإنتاجية العالية، قمنا بتحليل إشارات كهربائية المقابلة ل> 1000 الخلايا. تم فك الإشارات تلقائيا في MATLAB عن طريق تشغيل الخوارزمية أوضحأعلاه وجرى تقييم دقة نتائجنا بمقارنة مباشرة نتائجنا مع البيانات البصرية من سجلت في نفس الوقت فيديو عالية السرعة. ويشير تحليلنا أن الإشارات الكهربائية من 96.15٪ من الخلايا (973/1012) تم فك الشفرة بدقة. معدل النجاح من أجل فك رموز اشارات الخلايا غير المتداخلة والمتشابكة هو 98.71٪ (688/697) و90،48٪ (285/315)، على التوالي.
الشكل 1. تصميم الجهاز رموز ميكروفلويديك أربع قنوات. (أ) micropatterned أقطاب في كل قناة ميكروفلويديك لتوليد رمز رقمي فريد من نوعه. التشكيل مقاومة بسبب تفاعلات متسلسلة من تدفق الخلايا مع أزواج الكهربائي يؤدي إلى النبضات الكهربائية. (ب) صورة مجهر الجهاز رموز ميكروفلويديك. أثناء عملية التصنيع، يتم محاذاة الركيزة الزجاج مع الترميز أقطاب السطح مع قنوات ميكروفلويديك PDMS تحت المجهر. (ج) عن قرب صورة من الأقطاب الكهربائية سطح مشفرة إنتاج سلاسل الذهب 7 بت: "1010110"، "0111111"، "0100010"، "0011000". الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. عملية التصنيع الدقيق. (أ) هي ملفقة القنوات ميكروفلويديك PDMS باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة (27). (ب) هي ملفقة الأقطاب السطح باستخدام عملية رفع قبالة. (ج) التخطيطي مستعرضة الجهاز النهائي. يتم محاذاة PDMS قنوات ميكروفلويديك والمستعبدين إلى الركيزة الزجاج مع أقطاب السطح. jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. إعداد التجريبية. باستخدام مضخة الحقنة، يتم تشغيل نظام التعليق الخلية من خلال الجهاز رموز ميكروفلويديك في معدل تدفق ثابت. يتم تطبيق 400 كيلو هرتز إشارة AC إلى القطب إشارة باستخدام مولد وظيفة. يتم تحويل الإشارات الحالية من الأقطاب الإيجابية والسلبية الاستشعار أولا إلى إشارات الجهد باستخدام اثنين من مكبرات الصوت transimpedance وتطرح من بعضها البعض باستخدام مكبر للصوت التفاضلية. يتم استخراج إشارة القطبين التفاضلية التي مكبر للصوت قفل في وثم أخذ عينات في جهاز الكمبيوتر لمعالجة الإشارات وفك التشفير. يستخدم سرعة عالية المجهر الضوئي لعملية سجل بصريا من الجهاز لأغراض التحقق من صحة والتوصيف.e.jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. الإشارات الكهربائية المسجلة من أجهزة الاستشعار الفردية والارتباط بهم. يتم إعطاء إشارات المسجلة وترابطها مع بعضها البعض لأربعة أجهزة استشعار نبض مقاوم رمز المضاعفة. الاستشعار 1 (أ)، وأجهزة الاستشعار 2 (ب)، وأجهزة الاستشعار 3 (ج) والاستشعار 4 (د) تم تصميمه لإنتاج الموجات الرقمية 7 بت "1010110"، "0111111"، "0100010"، و "0011000"، على التوالي . لكل جهاز استشعار، يوضح الشكل العلوي الذي إشارة تطبيع المسجلة من كل أجهزة الاستشعار مباريات بشكل وثيق مع المثالي تسلسل نبض مربع التي تم تصميمها جهاز استشعار لإنتاج. لكل الاستشعار، وتظهر اللوحة السفلى المسجلة إشارة استشعار9؛ ق الارتباط الذاتي وعبر الارتباط مع إشارات المقابلة لثلاثة أجهزة استشعار أخرى رمز المضاعفة في الشبكة. في جميع الحالات، يمكن أن تحدد بقوة ذروة الارتباط الذاتي لأن الرموز الرقمية من أجهزة الاستشعار الفردية صممت لتكون متعامدة على بعضها البعض. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. فك الموجي تداخل مع إلغاء تدخل على التوالي. في كل تكرار، ويرتبط الموجي المدخلات (1 العمود الواحد) مع مكتبة قالب مجمعة مسبقا لتحديد قالب معين ينتج عنه الحد الأقصى للسعة الارتباط (2 العمود الثاني). باستخدام هذا القالب محددة، تم تقدير أقوى إشارة التدخل على السعةوتوقيت المعلومات من ذروة الارتباط (3 العمود الثالث). ثم يتم طرح إشارة المقدرة من الموجي الأصلي، وإلغاء فعالية أقوى التدخل نظرا لأكبر خلية. وكرر العملية حتى يمكن تحديد أي ذروة الارتباط (أي معامل الارتباط <0.5) في إشارة المتبقية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. فك تحليل النتيجة. (أ) المكرر أساس إشارات المقدرة على خوارزمية التحسين التي تهدف للحصول على أفضل تناسب بين إعادة الإعمار والموجي سجلت الأصلي باستخدام تقريب المربعات الصغرى. (ب) في نهاية عملية التحسين،توقيت والسعة من إشارات معايرة تعكس بدقة المعلمات خلية تقاس سرعة عالية المجهر. (ج) التي سجلت في نفس الوقت صورة مجهرية عالية السرعة بالتحقق من صحة نتائجنا من مقاييس الكهربائية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| نوع القياس | CH1 ص (ميكرون) | CH2 ص (ميكرون) | CH3 ص (ميكرون) | CH4 ص (ميكرون) | Δt 1 (مللي ثانية) | Δt 2 (مللي ثانية) | Δt 3 (مللي ثانية) |
| الكهرباء | 8،010 | 6،490 | 5.300 | 6.550 | 0.465 | 1.705 | 0،744 |
| بصري | 8.320 | 6،770 | 5.680 | 7.040 | 0.375 | 1.625 | 0.750 |
الجدول 1. مقارنة بين المعلمات خلية قياس كهربائيا وبصريا من الشكل 6B. للتحقق من صحة تقديراتنا، قمنا بقياس بصريا أحجام الخلية من صورة مجهرية عالية السرعة. يتم قياس توقيت النسبي بين خلايا مختلفة بصريا من عدد الإطارات بين الخلايا في الفيديو عالية السرعة المسجلة في 8000 لقطة في الثانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد سبق أن أدرجت أجهزة استشعار نبض مقاوم متعددة في رقائق ميكروفلويديك 28، 29، 30، 31، 32. في هذه الأنظمة، وإما غير المضاعفة أجهزة استشعار نبض مقاوم 28، 29، 30، 31 أو أنها تتطلب أجهزة الاستشعار الفردية لتكون مدفوعة على ترددات مختلفة (32). في كلتا الحالتين، هناك حاجة الاتصالات الخارجية مخصصة لكل جهاز استشعار نبض مقاوم على رقاقة، وبالتالي لا يمكن أن تكون متكاملة لعدد كبير من أجهزة الاستشعار دون مزيد من الأجهزة التعقيد. ميزة هامة من رموز ميكروفلويديك هو أنه يتيح القراءة في وقت واحد من عدة أجهزة استشعار نبض مقاوم من انتاج واحد في جهاز بسيط. يمكننا تحقيق ذلك من خلال الاستفادة من متقنيات ultiplexing التي يشيع استخدامها في الاتصالات السلكية واللاسلكية لتصميم مجهريا أجهزة استشعار نبض مقاوم دمجها في أجهزة ميكروفلويديك. في جوهرها، لدينا التكنولوجيا تعتمد على رمز مضاعفة شبكة عدادات كولتر على الرقاقة عن طريق تصميم كل لإنتاج إشارة مميزة عندما تم الكشف عن الجسيمات. كل أجهزة الاستشعار مجهريا في شبكة تتكون من عدة أقطاب سطح متحد المستوى أمر في تكوينات مختلفة مثل هذا التفاعل المتسلسل المتدفقة الجسيمات مع هذه الأقطاب الكهربائية تنتج التحويرات مقاومة المتعامدة الطول الموجي. لاستيعاب غير متزامن تفاعل الجسيمات أجهزة الاستشعار، ونحن مصممة خصيصا لكل جهاز استشعار لإنتاج رموز الذهب 33، رموز رقمية شبه متعامد التي عادة ما تستخدم في الإرسال لشبكات الاتصالات CDMA. رموز الذهب الحفاظ على التعامد مستوى معينة حتى عندما يتم المنحرفة أنهم مع وجود اختلافات مرحلة العشوائية 34.
ميلرموز crofluidic هي قابلة للتطوير بسهولة. على الرغم من أننا قدم نتائج من نموذج ميكروفلويديك جهاز الشفرات مع أربعة أجهزة استشعار في هذه الورقة، والمزيد من أجهزة الاستشعار يمكن إدراجها في الجهاز عند مصمم لإنتاج الناتج اشارات مميزة عن بقية. طريقة واحدة لتوسيع شبكة استشعار لتصميم أجهزة الاستشعار على أساس أكبر مجموعات كود متعامد مع رموز رقمية أطول. تعد رموز متعامد مع أكثر من بت توفر كسب المعالجة العالي في فك التشفير ويمكن تمييزها عن بعضها البعض عندما يكون هناك تدخل. من ناحية أخرى، رموز يعد الذهب في الجهاز يعني أيضا أكبر حجم الاستشعار عن بعد، مما يزيد من عدد المتوقع من أجهزة الاستشعار التدخل. وبالمثل، مما يزيد من عدد من أجهزة الاستشعار لكثافة عينة معينة من شأنها أن تؤدي إلى المزيد من الجسيمات تداخل بسبب زيادة في حجم الاستشعار العام. على هذا النحو، وكثافة الجزيئات في العينة هي معلمة الحرجة التي تحتاج إلى النظر فيها في استخدام التكنولوجيا رموز ميكروفلويديك. الحد الأقصى صكثافة المادة التي لا يمكن حلها (قياسا مع القدرة قناة شبكة الاتصالات CDMA) تعتمد على عدة عوامل مثل الإشارات الفردية أجهزة الاستشعار وعلاقتها، نظام فك والتخطيط للجهاز ميكروفلويديك، ومستوى الضوضاء الإلكترونية. اعتمادا على التطبيق، وعينة يمكن تخفيفه للوصول إلى كثافة الجسيمات التي تنتج نسبة الخطأ المقبول.
من منظور معالجة الإشارات، فك من الطول الموجي الوقت من جهاز رموز ميكروفلويديك ليس كثافة حسابيا باستخدام النظم الحالية كما يتضح من حقيقة أن الاتصالات الهاتف الخليوي على شبكة CDMA يمكن demultiplexed في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، فإن الأحداث المادية ليكون فك الشفرة في أجهزة ميكروفلويديك يحدث أبطأ بكثير من معدل انتقال بعض الشيء في مجال الاتصالات الهاتف الخليوي مما أتاح لنا استخدام أكثر تقدما والخوارزميات مثل SIC وعمليات التحسين، والتي نستخدمها لحل تكرارا تداخل الاشتراكية تستغرق وقتا طويلاgnals من أجهزة الاستشعار.
مجتمعة، رموز ميكروفلويديك هو تنوعا، قابلة للتكنولوجيا الاستشعار الالكترونية التي يمكن دمجها بسهولة في مختلف الأجهزة ميكروفلويديك لتحقيق المقايسات الكمية من خلال تتبع الجسيمات كما يتم معالجتها على رقاقة. التكنولوجيا من السهل جدا لتنفيذ، لأن (1) هو بسيط جدا من وجهة نظر الأجهزة (2) وهو متوافق مباشرة مع الطباعة الحجرية الناعمة (3) أنه يوفر الإلكترونية للقراءة خارج المباشر دون أي مكون نشط على الرقاقة، و (4) لأنه يعتمد على خوارزميات حسابية بسيطة لمعالجة الإشارات وتفسير البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 98% Sulfuric Acid | BDH Chemicals | BDH3074-3.8LP | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BDH Chemicals | BDH7690-3 | |
| Trichlorosilane | Aldrich Chemistry | 235725-100G | |
| NR9-1500PY Negative Photoresist | Furuttex | ||
| Resist Developer RD6 | Furuttex | ||
| Acetone | BDH Chemicals | BDH1101-4LP | |
| SU-8 2015 Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y010200 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| Isopropyl Alcohol | BDH Chemicals | BDH1133-4LP | |
| RPMI 1640 | Corning Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Amresco | K952-100ML | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CM | |
| PHD 22/2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2001 | |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instrument | ||
| HF2TA Current Amplifier | Zurich Instrument | ||
| Eclipse Ti-U Microscope | Nikon Corporation | ||
| DS-Fi2 High-Definition Color Camera | Nikon Corporation | ||
| v7.3 High-speed Camera | Phantom | ||
| PCIe-6361 Data Acquisition Board | National Instruments | 781050-01 | |
| BNC-2120 Shielded Connector Block | National Instruments | 777960-01 | |
| PX-250 Plasma Treatment System | Nordson MARCH |
References
- De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Res. 46 (3), 907-919 (2012).
- Vives-Rego, J., Lebaron, P., Nebe-von Caron, G. Current and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 24 (4), 429-448 (2000).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Cantón, R., Nombela, C., Sánchez-Pérez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Toner, M., Irimia, D. Blood-on-a-chip. Annu Rev Biomed Eng. 7, 77-103 (2005).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Current Opin Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nat Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Cermak, N., et al. High-throughput measurement of single-cell growth rates using serial microfluidic mass sensor arrays. Nat Biotechnol. , (2016).
- Gossett, D., et al. Label-free cell separation and sorting in microfluidic systems. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3249-3267 (2010).
- Tsutsui, H., Ho, C. Cell separation by non-inertial force fields in microfluidic systems. Mech Res Commun. 36 (1), 92-103 (2009).
- Edwards, T. L., Gale, B. K., Frazier, A. B. A microfabricated thermal field-flow fractionation system. Anal Chem. 74 (6), 1211-1216 (2002).
- Wang, M. M., et al. Microfluidic sorting of mammalian cells by optical force switching. Nat Biotechnol. 23 (1), 83-87 (2005).
- Shields, C. W. IV, Reyes, C. D., López, G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip. 15 (5), 1230-1249 (2015).
- Gawad, S., Schild, L., Renaud, P. Micromachined impedance spectroscopy flow cytometer for cell analysis and particle sizing. Lab Chip. 1 (1), 76-82 (2001).
- Haandbæk, N., Bürgel, S. C., Heer, F., Hierlemann, A. Characterization of subcellular morphology of single yeast cells using high frequency microfluidic impedance cytometer. Lab Chip. 14 (2), 369-377 (2014).
- Bayley, H., Martin, C. Resistive-pulse sensing-from microbes to molecules. Chem Rev. 100 (7), 2575-2594 (2000).
- Polling, D., Deane, S. C., Burcher, M. R., Glasse, C., Reccius, C. H. Coded electrodes for low signal-noise ratio single cell detection in flow-through impedance spectrophy. Proceedings of uTAS. (The 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences), Groningen, The Netherlands, , 3-7 (2010).
- Javanmard, M., Davis, R. W. Coded corrugated microfluidic sidewalls for code division multiplexing. IEEE Sensors J. 13 (5), 1399-1400 (2013).
- Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: a robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
- Emaminejad, S., Talebi, S., Davis, R. W., Javanmard, M. Multielectrode sensing for extraction of signal from noise in impedance cytometry. IEEE Sensors J. 15 (5), 2715-2716 (2015).
- Spencer, D., Caselli, F., Bisegna, P., Morgan, H. High accuracy particle analysis using sheathless microfluidic impedance cytometry. Lab Chip. 16 (2016), 2467-2473 (2016).
- Liu, R., Wang, N., Kamili, F., Sarioglu, A. Microfluidic CODES: a scalable multiplexed electronic sensor for orthogonal detection of particles in microfluidic channels. Lab Chip. 16 (8), 1350-1357 (2016).
- Buehrer, R. Code Division Multiple Access (CDMA). Synthesis Lectures on Communications. 1 (1), 1-192 (2006).
- Proakis, J. Digital Communications. , McGraw-Hill. New York, NY. (1989).
- Patel, P., Holtzman, J. Analysis of a simple successive interference cancellation scheme in a DS/CDMA system. IEEE J Sel Areas Commun. 12 (5), 796-807 (1994).
- Hui, A., Letaief, K. Successive interference cancellation for multiuser asynchronous DS/CDMA detectors in multipath fading links. IEEE Trans Commun. 46 (3), 384-391 (1998).
- Whittle, P. Prediction and regulation by linear least-square methods. J Macroecon. 7 (1), 126 (1985).
- Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 335-373 (2001).
- Zhe, J., Jagtiani, A., Dutta, P., Hu, J., Carletta, J. A micromachined high throughput Coulter counter for bioparticle detection and counting. J Micromech Microeng. 17 (2), 304-313 (2007).
- Song, Y., Yang, J., Pan, X., Li, D. High-throughput and sensitive particle counting by a novel microfluidic differential resistive pulse sensor with multidetecting channels and a common reference channel. Electrophoresis. 36 (4), 495-501 (2015).
- Watkins, N., et al. Microfluidic CD4+ and CD8+ T lymphocyte counters for point-of-care HIV diagnostics using whole blood. Sci Transl Med. 5 (214), 214ra170 (2013).
- Chen, Y., et al. Portable Coulter counter with vertical through-holes for high-throughput applications. Sensor Actuat B-Chem. 213, 375-381 (2015).
- Jagtiani, A., Carletta, J., Zhe, J. An impedimetric approach for accurate particle sizing using a microfluidic Coulter counter. J Micromech Microeng. 21 (4), 045036 (2011).
- Gold, R. Optimal binary sequences for spread spectrum multiplexing (Corresp). IEEE Trans. Inform. Theory. 13 (4), 619-621 (1967).
- Dinan, E., Jabbari, B. Spreading codes for direct sequence CDMA and wideband CDMA cellular networks. IEEE Commun Mag. 36 (9), 48-54 (1998).
