Summary
Vi demonstrerer en mikrofluid platform med en integreret overflade elektrode, der kombinerer resistiv puls sensing (RPS) med code division multiple access (CDMA), at multiplekse påvisning og dimensionering af partikler i flere mikrofluidkanaler.
Abstract
Mikrofluid behandling af biologiske prøver typisk involverer differentielle manipulationer af suspenderede partikler under forskellige kraftfelter for at rumligt fraktionering prøven baseret på en biologisk egenskab af interesse. For den resulterende rumlige fordeling skal anvendes som assay-udlæsning, er mikrovæskeanordninger ofte udsat for mikroskopisk analyse kræver kompleks instrumentering med højere omkostninger og reduceret bærbarhed. For at løse denne begrænsning, har vi udviklet et integreret elektronisk sensing teknologi til multiplex detektering af partikler på forskellige steder på en mikrofluid chip. Vores teknologi, kaldet Mikrofluid KODER, kombinerer Resistive Pulse Sensing med Code Division Multiple Access til at komprimere 2D geografisk information til et 1D elektrisk signal. I dette papir, præsenterer vi en praktisk demonstration af Mikrofluid KODER teknologi til at opdage og størrelse dyrkede kræftceller fordelt over flere mikrofluid kanaler. Somvalideres af high-speed mikroskopi, kan vores teknologi præcist analysere tætte cellepopulationer alle elektronisk uden behov for en ekstern instrument. Som sådan kan de Mikrofluid KODER potentielt muliggøre billige integrerede enheder lab-on-a-chip, der er velegnet til point-of-care test af biologiske prøver.
Introduction
Nøjagtig påvisning og analyse af biologiske partikler, såsom celler, bakterier eller vira suspenderet i væske er af stor interesse for en række applikationer 1, 2, 3. Godt matchede i størrelse, mikrovæskeanordninger tilbyde unikke fordele til dette formål såsom højfølsom, blid prøve manipulation og velkontrolleret mikromiljø 4, 5, 6, 7. Desuden kan mikrovæskeanordninger være udformet til at benytte en kombination af fluid dynamik og kraftfelter til passivt at fraktionere en heterogen population af biologiske partikler på basis af forskellige egenskaber 8, 9, 10, 11, 12. I disse enheds, kan den resulterende fordeling partikel anvendes som udlæsning men geografisk information er typisk kun tilgængelige via mikroskopi, hvilket begrænser den praktiske anvendelighed af mikrofluidanordning ved at binde den til et laboratorium infrastruktur. Derfor er en integreret sensor, der let kan rapportere partikler 'Spatiotemporal kortlægning, som de er manipuleret på en mikrofluidanordning, kan potentielt aktivere billige, integrerede enheder lab-on-a-chip, der er særligt attraktive for afprøvning af prøver i mobil , ressource-begrænset indstillinger.
Tynde film elektroder er blevet anvendt som integrerede sensorer i mikrovæskeanordninger til forskellige anvendelser 13, 14. Resistive Pulse Sensing (RPS) er særligt attraktivt for integreret sensing af små partikler i mikrofluide kanaler, da det giver en robust, følsom, og high-throughput afsløring mekanisme direkte fra elektriske målinger 15. I RPS, impedansen modulation mellem et par elektroder, nedsænket i en elektrolyt, der anvendes som et middel til at detektere en partikel. Når partiklen passerer gennem en åbning, dimensioneret på rækkefølgen af partiklen, er antallet og amplitude af forbigående impulser i den elektriske strøm bruges til at tælle og størrelse partikler hhv. Desuden kan føleren geometri udformes med en fotolitografisk beslutning at forme resistive puls bølgeformer for at øge følsomheden 16, 17, 18, 19 eller anslå lodrette placering af partikler i mikrofluidkanaler 20.
Vi har for nylig indført en skalerbar og enkel multiplex resistive puls sensing teknologi kaldet Mikrofluid Coded ortogonal Detection af elektrisk Sensing (Mikrofluid KODER) 21. Mikrofluid KODER afhængig af enforbundne net af resistive puls sensorer, der hver består af et array af elektroder mikrobearbejdet at modulere ledning i en unik, adskiller måde, således at multiplexing. Vi har specielt designet hver sensor til frembringelse ortogonale elektriske signaler svarende til de digitale koder, der anvendes i code division multiple access 22 (CDMA) telekommunikationsnetværk, således at individuelle resistive puls sensor signal kan entydigt udvundet fra en enkelt output bølgeform, selv om signalerne fra forskellige sensorer blande sig. På denne måde, vores teknologi komprimerer 2D geografisk information af partikler til et 1D elektrisk signal, der tillader overvågning af partikler på forskellige steder på et mikrofluid chip, samtidig med at både enheds- og system-niveau kompleksitet til et minimum.
I dette papir, præsenterer vi en detaljeret protokol til forsøg og beregningsmetoder, der er nødvendige for at bruge Mikrofluid KODER teknologi, samt representative resultater fra dens anvendelse i analyse af simulerede biologiske prøver. Brug af resultater fra en prototype-enhed med fire multiplex sensorer som et eksempel for at forklare den teknik, giver vi protokoller om (1) at mikrofabrikation proces for at skabe mikrofluidenheder med Mikrofluid KODER teknologi, (2) en beskrivelse af forsøgsopstillingen herunder elektronisk, optisk, og strømningsteknisk hardware, (3) computer algoritme til dekodning forstyrrende signaler fra forskellige sensorer, og (4) resultaterne fra detektering og analyse af kræftceller i mikrofluide kanaler. Vi mener, at anvender den detaljerede protokollen beskrevet her, kan andre forskere anvende vores teknologi for deres forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design af Kodning elektroder
Bemærk: Figur 1A viser 3-D strukturen af mikromønstrede elektroder.
- Designe et sæt af fire 7-bit gold-koder til kodning af mikrofluidkanaler 23.
- Construct to lineære feedback skift-registre (LFSRs), der hver repræsenterer en primitiv polynomium.
- Brug LFSRs at generere en foretrukken par 7-bit m -sequences.
- Cyklisk flytte foretrukne par m -sequences og tilføje dem i mod 2 at generere fire forskellige gold-koder.
- Design layoutet af de kodende elektroder (figur 1b).
- Placer tre elektrode terminaler, der repræsenterer de positive, negative og reference elektroder på tre hjørner.
- Rute positive og negative elektrode spor på modsatte sider af hvert mikrofluid kanal.
- Forlæng positive og negative elektroder i detmikrofluid kanaler som elektrode fingre, efter entydigt tildelt Gold kode (figur 1c).
- Placer referenceelektroden i mellem de positive og negative elektrodematerialer fingre.
- Placer positive og negative elektrodematerialer spor langt fra den yderste referenceelektrode fingre for at minimere elektrisk ledning uden den kodende region.
2. mikrofabrikation af Surface Elektroder
Bemærk: Figur 2b viser fremstillingsproces overfladeelektroder.
- Rense en 4-inch borsilikatglas wafer i en Piranha-opløsning (98% svovlsyre: 30% hydrogenperoxid = 5: 1) ved 120 ° C i 20 minutter for at fjerne alle de organiske forureninger. Derefter placere waferen på en 200 ° C varm plade i 20 min for at fjerne resterende vand.
- Overfør skiven til en spinner. Dispensér 2 mL negativ fotoresist på skiven og spin skiven med en hastighed på 3, 000 rpm i 40 s til ensartet overtrækning af wafer med en 1,5-um fotoresistlag.
- Placer skiven på en 150 ° C varm plade og bage det spundne fotoresist i 1 min.
- Udsætte fotoresist til 365-nm UV-lys (225 mJ / cm2) gennem en chrommasken anvendelse af en maske aligner.
- Placer skiven på en 100 ° C varm plade og bage den eksponerede fotoresist i 1 min.
- Udvikle fotoresist ved neddypning af skiven i en fotoresist udvikler (RD6) i 15 s. spray forsigtigt deioniseret (DI) vand og vask skiven. Tør ved at blæse komprimeret kvælstof.
- Placer skiven med mønstret fotoresist i en e-beam metal fordamper, og deponere en 20-nm-tyk krom film, efterfulgt af en 80-nm-tyk guldfilm på skiven ved en base tryk på 3 × 10 -6 Torr med en deposition på 1 a / s.
- Nedsænkes metalbelagte wafer i acetone i et ultralydsbad sæt ved en frekvens på 40 kHz med 100% amplitude i 30 minutter ved stue temperamentstemet at ætse den underliggende fotoresist og fuldføre lift-off processen.
- Tern skiven i mindre stykker under anvendelse af en konventionel udskæringssav.
3. Fremstilling af SU-8 Mold for mikrofluidkanaler
Bemærk: Figur 2a viser fremstillingsprocessen af formen for mikrofluidkanaler.
- Rengør og bage en 4 tommers siliciumskive anvendelse af den samme procedure som beskrevet i 2.1.
- Overfør skiven til en spinner. Hæld 4 ml fotoresist på skiven. Coat wafer med fotoresist.
- Spin wafer ved 500 rpm i 15 s.
- Spin wafer ved 1.000 rpm i 15 s.
- Spin wafer ved 3000 rpm i 60 s for at opnå en ensartet overtrukket 15-um tykt fotoresistlag.
- Anbring wafer opad på en renrum tørre gennemvædet i acetone og fjerne den resterende fotoresist fra bagsiden og kanterne af skiven.
- Overfør skiven på en varm plspiste til blød bagning. Først bage wafer ved 65 ° C i 1 min. Derefter hurtigt flytte skiven til en 95 ° C varm plade og bages i 2 min.
- Udsætte fotoresist til 365-nm UV-lys (180 mJ / cm2) gennem en krom maske ved anvendelse af en maske aligner.
- Bage wafer efter udsættelse ved 65 ° C i 1 minut og derefter ved 95 ° C i 2 min.
- Fordyb wafer i bygherren og forsigtigt ryste beholderen i 3 min. Derefter skylles vaflen med isopropanol alkohol (IPA) og tør det ved at blæse komprimeret nitrogen. Hvis en hvidfarvet rest vises på skiven, nedsænkes den i udvikleren igen og udvikle i længere tid og tør.
- Bag skiven på en 200 ° C varm plade i 30 minutter for at tørre det fuldstændigt.
- Måle tykkelsen af den mønstrede fotoresist under anvendelse af et profilometer på forskellige steder i hele waferen for at sikre ensartethed.
- Silanize formen wafer ved anvendelse af teknikken ifølge dampaflejring. Tilsæt 200 pi af trichlorosilane i en petriskål og sted i vakuum sammen med SU-8 skimmel wafer i 8 timer.
4. Montering af Mikrofluid KODER Device
- Placer 4-tommer silicium wafer med formen i en 150-mm petriskål, og ordne det ved at tape fra kanterne.
- Bland polydimethylsiloxan (PDMS) præ-polymer og tværbindingsmiddel i et forhold på 10: 1, og hæld 50 g af blandingen i petriskålen. Anbring petriskålen i vakuum til afgasse blandingen i 1 time, og derefter hærde det i en ovn ved 65 ° C i mindst 4 timer (figur 2A).
- Klip det hærdede PDMS lag ved hjælp af en skalpel og flå det af formen wafer ved hjælp af en pincet. Størrelsen af proof-of-principle enhed er ca. 20 mm x 7 mm. Derefter hulle med en diameter på 1,5 mm gennem PDMS til indløb og udløb af mikrofluid kanal med en biopsi puncher.
- Rengør mønstrede side af PDMS del ved at placere it på en ren-rum tape.
- Rengør glasset substrat med overfladeelektroder ved at skylle den med acetone, IPA, DI vand og tør bruge komprimeret kvælstof.
- Aktivere overfladerne af PDMS og glassubstratet i oxygenplasma i 30 s med den mikrobearbejdet side af hver del opad i en RF plasma generator sat til 100 mW.
- Juster PDMS mikrofluid kanal med overfladeelektroder på glassubstratet ved anvendelse af et optisk mikroskop og derefter bringe de to plasma-aktiverede overflader i fysisk kontakt.
- Bag apparatet på en 70 ° C varm plade i 5 minutter, med glasset side vendende varmepladen.
- Tilslut kontaktpuderne af elektroderne med ledninger ved lodning.
5. Fremstilling af de simulerede biologiske prøve
- Kultur de HeyA8 humane ovariecancerceller i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin i 5% CO2-atmosfære ved 37 ° Cindtil de når 80% sammenløb.
- Aspireres mediet fra kulturen kolben under anvendelse af en glaspipette. Dispensere og derefter aspirer 1x phosphatpufret saltvand (PBS) for at vaske cellerne.
- Cellerne inkuberes i 2 ml 0,05% (vægt / volumen) trypsin-opløsning i 2 min ved 37 ° C for at suspendere adhærente celler. Derefter tilsættes 4 ml af kulturen medier til at neutralisere trypsin.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 100 x g i 5 minutter for at pelletere cellerne i et reagensglas. Derefter aspirat supernatant fuldstændigt.
- Re-suspendere cellerne i 1-2 mL 1x PBS ved forsigtigt pipettering op og ned til mekanisk dissociere celle klumper.
- Tegn en lille mængde cellesuspension i en pipette og tælle antallet af celler under anvendelse af hæmocytometer.
- Fortynd cellesuspensionen med PBS for at forberede en prøve med endelig cellekoncentration på 10 5 -10 6 celler / ml.
6. Kørsel af Mikrofluid KODER Device
Bemærk: Fifigur 3 viser forsøgsopstillingen.
- Placer Mikrofluid KODER enhed på scenen af et optisk mikroskop.
- Påfør en 400 kHz sinusbølge til referenceelektroden på chippen ved hjælp af en elektronisk funktion generator.
- Tilslut positive og negative følerelektroder til to uafhængige trans-impedans forstærkere til at konvertere strømsignaler fra hver til spændingssignaler.
- Fratræk den positive detektionselektrode spændingssignal fra den negative elektrode sensing spændingssignal ved anvendelse af en differential spændingsforstærker for at opnå en bipolar signal.
- Brug et high-speed kamera til optisk rekord drift af enheden for validering og karakterisering formål.
- Kør cellesuspensionen gennem Mikrofluid KODER enheden ved en konstant strømningshastighed (50-1,000 uL / h) ved anvendelse af en sprøjtepumpe.
- Mål impedans modulationssignal under anvendelse af en lock-in forstærker.
- Tilslut henvisningen AC signal til dommerenreferencerente input af lock-in forstærker. Tilslut forskellen bipolar signal til lock-in forstærker som indgangssignal.
- Finde et RMS amplitude af differentialsignalet fra lock-in forstærker output.
- Prøve den lock-in forstærker udgangssignal ved 1 MHz hastighed ind i en computer via en dataopsamling bord til yderligere analyse.
7. Behandling af følersignaler
- Overfør optagne elektriske data i Matlab for efterbehandling og afkodning.
- Filtrer det optagne signal i det digitale domæne under anvendelse af et Butterworth-filter (MATLAB indbyggede funktion) for at fjerne den højfrekvente støj (> 2,5 kHz).
- Generer en skabelon kode bibliotek fra sensorsignaler.
- Identificer repræsentative ikke-overlappende kode signaler svarende til hver sensor i enheden, og udtrække disse signal blokke fra datasættet som separate bølgeform vektorer.
- Normalisér hver skabelon kode bølgeform vektoraf sin magt. Brug MATLAB indbyggede funktion (bandpower) for at måle signaleffekt.
- Brug MATLAB funktion (resample) for at udvide skabelonen bibliotek ved digitalt at skabe versioner af normaliserede kodesignaler med varierende varigheder for at imødekomme variationer i cellen flow hastighed over elektroderne.
- Identificer de signal blokke, der svarer til sensor aktivitet (tærskel: SNR> 12 dB) i den filtrerede bølgeform. Waveform med SNR under tærskelværdien ville blive behandlet som støj.
- Afkode individuelle blokke af sensor aktivitet i det optagne signal ved anvendelse af en iterativ algoritme baseret på den successive interferensundertrykkelse, en teknik, der almindeligvis anvendes i multi-user CDMA kommunikationsnetværk 24, 25.
- Beregn krydskorrelationen af hvert signal blok med alle skabelonerne i biblioteket ved hjælp af glidende dot produkt.
- Identificere den skabelon, producerer largest autokorrelation peak at bestemme den dominerende individuelle sensor kodesignal. Notér både tid og amplitude af toppen autokorrelation.
- Konstruere et estimat sensor kodesignal ved at skalere den identificerede kode skabelon baseret på den målte autokorrelation peak amplitude og timing information (bestemt i trin 7.5.2).
- Fratræk den anslåede sensor kodesignal fra de oprindelige data.
- Gentage processen fra 7.5.1, indtil den resterende signal ikke ligner noget signal i skabelonen biblioteket, matematisk defineret som korrelationskoefficienten er mindre end 0,5.
- Tilpas indledende sensor signal skøn fra trin 7.5 ved hjælp af en optimeringsproces.
- Rekonstruere signalet ved tilsætning estimerede individuelle sensorsignaler fra hver iteration.
- Fej amplituden, varighed og timingen af de enkelte sensor signaler omkring de oprindelige skøn at producere den bedste pasform med den indspillede elektriske signalbaseret på mindst kvadraters approksimation 26.
- Konverter amplituder estimerede sensorsignaler i celle størrelse ved at kalibrere elektriske signaler mod optiske billeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrofluidapparat KODER enhed bestående af fire sensorer fordelt over fire mikrofluidkanaler er vist i figur 1b. I dette system blev tværsnittet af hver mikrofluid kanal designet til at være tæt på størrelsen af en celle, således at (1) flere celler kan ikke passere over elektroderne i parallel og (2) celler forbliver tæt på elektroderne forøgelse af følsomheden . Hver sensor er designet til at generere et unikt 7-bit digital kode. Indretningen blev derefter testet under anvendelse af en cellesuspension. Optagne elektriske signaler svarende til fire individuelle sensorer er vist med tilhørende ideelle digitale koder i figur 4. Indspillede signaler tæt op med de ideelle firkantede pulser, mens små afvigelser findes. Sådanne afvigelser skyldes en kombination af flere faktorer, herunder ikke-ensartet elektrisk felt mellem koplanare elektroder, kobling mellem forskellige elektrodepar, kugleformceller, såvel som den konstante strømningshastighed af celler i mikrofluidkanaler. Vi skabte en skabelon bibliotek baseret på de recoded sensorsignaler. Ved at samkøre de optagne signaler med alle de skabeloner i biblioteket, vi bestemt en skabelon, der er produceret til det maksimale auto-korrelation (figur 4). Da de digitale koder for mikrofluidkanaler er designet til at være ortogonale på hinanden, kan en dominerende autokorrelation peak håndfast identificeres i denne proces. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde, kunne vi beregningsmæssigt bestemme mikrofluid kanal cellen passeret, varigheden af sensorsignalet, og derfor strømningshastigheden af cellen.
Den Mikrofluid KODER teknologi kan løse situationer, hvor flere celler samtidigt interagere med kodning elektroder. Når sådanne overlapninger forekomme, signalerne fra individuelle sensorer interfererer og den resulterende bølgeform kan ikke umiddelbart forbundet med nogenenkelt skabelon svarende til en specifik sensor. Præcist afkode sådanne overlappende signaler er særlig vigtig for pålidelig behandling high-density prøver, hvor interferens er mere tilbøjelige til at forekomme. For at løse overlappende begivenheder, udviklede vi en iterativ algoritme baseret på en successiv interferens aflysning (SIC) skema 24, 25, der typisk anvendes til flerbrugerdetektering i CDMA kommunikationsnetværk. Figur 5 viser, hvordan SIC algoritmen implementeres i løsningen af en bølgeform, der førte fra fire overlappende celler i fire forskellige mikrofluide kanaler. I hver iteration, vi først bestemt den dominerende auto-korrelation top (figur 5a, 2. kolonne), svarende til det stærkeste interfererende signal, ved at korrelere indgangsbølgeformen (figur 5a, 1 m-søjle) med skabelonen biblioteket. Baseret på den valgte skabelon og than de heraf autokorrelation amplitude, vi derefter estimeret den stærkeste interfererende signal (figur 5a, 3. kolonne) og trækkes det fra input bølgeform. Den resterende bølgeform blev videregivet til den næste iteration som input. Denne proces fortsættes, indtil korrelationen af det resterende signal med skabelonen biblioteket gav ikke en klar top autokorrelation (figur 5a, 5 th rækken, 2. plot). Efter afslutning af interferens annulleringsprocessen, vi rekonstrueret et skøn over den bølgeform ved at kombinere alle de anslåede signaler fra hver iteration (figur 6a). Ved anvendelse af en optimeringsproces baseret på en mindste kvadraters approksimation at minimere middelkvadratfejlen mellem den oprindelige bølgeform og rekonstruerede signal, opdateret vores estimater for amplitude og relative timing af individuelle sensor kodesignaler (figur 6b). Vi vurderede også størrelsen afcellerne detekteres på basis af amplituden af de estimerede individuelle sensorsignaler. For at opnå dette, vi kalibrerede det elektriske signal amplituder med optisk målte cellestørrelser anvendelse af lineær regression (figur 6b). En sammenligning af vores resultater fra Mikrofluid KODER med oplysningerne fra de samtidig indspillede højhastigheds-mikroskop billeder viser, at cellen størrelse og hastighed kan måles nøjagtigt, som validerer vores resultater (tabel 1). Figur 6c viser samtidig indspillet høj hastighed mikroskopi billede bruges til validering af afkodning resultat.
For at demonstrere reproducerbarheden af vores resultater og også ydeevnen af Mikrofluid KODER teknologi til en high-throughput prøve forarbejdning, analyserede vi elektriske signaler svarende til> 1000 celler. Signalerne blev automatisk dekodet i MATLAB ved at køre algoritmen forklaredeovenfor, og nøjagtigheden af vores resultater blev vurderet ved direkte at sammenligne vores resultater med optiske data fra samtidigt registreret high-speed video. Vores analyse viser, at elektriske signaler fra 96,15% af celler (973/1012) præcist blev afkodet. Succes sats for dekodning ikke-overlappende og overlappende celle signaler er 98,71% (688/697) og 90,48% (285/315), hhv.
Figur 1. Design af fire kanaler Mikrofluid KODER enhed. (A) Elektroder i hvert mikrofluid kanal mikromønstrede at generere en unik digital kode. Impedansen modulation grund sekventielle interaktioner af strømmende celler med elektrodepar fører til elektriske impulser. (B) En mikroskop billede af den mikro KODER enheden. Under produktionsprocessen, er glassubstrat med kodende overfladeelektroder linie med PDMS mikrofluid kanaler under et mikroskop. (C) Et close-up billede af kodede overfladeelektroder producerer 7-bit Guld sekvenser: "1.010.110", "0.111.111", "0.100.010", "0.011.000". Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. mikrofabrikation proces. (A) PDMS mikrofluide kanaler er fremstillet ved hjælp blød litografi 27. (B) De overfladeelektroder er fremstillet ved anvendelse af en lift-off processen. (C) En skematisk tværsnit af den endelige indretning. PDMS mikrofluidkanaler linie og bundet til glassubstratet med overfladeelektroder. jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Eksperimentel opsætning. Ved hjælp af en sprøjtepumpe, er cellesuspensionen løbe gennem Mikrofluid KODER enheden ved en konstant strømningshastighed. En 400 kHz AC påtrykkes referenceelektroden under anvendelse af en funktion generator. Aktuelle signaler fra positive og negative sensing elektroder er først omdannes til spændingssignaler med to transimpedance forstærkere og trækkes fra hinanden ved hjælp af en differentialforstærker. Det differentielle bipolar signal ekstraheres med en lock-in forstærker og derefter udtages i en computer til signalbehandling og dekodning. High-speed optisk mikroskopi anvendes til optisk registrering drift af indretningen til validerings- og karakteriseringsformål.e.jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Recorded elektriske signaler fra individuelle sensorer og deres korrelationer. Indspillede signaler og deres korrelation med hinanden er givet for fire kode-multiplex resistiv puls sensorer. Føler 1 (a), blev sensor 2 (b), sensor 3 (c), og sensor 4 (d) designet til at producere 7-bit digitale kurveformer "1.010.110", "0.111.111", "0.100.010", og "0.011.000", henholdsvis . For hver sensor, den øverste figur viser, at normaliserede signal registreres fra hver sensor passer tæt sammen med den ideelle firkantede pulssekvens, at sensoren er designet til at producere. For hver sensor, det nederste panel viser indspillet følersignal9; s autokorrelation og krydskorrelation med signaler svarende til tre andre kode-multipleksede sensorer i netværket. I alle tilfælde kan en peak autokorrelation håndfast identificeres, fordi de digitale koder fra individuelle sensorer er designet til at være vinkelret på hinanden. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Afkodning en overlappende bølgeform med successiv interferens annullering. I hver iteration, er input bølgeform (1 st-søjle) korreleret med den formonterede skabelon bibliotek for at identificere det specifikke skabelon, der medfører den maksimale korrelation amplitude (2 nd kolonne). Ved hjælp af denne bestemt skabelon, er det stærkeste interferenssignal estimeret baseret på amplitudenog timing information fra korrelationen top (3. kolonne). Den estimerede signal subtraheres derefter fra den oprindelige bølgeform, effektivt annullerer den stærkeste interferens på grund af den største celle. Processen gentages, indtil der ikke korrelationsspidsen kan bestemmes (dvs. korrelationskoefficienten <0,5) i den resterende signal. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Afkodning resultat analyse. (A) anslåede signaler raffineret baseret på en optimering algoritme, der har til formål at opnå den bedste pasform mellem den rekonstruerede og den oprindelige indspillede bølgeform ved hjælp af mindste kvadraters tilnærmelse. (B) Ved afslutningen af optimeringsprocessen,timingen og amplituden af kalibrerede signaler præcist afspejler cellens parametre målt ved høj hastighed mikroskopi. (C) Samtidig indspillet høj hastighed mikroskopi billede validerer vores resultater fra elektriske målinger. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Måling typen | r CH1 (um) | R ch2 (um) | r CH3 (um) | r CH4 (um) | AT 1 (ms) | AT 2 (ms) | AT 3 (ms) |
| Elektrisk | 8,010 | 6.490 | 5.300 | 6.550 | 0,465 | 1,705 | 0,744 |
| Optisk | 8.320 | 6.770 | 5.680 | 7.040 | 0,375 | 1,625 | 0.750 |
Tabel 1. Sammenligning af elektrisk og optisk målte celle parametre figur 6b. For at validere vores skøn, vi optisk målt cellen størrelser fra højhastighedstog mikroskopi billede. Relative timing mellem forskellige celler er optisk målt fra antallet af rammer mellem cellerne i high-speed video optaget ved 8.000 billeder i sekundet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere resistive puls sensorer er tidligere blevet indarbejdet i mikrofluide chips 28, 29, 30, 31, 32. I disse systemer blev resistive puls sensorer enten ikke multiplekset 28, 29, 30, 31 eller de krævede individuelle sensorer til at blive drevet ved forskellige frekvenser 32. I begge tilfælde var behov dedikerede eksterne forbindelser for hver resistiv puls sensor på chippen og dermed et stort antal sensorer kunne ikke integreres uden større hardware kompleksitet. Den vigtige fordel ved Mikrofluid KODER er, at det tillader samtidig læsning af flere resistive puls sensorer fra en enkelt output i en enkel enhed. Vi opnår dette ved at udnytte multiplexing teknikker almindeligvis anvendes i telekommunikation til at designe mikrobearbejdet resistiv puls sensorer integreret i mikrofluidenheder. I det væsentlige, vores teknologi er afhængig af code-multiplexing et netværk af on-chip Coulter tællere ved at designe hver at producere et skelnes signal, når der registreres en partikel. Hver mikrobearbejdet sensor i netværket består af flere koplanare overfladeelektroder bestilt i forskellige konfigurationer, således at den sekventielle vekselvirkning af strømmende partikler med disse elektroder frembringer ortogonale impedans modulationer bølgeformer. Til at rumme asynkron partikel-sensor interaktion, vi specifikt designet hver sensor til frembringelse af gold-koder 33, pseudo-ortogonal digitale koder, der typisk anvendes i uplink af CDMA telekommunikationsnetværk. Gold koder opretholde et vist niveau orthogonality selv når de er justeret forkert med tilfældig faseforskelle 34.
microfluidic KODER er let skalerbar. Selvom vi præsenterede resultater fra en prototype Mikrofluid KODER enhed med fire sensorer i dette papir, kan flere sensorer inkorporeres i enheden, når designet til at producere udgangssignaler skelnes fra resten. En måde at udvide sensornetværket er at designe sensorer baseret på større ortogonale kodesæt med længere digitale koder. Længere ortogonale koder med flere bits giver højere behandling gevinst i afkodning og kan skelnes fra hinanden, når der er interferens. På den anden side, længere Gold koder i enheden betyder også større sensing volumen, hvilket øger det forventede antal interfererende sensorer. Ligeledes forøgelse af antallet af sensorer for en given prøve densitet vil føre til flere partikler overlappende grund af en stigning i det samlede sensing volumen. Som sådan er densiteten af partiklerne i prøven er en kritisk parameter, der skal overvejes i at bruge Mikrofluid KODER teknologi. Den maksimale partiklen tæthed, der kan løses (i analogi med kanalen kapaciteten af et CDMA telekommunikationsnetværk) afhænger af flere faktorer, såsom de individuelle sensorsignaler og deres forbindelse, afkodning ordning, layout af mikrofluidapparatet, samt den elektroniske støjniveau. Afhængigt af programmet, kan prøven fortyndes for at nå en partikel tæthed, der producerer en acceptabel fejlprocent.
Fra signalbehandling perspektiv, afkodning af tid bølgeformer fra en Mikrofluid KODER enhed ikke er beregningsmæssigt intensiv anvendelse af nuværende systemer, hvilket fremgår af den kendsgerning, at mobiltelefon kommunikation på et CDMA netværk kan demultiplekses i realtid. Desuden de fysiske begivenheder afkodes i mikrofluidapparater ske meget langsommere end bit transmissionshastighed i mobiltelefon kommunikation tillade os at bruge mere avancerede og tidskrævende algoritmer, som SIC og en optimering processer, som vi bruger til at iterativt løse overlappende signals fra sensorer.
Tilsammen Mikrofluid KODER er en alsidig, skalerbar elektronisk sensing teknologi, der let kan integreres i forskellige mikrofluidenheder at realisere kvantitative analyser ved at spore partikler som de behandles på chippen. Teknologien er meget let at gennemføre, fordi (1) det er meget simpelt fra en hardware perspektiv (2) det er direkte kompatible med den bløde litografi (3) den tilvejebringer en direkte elektronisk udlæsning uden nogen aktiv on-chip komponent, og (4) den bygger på simple beregningsmæssige algoritmer til signalbehandling og data fortolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 98% Sulfuric Acid | BDH Chemicals | BDH3074-3.8LP | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BDH Chemicals | BDH7690-3 | |
| Trichlorosilane | Aldrich Chemistry | 235725-100G | |
| NR9-1500PY Negative Photoresist | Furuttex | ||
| Resist Developer RD6 | Furuttex | ||
| Acetone | BDH Chemicals | BDH1101-4LP | |
| SU-8 2015 Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y010200 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| Isopropyl Alcohol | BDH Chemicals | BDH1133-4LP | |
| RPMI 1640 | Corning Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Amresco | K952-100ML | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CM | |
| PHD 22/2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2001 | |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instrument | ||
| HF2TA Current Amplifier | Zurich Instrument | ||
| Eclipse Ti-U Microscope | Nikon Corporation | ||
| DS-Fi2 High-Definition Color Camera | Nikon Corporation | ||
| v7.3 High-speed Camera | Phantom | ||
| PCIe-6361 Data Acquisition Board | National Instruments | 781050-01 | |
| BNC-2120 Shielded Connector Block | National Instruments | 777960-01 | |
| PX-250 Plasma Treatment System | Nordson MARCH |
References
- De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Res. 46 (3), 907-919 (2012).
- Vives-Rego, J., Lebaron, P., Nebe-von Caron, G. Current and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 24 (4), 429-448 (2000).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Cantón, R., Nombela, C., Sánchez-Pérez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Toner, M., Irimia, D. Blood-on-a-chip. Annu Rev Biomed Eng. 7, 77-103 (2005).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Current Opin Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nat Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Cermak, N., et al. High-throughput measurement of single-cell growth rates using serial microfluidic mass sensor arrays. Nat Biotechnol. , (2016).
- Gossett, D., et al. Label-free cell separation and sorting in microfluidic systems. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3249-3267 (2010).
- Tsutsui, H., Ho, C. Cell separation by non-inertial force fields in microfluidic systems. Mech Res Commun. 36 (1), 92-103 (2009).
- Edwards, T. L., Gale, B. K., Frazier, A. B. A microfabricated thermal field-flow fractionation system. Anal Chem. 74 (6), 1211-1216 (2002).
- Wang, M. M., et al. Microfluidic sorting of mammalian cells by optical force switching. Nat Biotechnol. 23 (1), 83-87 (2005).
- Shields, C. W. IV, Reyes, C. D., López, G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip. 15 (5), 1230-1249 (2015).
- Gawad, S., Schild, L., Renaud, P. Micromachined impedance spectroscopy flow cytometer for cell analysis and particle sizing. Lab Chip. 1 (1), 76-82 (2001).
- Haandbæk, N., Bürgel, S. C., Heer, F., Hierlemann, A. Characterization of subcellular morphology of single yeast cells using high frequency microfluidic impedance cytometer. Lab Chip. 14 (2), 369-377 (2014).
- Bayley, H., Martin, C. Resistive-pulse sensing-from microbes to molecules. Chem Rev. 100 (7), 2575-2594 (2000).
- Polling, D., Deane, S. C., Burcher, M. R., Glasse, C., Reccius, C. H. Coded electrodes for low signal-noise ratio single cell detection in flow-through impedance spectrophy. Proceedings of uTAS. (The 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences), Groningen, The Netherlands, , 3-7 (2010).
- Javanmard, M., Davis, R. W. Coded corrugated microfluidic sidewalls for code division multiplexing. IEEE Sensors J. 13 (5), 1399-1400 (2013).
- Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: a robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
- Emaminejad, S., Talebi, S., Davis, R. W., Javanmard, M. Multielectrode sensing for extraction of signal from noise in impedance cytometry. IEEE Sensors J. 15 (5), 2715-2716 (2015).
- Spencer, D., Caselli, F., Bisegna, P., Morgan, H. High accuracy particle analysis using sheathless microfluidic impedance cytometry. Lab Chip. 16 (2016), 2467-2473 (2016).
- Liu, R., Wang, N., Kamili, F., Sarioglu, A. Microfluidic CODES: a scalable multiplexed electronic sensor for orthogonal detection of particles in microfluidic channels. Lab Chip. 16 (8), 1350-1357 (2016).
- Buehrer, R. Code Division Multiple Access (CDMA). Synthesis Lectures on Communications. 1 (1), 1-192 (2006).
- Proakis, J. Digital Communications. , McGraw-Hill. New York, NY. (1989).
- Patel, P., Holtzman, J. Analysis of a simple successive interference cancellation scheme in a DS/CDMA system. IEEE J Sel Areas Commun. 12 (5), 796-807 (1994).
- Hui, A., Letaief, K. Successive interference cancellation for multiuser asynchronous DS/CDMA detectors in multipath fading links. IEEE Trans Commun. 46 (3), 384-391 (1998).
- Whittle, P. Prediction and regulation by linear least-square methods. J Macroecon. 7 (1), 126 (1985).
- Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 335-373 (2001).
- Zhe, J., Jagtiani, A., Dutta, P., Hu, J., Carletta, J. A micromachined high throughput Coulter counter for bioparticle detection and counting. J Micromech Microeng. 17 (2), 304-313 (2007).
- Song, Y., Yang, J., Pan, X., Li, D. High-throughput and sensitive particle counting by a novel microfluidic differential resistive pulse sensor with multidetecting channels and a common reference channel. Electrophoresis. 36 (4), 495-501 (2015).
- Watkins, N., et al. Microfluidic CD4+ and CD8+ T lymphocyte counters for point-of-care HIV diagnostics using whole blood. Sci Transl Med. 5 (214), 214ra170 (2013).
- Chen, Y., et al. Portable Coulter counter with vertical through-holes for high-throughput applications. Sensor Actuat B-Chem. 213, 375-381 (2015).
- Jagtiani, A., Carletta, J., Zhe, J. An impedimetric approach for accurate particle sizing using a microfluidic Coulter counter. J Micromech Microeng. 21 (4), 045036 (2011).
- Gold, R. Optimal binary sequences for spread spectrum multiplexing (Corresp). IEEE Trans. Inform. Theory. 13 (4), 619-621 (1967).
- Dinan, E., Jabbari, B. Spreading codes for direct sequence CDMA and wideband CDMA cellular networks. IEEE Commun Mag. 36 (9), 48-54 (1998).
