Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Plataforma microfluídico com multiplexada detecção electrónica do Ordenamento do Rastreamento de Partículas

Published: March 13, 2017 doi: 10.3791/55311

Summary

Nós demonstramos uma plataforma de microfluidos com uma rede de eléctrodo de superfície integrada que combina a detecção de impulsos resistiva (RPS) com acesso múltiplo por divisão de código (CDMA), para multiplexar detecção e dimensionamento de partículas em vários canais de microfluidos.

Abstract

processamento de microfluidos de amostras biológicas normalmente envolve manipulações diferenciais de partículas suspensas sob vários campos de força, a fim de fracionar espacialmente a amostra com base em uma propriedade biológica de interesse. Para a distribuição espacial resultante para ser utilizado como a leitura de ensaio, dispositivos microfluidicos são muitas vezes sujeitas a análise microscópica requerendo instrumentação complexa com maior custo e portabilidade reduzida. Para resolver esta limitação, temos desenvolvido uma tecnologia de detecção electrónico integrado para a detecção de partículas multiplexado em locais diferentes num chip de microfluidos. A nossa tecnologia, chamada CÓDIGOS microfluídicos, combina pulso resistiva Sensing com Code Division Multiple Access para comprimir 2D informação espacial em um sinal elétrico 1D. Neste artigo, apresentamos uma demonstração prática da tecnologia CÓDIGOS microfluídicos para detectar e tamanho células cancerosas cultivadas distribuído por vários canais microfluídicos. Comovalidado pela microscopia de alta velocidade, a tecnologia pode analisar com precisão todas as populações de células densas electronicamente, sem a necessidade de um instrumento externo. Como tal, os códigos microfluídicos pode potencialmente permitir que dispositivos de baixo custo integrados lab-on-a-chip que estão bem adaptados para os testes point-of-care de amostras biológicas.

Introduction

A detecção precisa e análise de partículas biológicas tais como células, bactérias ou vírus em suspensão no líquido é de grande interesse para uma série de aplicações de 1, 2, 3. Bem combinado em tamanho, dispositivos microfluídicos oferecem vantagens únicas para este fim, como de alta sensibilidade, a manipulação da amostra gentil e microambiente bem controlados 4, 5, 6, 7. Além disso, os dispositivos de microfluidos podem ser concebidos para empregar uma combinação de dinâmica de fluidos e campos de força para fraccionar passivamente uma população heterogénea de partículas biológicas baseadas em diversas propriedades de 8, 9, 10, 11, 12. Naqueles dispositivos, a distribuição de partículas resultante pode ser utilizado como leitura da informação espacial, mas é, tipicamente, acessíveis apenas por meio de microscopia, o que limita a utilidade prática do dispositivo de microfluidos, amarrando-o para uma infra-estrutura de laboratório. Por isso, um sensor integrado que pode prontamente relatório de mapeamento espaço-temporal das partículas, à medida que são manipuladas em um dispositivo de microfluidos, pode potencialmente permitir a baixo custo, dispositivos de Lab-on-a-chip integrado que são particularmente atraente para o ensaio das amostras em Mobile , contextos de recursos limitados.

Eléctrodos de película fina têm sido usadas como sensores integrados em dispositivos de microfluidos para várias aplicações 13, 14. Pulso de detecção resistiva (RPS) é particularmente atraente para detecção integrada das pequenas partículas em canais de microfluidos, uma vez que oferece um mecanismo robusto, sensível, e detecção de alto rendimento directamente a partir de medições eléctricas 15. Em RPS, a modulação da impedância entre um par de eléctrodos, imersos num electrólito, é utilizado como um meio para detectar uma partícula. Quando a partícula passa através de uma abertura, de tamanho da ordem da partícula, o número e amplitude de impulsos transientes na corrente eléctrica que são utilizados para contar e partículas de tamanho, respectivamente. Além disso, a geometria do sensor pode ser concebido com uma resolução de fotolitografia a forma de onda de impulso resistivas, a fim de aumentar a sensibilidade de 16, 17, 18, 19 ou para estimar a posição vertical de partículas em canais de microfluidos 20.

Temos recentemente introduziu uma tecnologia de detecção de pulso resistiva multiplexado escalável e simples chamado Microfluidic Coded Orthogonal Detecção por Sensoriamento Elétrica (CODES microfluídicos) 21. CÓDIGOS microfluídicos depende de umrede interligada de sensores de pulso resistivos, cada um consistindo de uma matriz de eléctrodos de micromecânica para modular a condução de uma maneira única, distinguível, de modo a permitir a multiplexação. Temos concebido especificamente cada sensor para produzir sinais eléctricos ortogonais semelhantes aos códigos digitais usados no Code Division Multiple Access 22 (CDMA) de redes de telecomunicações, de modo que o sinal do sensor de pulso resistivas individuais podem ser recuperados de forma única a partir de uma única forma de onda de saída, mesmo se os sinais a partir de diferentes sensores interferir. Desta forma, a nossa tecnologia comprime informação espacial 2D de partículas num sinal eléctrico 1D, permitindo a monitorização de partículas em diferentes localizações sobre um chip de microfluidos, mantendo tanto a complexidade do dispositivo e ao nível do sistema a um nível mínimo.

Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para métodos experimentais e computacionais necessárias para utilizar a tecnologia CÓDIGOS Microfluidic, bem como representative resultados da sua utilização em análises de amostras biológicas simulado. Utilizando os resultados de um dispositivo protótipo com quatro sensores multiplexados como um exemplo para explicar a técnica, nós fornecemos protocolos sobre (1) o processo de microfabricação para criar dispositivos microfluídicos com a tecnologia microfluídica CODES, (2) a descrição da configuração experimental, incluindo a hardware electrónico, óptico, e fluidificada, (3) o algoritmo de computador para descodificar sinais de interferência de diferentes sensores, e (4) os resultados de detecção e análise de células cancerosas em canais de microfluidos. Acreditamos que a utilização do protocolo detalhado descrito aqui, outros pesquisadores podem aplicar nossa tecnologia para suas pesquisas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Projeto de Eletrodos de Codificação

Nota: A Figura 1a mostra a estrutura 3-D dos eléctrodos micropatterned.

  1. Desenhar um conjunto de quatro códigos de ouro de 7 bits para codificar os canais microfluídicos 23.
    1. Construir dois de feedback shift-registos lineares (LFSRs), cada um representando um polinômio primitivo.
    2. Use as LFSRs para gerar um par preferido de m -sequences 7-bit.
    3. Ciclicamente deslocar o par preferido de m -sequences e adicioná-los na modificação 2 para gerar quatro códigos de Ouro distintas.
  2. Criar o layout dos eletrodos de codificação (Figura 1B).
    1. Coloque três terminais do eletrodo, representando os, e eletrodos de referência negativos positivos em três cantos.
    2. Rota eléctrodo positivo e negativo traça em lados opostos de cada canal microfluídico.
    3. Estender eletrodos positivos e negativos para ocanais microfluídicos como dedos de eletrodos, a seguir ao código de Ouro atribuídos exclusivamente (Figura 1C).
    4. Colocar o eléctrodo de referência de entre os dedos positivos e negativos de eléctrodos.
    5. Coloque vestígios de eléctrodos positivos e negativos longe dos dedos de eléctrodos de referência mais exteriores, a fim de minimizar a condução eléctrica fora da região de codificação.

2. Microfabricação de eletrodos de superfície

Nota: A Figura 2b mostra o processo de fabricação de eléctrodos de superfície.

  1. Limpar uma bolacha de vidro de borossilicato de 4 polegadas em uma solução piranha (ácido sulfúrico a 98%: 30% de peróxido de hidrogénio = 5: 1) a 120 ° C durante 20 min para remover todos os contaminantes orgânicos. Em seguida, coloca a bolacha sobre uma placa quente a 200 ° C durante 20 min para remover a água residual.
  2. Transferir a bolacha para um spinner. Dispensar 2 mL fotorresistente negativo sobre a bolacha e girar a bolacha a uma velocidade de 3000 rpm durante 40 s para revestir uniformemente o wafer com uma camada fotorresistente 1,5 mícrons.
  3. Coloque a bolacha sobre uma placa quente a 150 ° C e assar o fotorresistente centrifugada durante 1 min.
  4. Expor o foto-resistente a luz UV de 365 nm (225 mJ / cm 2) através de uma máscara de crómio usando uma máscara de alinhador.
  5. Coloque a bolacha em uma placa quente a 100 ° C e asse o fotorresistente exposto durante 1 min.
  6. Desenvolver o fotorresistente por imersão da bolacha num revelador fotorresistente (RD6) durante 15 s. Suavemente pulverizar água desionizada (DI) e lava-se a bolacha. Seco, soprando nitrogénio comprimido.
  7. Coloque o wafer foto-resistente com modelado em um evaporador de metal por feixe electrónico, e depositar uma película de cromo-20 nm de espessura, seguindo-se um filme de ouro de 80 nm de espessura sobre a bolacha de base a uma pressão de 3 x 10 -6 Torr com a taxa de deposição de 1 a / s.
  8. Mergulhe o wafer revestido de metal em acetona em um conjunto de banho de ultra-som com uma frequência de 40 kHz com 100% de amplitude durante 30 minutos a têmpera quartoAture para gravar a foto-resistente subjacente e concluir o processo de decolagem.
  9. Cortar a bolacha em pedaços menores usando uma serra de corte em cubos convencional.

3. Fabricação do SU-8 molde de canais microfluídicos

Nota: A Figura 2a mostra o processo de fabricação do molde para os canais de microfluidos.

  1. Limpar e assar uma bolacha de silício de 4 polegadas usando o mesmo processo descrito em 2.1.
  2. Transferir a bolacha para um spinner. Pour 4 mL fotorresistência sobre a bolacha. Brasão o wafer com fotorresiste.
    1. Girar a bolacha a 500 rpm durante 15 s.
    2. Girar a bolacha a 1.000 rpm durante 15 s.
    3. Girar a bolacha a 3.000 rpm durante 60 segundos para se obter uma camada fotorresistente de espessura 15 mícrons uniformemente revestido.
  3. Coloque o wafer-se em uma sala limpa limpe embebido em acetona e remover o fotorresiste residual da parte traseira e as bordas do wafer.
  4. Transferir a bolacha quente para uma PLcomeu para o cozimento macio. Em primeiro lugar, cozer a bolacha a 65 ° C durante 1 min. Em seguida, mova rapidamente a bolacha para um prato quente de 95 ° C e asse por 2 min.
  5. Expor o foto-resistente a luz UV de 365 nm (180 mJ / cm 2) por meio de uma máscara de cromo utilizando uma máscara de alinhador.
  6. Cozer a bolacha após exposição a 65 ° C durante 1 min e em seguida a 95 ° C durante 2 min.
  7. Mergulhe o wafer no desenvolvedor e agite o recipiente para 3 min. Em seguida, lavar o wafer com álcool isopropílico (IPA) e secá-lo, soprando nitrogénio comprimido. Se um resíduo de cor branca aparece no wafer, mergulhá-lo no desenvolvedor de novo e desenvolver por mais tempo e seco.
  8. Cozer a bolacha sobre uma placa quente a 200 ° C durante 30 minutos para secá-la completamente.
  9. Medir a espessura do fotorresistente modelado utilizando um perfilómetro em locais diferentes por todo o wafer para assegurar a uniformidade.
  10. Silanizar da bolacha do molde, utilizando a técnica de deposição de vapor. Adicionar 200 uL de trichlorosilane numa placa de Petri e colocar num exsicador de vácuo, juntamente com o SU-8 bolacha do molde durante 8 h.

4. Montagem do Dispositivo CÓDIGOS Microfluidic

  1. Coloque o wafer de silício de 4 polegadas com o molde em um diâmetro de Petri de 150 mm, e corrigi-lo gravando a partir de suas bordas.
  2. Misturar o polidimetilsiloxano (PDMS) de pré-polímero e do agente de reticulação numa proporção de 10: 1, e 50 g de derramar a mistura para a placa de Petri. Colocar a placa de Petri num exsicador de vácuo para desgaseificar a mistura durante 1 h, e, em seguida, curar em um forno a 65 ° C durante pelo menos 4 h (Figura 2A).
  3. Cortar a camada de PDMS curado usando um bisturi e retire-a da bolacha molde usando uma pinça. O tamanho do dispositivo de prova de princípio é de aproximadamente 20 mm x 7 mm. Em seguida, fazer furos com um diâmetro de 1,5 mm através do PDMS para a entrada e a saída do canal microfluídico utilizando um perfurador de biópsia.
  4. Limpe o lado modelado da parte PDMS colocando it em uma fita adesiva de sala limpa.
  5. Limpe o substrato de vidro com eletrodos de superfície por lavagem com acetona, IPA, água DI e seque com nitrogênio comprimido.
  6. Ative as superfícies de PDMS e substrato de vidro em plasma de oxigênio durante 30 s com o lado microusinado de cada parte voltada para cima em um gerador de plasma RF fixado em 100 mW.
  7. Alinhe o canal microfluídicos PDMS com eletrodos de superfície sobre o substrato de vidro usando um microscópio óptico e, em seguida, trazer as duas superfícies ativada por plasma em contato físico.
  8. Asse o dispositivo sobre uma placa de aquecimento de 70 ° C durante 5 min, com o lado do vidro virado para a placa quente.
  9. Conecte os suportes de contato dos eletrodos com fios soldando.

5. Preparação da amostra Simulado Biológica

  1. Cultura das células cancerosas do ovário humano HeyA8 em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina, em 5% de CO2 a 37 ° Caté atingirem 80% de confluência.
  2. Aspirar a mídia do frasco de cultura com uma pipeta de vidro. Dispensar e, em seguida, solução salina de fosfato tamponada aspirado 1x (PBS), para lavar as células.
  3. Incubar as células em 2 ml de 0,05% (w / v) de solução de tripsina, durante 2 minutos a 37 ° C a suspender as células aderentes. Em seguida, adicionar 4 ml de meio de cultura para neutralizar a tripsina.
  4. Centrifugar a suspensão de células a 100 x g durante 5 min para sedimentar as células num tubo de ensaio. Em seguida, sobrenadante aspirado completamente.
  5. Re-suspender as células em 1-2 mL 1x PBS cuidado pipetando para cima e para baixo para aglomerados de células mecanicamente Separar.
  6. Desenhar uma pequena quantidade de suspensão de células para uma pipeta e contar o número de células utilizando um hemocitómetro.
  7. Dilui-se a suspensão de células com PBS para preparar uma amostra com uma concentração celular final de 10 5 -10 6 células / ml.

6. A execução do CODES dispositivo micro

Nota: Fifigura 3 mostra a configuração experimental.

  1. Coloque o dispositivo CÓDIGOS Microfluidic sobre a platina de um microscópio óptico.
  2. Aplique uma onda senoidal de 400 kHz para o eletrodo de referência no chip usando um gerador de função eletrônica.
  3. Ligue os eléctrodos de detecção positivos e negativos a dois amplificadores trans-impedância independentes para converter sinais de corrente de cada um para sinais de tensão.
  4. Subtrair o sinal de tensão do eléctrodo de detecção positiva do sinal de tensão negativa eléctrodo de detecção usando um amplificador de tensão diferencial, a fim de obter um sinal bipolar.
  5. Use uma câmera de alta velocidade para operação de gravação óptica do dispositivo para fins de validação e caracterização.
  6. Conduzir a suspensão de células através do dispositivo CÓDIGOS microfluídicos a um caudal constante (50-1.000 mL / h) utilizando uma bomba de seringa.
  7. Medir o sinal de modulação de impedância, utilizando um amplificador lock-in.
    1. Ligue o sinal AC referência à refentrada refe- do amplificador lock-in. Ligue o sinal bipolar diferencial para o amplificador lock-in como sinal de entrada.
    2. Obter a amplitude RMS do sinal diferencial a partir da saída do amplificador lock-in.
  8. A amostragem do sinal de saída do amplificador lock-in na taxa de 1 MHz a um computador através de uma placa de aquisição de dados para análise posterior.

7. Processamento de sinais do sensor

  1. Transferir dados elétricos registrados em MATLAB para pós-processamento e decodificação.
  2. Filtrar o sinal gravado no domínio digital usando um filtro Butterworth (função built-in MATLAB) para remover o ruído de alta frequência (> 2,5 kHz).
  3. Gerar uma biblioteca de código do modelo de sinais do sensor.
    1. Identificar os sinais de código não sobreposta representativos correspondentes a cada sensor no dispositivo e extrai-se estes blocos de sinal a partir do conjunto de dados de forma de onda como vectores separados.
    2. Normalizar cada modelo de forma de onda de código vectorpelo seu poder. Use o MATLAB função built-in (bandpower) para medir a potência do sinal.
    3. Use a função MATLAB (resample) para expandir a biblioteca de template digital criando versões de sinais de código normalizadas com diferentes durações para acomodar variações na velocidade do fluxo de células ao longo dos eletrodos.
  4. Identificar os blocos de sinais que correspondem ao sensor de actividade (limiar: SNR> 12 dB) na forma de onda filtrada. Forma de onda com SNR abaixo do limiar seria tratado como ruído.
  5. Descodificar os blocos individuais de actividade de sensor no sinal gravado por meio de um algoritmo iterativo com base na cancelamento de interferência sucessivas, uma técnica habitualmente utilizada nas redes de comunicações CDMA multi-utilizador 24, 25.
    1. Calcular a correlação cruzada de cada bloco de sinal com todos os modelos na biblioteca utilizando deslizante produto escalar.
    2. Identificar o modelo que produz o largEst pico de auto-correlação para determinar o sinal de código do sensor indivíduo dominante. Grave a tempo e amplitude do pico de autocorrelação.
    3. Construir um sinal de código do sensor estimativa escalando o modelo de código identificados com base na medida da amplitude autocorrelação de pico e informações de tempo (determinado na etapa 7.5.2).
    4. Subtrair o sinal de código do sensor calculado a partir dos dados originais.
    5. Iterar o processo a partir de 7.5.1, até que o sinal residual não se assemelha a qualquer sinal na biblioteca molde, definida matematicamente como o coeficiente de correlação é inferior a 0,5.
  6. Refinar estimativas sinal do sensor iniciais da etapa 7.5, utilizando um processo de otimização.
    1. Reconstruir o sinal adicionando sinais de sensores individuais estimados de cada iteração.
    2. Varrer a amplitude, duração e calendário de sinais dos sensores individuais em torno das estimativas originais para produzir o melhor ajuste com o sinal elétrico gravadobaseada em mínimos quadrados aproximação 26.
  7. Converter amplitudes de sinais do sensor estimados em tamanho de célula calibrando sinais elétricos contra as imagens ópticas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Um dispositivo CÓDIGOS Microfluidic consistindo de quatro sensores distribuídos ao longo de quatro canais de microfluidos é mostrado na Figura 1b. Neste sistema, a secção transversal de cada um dos canais de microfluidos foi concebido para ser próximo do tamanho de uma célula de modo a que (1) várias células não podem passar através dos eléctrodos em paralelo e (2) as células permanecem perto dos eléctrodos aumentando a sensibilidade . Cada sensor está concebido para gerar um código digital de 7-bits única. O dispositivo foi testado em seguida, utilizando uma suspensão de células. Temos sinais eléctricos correspondentes aos quatro sensores individuais são mostrados com os códigos digitais ideal associado na Figura 4. sinais gravados de perto combinar com os pulsos quadrados ideais, enquanto existem pequenos desvios. Tais desvios resultar de uma combinação de vários factores, incluindo o campo eléctrico não uniforme entre os eléctrodos coplanares, o acoplamento entre os diversos pares de eléctrodos, de forma esféricacélulas, bem como a velocidade de fluxo constante de células em canais de microfluidos. Criamos uma biblioteca de modelos com base nos sinais do sensor recodificados. Ao correlacionar os sinais gravados com todos os modelos na biblioteca, determinou-se um molde que produziu o pico máximo de auto-correlação (Figura 4). Como os códigos digitais para os canais de microfluidos são concebidos para serem ortogonais entre si, um pico de auto-correlação dominante podia ser robustamente identificada neste processo. Utilizando esta abordagem, podemos computacionalmente determinar o canal microfluídico a célula passar através, a duração do sinal do sensor, e, por conseguinte, a velocidade de fluxo da célula.

O Microfluidic tecnologia CODES pode resolver situações em que várias células interagir simultaneamente com eletrodos de codificação. Quando ocorrem tais sobreposições, os sinais dos sensores individuais interferem e a forma de onda resultante não pode ser facilmente associado a qualquermolde único correspondente a um sensor específico. Com precisão de descodificação, sinais em sobreposição é particularmente importante para as amostras de alta densidade de processamento fiável, em que as interferências são mais prováveis ​​de ocorrer. Para resolver sobreposição de eventos, desenvolvemos um algoritmo iterativo baseado em um esquema sucessivo cancelamento de interferência (SIC) 24, 25, que é normalmente usado para a detecção multi-usuário em redes de comunicação CDMA. A Figura 5 demonstra a forma como o algoritmo de SIC é implementado na resolução de uma forma de onda que resultou de quatro células sobrepostas em quatro canais de microfluidos diferentes. Em cada iteração, determinou-se primeiro o pico de auto-correlação dominante (Figura 5A, coluna 2 ND), correspondente ao sinal de interferência mais forte, correlacionando-se a forma de onda de entrada (Figura 5A, coluna 1 r) com a biblioteca de modelos. Com base no modelo selecionado e tele resultante amplitude auto-correlação, e então estimamos o mais forte interferência de sinal (Figura 5a, 3 coluna rd) e subtraiu-o da forma de onda de entrada. A forma de onda remanescente foi passado para a iteração seguinte como a entrada. Este processo continuou até que a correlação do sinal residual com a biblioteca de template não produziu um claro pico de auto-correlação (Figura 5a, linha, parcela). Após o término do processo de cancelamento de interferência, reconstruímos uma estimativa da forma de onda, combinando todos os sinais provenientes de cada iteração (Figura 6a). Usando um processo de otimização baseado em uma mínimos quadrados aproximação para minimizar o erro quadrático médio entre a forma de onda original e o sinal reconstruído, atualizamos nossas estimativas para a amplitude, duração e temporização relativa dos sinais de código de sensor individuais (Figura 6b). Nós também estimou o tamanho doas células detectado com base na amplitude dos sinais dos sensores individuais estimados. Para conseguir isso, calibrado as amplitudes de sinais elétricos com tamanhos de células opticamente medidos utilizando regressão linear (Figura 6b). Uma comparação dos nossos resultados a partir dos códigos microfluídicos com as informações obtidas a partir das imagens gravadas simultaneamente microscópio de alta velocidade mostra que o tamanho da célula e velocidade pode ser medido com precisão, o que valida os nossos resultados (Tabela 1). Figura 6c mostra a imagem de microscopia de alta velocidade gravados simultaneamente usado para validar o resultado de descodificação.

Para demonstrar a reprodutibilidade dos resultados e também o desempenho da tecnologia CÓDIGOS Microfluidic para um processamento de amostras de elevado rendimento, foram analisados ​​os sinais eléctricos correspondentes a> 1.000 células. Os sinais foram automaticamente decodificado em MATLAB, executando o algoritmo explicouacima e a precisão dos nossos resultados foi avaliada comparando diretamente nossos resultados com dados ópticos de vídeo de alta velocidade gravados simultaneamente. A análise indica que os sinais eléctricos a partir de 96,15% de células (973/1012) foram descodificados com precisão. A taxa de sucesso para a descodificação de sinais de celulares não sobrepostos e sobrepostas é 98,71% (688/697) e 90,48% (285/315), respectivamente.

figura 1
Figura 1. Projeto do dispositivo CÓDIGOS microfluídicos de quatro canais. (A) Os eléctrodos em cada canal microfluídico são micropadronadas para gerar um código digital único. A modulação da impedância devido às interações sequenciais de células que flui com pares de eléctrodos leva a pulsos elétricos. (B) A imagem do microscópio do dispositivo CÓDIGOS microfluídicos. Durante o processo de fabricação, substrato de vidro com eletrodos de superfície de codificação está alinhado com canais microfluídicos PDMS sob um microscópio. (C) Um close-up da imagem de eletrodos de superfície codificadas produzindo sequências de ouro de 7 bits: "1010110", "0111111", "0100010", "0011000". Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Processo de microfabricação. (A) Os canais de microfluidos PDMS são fabricadas usando litografia macia 27. (B) Os eletrodos de superfície são fabricados usando um processo de lift-off. (C) Um esquemática em corte transversal do dispositivo final. PDMS canais microfluídicos estão alinhados e ligado ao substrato de vidro com eletrodos de superfície. jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Instalação experimental. Utilizando uma bomba de seringa, a suspensão de células é executado através do dispositivo CÓDIGOS microfluídicos a um caudal constante. Um sinal de CA de 400 kHz é aplicada ao eléctrodo de referência, utilizando um gerador de função. sinais de corrente de eléctrodos de detecção positivos e negativos são primeiro convertidos em sinais de tensão, utilizando dois amplificadores de transimpedância e subtraídos uns dos outros utilizando um amplificador diferencial. O sinal bipolar diferencial é extraído por um amplificador lock-in e, em seguida, recolhidos num computador para processamento de sinal e de descodificação. microscopia óptica de alta velocidade é utilizado para operação de gravação óptica do dispositivo para fins de validação e caracterização.e.jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. sinais elétricos gravadas de sensores individuais e suas correlações. sinais gravados e sua correlação com o outro são dadas por quatro sensores de pulso resistiva código multiplexado. Sensor de 1 (um), o sensor 2 (b), o sensor 3 (c) e o sensor 4 (d) foram concebidos para a produção de formas de onda digitais de 7 bits "1010110", "0111111", "0100010", e "0011000", respectivamente . Para cada sensor, a figura superior mostra que sinal normalizado gravado a partir de cada sensor corresponde estreitamente com a sequência de pulso quadrado ideal que o sensor foi projetado para produzir. Para cada sensor, o painel inferior mostra o sinal do sensor gravada9; s autocorrelação e a correlação cruzada com sinais correspondentes a três outros sensores de código multiplexado na rede. Em todos os casos, um pico de auto-correlação pode ser identificado de forma robusta, porque os códigos digitais de sensores individuais são concebidos para serem ortogonais entre si. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Decodificando uma forma de onda sobreposição com sucessivas cancelamento de interferência. Em cada iteração, a forma de onda de entrada (uma coluna St) é correlacionada com a biblioteca de modelos pré-montado para identificar o modelo específico que resulta da amplitude de correlação máxima (coluna 2 ND). Usando este modelo específico, o sinal mais forte interferência é estimado com base na amplitudee informação de temporização a partir do pico de correlação (3 rd coluna). O sinal estimado é então subtraído a partir da forma de onda original, anulando a interferência mais forte devido ao maior célula. O processo é iterado até que nenhum pico de correlação podem ser determinadas (isto é, o coeficiente de correlação <0,5) no sinal residual. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. análise dos resultados de decodificação. (A) sinais estimados são refinados com base em um algoritmo de otimização que visa obter o melhor ajuste entre o reconstruído ea forma de onda original gravado usando a aproximação de mínimos quadrados. (B) No final do processo de optimização,o momento e a amplitude dos sinais calibrados reflete com precisão os parâmetros da célula medida por microscopia de alta velocidade. (C) imagem de microscopia de alta velocidade Simultaneamente registrou valida nossos resultados a partir de medições eléctricas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tipo de medição CH1 R (mm) CH2 R (mm) CH3 R (mm) CH4 R (mm) At 1 (ms) At 2 (MS) At 3 (ms)
Elétrico 8.010 6.490 5.300 6.550 0,465 1.705 0,744
ótico 8.320 6.770 5.680 7.040 0,375 1.625 0,750

Tabela 1. Comparação dos parâmetros celulares e electricamente opticamente medidos da Figura 6b. Para validar os nossos estimativas, que opticamente medidos os tamanhos das células da imagem de microscopia de alta velocidade. timing relativo entre as células diferentes é opticamente medido a partir do número de quadros entre as células do vídeo de alta velocidade registada a 8.000 quadros por segundo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vários sensores de pulso resistivas foram previamente incorporados em chips microfluídicos 28, 29, 30, 31, 32. Nestes sistemas, sensores de pulso resistivas ou não foram multiplexados 28, 29, 30, 31 ou eles necessários sensores individuais para ser conduzido em diferentes frequências 32. Em ambos os casos, foram necessárias conexões externas dedicados a cada sensor de pulso resistiva no chip e, por conseguinte, um grande número de sensores não poderia ser integrado sem uma maior complexidade de hardware. A vantagem importante da CÓDIGOS microfluídicos é que ele permite a leitura simultânea de vários sensores de pulso resistiva de uma única saída em um dispositivo simples. Nós conseguimos isso através da utilização de mtécnicas ultiplexing comumente utilizados em telecomunicações para projetar sensores de pulso resistiva microusinados integrados em dispositivos microfluídicos. Em essência, a tecnologia baseia-se no código de-multiplexagem de uma rede de marcadores de Coulter no chip através da concepção de cada para produzir um sinal quando uma partícula distinguíveis é detectado. Cada sensor microusinado na rede consiste em vários eletrodos de superfície coplanar ordenados em diferentes configurações de modo que a interação sequencial de fluir partículas com estes eléctrodos produz ortogonais modulações de impedância formas de onda. Para acomodar a interação de partículas do sensor assíncrona, nós projetado especificamente cada sensor para produzir códigos de ouro 33, códigos digitais pseudo-ortogonais que são normalmente utilizados no uplink das redes de telecomunicações CDMA. Códigos de Ouro manter um certo nível de ortogonalidade, mesmo quando estão desalinhadas com diferenças de fase aleatória 34.

MiCÓDIGOS crofluidic é facilmente escalável. Embora nós apresentamos os resultados de um protótipo microfluídicos dispositivo de códigos com quatro sensores neste trabalho, mais sensores podem ser incorporados no dispositivo quando projetada para produzir sinais de saída distinguíveis do resto. Uma maneira de expandir a rede de sensores é a concepção de sensores com base em maiores conjuntos de códigos ortogonais com códigos digitais mais longos. Mais códigos ortogonais com mais bits proporcionar maior ganho de processamento de descodificação e pode ser distinguidos um do outro quando há interferência. Por outro lado, os códigos mais de ouro em que o dispositivo também meios de detecção de volume maior, o que aumenta o número esperado de sensores interferentes. Do mesmo modo, o aumento do número de sensores para uma dada densidade da amostra irá levar a mais partículas que se sobrepõem, devido a um aumento no volume global de detecção. Como tal, a densidade das partículas na amostra é um parâmetro crítico que deve ser considerado na utilização da tecnologia CÓDIGOS microfluídico. O p máximodensidade artigo que pode ser resolvido (em analogia com a capacidade de canal de uma rede de telecomunicações CDMA) depende de vários factores, tais como os sinais dos sensores individuais e a sua relação, o esquema de descodificação, a disposição do dispositivo de microfluidos, e o nível de ruído electrónico. Dependendo da aplicação, a amostra pode ser diluída até alcançar uma densidade de partículas que produz uma taxa de erro aceitável.

Do ponto de vista de processamento de sinal, decodificação de formas de onda de tempo de um dispositivo CÓDIGOS Microfluidic não é computacionalmente intensivas usando sistemas atuais, como evidenciado pelo fato de que as comunicações de telefone celular em uma rede CDMA pode ser demultiplexed em tempo real. Além disso, os eventos físicos para ser decodificado em microcanais acontecer muito mais lento do que a taxa de transmissão de bits em comunicações de telefone celular que nos permite usar mais avançada e algoritmos como SIC e um processos de otimização, que usamos para resolver de forma iterativa sobreposição de si morosognals de sensores.

Tomados em conjunto, os códigos microfluídicos é uma tecnologia versátil, escalável electrónico de detecção que pode ser facilmente integrado em vários dispositivos de microfluido para realizar ensaios quantitativos rastreando partículas como eles são processados ​​no chip. A tecnologia é muito fácil de implementar, porque (1) é muito simples a partir de uma perspectiva de hardware (2) que é diretamente compatível com a litografia macia (3) que proporciona uma leitura electrónica directa, sem qualquer componente ativo on-chip, e (4) que se baseia em algoritmos computacionais simples para processamento de sinal e interpretação dos dados.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
98% Sulfuric Acid    BDH Chemicals BDH3074-3.8LP
30% Hydrogen Peroxide   BDH Chemicals BDH7690-3
Trichlorosilane Aldrich Chemistry 235725-100G
NR9-1500PY Negative Photoresist Furuttex
Resist Developer RD6 Furuttex
Acetone BDH Chemicals BDH1101-4LP
SU-8 2015 Negative Photoresist Microchem SU8-2015
SU-8 Developer Microchem Y010200
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 3097358-1004 Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
Isopropyl Alcohol BDH Chemicals BDH1133-4LP
RPMI 1640 Corning Cellgro 10-040-CV
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050
Penicillin-Streptomycin Amresco K952-100ML
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CM
PHD 22/2000 Syringe Pump Harvard Apparatus 70-2001
HF2LI Lock-in Amplifier Zurich Instrument
HF2TA Current Amplifier Zurich Instrument
Eclipse Ti-U Microscope Nikon Corporation
DS-Fi2 High-Definition Color Camera  Nikon Corporation
v7.3 High-speed Camera Phantom
PCIe-6361 Data Acquisition Board  National Instruments 781050-01
BNC-2120 Shielded Connector Block National Instruments 777960-01 
PX-250 Plasma Treatment System Nordson MARCH 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Res. 46 (3), 907-919 (2012).
  2. Vives-Rego, J., Lebaron, P., Nebe-von Caron, G. Current and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 24 (4), 429-448 (2000).
  3. Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Cantón, R., Nombela, C., Sánchez-Pérez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
  4. Toner, M., Irimia, D. Blood-on-a-chip. Annu Rev Biomed Eng. 7, 77-103 (2005).
  5. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Current Opin Biotech. 25, 95-102 (2014).
  6. Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nat Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
  7. Cermak, N., et al. High-throughput measurement of single-cell growth rates using serial microfluidic mass sensor arrays. Nat Biotechnol. , (2016).
  8. Gossett, D., et al. Label-free cell separation and sorting in microfluidic systems. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3249-3267 (2010).
  9. Tsutsui, H., Ho, C. Cell separation by non-inertial force fields in microfluidic systems. Mech Res Commun. 36 (1), 92-103 (2009).
  10. Edwards, T. L., Gale, B. K., Frazier, A. B. A microfabricated thermal field-flow fractionation system. Anal Chem. 74 (6), 1211-1216 (2002).
  11. Wang, M. M., et al. Microfluidic sorting of mammalian cells by optical force switching. Nat Biotechnol. 23 (1), 83-87 (2005).
  12. Shields, C. W. IV, Reyes, C. D., López, G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip. 15 (5), 1230-1249 (2015).
  13. Gawad, S., Schild, L., Renaud, P. Micromachined impedance spectroscopy flow cytometer for cell analysis and particle sizing. Lab Chip. 1 (1), 76-82 (2001).
  14. Haandbæk, N., Bürgel, S. C., Heer, F., Hierlemann, A. Characterization of subcellular morphology of single yeast cells using high frequency microfluidic impedance cytometer. Lab Chip. 14 (2), 369-377 (2014).
  15. Bayley, H., Martin, C. Resistive-pulse sensing-from microbes to molecules. Chem Rev. 100 (7), 2575-2594 (2000).
  16. Polling, D., Deane, S. C., Burcher, M. R., Glasse, C., Reccius, C. H. Coded electrodes for low signal-noise ratio single cell detection in flow-through impedance spectrophy. Proceedings of uTAS. (The 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences), Groningen, The Netherlands, , 3-7 (2010).
  17. Javanmard, M., Davis, R. W. Coded corrugated microfluidic sidewalls for code division multiplexing. IEEE Sensors J. 13 (5), 1399-1400 (2013).
  18. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: a robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
  19. Emaminejad, S., Talebi, S., Davis, R. W., Javanmard, M. Multielectrode sensing for extraction of signal from noise in impedance cytometry. IEEE Sensors J. 15 (5), 2715-2716 (2015).
  20. Spencer, D., Caselli, F., Bisegna, P., Morgan, H. High accuracy particle analysis using sheathless microfluidic impedance cytometry. Lab Chip. 16 (2016), 2467-2473 (2016).
  21. Liu, R., Wang, N., Kamili, F., Sarioglu, A. Microfluidic CODES: a scalable multiplexed electronic sensor for orthogonal detection of particles in microfluidic channels. Lab Chip. 16 (8), 1350-1357 (2016).
  22. Buehrer, R. Code Division Multiple Access (CDMA). Synthesis Lectures on Communications. 1 (1), 1-192 (2006).
  23. Proakis, J. Digital Communications. , McGraw-Hill. New York, NY. (1989).
  24. Patel, P., Holtzman, J. Analysis of a simple successive interference cancellation scheme in a DS/CDMA system. IEEE J Sel Areas Commun. 12 (5), 796-807 (1994).
  25. Hui, A., Letaief, K. Successive interference cancellation for multiuser asynchronous DS/CDMA detectors in multipath fading links. IEEE Trans Commun. 46 (3), 384-391 (1998).
  26. Whittle, P. Prediction and regulation by linear least-square methods. J Macroecon. 7 (1), 126 (1985).
  27. Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 335-373 (2001).
  28. Zhe, J., Jagtiani, A., Dutta, P., Hu, J., Carletta, J. A micromachined high throughput Coulter counter for bioparticle detection and counting. J Micromech Microeng. 17 (2), 304-313 (2007).
  29. Song, Y., Yang, J., Pan, X., Li, D. High-throughput and sensitive particle counting by a novel microfluidic differential resistive pulse sensor with multidetecting channels and a common reference channel. Electrophoresis. 36 (4), 495-501 (2015).
  30. Watkins, N., et al. Microfluidic CD4+ and CD8+ T lymphocyte counters for point-of-care HIV diagnostics using whole blood. Sci Transl Med. 5 (214), 214ra170 (2013).
  31. Chen, Y., et al. Portable Coulter counter with vertical through-holes for high-throughput applications. Sensor Actuat B-Chem. 213, 375-381 (2015).
  32. Jagtiani, A., Carletta, J., Zhe, J. An impedimetric approach for accurate particle sizing using a microfluidic Coulter counter. J Micromech Microeng. 21 (4), 045036 (2011).
  33. Gold, R. Optimal binary sequences for spread spectrum multiplexing (Corresp). IEEE Trans. Inform. Theory. 13 (4), 619-621 (1967).
  34. Dinan, E., Jabbari, B. Spreading codes for direct sequence CDMA and wideband CDMA cellular networks. IEEE Commun Mag. 36 (9), 48-54 (1998).

Tags

Bioengenharia Edição 121 lab-on-a-chip microfluídica multiplexados citometria rastreamento de celular espacial sensoriamento pulso resistiva contador Coulter CDMA detecção ortogonal
Plataforma microfluídico com multiplexada detecção electrónica do Ordenamento do Rastreamento de Partículas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, N., Liu, R., Sarioglu, A. F.More

Wang, N., Liu, R., Sarioglu, A. F. Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles. J. Vis. Exp. (121), e55311, doi:10.3791/55311 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter