Summary
Demostramos una plataforma de microfluidos con una red de electrodo de superficie integrado que combina detección de pulso resistivo (RPS) con división de código de acceso múltiple (CDMA), para multiplexar la detección y el tamaño de las partículas en múltiples canales de microfluidos.
Abstract
procesamiento de muestras biológicas de microfluidos típicamente implica manipulaciones diferenciales de partículas en suspensión en virtud de diversos campos de fuerza con el fin de fraccionar espacialmente la muestra en base a una propiedad biológica de interés. Para la distribución espacial resultante para ser utilizado como la lectura del ensayo, los dispositivos de microfluidos a menudo se sometieron a análisis microscópico que requiere instrumentación compleja con mayor coste y la reducción de la portabilidad. Para hacer frente a esta limitación, se ha desarrollado una tecnología de detección electrónico integrado para la detección multiplexada de partículas en diferentes ubicaciones en un chip microfluídico. Nuestra tecnología, conocidos como códigos de microfluidos, combina pulso resistiva de detección con Acceso Múltiple por División de Código para comprimir la información espacial 2D en una señal eléctrica 1D. En este trabajo, presentamos una demostración práctica de la tecnología microfluídica CÓDIGOS para detectar y células cancerosas cultivadas tamaño distribuida a través de múltiples canales de microfluidos. Comovalidado por la microscopía de alta velocidad, nuestra tecnología puede analizar con precisión las poblaciones de células densas todo electrónicamente sin la necesidad de un instrumento externo. Como tal, los códigos de microfluidos pueden permitir potencialmente bajo coste dispositivos integrados lab-on-a-chip que están bien adaptados para la prueba de punto de atención de las muestras biológicas.
Introduction
La detección exacta y el análisis de las partículas biológicas tales como células, bacterias o virus en suspensión en el líquido es de gran interés para una serie de aplicaciones 1, 2, 3. Bien adaptado en tamaño, los dispositivos de microfluidos ofrecen ventajas únicas para este propósito, tales como alta sensibilidad, manipulación de la muestra suave y bien controlada microambiente 4, 5, 6, 7. Además, los dispositivos de microfluidos pueden ser diseñados para emplear una combinación de dinámica de fluidos y campos de fuerza para fraccionar pasivamente una población heterogénea de partículas biológicas en base a varias propiedades 8, 9, 10, 11, 12. En los dispositivoss, la distribución de partículas resultante se puede utilizar como lectura, pero la información espacial es típicamente accesible sólo a través de microscopía, lo que limita la utilidad práctica del dispositivo de microfluidos atándolo a una infraestructura de laboratorio. Por lo tanto, un sensor integrado que puede reportar fácilmente mapeo espacio-temporal partículas ', ya que son manipulados en un dispositivo de microfluidos, potencialmente puede permitir a bajo costo, dispositivos integrados lab-on-a-chip que son particularmente atractivo para el análisis de muestras en móvil , entornos con recursos limitados.
Electrodos de película delgada han sido utilizados como sensores integrados en dispositivos de microfluidos para diversas aplicaciones 13, 14. Pulso resistiva Sensing (RPS) es particularmente atractivo para la detección integrada de pequeñas partículas en los canales de microfluidos, ya que ofrece un mecanismo de detección de alto rendimiento robusto, sensible, y directamente a partir de mediciones eléctricas 15. En RPS, la modulación de impedancia entre un par de electrodos, inmerso en un electrolito, se utiliza como un medio para detectar una partícula. Cuando la partícula pasa a través de una abertura, de tamaño del orden de la partícula, el número y la amplitud de impulsos transitorios de la corriente eléctrica se utilizan para contar y partículas de tamaño, respectivamente. Por otra parte, la geometría de sensor puede ser diseñado con una resolución fotolitográfica para dar forma a las formas de onda de pulso de resistencia con el fin de aumentar la sensibilidad 16, 17, 18, 19 o para estimar la posición vertical de las partículas en los canales de microfluidos 20.
Recientemente hemos introducido una tecnología de detección de pulsos multiplexado resistivo escalable y sencilla llamada microfluídica Coded Ortogonal detección por detección eléctrica (CÓDIGOS microfluidos) 21. CÓDIGOS microfluidos se basa en unared interconectada de sensores de pulso resistivos, cada uno compuesto de una serie de electrodos micromaquinados para modular la conducción de una manera única, distinguibles, a fin de permitir la multiplexación. Hemos diseñado específicamente cada sensor para producir señales eléctricas ortogonales similares a los códigos digitales utilizados en división de código de acceso múltiple 22 (CDMA) las redes de telecomunicaciones, de modo que la señal de sensor de pulso resistiva individuo se puede recuperar de forma única a partir de una sola forma de onda de salida, incluso si las señales de diferentes sensores interfieren. De esta forma, nuestra tecnología comprime la información espacial en 2D de partículas en una señal eléctrica 1D, lo que permite el seguimiento de las partículas en diferentes ubicaciones en un chip microfluídico, manteniendo tanto del dispositivo y del sistema de nivel de complejidad a un mínimo.
En este trabajo, presentamos un protocolo detallado para métodos experimentales y computacionales necesarios para utilizar la tecnología de microfluidos CÓDIGOS, así como rresultados epresentante de su uso en el análisis de muestras biológicas simuladas. Utilizando los resultados de un prototipo de dispositivo con cuatro sensores multiplexados como un ejemplo para explicar la técnica, proporcionamos protocolos sobre (1) el proceso de microfabricación para crear dispositivos de microfluidos con la tecnología CÓDIGOS microfluidos, (2) la descripción de la configuración experimental que incluye el hardware electrónico, óptico, y fluídico, (3) el algoritmo de computadora para la decodificación de señales de interferencia de diferentes sensores, y (4) los resultados de la detección y el análisis de las células de cáncer en los canales de microfluidos. Creemos que utilizando el protocolo detallado se describe aquí, otros investigadores pueden aplicar nuestra tecnología para su investigación.
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Protocol
1. Diseño de electrodos de codificación
Nota: La Figura 1a muestra la estructura 3-D de los electrodos micropatterned.
- Diseñar un conjunto de cuatro códigos Gold de 7 bits para la codificación de los canales de microfluidos 23.
- La construcción de dos turnos de retroalimentación registros lineales (LFSRs), cada uno representando un polinomio primitivo.
- Usa los LFSR para generar un par preferido de m -sequences de 7 bits.
- Cíclicamente cambiar el par preferido de m -sequences y añadirlos en mod 2 para generar cuatro códigos Gold distintos.
- Diseñar la disposición de los electrodos de codificación (Figura 1b).
- Coloque tres terminales de los electrodos, lo que representa, y los electrodos de referencia positivos, negativos en tres esquinas.
- Ruta electrodo positivo y negativo traza en lados opuestos de cada canal de microfluidos.
- Extender los electrodos positivos y negativos en lacanales de microfluidos como los dedos de electrodo, siguiendo el código de Oro asignada de forma única (Figura 1c).
- Coloque el electrodo de referencia entre los dedos de los electrodos positivos y negativos.
- Coloque trazas electrodo positivo y negativo lejos de los dedos de electrodo de referencia más exteriores con el fin de minimizar la conducción eléctrica fuera de la región de codificación.
2. La microfabricación de electrodos de superficie
Nota: La Figura 2b muestra el proceso de fabricación de electrodos de superficie.
- Limpiar una oblea de vidrio de borosilicato de 4 pulgadas en una solución Piranha (ácido sulfúrico al 98%: 30% de peróxido de hidrógeno = 5: 1) a 120 ° C durante 20 min para eliminar todos los contaminantes orgánicos. A continuación, coloque la oblea en una placa caliente a 200 ° C durante 20 minutos para eliminar el agua residual.
- La transferencia de la oblea para un control de giro. Dispensar 2 fotorresistente negativo ml sobre la oblea y hacer girar la oblea a una velocidad de 3, 000 rpm durante 40 s para recubrir uniformemente la oblea con una capa fotorresistente 1,5-m.
- Colocar la oblea en una placa caliente a 150 ° C y hornear el fotoprotector hecho girar durante 1 min.
- Exponer la resina fotosensible a 365 nm de luz UV (225 mJ / cm2) a través de una máscara de cromo utilizando un alineador de máscara.
- Colocar la oblea en una placa caliente a 100 ° C y hornear el fotoprotector expuesto durante 1 min.
- Desarrollar la fotoprotección mediante la inmersión de la oblea en un revelador fotorresistente (RD6) durante 15 s. rociar suavemente con agua desionizada (DI) y lavar la oblea. Seca por soplado de nitrógeno comprimido.
- Coloque la oblea con fotorresistente diseñado en un evaporador de metal de haz de electrones, y depositar una película de cromo 20 nm de espesor, seguida por una película de oro de 80 nm de espesor sobre la oblea a una presión de base de 3 × 10 -6 Torr con una velocidad de depósito 1 a / s.
- Sumergir la oblea recubierta de metal en acetona en un conjunto de baño de ultrasonidos a una frecuencia de 40 kHz con 100% de amplitud durante 30 minutos a temperamento habitaciónATURALEZA para grabar la fotoprotección subyacente y completar el proceso de despegue.
- Se pica la oblea en trozos más pequeños usando una sierra de corte en dados convencional.
3. La fabricación de la SU-8 Molde para los canales de microfluidos
Nota: La figura 2a muestra el proceso de fabricación del molde para canales de microfluidos.
- Limpiar y hornear una oblea de silicio de 4 pulgadas utilizando el mismo procedimiento descrito en 2.1.
- La transferencia de la oblea para un control de giro. Verter 4 ml fotorresistente sobre la oblea. Escudo de la oblea con fotoprotector.
- Hacer girar la oblea a 500 rpm durante 15 s.
- Hacer girar la oblea a 1.000 rpm durante 15 s.
- Girar la oblea a 3000 rpm durante 60 s para obtener una capa fotorresistente gruesa 15-m uniformemente recubierto.
- Coloque la cara de la oblea en una sala limpia limpie empapado en acetona y eliminar el fotoprotector residual de la parte trasera y los bordes de la oblea.
- La transferencia de la oblea en una pl calientecomió para la cocción suave. En primer lugar, hornear la oblea a 65 ° C durante 1 min. A continuación, mueva rápidamente la oblea a una placa caliente 95 ° C y hornear durante 2 min.
- Exponer la resina fotosensible a 365 nm de luz UV (180 mJ / cm2) a través de una máscara de cromo mediante el uso de un alineador de máscara.
- Hornear el después de la exposición de la oblea a 65 ° C durante 1 min y después a 95 ° C durante 2 min.
- Sumergir la oblea en el revelador y agitar suavemente el recipiente durante 3 min. A continuación, enjuagar la oblea con el alcohol isopropanol (IPA) y se seca mediante soplado de nitrógeno comprimido. Si aparece un residuo de color blanco sobre la oblea, sumergirlo en el revelador nuevo y desarrollar de tiempo más largo y seco.
- Hornear la oblea en una placa caliente a 200 ° C durante 30 minutos para que se seque por completo.
- Medir el espesor de la resina fotosensible modelado usando un perfilómetro en diferentes lugares a través de la oblea para asegurar la uniformidad.
- Silanizar la oblea del molde mediante la utilización de la técnica de deposición de vapor. Añadir 200 l de trichlorosilane en una placa de Petri y el lugar en un desecador de vacío junto con la oblea de molde SU-8 durante 8 h.
4. Montaje de los códigos de dispositivo de microfluidos
- Colocar la oblea de silicio de 4 pulgadas con el molde en una placa de Petri de diámetro 150 mm, y fijarlo con cinta adhesiva de sus bordes.
- Mezclar el polidimetilsiloxano (PDMS) pre-polímero y reticulante en una relación de 10: 1, y verter 50 g de la mezcla en la placa de Petri. Coloque la placa de Petri en un desecador de vacío para desgasificar la mezcla durante 1 h, y luego curar en un horno a 65 ° C durante al menos 4 h (Figura 2a).
- Cortar la capa de PDMS curado utilizando un bisturí y despegarlo la oblea molde usando unas pinzas. El tamaño del dispositivo de prueba de principio es de aproximadamente 20 mm x 7 mm. Entonces perforar agujeros con un diámetro de 1,5 mm a través de los PDMS para la entrada y salida del canal microfluídico usando un golpeador biopsia.
- Limpiar el lado de la pieza modelada PDMS colocando it en una cinta adhesiva de sala limpia.
- Limpiar el sustrato de vidrio con electrodos de superficie, aclarándolo con acetona, IPA, agua desionizada y secar con nitrógeno comprimido.
- Activar las superficies de PDMS y el sustrato de vidrio en plasma de oxígeno durante 30 s con el lado de micromecanizado de cada parte hacia arriba en un generador de plasma RF fijado en 100 mW.
- Alinear el canal de microfluidos PDMS con electrodos de superficie sobre el sustrato de vidrio utilizando un microscopio óptico y a continuación, llevar las dos superficies de plasma activado en contacto físico.
- Hornear el dispositivo sobre una placa caliente a 70 ° C durante 5 minutos, con el lado del vidrio frente a la placa caliente.
- Conectar los adaptadores de contacto de los electrodos con cables por soldadura.
5. Preparación de la muestra simulada Biológica
- Cultivar las células de cáncer de ovario humano HeyA8 en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina en 5% de CO2 a 37 ° Chasta que alcanzan 80% de confluencia.
- Aspirar los medios de comunicación del matraz de cultivo usando una pipeta de vidrio. Dispensar y luego solución salina de fosfato tamponada aspirado 1x (PBS) para lavar las células.
- Se incuban las células en 2 ml de 0,05% (w / v) de solución de tripsina durante 2 min a 37 ° C la suspensión de células adherentes. A continuación, añadir 4 ml de los medios de cultivo para neutralizar la tripsina.
- Se centrifuga la suspensión celular a 100 × g durante 5 min para sedimentar las células en un tubo de ensayo. Entonces, Aspirar el sobrenadante por completo.
- Vuelva a suspender las células en 1-2 ml de PBS 1x pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para grupos de células se disocian mecánicamente.
- Dibuje una pequeña cantidad de la suspensión celular en una pipeta y contar el número de células utilizando un hemocitómetro.
- Se diluye la suspensión celular con PBS para preparar una muestra con una concentración final de células de 10 5 -10 6 células / ml.
6. Ejecución de los códigos de dispositivo de microfluidos
Nota: Fifigura 3 muestra el montaje experimental.
- Coloque el dispositivo de microfluidos CÓDIGOS en el escenario de un microscopio óptico.
- Aplicar una onda sinusoidal 400 kHz al electrodo de referencia en el chip usando un generador de función electrónica.
- Conectar los electrodos de detección positiva y negativa a dos amplificadores trans-impedancia independientes para convertir señales de corriente de cada una de las señales de tensión.
- Restar la señal de tensión de electrodo de detección positiva de la señal de voltaje de electrodo de detección negativa usando un amplificador de voltaje diferencial con el fin de obtener una señal bipolar.
- Utilice una cámara de alta velocidad de operación de grabación óptica del dispositivo para fines de validación y caracterización.
- Conduce la suspensión de células a través del dispositivo de microfluidos CÓDIGOS a un caudal constante (50-1,000 l / h) usando una bomba de jeringa.
- Medir la señal de modulación de impedancia usando un amplificador lock-in.
- Conectar la señal de CA referencia a que el árbitrorencia de entrada del amplificador lock-in. Conectar la señal diferencial bipolar al amplificador lock-in como señal de entrada.
- Obtener la amplitud RMS de la señal diferencial a partir de la salida del amplificador lock-in.
- Muestrear la señal de salida del amplificador lock-in a 1 MHz tasa en un ordenador a través de una tarjeta de adquisición de datos para su posterior análisis.
7. Tratamiento de señales de los sensores
- Transferir datos eléctricas registradas en MATLAB para el post-procesamiento y decodificación.
- Se filtra la señal grabada en el dominio digital usando un filtro de Butterworth (MATLAB función incorporada) para eliminar el ruido de alta frecuencia (> 2,5 kHz).
- Generar una biblioteca de código de la plantilla de las señales del sensor.
- Identificar señales de código no se solapan representativos correspondientes a cada sensor en el dispositivo y extraer estos bloques de señal del conjunto de datos de forma de onda como vectores separados.
- Normalizar cada plantilla de forma de onda de código vectorpor su poder. Utilice el MATLAB función incorporada (bandpower) para medir la potencia de la señal.
- Utilice la función MATLAB (volver a muestrear) para expandir la biblioteca de la plantilla mediante la creación de versiones de digitalmente señales de código normalizadas con diferentes duraciones para acomodar las variaciones en la velocidad de flujo de células sobre los electrodos.
- Identificar los bloques de señal que se corresponden con sensor de actividad (umbral: SNR> 12 dB) en la forma de onda filtrada. Forma de onda con SNR bajo el umbral sería tratado como ruido.
- Decodificar bloques individuales de la actividad del sensor en la señal grabada mediante el uso de un algoritmo iterativo basándose en la cancelación sucesiva de interferencias, una técnica comúnmente empleada en las redes de comunicación CDMA de múltiples usuarios 24, 25.
- Calcular la correlación cruzada de la señal de cada bloque con todas las plantillas de la biblioteca usando deslizamiento producto escalar.
- Identificar la plantilla que produce la largEste valor máximo de autocorrelación para determinar la señal de código de sensor individuo dominante. Registre el tiempo y la amplitud del pico de autocorrelación.
- Construir una señal de código de sensor estimación escalando la plantilla de código identificado a partir de la amplitud de pico de autocorrelación medida y la información de tiempo (determinado en la etapa 7.5.2).
- Restar la señal de código del sensor estimadas a partir de los datos originales.
- Iterar el proceso de 7.5.1, hasta que la señal residual no se parece a ninguna señal en la biblioteca de plantillas, matemáticamente definido como el coeficiente de correlación es menor que 0,5.
- Refinar las estimaciones iniciales de las señales del sensor paso 7.5 utilizando un proceso de optimización.
- Reconstruir la señal mediante la adición de señales de los sensores individuales estimados a partir de cada iteración.
- Barrer la amplitud, la duración y la sincronización de las señales de los sensores individuales en torno a las estimaciones originales para producir el mejor ajuste con la señal eléctrica registradabasado en la aproximación por mínimos cuadrados 26.
- Convertir amplitudes de las señales del sensor estimadas en el tamaño celular calibrando las señales eléctricas contra las imágenes ópticas.
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Representative Results
Un dispositivo de microfluidos CÓDIGOS que consta de cuatro sensores distribuidos sobre cuatro canales de microfluidos se muestra en la Figura 1b. En este sistema, la sección transversal de cada canal microfluídico fue diseñado para ser cerca del tamaño de una célula de modo que (1) múltiples células no pueden pasar por encima de los electrodos en paralelo y (2) las células se mantienen cerca de los electrodos de aumentar la sensibilidad . Cada sensor está diseñado para generar un código digital único 7 bits. A continuación, el dispositivo se ha probado el uso de una suspensión celular. Las señales eléctricas registradas correspondientes a cuatro sensores individuales se muestran con códigos digitales ideales asociados en la Figura 4. señales registradas coinciden estrechamente con los pulsos cuadrados ideales, mientras que sí existen pequeñas desviaciones. Tales desviaciones resultan de una combinación de varios factores, entre ellos el campo eléctrico no uniforme entre los electrodos coplanares, el acoplamiento entre los diferentes pares de electrodos, de forma esféricacélulas, así como la velocidad de flujo constante de células en los canales de microfluidos. Hemos creado una biblioteca de plantillas basado en las señales de los sensores recodificados. Mediante la correlación de las señales registradas con todas las plantillas en la biblioteca, se determinó una plantilla que produce el máximo del pico de auto-correlación (Figura 4). Como los códigos digitales para canales microfluídicos están diseñadas para ser ortogonales entre sí, un pico de autocorrelación dominante robustamente podría ser identificado en este proceso. Usando este enfoque, se podría determinar computacionalmente el canal microfluídico la célula pasa a través de, la duración de la señal de sensor, y por lo tanto la velocidad de flujo de la célula.
La tecnología CÓDIGOS de microfluidos puede resolver situaciones en las que múltiples células interactúan simultáneamente con electrodos de codificación. Cuando se producen tales solapamientos, las señales de los sensores individuales interfieren y la forma de onda resultante no pueden ser fácilmente asociados con cualquierúnica plantilla correspondiente a un sensor específico. Decodificar con precisión tales señales superpuestas es particularmente importante para las muestras de alta densidad de procesamiento confiable, donde las interferencias son más probable que ocurra. Para resolver eventos superpuestos, hemos desarrollado un algoritmo iterativo basado en un esquema de cancelación de interferencia sucesiva (SIC) 24, 25, que normalmente se utiliza para la detección multi-usuario en las redes de comunicación CDMA. La Figura 5 muestra cómo el algoritmo de SIC se implementa en la resolución de una forma de onda que resultó de cuatro celdas superpuestas en cuatro diferentes canales de microfluidos. En cada iteración, se determinó primero el pico de autocorrelación dominante (Figura 5a, 2 columna nd), correspondiente a la señal de interferencia más fuerte, mediante la correlación de la forma de onda de entrada (Figura 5a, 1 columna st) con la biblioteca de plantillas. Sobre la base de la plantilla seleccionada y tque el consiguiente deterioro de la amplitud de auto-correlación, que estima entonces el más fuerte señal interferente (Figura 5a, la columna 3 rd) y se resta desde la forma de onda de entrada. La forma de onda restante se pasa a la siguiente iteración que la entrada. Este proceso continúa hasta que la correlación de la señal residual con la biblioteca de plantillas no produjo un claro pico de auto-correlación (Figura 5a, 5ª fila, 2ª parcela). Después de la terminación del proceso de cancelación de interferencia, hemos reconstruido una estimación de la forma de onda mediante la combinación de todas las señales estimadas de cada iteración (Figura 6a). El uso de un proceso de optimización basado en una aproximación de mínimos cuadrados para minimizar el error cuadrático medio entre la forma de onda original y la señal reconstruida, actualizamos nuestras estimaciones para la amplitud, duración y tiempo relativo de las señales de código de sensor individuales (Figura 6b). También estima que el tamaño delas células detectadas basadas en la amplitud de las señales de los sensores individuales estimados. Para lograr esto, calibró el amplitudes de señal eléctricas con tamaños de celda ópticamente medidos utilizando regresión lineal (Figura 6b). Una comparación de nuestros resultados de los códigos de microfluidos con la información obtenida de las imágenes de microscopio de alta velocidad simultáneamente grabadas muestra que el tamaño de celda y la velocidad se pueden medir con precisión, lo que valida nuestros resultados (Tabla 1). La figura 6c muestra la imagen grabada simultáneamente microscopía de alta velocidad que se utiliza para validar el resultado de la descodificación.
Para demostrar la reproducibilidad de los resultados y también el rendimiento de la tecnología CÓDIGOS microfluídica para un procesamiento de muestras de alto rendimiento, se analizaron las señales eléctricas correspondientes a> 1000 células. Las señales se descodifican automáticamente en MATLAB mediante la ejecución del algoritmo explicadoarriba y la exactitud de los resultados se evaluó mediante la comparación directa con los resultados de los datos ópticos del vídeo de alta velocidad registrado simultáneamente. Nuestro análisis indica que las señales eléctricas del 96,15% de las células (973 / 1.012) se descodifican con precisión. tasa de éxito para la decodificación de señales de las células que no se solapan y superpuestas es 98,71% (688/697) y 90,48% (285/315), respectivamente.
Figura 1. Diseño del dispositivo de microfluidos CÓDIGOS de cuatro canales. (A) Los electrodos en cada canal de microfluidos se micropatterned para generar un código digital único. La modulación de impedancia debido a las interacciones secuenciales de células que fluye con pares de electrodos conduce a impulsos eléctricos. Una imagen de microscopio del dispositivo de microfluidos CÓDIGOS (b). Durante el proceso de fabricación, el sustrato de vidrio con electrodos de superficie de codificación está alineado con canales de microfluidos PDMS bajo un microscopio. (C) Un primer plano la imagen de electrodos de superficie que producen secuencias codificadas de oro de 7 bits: "1010110", "0111111", "0100010", "0011000". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Proceso de microfabricación. (A) Los canales de microfluidos PDMS se fabrican usando litografía blanda 27. (B) Los electrodos de superficie se fabrican mediante un procedimiento de despegado. (C) Un diagrama esquemático de la sección transversal del dispositivo final. PDMS canales de microfluidos se alinean y se unen al sustrato de vidrio con electrodos de superficie. jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Arreglo experimental. Usando una bomba de jeringa, la suspensión de células se ejecuta a través del dispositivo de microfluidos CÓDIGOS a un caudal constante. Una señal de CA 400 kHz se aplica al electrodo de referencia utilizando un generador de funciones. señales de corriente de electrodos de detección de positivos y negativos se convierten primero en señales de voltaje utilizando dos amplificadores de transimpedancia y se restan entre sí usando un amplificador diferencial. La señal bipolar diferencial se extrae por un amplificador lock-in y luego muestreado en un ordenador para procesamiento de señales y de decodificación. La microscopía óptica de alta velocidad se utiliza para operaciones de grabación óptica del dispositivo para fines de validación y caracterización.e.jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Las señales eléctricas registradas de sensores individuales y sus correlaciones. señales grabadas y su correlación con los demás se dan para cuatro sensores de pulso resistiva de código multiplexado. Sensor 1 (a), el sensor 2 (b), sensor 3 (c) y el sensor 4 (d) se han diseñado para producir formas de onda digitales 7 bits "1010110", "0111111", "0100010", y "0011000", respectivamente . Para cada sensor, la figura superior muestra que la señal normalizada registrada de cada sensor coincide estrechamente con la secuencia de pulso cuadrado ideal que el sensor ha sido diseñado para producir. Para cada sensor, el panel inferior muestra la señal del sensor grabada9; s de autocorrelación y correlación cruzada con señales correspondientes a otros tres sensores de código multiplexado en la red. En todos los casos, un pico de autocorrelación robusta puede ser identificada debido a que los códigos digitales de los sensores individuales están diseñadas para ser ortogonales entre sí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. La decodificación de una forma de onda solapada con sucesiva cancelación de interferencia. En cada iteración, la forma de onda de entrada (1 columna st) se correlaciona con la biblioteca de plantillas premontado para identificar la plantilla específica que da como resultado la amplitud máxima correlación (2 columna nd). El uso de esta plantilla específica, la señal interferente más fuerte se estima en base a la amplitudy la información de temporización desde el pico de correlación (columna 3 rd). La señal estimada se resta de la forma de onda original, cancelando la interferencia más fuerte debido a la celda más grande. El proceso se itera hasta que no pico de correlación puede ser determinada (es decir, el coeficiente de correlación <0,5) en la señal residual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Análisis resultado de la descodificación. (A) Las señales estimadas se refinado basan en un algoritmo de optimización que tiene como objetivo obtener el mejor ajuste entre la reconstruida y la forma de onda original grabado usando la aproximación de mínimos cuadrados. (B) Al final del proceso de optimización,el tiempo y la amplitud de las señales calibradas reflejan con precisión los parámetros de la celda medidos por microscopía de alta velocidad. (C) Imagen de microscopía de alta velocidad registradas simultáneamente valida los resultados de las mediciones eléctricas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| tipo de medición | r CH1 (micras) | r ch2 (m) | r CH3 (m) | r CH4 (m) | Dt 1 (ms) | T 2 (ms) | Dt 3 (ms) |
| Eléctrico | 8.010 | 6.490 | 5.300 | 6.550 | 0,465 | 1.705 | 0,744 |
| Óptico | 8.320 | 6.770 | 5.680 | 7.040 | 0,375 | 1.625 | 0.750 |
Tabla 1. Comparación de los parámetros celulares medidos eléctricamente y ópticamente de la Figura 6b. Para validar nuestras estimaciones, que ópticamente midieron los tamaños de celda de la imagen de microscopía de alta velocidad. La temporización relativa entre diferentes células se mide ópticamente a partir del número de tramas entre las células en el vídeo de alta velocidad de grabación a 8,000 cuadros por segundo.
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Discussion
Sensores resistivos múltiples previamente se han incorporado en los chips de microfluidos 28, 29, 30, 31, 32. En estos sistemas, sensores de pulso de resistencia fueron, o bien no multiplexadas 28, 29, 30, 31 o que requieren sensores individuales a ser conducidos a diferentes frecuencias 32. En ambos casos, se necesitan conexiones externas dedicado para cada sensor de pulso resistiva en el chip y por lo tanto un gran número de sensores no podrían integrarse sin una mayor complejidad del hardware. La ventaja importante de CÓDIGOS microfluídicos es que permite la lectura simultánea de múltiples sensores de pulso resistiva de una sola salida en un dispositivo simple. Esto lo conseguimos mediante la utilización de multiplexing técnicas comúnmente utilizadas en telecomunicaciones para el diseño de sensores de pulso resistiva micromecanizadas integrados en dispositivos de microfluidos. En esencia, nuestra tecnología se basa en la codificación multiplexada de una red de contadores de Coulter en el chip mediante el diseño de cada uno para producir una señal distinguible cuando se detecta una partícula. Cada sensor micromecanizado de la red consiste en múltiples electrodos de superficie coplanar ordenadas en diferentes configuraciones tales que la interacción secuencial de partículas que fluye con estos electrodos produce modulaciones de impedancia ortogonales formas de onda. Para dar cabida a la interacción de partículas sensor asincrónico, que específicamente diseñado cada sensor para producir códigos Gold 33, códigos digitales seudo-ortogonales que se utilizan típicamente en el enlace ascendente de las redes de telecomunicaciones CDMA. Códigos Gold mantener un cierto nivel de ortogonalidad, incluso cuando están mal alineados con las diferencias de fase aleatoria 34.
MiCÓDIGOS crofluidic es fácilmente escalable. A pesar de que se presentaron los resultados de un prototipo de dispositivo de microfluidos CÓDIGOS con cuatro sensores en el presente documento, más sensores se pueden incorporar en el dispositivo cuando está diseñado para producir señales de salida distinguibles del resto. Una forma de ampliar la red de sensores es el diseño de sensores basados en grandes conjuntos de códigos ortogonales con códigos digitales más largos. Ya los códigos ortogonales con más bits proporcionan una mayor ganancia de procesamiento en la decodificación y se pueden distinguir unos de otros cuando hay interferencias. Por otro lado, los códigos de tiempo de oro en el dispositivo también significa volumen de detección más grande, lo que aumenta el número esperado de sensores de interferencia. Del mismo modo, el aumento del número de sensores para una densidad de muestra dada conducirá a más partículas superpuestas debido a un aumento en el volumen general de detección. Como tal, la densidad de las partículas en la muestra es un parámetro crítico que debe ser considerado en el uso de la tecnología CÓDIGOS microfluidos. El máximo pdensidad artículo que se puede resolver (en analogía con la capacidad del canal de una red de telecomunicaciones CDMA) depende de varios factores tales como las señales individuales de los sensores y su relación, el esquema de decodificación, la disposición del dispositivo de microfluidos, y el nivel de ruido electrónico. Dependiendo de la aplicación, la muestra puede ser diluida para llegar a una densidad de partícula que produce una tasa de error aceptable.
Desde la perspectiva de procesamiento de señales, la decodificación de las formas de onda de tiempo de un dispositivo de microfluidos CÓDIGOS no es computacionalmente intensivo utilizando los sistemas actuales como se evidencia por el hecho de que las comunicaciones de teléfono celular en una red CDMA se pueden demultiplexar en tiempo real. Por otra parte, los acontecimientos físicos para ser decodificados en dispositivos de microfluidos suceda mucho más lenta que la velocidad de transmisión de bits en las comunicaciones de telefonía celular que nos permite utilizar más avanzado y requiere mucho tiempo los algoritmos, como SIC y la optimización de procesos, que utilizamos para resolver iterativamente si se superponenertas señales de los sensores.
Tomados en conjunto, los códigos de microfluidos es una tecnología versátil, escalable electrónico de detección que se puede integrar fácilmente en diversos dispositivos microfluídicos para realizar ensayos cuantitativos mediante el seguimiento de partículas a medida que se procesan en el chip. La tecnología es muy fácil de implementar, debido a que (1) es muy simple desde el punto de vista de hardware (2) es directamente compatible con el litografía blanda (3) que proporciona una lectura electrónica directa sin ningún componente activo en el chip, y (4) que se basa en sencillos algoritmos de cálculo para el procesamiento de señales e interpretación de datos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 98% Sulfuric Acid | BDH Chemicals | BDH3074-3.8LP | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BDH Chemicals | BDH7690-3 | |
| Trichlorosilane | Aldrich Chemistry | 235725-100G | |
| NR9-1500PY Negative Photoresist | Furuttex | ||
| Resist Developer RD6 | Furuttex | ||
| Acetone | BDH Chemicals | BDH1101-4LP | |
| SU-8 2015 Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y010200 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| Isopropyl Alcohol | BDH Chemicals | BDH1133-4LP | |
| RPMI 1640 | Corning Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Amresco | K952-100ML | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CM | |
| PHD 22/2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2001 | |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instrument | ||
| HF2TA Current Amplifier | Zurich Instrument | ||
| Eclipse Ti-U Microscope | Nikon Corporation | ||
| DS-Fi2 High-Definition Color Camera | Nikon Corporation | ||
| v7.3 High-speed Camera | Phantom | ||
| PCIe-6361 Data Acquisition Board | National Instruments | 781050-01 | |
| BNC-2120 Shielded Connector Block | National Instruments | 777960-01 | |
| PX-250 Plasma Treatment System | Nordson MARCH |
References
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