Summary
Vi viser en mikrofluid plattform med integrert flate elektrode-nettverk som kombinerer resistive pulsføle (RPS) med kodedelt multippelaksess (CDMA) for å multiplekse deteksjon og dimensjonering av partikler i flere microfluidic kanaler.
Abstract
Microfluidic behandling av biologiske prøver vanligvis innebærer differensial manipulasjoner av suspenderte partikler under ulike kraftfelt for å romlig fraksjonere prøven basert på en biologisk egenskap av interesse. Til den resulterende romlige fordeling som skal brukes som analyse avlesning, blir microfluidic anordninger ofte utsatt for mikroskopisk analyse krever komplisert instrumentering med høyere kostnader og redusert portabilitet. For å møte denne begrensningen, har vi utviklet en integrert elektronisk sensing teknologi for multiplex deteksjon av partikler på forskjellige steder på en microfluidic chip. Vår teknologi, kalt mikrofluid KODER, kombinerer Resistive Pulse Sensing med Kode Division Multiple Access til å komprimere 2D romlig informasjon i en 1D elektrisk signal. I denne artikkelen presenterer vi en praktisk demonstrasjon av mikrofluid KODER teknologi for å oppdage og størrelse dyrkede kreftceller fordelt over flere microfluidic kanaler. Somvalidert av høyhastighets mikroskopi, kan vår teknologi nøyaktig analysere tette cellepopulasjoner all elektronisk uten behov for en ekstern instrument. Som sådan kan microfluidic KODER potensielt gjøre det mulig lavkost integrerte lab-on-a-chip enheter som er godt egnet for point-of-care testing av biologiske prøver.
Introduction
Nøyaktig deteksjon og analyse av biologiske partikler som celler, bakterier eller virus suspendert i væsken er av stor interesse for en rekke programmer 1, 2, 3. Godt matchet i størrelse, microfluidic enheter tilbyr unike fordeler for dette formålet som høy følsomhet, milde prøve manipulasjon og godt kontrollert mikro 4, 5, 6, 7. I tillegg kan microfluidic enheter være konstruert for å anvende en kombinasjon av fluid-dynamikk og kraftfelt for å passivt fraksjonere en heterogen populasjon av biologiske partikler basert på forskjellige egenskaper til 8, 9, 10, 11, 12. I de enhetss, kan den resulterende partikkelfordelingen bli brukt som utlesning, men romlig informasjon er vanligvis kun tilgjengelig gjennom mikroskopi, noe som begrenser den praktiske nytten av mikrofluid anordningen ved å binde den til et laboratorium infrastruktur. Derfor er en integrert sensor som lett kan rapportere partiklenes spatiotemporal kartlegging, som de er manipulert på en mikrofluidteknisk enhet, kan potensielt gjøre det mulig med lave kostnader, integrert lab-på-en-brikke enheter som er spesielt attraktivt for testing av prøver i mobil , ressursbegrenset innstillinger.
Tynnfilmelektroder har vært brukt som integrerte sensorer i microfluidic anordninger for ulike applikasjoner 13, 14. Resistive Pulse Sensing (RPS) er spesielt attraktivt for integrert sensing av små partikler i microfluidic kanaler som det gir en robust, følsom, og høy gjennomstrømming deteksjon mekanisme direkte fra elektriske målinger 15. I RPS, impedansen modulasjon mellom et par elektroder, nedsenket i en elektrolytt, blir brukt som et middel for å detektere en partikkel. Når partikkelen passerer gjennom en åpning, størrelse av størrelsesorden av partikkelen, blir antallet og amplituden av transiente pulser i den elektriske strøm som brukes til å telle og størrelse partikler, respektivt. Videre kan sensorgeometri være utformet med en fotolitografisk oppløsning for å forme resistive pulsbølgeformer for å øke følsomheten 16, 17, 18, 19 eller for å estimere vertikal stilling av partikler i microfluidic kanalene 20.
Vi har nylig introdusert en skalerbar og enkel multiplex resistive puls sensing teknologi som kalles mikrofluid Coded Orthogonal Påvisning av elektrisk Sensing (mikrofluid KODER) 21. Microfluidic KODER er avhengig av eninnbyrdes forbundet nettverk av motstandspulssensor, som hver består av en oppstilling av elektroder mikromaskinert å modulere ledning i en unik identifiserbar måte, for derved å muliggjøre multipleksing. Vi har spesielt utviklet for hver sensor for å frembringe ortogonale elektriske signaler tilsvarende de digitale koder som brukes i kodedelt multippelaksess 22 (CDMA) telekommunikasjonsnett, slik at den enkelte resistive pulssensorsignalet være entydig utvinnes fra et enkelt utgangsbølgeform, selv om signalene fra forskjellige sensorer forstyrre. På denne måten komprimerer vår teknologi 2D romlig informasjon av partikler inn i en 1D elektrisk signal, som tillater overvåking av partikler på forskjellige steder på et mikrofluid brikke, samtidig som både enhets- og system-nivå kompleksitet til et minimum.
I denne artikkelen presenterer vi en detaljert protokoll for eksperimentelle og beregningsmetoder som er nødvendige for å bruke mikrofluid KODER teknologi, samt representative resultater fra dens anvendelse ved analyse av simulerte biologiske prøver. Ved hjelp av resultatene fra en prototype enhet med fire multipleksede sensorer som et eksempel for å forklare teknikken, gir vi protokoller på (1) microfabrication prosessen for å skape microfluidic enheter med mikrofluidKODER teknologi, (2) beskrivelsen av eksperimentelle oppsettet inkludert elektronisk, optisk, og fluid maskinvare, (3) en datamaskinalgoritme for dekoding av interfererende signaler fra forskjellige sensorer, og (4) resultatene fra deteksjon og analyse av kreftceller i microfluidic kanaler. Vi tror at ved å bruke detaljert protokoll beskrevet her, kan andre forskere benytte vår teknologi for sin forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design av Coding Elektroder
Merk: Figur 1a viser den 3-D struktur av micropatterned elektrodene.
- Utforme et sett med fire 7-bits gull koder for å kode microfluidic kanaler 23.
- Konstruer to lineære tilbakemeldingsskiftregistre (LFSRs), som hver representerer en primitiv polynom.
- Bruk LFSRs å generere en foretrukket par av syv-biters m -sequences.
- Syklisk skifte den foretrukne par m -sequences og legge dem i mod 2 til å generere fire distinkte Gold koder.
- Design utformingen av koding elektroder (Figur 1b).
- Plasser tre elektrodeterminaler, som representerer de positive, negative og referanseelektroder på tre hjørner.
- Rute positiv og negativ elektrode spor på motsatte sider av hver mikrofluidkanal.
- Forlenge positive og negative elektroder, og imicrofluidic kanaler som elektrodefingre, som følge av unikt vis tildelt Gold-kode (Figur 1c).
- Plassere referanseelektroden i mellom de positive og negative elektrodefingre.
- Plasser positive og negative elektrode spor langt fra de ytterste referanseelektrodefingrene for å minimalisere elektrisk ledning utenfor det kodende område.
2. microfabrication av Surface Elektroder
Merk: Figur 2b viser fremstillingsprosessen av overflateelektroder.
- Rengjøre en fire-tommers borsilikatglass platen i en piraja oppløsning (98% svovelsyre: 30% hydrogenperoksyd = 5: 1) ved 120 ° C i 20 minutter for å fjerne alle organiske forurensninger. Deretter plassere skiven på en 200 ° C varm plate i 20 min for å fjerne gjenværende vann.
- Overfør wafer til en spinner. Dispensere 2 ml negativ fotoresist på skiven og roterer skiven med en hastighet på 3000 opm i 40 s til jevnt belegge wafer med en 1,5 um fotoresistlaget.
- Plassere skiven på en 150 ° C varm plate og bake den spunnede fotoresisten i 1 min.
- Utsett fotoresist til 365-nm UV-lys (225 mJ / cm 2) gjennom en krom maske ved hjelp av en maske aligner.
- Plassere skiven på en 100 ° C varm plate og bake de eksponerte fotoresist i 1 min.
- Utvikle fotoresisten ved å dyppe den platen i en fotoresist utvikler (RD6) i 15 sek. Forsiktig spray deionisert (DI) vann og vask skiven. Tørr ved å blåse komprimert nitrogen.
- Plasser wafer med mønstrede fotoresist i en e-beam metall fordamper, og avsette et 20 nm tykt krom film, etterfulgt av en 80-nm-tykk gullfilm på skiven ved et basistrykk på 3 x 10 -6 Torr med en avsetningshastighet på 1 A / s.
- Senkes ned metall-belagt skive i aceton i et ultrasonisk bad innstilt på en frekvens på 40 kHz med 100% amplitude i 30 minutter ved værelses hodetperatur å etse den underliggende fotoresist og fullføre lift-off prosess.
- Skjær platen i mindre biter ved hjelp av en konvensjonell sag oppdeling.
3. Fabrikasjon av SU-8 Mold for microfluidic kanaler
Merk: Figur 2a viser fremstillingsprosessen av støpeformen for microfluidic kanaler.
- Rengjør og bake en 4-tommers silisium wafer ved hjelp av samme prosedyre som er beskrevet i 2.1.
- Overfør wafer til en spinner. Hell 4 ml fotoresist på skiven. Coat wafer med fotoresist.
- Spin skiven ved 500 opm i 15 s.
- Spinn wafer ved 1000 rpm i 15 s.
- Spin skiven ved 3000 rpm i 60 s for å oppnå et jevnt belegg 15 um tykt sjikt fotoresist.
- Plasser wafer forsiden opp på et renrom tørk dynket i aceton og fjerne rest fotoresist fra baksiden og kantene på wafer.
- Overfør wafer på en varm plspiste for myk baking. Først bake skiven ved 65 ° C i 1 min. Så raskt flytte wafer til en 95 ° C varm plate og stek i 2 min.
- Utsett fotoresist til 365-nm UV-lys (180 mJ / cm 2) gjennom en krom maske ved hjelp av en maske aligner.
- Bake skiven etter eksponering ved 65 ° C i 1 min og deretter ved 95 ° C i 2 min.
- Senk wafer i utbygger og rist forsiktig på beholderen for 3 min. Deretter skylle wafer med isopropanol alkohol (IPA) og tørk den ved å blåse komprimert nitrogen. Hvis en hvit-farget rester vises på wafer, dyppe den i utvikleren igjen og utvikle for lengre tid og tørr.
- Bake platen på en 200 ° C varm plate i 30 minutter for å tørke den fullstendig.
- Måle tykkelsen av det mønstrede fotoresist ved hjelp av et profilometer på forskjellige steder over hele skiven for å sikre ensartethet.
- Silanize formplaten ved å utnytte teknikken for dampavsetning. Tilsett 200 mL av trichlorosilane i en petriskål, og plasser i en vakuumeksikator sammen med SU-8 formplaten i 8 timer.
4. Montering av microfluidic KODER Device
- Plasser 4-tommers silisium wafer med formen i en 150-mm diameter petriskål, og fikse det ved taping fra kantene.
- Bland polydimetylsiloksan (PDMS) pre-polymer og tverrbindingsmiddel i et forhold på 10: 1, og helle 50 g av blandingen i petriskål. Sett petriskål i en vakuum-eksikator for å avgasse blandingen i 1 time, og deretter herde den i en ovn ved 65 ° C i minst 4 timer (Figur 2a).
- Skjær ut herdet PDMS lag ved hjelp av en skalpell og skrelle den av formen wafer ved hjelp av en pinsett. Størrelsen på proof-of-prinsipp anordningen er omtrent 20 mm x 7 mm. Deretter lage hull med en diameter på 1,5 mm gjennom PDMS for innløp og utløp av mikrofluidkanalen ved hjelp av en biopsi puncher.
- Rens det mønstrede side av PDMS del ved å plassere it på en ren-rom tape.
- Rengjør glasset underlaget med overflateelektroder ved å skylle den med aceton, IPA, DI vann og tørk ved hjelp av komprimert nitrogen.
- Aktiverer overflatene av PDMS og glass-substrat i oksygenplasma i 30 s med den mikromaskinerte side av hver del vender opp i en RF-plasmagenerator satt til 100 mW.
- Juster PDMS microfluidic kanal med overflateelektroder på glasset underlaget med en optisk mikroskop og deretter bringe de to plasma-aktivert overflater i fysisk kontakt.
- Bake til enheten på en 70 ° C varm plate i 5 min, med glasset siden som vender mot den varme platen.
- Koble kontaktflatene til elektrodene med ledningene ved lodding.
5. Utarbeidelse av simulert biologisk prøve
- Kultur de HeyA8 human ovarian cancer celler i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin i 5% CO2 atmosfære ved 37 ° Cinntil de når 80% samløpet.
- Aspirer media fra kulturflaske ved hjelp av et glass pipette. Dispensere og deretter aspireres 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) for å vaske cellene.
- Inkuber cellene i 2 ml 0,05% (vekt / volum) trypsin-løsning i 2 minutter ved 37 ° C for å suspendere adherente celler. Deretter legger 4 ml av kulturen media for å nøytralisere trypsin.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 100 x g i 5 minutter for å pelletere cellene i et reagensrør. Deretter aspirer supernatanten helt.
- Re-suspendere cellene i 1-2 ml 1x PBS ved forsiktig pipettering opp og ned til mekanisk distansere celleklumper.
- Tegn en liten mengde av cellesuspensjonen i en pipette og telle antallet celler ved hjelp av hemocytometer.
- Fortynn cellesuspensjonen med PBS for å fremstille en prøve med endelig cellekonsentrasjon på 10 5 -10 6 celler / ml.
6. Kjøre mikrofluidKODER Device
Merk: Fifigur 3 viser eksperimentelle oppsettet.
- Plasser mikrofluid KODER enhet på scenen av en optisk mikroskop.
- Anvende en 400 kHz sinusbølge til referanseelektroden på brikken ved hjelp av en elektronisk funksjonsgenerator.
- Koble til positive og negative føleelektrodene til to uavhengige trans-impedans forsterkere for å konvertere strømsignalene fra hver til spenningssignaler.
- Trekk fra den positive elektrode følespenningssignal fra den negative elektrode følespenningssignal ved hjelp av et differensialspenningsforsterker for å oppnå en bipolar signal.
- Bruk en høyhastighetskamera til optisk posten drift av enheten for validering og karakterisering formål.
- Kjør cellesuspensjonen gjennom mikrofluidKODER enheten ved en konstant strømningshastighet (50-1,000 pl / t) ved hjelp av en sprøytepumpe.
- Mål impedans modulasjon signal ved hjelp av en lock-forsterker.
- Koble vekselstrømsreferansesignal til dommerenerence inngang på lock-forsterker. Koble differensial bipolar signal til lock-in forsterker som inngangssignal.
- Oppnå RMS-amplituden av differensialsignalet fra synkroniseringsforsterkeren utgang.
- Smak den lock-in forsterker utgangssignal på 1 MHz hastighet inn i en datamaskin via en datainnsamling brett for videre analyse.
7. Behandling av sensorsignaler
- Overfør registrerte elektriske data i MATLAB for etterbehandling og dekoding.
- Filtrer det innspilte signal i det digitale domenet ved bruk av en Butterworth filter (MATLAB innebygd funksjon) for å fjerne høyfrekvent støy (> 2,5 kHz).
- Generere en mal kodebibliotek fra sensorsignaler.
- Identifisere representative ikke-overlappende kodesignaler som svarer til hver sensor i enheten og trekke disse signal kvartaler fra datasettet som separate kurve vektorer.
- Normal hver mal kode bølgeform vektorav sin makt. Bruk MATLAB innebygd funksjon (bandpower) for å måle signaleffekten.
- Bruk MATLAB funksjon (sampling) for å utvide malen biblioteket ved digitalt å skape versjoner av normaliserte kodesignaler med varierende varighet for å romme variasjoner i cellen strømningshastigheten over elektrodene.
- Identifisere signal blokkene som svarer til sensor aktivitet (terskel: SNR> 12 dB) i den filtrerte bølgeform. Bølgeform med SNR under terskelen ville bli behandlet som støy.
- Dekode individuelle blokker av sensoren aktivitet i det innspilte signal ved hjelp av en iterativ algoritme basert på suksessiv interferenskansellering, en teknikk som vanligvis benyttes i flerbruker CDMA kommunikasjonsnett 24, 25.
- Beregn krysskorrelasjon av hvert signal blokk med alle malene i biblioteket ved å skyve dot produktet.
- Identifiser mal som produserer largest autokorrelasjonstoppen for å bestemme den dominerende enkelt sensor kodesignalet. Registrere både tid og amplitude av autokorrelasjonstopp.
- Konstruere et anslag sensor kodesignal ved å skalere den identifiserte koden mal basert på den målte autokorrelasjons-topp amplitude og tidsinformasjon (bestemt i trinn 7.5.2).
- Trekk fra den beregnede sensorkodesignal fra den opprinnelige data.
- Iterere prosessen fra 7.5.1, inntil det gjenværende signalet ikke ligner noe signal i malen biblioteket, matematisk definert som korrelasjonskoeffisienten er mindre enn 0,5.
- Spesifiser første sensorsignal estimater fra trinn 7,5 ved hjelp av en optimaliseringsprosess.
- Rekonstruere signalet ved tilsetning av beregnede de enkelte sensorsignalene fra hver iterasjon.
- Feie amplitude, varighet og tidspunkt for individuelle sensorsignalene rundt de opprinnelige estimatene til å produsere best mulig passform med den innspilte elektrisk signalbasert på minste kvadrater tilnærming 26.
- Konverter amplituder av estimerte sensorsignaler i celle størrelse ved å kalibrere elektriske signaler mot optiske bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En mikrofluid KODER anordning som består av fire sensorer fordelt over fire microfluidic kanaler er vist i figur 1b. I dette system ble det tverrsnittet av hver mikrofluidkanal er utformet for å være i nærheten av størrelsen av en celle, slik at (1) flere celler kan ikke passere over elektrodene i parallell og (2) cellene forblir nær elektrodene øke følsomheten . Hver sensor er konstruert for å generere en unik 7-bits digital kode. Anordningen ble deretter testet ved hjelp av en cellesuspensjon. Innspilte elektriske signaler som svarer til fire individuelle følere er vist med tilhørende ideelle digitale koder i figur 4. Innspilte signaler grad samsvarer med den ideelle kvadrat pulser, mens små avvik finnes. Slike avvik skyldes en kombinasjon av flere faktorer, inkludert den ikke-uniformt elektrisk felt mellom elektrodene i samme plan, kopling mellom forskjellige elektrodepar, kuleform-celler, så vel som den konstante strømningshastighet av celler i microfluidic kanaler. Vi skapte en mal bibliotek basert på recoded sensorsignaler. Ved å korrelere de registrerte signaler med alle maler i biblioteket, bestemt vi en mal som produserte den maksimale autokorrelasjonstoppen (figur 4). Da de digitale kodene for microfluidic kanaler er utformet for å være ortogonale til hverandre, kan en dominerende auto-korrelasjonstopp robust bli identifisert i denne prosessen. Ved bruk av denne tilnærmingen, kan vi beregningsmessig bestemme mikrofluidkanalen cellen passerte gjennom, varigheten av sensorsignalet, og dermed strømningshastigheten av cellen.
Microfluidic KODER teknologi kan løse situasjoner når flere celler samtidig samhandle med koding elektroder. Når slike overlappinger opptrer, vil signalene fra de enkelte følere forstyrre og den resulterende bølgeform kan ikke uten videre være forbundet med en hvilken som helstenkelt templat svarende til en spesifikk sensor. Nøyaktig dekoding slike overlappende signaler er spesielt viktig for prøver pålitelig prosessering med høy tetthet, der forstyrrelser er mer sannsynlig å skje. For å løse overlappende hendelser, har vi utviklet en iterativ algoritme basert på en påfølgende forstyrrelse kansellering (SN) ordningen 24, 25, som vanligvis brukes for flerbrukerdeteksjon i CDMA kommunikasjonsnett. Figur 5 viser hvordan SIC algoritmen er implementert i å løse en bølgeform som resulterte fra fire overlappende celler i fire ulike microfluidic kanaler. I hver iterasjon, vi først bestemt den dominerende auto-korrelasjonstopp (5a, 2. kolonne), som tilsvarer den sterkeste interfererende signal, ved å korrelere inngangsbølgeform (figur 5a, 1. kolonne) med malen biblioteket. Basert på den valgte malen og than dermed gi autokorrelasjon amplitude, vi deretter beregnet sterkest interfererende signal (figur 5a, 3. kolonne) og subtraheres den fra inngangsbølgeforma. De resterende bølgeform ble vedtatt til neste iterasjon som input. Denne prosessen fortsettes inntil korrelasjonen av restsignalet med malen biblioteket ga ikke en klar auto-korrelasjonstopp (5a, 5 th rad, 2. plott). Etter avslutning av forstyrrelser kansellering prosessen, rekonstruert vi et estimat av bølgeformen ved å kombinere alle de estimerte signalene fra hver iterasjon (figur 6a). Ved hjelp av en optimeringsprosess basert på en minste kvadraters approksimasjon for å minimere den midlere kvadratfeil mellom den opprinnelige bølgeformen og den rekonstruerte signal, vi oppdatert estimat for den amplitude, varighet og relative tidspunkt for de enkelte sensorkodesignalene (figur 6b). Vi har også beregnet størrelsencellene detektert på grunnlag av amplituden av de estimerte enkelte sensorsignalene. For å oppnå dette, kalibrert vi de elektriske signalamplituder med optisk målte cellestørrelser ved hjelp av lineær regresjon (figur 6b). En sammenligning av resultatene fra microfluidic KODER med informasjon innhentet fra samtidig registrert høyhastighets mikroskop bilder viser at cellen størrelse og hastighet kan måles nøyaktig, noe som bekrefter resultatene våre (tabell 1). Figur 6c viser samtidig registrert høyhastighets mikroskopi bilde som brukes for å validere dekoding resultat.
For å demonstrere reproduserbarheten av resultatene våre, og også resultatene av mikrofluidKODER teknologi for en high-throughput utvalgets behandling, analyserte vi elektriske signaler som tilsvarer> 1000 celler. Signalene ble automatisk dekodet i MATLAB ved å kjøre algoritmen forklartovenfor og nøyaktigheten av våre resultater ble evaluert ved direkte å sammenligne våre resultater med optiske data fra opp samtidig høyhastighets video. Vår analyse viser at elektriske signaler fra 96,15% av celler (973/1012) ble nøyaktig dekodet. Suksessraten for dekoding av ikke-overlappende og overlappende cellesignaler er 98,71% (688/697) og 90,48% (285/315), henholdsvis.
Figur 1. Design av de fire-kanals mikrofluid KODER enhet. (A) Elektroder i hver mikrofluidkanal micropatterned for å generere en unik digital kode. Impedansen modulasjon skyldes sekvensielle interaksjoner av strømmer celler med elektrodeparene fører til elektriske pulser. (B) En mikroskopbilde av den mikrofluid KODER enheten. Under fremstillingsprosessen blir glassubstrat med koding overflateelektroder på linje med PDMS microfluidic kanaler under et mikroskop. (C) Et nærbilde bilde av kodede overflateelektroder produserer 7-bits Gold sekvenser: "1010110", "0111111", "0100010", "0011000". Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. microfabrication prosess. (A) PDMS microfluidic kanaler er fabrikkert ved hjelp av myke litografi 27. (B) overflateelektrodene er fremstilt ved hjelp av en lift-off-prosess. (C) Et skjematisk tverrsnitt av den siste enheten. PDMS microfluidic kanaler er innrettet og festet til glassubstratet med overflateelektroder. jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Eksperimentell oppsett. Ved hjelp av en sprøytepumpe, blir cellesuspensjonen går gjennom mikrofluidKODER enheten ved en konstant strømningshastighet. Et 400 kHz AC-signalet blir tilført referanseelektroden ved hjelp av en funksjonsgenerator. Strømsignaler fra positive og negative elektroder er føle først omdannes til spenningssignaler ved hjelp av to transimpedans-forsterkere og subtrahert fra hverandre ved hjelp av en differensialforsterker. Differensial bipolare signal ekstraheres med en lock-in-forsterker og deretter samplet inn i en datamaskin for signalbehandling og dekoding. Høyhastighets optisk mikroskopi brukes til optisk posten drift av enheten for validering og karakterisering formål.e.jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Registrerte elektriske signaler fra individuelle sensorer og deres sammenhenger. Registrerte signaler og deres korrelasjon med hverandre, er gitt for fire kode-multiplekset resistive pulssensor. Henholdsvis Sensor 1 (a), ble sensor 2 (b), sensor 3 (c) og føleren 4 (d) som er utformet for å fremstille 7-bits digitale bølgeformer "1010110", "0111111", "0100010", og "0.011.000", . For hver sensor, viser den øverste figuren at normalisert signal registreres fra hver sensor kamper tett med den ideelle plassen pulssekvens at sensoren er designet for å produsere. For hver sensor, viser den nedre panel innspilte sensorsignal9; s autokorrelasjon og krysskorrelasjon med signaler som svarer til tre andre kode-multiplekset sensorer i nettverket. I alle tilfeller kan en autokorrelasjonstopp robust identifiseres fordi de digitale kodene fra de enkelte følere er konstruert for å være ortogonale til hverandre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Decoding en overlappende bølgeform med påfølgende forstyrrelser avbestillingen. I hver iterasjon, blir inngangsbølgeformen (1 st kolonne) korrelert med den forhåndsmontert malen biblioteket for å identifisere den spesifikke mal som resulterer i den høyeste korrelasjonen amplitude (2. kolonne). Ved hjelp av denne bestemt mal, er den sterkeste forstyrrer signalet estimert basert på amplitudeog tidsinformasjon fra en korrelasjonstoppen (3. kolonne). Den estimerte signal blir deretter subtrahert fra den opprinnelige bølgeformen, effektivt avbryter den sterkeste forstyrrelser på grunn av den største cellen. Fremgangsmåten itereres inntil intet korrelasjonstoppen kan bestemmes (dvs. korrelasjonskoeffisient <0,5) i restsignalet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. dekoding resultat analyse. (A) Estimert signaler er raffinert basert på en optimaliseringsalgoritme som tar sikte på å oppnå best mulig passform mellom den rekonstruerte og den originale innspilte bølgeform ved hjelp av minste kvadraters tilnærming. (B) Ved slutten av optimaliseringsprosessen,timing og amplitude av kalibrerte signaler nøyaktig bilde av celleparametre målt ved høy hastighet mikroskopi. (C) Samtidig registreres høyhastighets mikroskopi bilde validerer våre resultater fra elektriske målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| målingstype | r CH1 (mikrometer) | r CH2 (mikrometer) | r CH3 (um) | r CH4 (mikrometer) | At 1 (ms) | At 2 (ms) | At 3 (ms) |
| Elektrisk | 8,010 | 6,490 | 5.300 | 6,550 | 0,465 | 1,705 | 0,744 |
| Optisk | 8,320 | 6,770 | 5,680 | 7,040 | 0,375 | 1,625 | 0.750 |
Tabell 1. Sammenligning av elektrisk og optisk målte celleparametre i figur 6b. For å validere våre beregninger, vi optisk målte cellestørrelser fra high-speed mikroskopi bilde. Relativ timing mellom ulike celler er optisk målt ut fra antall rammer mellom cellene i high-speed video tatt opp med 8000 bilder per sekund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere resistive pulssensor, er blitt innarbeidet i microfluidic brikker 28, 29, 30, 31, 32. I disse systemer ble resistive pulssensor heller ikke multiplekset 28, 29, 30, 31 eller de nødvendige individuelle sensorer for å drives ved forskjellige frekvenser 32. I begge tilfellene ble engasjerte eksterne koblinger som er nødvendig for hver puls resistiv sensor på brikken og dermed et stort antall sensorer kan ikke integreres uten større kompleksitet maskinvare. Den viktig fordel ved mikrofluid KODER er at den tillater samtidig avlesning av flere resistive pulssensor fra en enkelt utgang i en enkel enhet. Dette oppnår vi ved å bruke multiplexing teknikker som vanligvis brukes i telekommunikasjon å designe mikromaskin resistive pulssensor integrert i microfluidic enheter. I hovedsak er avhengig vår teknologi på kode-multipleksing et nettverk av on-chip Coulter tellere ved å designe hver for å produsere en identifiserbar signal når en partikkel er oppdaget. Hver sensor mikromaskinert i nettverket består av flere i samme plan overflate elektroder bestilt i forskjellige konfigurasjoner slik at den sekvensielle interaksjonen av strømmende partikler med disse elektrodene produserer ortogonale impedans modulasjoner bølgeformer. For å få plass til asynkron partikkel-sensor interaksjon, vi spesielt utformet for hver sensor for å produsere Gold-koder 33, pseudo-ortogonal digitale koder som vanligvis brukes i oppadgående av CDMA-telekommunikasjonsnett. Gold-koder opprettholde et visst nivå ortogonalitet selv når de er feilinnrettet med tilfeldig faseforskjeller 34.
microfluidic KODER er lett skalerbar. Selv om vi presenterte resultater fra en prototype mikrofluid KODER enhet med fire sensorer i dette papiret, kan flere sensorer bli innarbeidet i enheten når designet for å produsere utgangssignaler skjelnes fra resten. En måte å utvide sensornettverket er å konstruere sensorer basert på større ortogonale koden sett med lengre digitale koder. Lengre ortogonale koder med flere bits gir høyere prosessgevinst i dekoding og kan skilles fra hverandre når det er forstyrrelser. På den annen side, lengre Gold-koder i anordningen innebærer også større føler volum, noe som øker den forventede antall interfererende sensorer. Likeledes vil øke antall sensorer for en gitt prøve tetthet fører til flere partikler overlappende på grunn av en økning i det totale sensorvolumet. Som sådan, er tettheten av partiklene i prøven en kritisk parameter som må tas i betraktning i å bruke mikrofluid KODER teknologi. Den maksimale pArtikkelen tetthet som kan løses (i analogi med den kanalkapasitet av et CDMA-telekommunikasjonssystem) avhenger av flere faktorer slik som de enkelte sensorsignalene og deres forhold, den avkodingsplanen layout av mikrofluidanordningen, og elektronisk støy-nivå. Avhengig av programmet, kan prøven fortynnes for å nå en partikkeltetthet som gir en akseptabel feilrate.
Fra signalbehandling perspektiv, er dekoding av tidsbølgeformer fra en mikrofluid KODER enhet ikke beregningsintensive med dagens systemer som gjenspeiles av det faktum at mobiltelefonen kommunikasjon på et CDMA-nettverk kan demultiplekset i sanntid. Videre de fysiske hendelsene som skal dekodes i microfluidic enheter skje mye tregere enn litt overføringshastighet i mobiltelefon kommunikasjon tillater oss å bruke mer avanserte og tidkrevende algoritmer som SIC og en optimalisering prosesser, som vi bruker til å iterativt løse overlapp signals fra sensorer.
Til sammen microfluidic KODER er en allsidig, skalerbar elektronisk sensing teknologi som lett kan integreres i ulike microfluidic enheter for å realisere kvantitative analyser ved å spore partiklene som de blir behandlet på brikken. Teknologien er meget lett å gjennomføre, fordi (1) det er meget enkelt fra et maskinvareperspektiv (2) det er direkte kompatibel med myklitografi (3) den tilveiebringer en direkte elektronisk utlesning uten noen aktiv on-chip-komponent, og (4) det er avhengig av enkle beregningsalgoritmer for signalbehandling og tolking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 98% Sulfuric Acid | BDH Chemicals | BDH3074-3.8LP | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BDH Chemicals | BDH7690-3 | |
| Trichlorosilane | Aldrich Chemistry | 235725-100G | |
| NR9-1500PY Negative Photoresist | Furuttex | ||
| Resist Developer RD6 | Furuttex | ||
| Acetone | BDH Chemicals | BDH1101-4LP | |
| SU-8 2015 Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y010200 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| Isopropyl Alcohol | BDH Chemicals | BDH1133-4LP | |
| RPMI 1640 | Corning Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Amresco | K952-100ML | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CM | |
| PHD 22/2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2001 | |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instrument | ||
| HF2TA Current Amplifier | Zurich Instrument | ||
| Eclipse Ti-U Microscope | Nikon Corporation | ||
| DS-Fi2 High-Definition Color Camera | Nikon Corporation | ||
| v7.3 High-speed Camera | Phantom | ||
| PCIe-6361 Data Acquisition Board | National Instruments | 781050-01 | |
| BNC-2120 Shielded Connector Block | National Instruments | 777960-01 | |
| PX-250 Plasma Treatment System | Nordson MARCH |
References
- De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Res. 46 (3), 907-919 (2012).
- Vives-Rego, J., Lebaron, P., Nebe-von Caron, G. Current and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 24 (4), 429-448 (2000).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Cantón, R., Nombela, C., Sánchez-Pérez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Toner, M., Irimia, D. Blood-on-a-chip. Annu Rev Biomed Eng. 7, 77-103 (2005).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Current Opin Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nat Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Cermak, N., et al. High-throughput measurement of single-cell growth rates using serial microfluidic mass sensor arrays. Nat Biotechnol. , (2016).
- Gossett, D., et al. Label-free cell separation and sorting in microfluidic systems. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3249-3267 (2010).
- Tsutsui, H., Ho, C. Cell separation by non-inertial force fields in microfluidic systems. Mech Res Commun. 36 (1), 92-103 (2009).
- Edwards, T. L., Gale, B. K., Frazier, A. B. A microfabricated thermal field-flow fractionation system. Anal Chem. 74 (6), 1211-1216 (2002).
- Wang, M. M., et al. Microfluidic sorting of mammalian cells by optical force switching. Nat Biotechnol. 23 (1), 83-87 (2005).
- Shields, C. W. IV, Reyes, C. D., López, G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip. 15 (5), 1230-1249 (2015).
- Gawad, S., Schild, L., Renaud, P. Micromachined impedance spectroscopy flow cytometer for cell analysis and particle sizing. Lab Chip. 1 (1), 76-82 (2001).
- Haandbæk, N., Bürgel, S. C., Heer, F., Hierlemann, A. Characterization of subcellular morphology of single yeast cells using high frequency microfluidic impedance cytometer. Lab Chip. 14 (2), 369-377 (2014).
- Bayley, H., Martin, C. Resistive-pulse sensing-from microbes to molecules. Chem Rev. 100 (7), 2575-2594 (2000).
- Polling, D., Deane, S. C., Burcher, M. R., Glasse, C., Reccius, C. H. Coded electrodes for low signal-noise ratio single cell detection in flow-through impedance spectrophy. Proceedings of uTAS. (The 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences), Groningen, The Netherlands, , 3-7 (2010).
- Javanmard, M., Davis, R. W. Coded corrugated microfluidic sidewalls for code division multiplexing. IEEE Sensors J. 13 (5), 1399-1400 (2013).
- Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: a robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
- Emaminejad, S., Talebi, S., Davis, R. W., Javanmard, M. Multielectrode sensing for extraction of signal from noise in impedance cytometry. IEEE Sensors J. 15 (5), 2715-2716 (2015).
- Spencer, D., Caselli, F., Bisegna, P., Morgan, H. High accuracy particle analysis using sheathless microfluidic impedance cytometry. Lab Chip. 16 (2016), 2467-2473 (2016).
- Liu, R., Wang, N., Kamili, F., Sarioglu, A. Microfluidic CODES: a scalable multiplexed electronic sensor for orthogonal detection of particles in microfluidic channels. Lab Chip. 16 (8), 1350-1357 (2016).
- Buehrer, R. Code Division Multiple Access (CDMA). Synthesis Lectures on Communications. 1 (1), 1-192 (2006).
- Proakis, J. Digital Communications. , McGraw-Hill. New York, NY. (1989).
- Patel, P., Holtzman, J. Analysis of a simple successive interference cancellation scheme in a DS/CDMA system. IEEE J Sel Areas Commun. 12 (5), 796-807 (1994).
- Hui, A., Letaief, K. Successive interference cancellation for multiuser asynchronous DS/CDMA detectors in multipath fading links. IEEE Trans Commun. 46 (3), 384-391 (1998).
- Whittle, P. Prediction and regulation by linear least-square methods. J Macroecon. 7 (1), 126 (1985).
- Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 335-373 (2001).
- Zhe, J., Jagtiani, A., Dutta, P., Hu, J., Carletta, J. A micromachined high throughput Coulter counter for bioparticle detection and counting. J Micromech Microeng. 17 (2), 304-313 (2007).
- Song, Y., Yang, J., Pan, X., Li, D. High-throughput and sensitive particle counting by a novel microfluidic differential resistive pulse sensor with multidetecting channels and a common reference channel. Electrophoresis. 36 (4), 495-501 (2015).
- Watkins, N., et al. Microfluidic CD4+ and CD8+ T lymphocyte counters for point-of-care HIV diagnostics using whole blood. Sci Transl Med. 5 (214), 214ra170 (2013).
- Chen, Y., et al. Portable Coulter counter with vertical through-holes for high-throughput applications. Sensor Actuat B-Chem. 213, 375-381 (2015).
- Jagtiani, A., Carletta, J., Zhe, J. An impedimetric approach for accurate particle sizing using a microfluidic Coulter counter. J Micromech Microeng. 21 (4), 045036 (2011).
- Gold, R. Optimal binary sequences for spread spectrum multiplexing (Corresp). IEEE Trans. Inform. Theory. 13 (4), 619-621 (1967).
- Dinan, E., Jabbari, B. Spreading codes for direct sequence CDMA and wideband CDMA cellular networks. IEEE Commun Mag. 36 (9), 48-54 (1998).
